本申請涉及生物醫(yī)藥，更具體地說，它涉及一種基于六方氮化硼的自級聯(lián)捕獲活性氧水凝膠體系的制備方法。

背景技術(shù)：

1、近年來，牙周炎作為一種慢性炎癥性疾病，在口腔健康領(lǐng)域引起廣泛關(guān)注。牙周炎是一種由齦下菌斑中的病原微生物引起的慢性炎癥，常伴隨著牙周炎癥、牙周袋形成、牙槽骨丟失等癥狀。牙周炎病理情況下，免疫細(xì)胞不斷產(chǎn)生活性氧(reactive?oxygen?species,ros)對抗細(xì)菌入侵。ros具有“雙刃劍”作用，線粒體呼吸鏈和大多數(shù)酶促反應(yīng)釋放的適量ros對細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等至關(guān)重要。但過量產(chǎn)生的ros會超出內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)的清除能力，進(jìn)而引起氧化應(yīng)激(oxidative?stress,os)。此外，ros水平升高會抑制骨髓干細(xì)胞(bone?marrow?stem?cells,bmscs)成骨分化，促進(jìn)rankl介導(dǎo)的破骨細(xì)胞活化，最終破壞骨再生的動態(tài)平衡。因此，改變細(xì)胞外富氧環(huán)境和逆轉(zhuǎn)細(xì)胞內(nèi)氧化還原失衡對牙周再生至關(guān)重要。

2、組織工程領(lǐng)域中，ros響應(yīng)水凝膠被設(shè)計(jì)并用于清除ros和修復(fù)組織缺陷，以實(shí)現(xiàn)氧化應(yīng)激微環(huán)境下的綜合診療。然而，os微環(huán)境會損壞水凝膠交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)致高分子鏈段斷裂、修復(fù)系統(tǒng)崩潰，最終喪失再生生態(tài)位。

3、因此，牙周炎微環(huán)境中氧化應(yīng)激水平升高引起的牙周組織再生困難的問題是本領(lǐng)域亟待解決的技術(shù)難題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的發(fā)明目的：解決牙周炎微環(huán)境中氧化應(yīng)激水平升高引起的牙周組織再生困難的問題。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明策略性提出將抗氧化劑置于交聯(lián)位點(diǎn)，當(dāng)水凝膠體系在os狀態(tài)下氧化降解時(shí)，位于交聯(lián)位點(diǎn)的抗氧化劑作為陷阱“打開”，捕獲ros并平衡其水平；具有抗氧化和促成骨分化活性的二維片層六方氮化硼(hbn)在提高水凝膠體系力學(xué)性能的同時(shí)，接管、清除捕獲的ros；水凝膠體系的自級聯(lián)產(chǎn)物——果膠的氧化產(chǎn)物進(jìn)一步驅(qū)動還原反應(yīng)，最終與氧化hbn協(xié)同重塑細(xì)胞內(nèi)、外氧化應(yīng)激狀態(tài)。綜上，本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種基于六方氮化硼的自級聯(lián)捕獲活性氧水凝膠體系，其生物安全性和促牙周組織再生的效果證明其具有較好的研究前景和應(yīng)用價(jià)值。

3、第一方面，本申請?zhí)峁┝艘环N甲基丙烯酸酯化果膠的制備方法，采用以下的技術(shù)方案：

4、所述制備方法包括以下步驟：將果膠加入含有氯化鈉(nacl)的2-嗎啉乙磺酸(mes)緩沖液中，室溫下攪拌至完全溶解，加入n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc)，攪拌10分鐘，在溶液中加入n-(2-氨基乙基)甲基丙烯酰胺鹽酸鹽(aema)，室溫下于暗處反應(yīng)24小時(shí)；

5、加入過量丙酮沉淀溶液，將所得聚合物在通風(fēng)柜下干燥，將所得聚合物溶解于去離子水中凈化，在常溫下用去離子水透析72h，凍干處理后得到甲基丙烯酸酯化果膠凍干樣品。

6、優(yōu)選的，所述nhs：edc：aema比例為90mm：180mm：90mm，以制備高取代度的甲基丙烯酸酯化果膠。

7、進(jìn)一步優(yōu)選的，所述制備方法涉及的原料組成及配比為：果膠1g、nacl?2.925g、mes緩沖液100ml、nhs1.035g、edc?3.45g以及aema?1.491g。

8、第二方面，本申請?zhí)峁┝艘环N谷胱甘肽修飾絲蛋白的制備方法，采用以下的技術(shù)方案：

9、所述制備方法包括以下步驟：使用mes緩沖液將天然絲蛋白溶解為溶液，加入edc和nhs，磁力攪拌下室溫反應(yīng)15分鐘，在上述溶液中加入還原型谷胱甘肽(gsh)，磁力攪拌下室溫反應(yīng)15分鐘，反應(yīng)溶液在常溫下用去離子水透析24h，凍干處理后得到谷胱甘肽修飾絲蛋白凍干樣品。

10、優(yōu)選的，所述制備方法涉及的原料組成及配比為：天然絲蛋白0.8g、mes緩沖液10ml、nhs?0.7mg、edc?0.5mg以及gsh?0.02g。

11、優(yōu)選的，所述制備的谷胱甘肽修飾絲蛋白濃度為8％(w/v)。

12、第三方面，本申請?zhí)峁┮环N基于六方氮化硼的自級聯(lián)捕獲活性氧水凝膠體系的制備方法，采用以下的技術(shù)方案：

13、所述制備方法包括以下步驟：

14、(1)制備甲基丙烯酸酯化果膠；

15、(2)制備谷胱甘肽修飾絲蛋白；

16、(3)將谷胱甘肽修飾絲蛋白配制為10-20％(w/v)溶液，優(yōu)選的，加入三(2-羧基乙基)磷酸鹽酸鹽(tcep·hcl)10mmol/l，攪拌15分鐘；

17、(4)甲基丙烯酸酯化果膠、步驟(3)中優(yōu)化的谷胱甘肽修飾絲蛋白、光引發(fā)劑苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰)磷酸鋰(lap)按照體積分?jǐn)?shù)2：1：1的比例混合均勻，得到水凝膠前聚體溶液；

18、(5)加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10％的六方氮化硼(hbn)，混合均勻，經(jīng)紫外光(波長405nm)照射30秒，得到一種基于六方氮化硼的自級聯(lián)捕獲活性氧水凝膠體系。

19、第四方面，本申請?zhí)峁┮环N基于六方氮化硼的自級聯(lián)捕獲活性氧水凝膠體系，由第三方面記載的制備方法制備獲得。

20、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

21、1.本發(fā)明提供的一種基于六方氮化硼的自級聯(lián)捕獲活性氧水凝膠體系，選用天然果膠和絲蛋白作為水凝膠支架原材料，制備方法簡單，操作簡便，生物相容性良好。

22、2.與以往在水凝膠體系中單純添加抗氧化劑不同，本發(fā)明提供的一種基于六方氮化硼的自級聯(lián)捕獲活性氧水凝膠體系，突破性地將抗氧化劑置于交聯(lián)位點(diǎn)，其作為陷阱誘捕過量產(chǎn)生的ros，并引發(fā)后續(xù)自級聯(lián)反應(yīng)清除ros。

23、3.hbn的加入不僅有效提高水凝膠力學(xué)性能，在陷阱“打開”后，hbn級聯(lián)接管、清除捕獲的ros，氧化的hbn作為水凝膠體系的自級聯(lián)產(chǎn)物進(jìn)入細(xì)胞，逆轉(zhuǎn)胞內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)，調(diào)節(jié)胞內(nèi)氧化還原平衡。

24、4.當(dāng)清除ros的反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)，需要進(jìn)一步引入反應(yīng)物或消耗產(chǎn)物來維持反應(yīng)正向進(jìn)行，果膠氧化解聚產(chǎn)生的果膠寡糖(pos)具有抗氧化作用，其有助于推進(jìn)自級聯(lián)ros捕獲反應(yīng)，提高水凝膠體系整體抗氧化性能，與氧化hbn協(xié)同重塑細(xì)胞內(nèi)、外氧化應(yīng)激狀態(tài)。

技術(shù)特征：

1.一種基于六方氮化硼的自級聯(lián)捕獲活性氧水凝膠體系的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)的制備過程為：

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述nhs：edc：aema比例為90mm：180mm：90mm。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述制備過程涉及的原料組成及配比為：果膠1g、nacl?2.925g、mes緩沖液100ml、nhs1.035g、edc?3.45g以及aema?1.491g。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)的制備過程為：

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述制備過程涉及的原料組成及配比為：天然絲蛋白0.8g、mes緩沖液10ml、nhs?0.7mg、edc?0.5mg以及gsh?0.02g。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(4)中甲基丙烯酸酯化果膠、步驟(3)中的谷胱甘肽修飾絲蛋白溶液、光引發(fā)劑lap按照體積分?jǐn)?shù)2：1：1的比例混合。

8.一種由權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的制備方法得到的基于六方氮化硼的自級聯(lián)捕獲活性氧水凝膠體系。

9.權(quán)利要求8所述的基于六方氮化硼的自級聯(lián)捕獲活性氧水凝膠體系在制備治療牙周炎的藥物中的應(yīng)用。

10.一種藥物，其特征在于，所述藥物包括權(quán)利要求8所述的基于六方氮化硼的自級聯(lián)捕獲活性氧水凝膠體系作為活性成分。

技術(shù)總結(jié)
本申請涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，公開了一種基于六方氮化硼的自級聯(lián)捕獲活性氧水凝膠體系的制備方法。所述制備方法包括以下步驟：(1)制備甲基丙烯酸酯化果膠；(2)制備谷胱甘肽修飾絲蛋白；(3)將谷胱甘肽修飾絲蛋白加入TCEP·HCl，配制為10?20％(w/v)谷胱甘肽修飾絲蛋白溶液；(4)甲基丙烯酸酯化果膠、步驟(3)中的谷胱甘肽修飾絲蛋白溶液、光引發(fā)劑LAP混合均勻，得到水凝膠前聚體溶液；(5)加入hBN，混合均勻，經(jīng)紫外光照射后，得到基于六方氮化硼的自級聯(lián)捕獲活性氧水凝膠體系。本申請制得的水凝膠體系解決了牙周炎微環(huán)境中氧化應(yīng)激水平升高引起的牙周組織再生困難的問題。

技術(shù)研發(fā)人員：蔣欣泉,楊嘉巍,王潔,周名亮,顧浩
受保護(hù)的技術(shù)使用者：上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19