本發(fā)明涉及醫(yī)藥、食品和化妝品領(lǐng)域，具體涉及一種用于發(fā)酵法生產(chǎn)d-氨基葡萄糖的工程菌及其應(yīng)用，特別涉及以丙三醇或油脂與d-葡萄糖共同合成d-氨基葡萄糖的工程菌及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、d-氨基葡萄糖(d-glucosamine)，俗稱(chēng)氨糖，是d-葡萄糖分子中2位羥基被氨基取代后的化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為c6h13no5。氨糖的結(jié)構(gòu)與葡萄糖相似，但第二個(gè)碳原子上的羥基(-oh)被氨基(-nh2)取代。這種替換導(dǎo)致氨糖的化學(xué)性質(zhì)和生物活性與葡萄糖有所不同。氨糖是糖蛋白和蛋白聚糖的主要成分，幾乎存在于所有有機(jī)體中。因其特有化學(xué)性質(zhì)和生物活性，氨糖及其衍生物廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域。工業(yè)生產(chǎn)的氨糖分為d-氨基葡萄糖鹽酸鹽、d-氨基葡萄糖硫酸鹽、高純硫酸氨糖三種。

2、傳統(tǒng)生產(chǎn)氨糖方法主要包括生物提取法和生物發(fā)酵法兩種。生物提取法是指從蝦蟹殼中提取甲殼素或殼聚糖經(jīng)酸水解而生成氨基葡萄糖鹽酸鹽；生物發(fā)酵法以葡萄糖為原料，經(jīng)發(fā)酵、提取、純化、濃縮、結(jié)晶干燥等工藝生產(chǎn)氨基葡萄糖等系列產(chǎn)品。水解法技術(shù)壁壘相對(duì)較低，但生產(chǎn)效率低，使鹽酸等濃酸水解甲殼素還面臨較嚴(yán)重的環(huán)境污染問(wèn)題，同時(shí)原料來(lái)源受季節(jié)的影響，因此成本相對(duì)較高。

3、生物合成法利用自然界中大量存在的天然原料，以生物酶為催化劑制備氨糖。這種生產(chǎn)方式有利于降低工業(yè)化生產(chǎn)成本，而且符合當(dāng)下綠色環(huán)保的生產(chǎn)原則，其生產(chǎn)過(guò)程不受資源限制，對(duì)環(huán)境污染相對(duì)較小，且產(chǎn)品無(wú)動(dòng)物源性過(guò)敏原存在。大腸桿菌是最常見(jiàn)的氨糖生產(chǎn)菌，主要通過(guò)乙酰氨糖作為氨基供體，經(jīng)l-谷氨酰胺-d-果糖-6-磷酸氨基轉(zhuǎn)移酶催化將果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化為氨基葡萄糖-6-磷酸。受限于氨基葡萄糖-6-磷酸對(duì)氨糖生成的反饋抑制及氨糖所產(chǎn)生的細(xì)胞毒性，當(dāng)前氨糖生產(chǎn)菌存在菌體發(fā)酵密度低，氨糖生產(chǎn)量低同時(shí)難以在胞外積累等問(wèn)題，這也成為了限制微生物發(fā)酵生產(chǎn)氨糖的關(guān)鍵技術(shù)難題。

4、中國(guó)是氨糖原料生產(chǎn)大國(guó)，美國(guó)是消費(fèi)大國(guó)。據(jù)公開(kāi)信息，全球95％以上的氨糖原料生產(chǎn)企業(yè)在中國(guó)，而中國(guó)氨糖原料生產(chǎn)企業(yè)主要集中在江浙等沿海地區(qū)。目前氨糖的生產(chǎn)方式生物提取法和生物發(fā)酵法各占據(jù)一定的比例，其中發(fā)酵法多以葡萄糖為原料將氨糖轉(zhuǎn)化為乙酰氨基葡萄糖，再通過(guò)脫乙酰酶將乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)化為氨基葡萄糖，生產(chǎn)周期相對(duì)較長(zhǎng)，且存在“與人爭(zhēng)粱”的問(wèn)題。餐廚廢棄油脂的水分和酸價(jià)以及過(guò)氧化值嚴(yán)重超標(biāo)，作為一種非食用油，從環(huán)保層面上來(lái)說(shuō)，其衛(wèi)生和安全性極差，人們聞之色變。但在我國(guó)，餐飲業(yè)中每年產(chǎn)生的餐廚廢棄油脂約有2000多萬(wàn)噸，全國(guó)每年廢棄或閑置的動(dòng)植物油總計(jì)在1億噸左右，以1噸動(dòng)植物油約提煉800kg油脂計(jì)算，可生成8000多萬(wàn)噸油脂，同時(shí)有大量的甘油作為副產(chǎn)物隨之生成。如果餐廚廢棄油脂無(wú)正確的收回利用手段，極易危機(jī)人體健康或造成資源浪費(fèi)，因此，高效合理利用餐廚廢棄油脂，減少環(huán)境污染迫在眉睫。建立以甘油和油脂為原料供微生物生長(zhǎng)，以葡萄糖為原料合成d-氨基葡萄糖的路線(xiàn)，具有極大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是如何構(gòu)建可以甘油或油脂為碳源積累生物量，同時(shí)以d-葡萄糖為原料合成d-氨基葡萄糖的重組大腸桿菌。

2、為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明首先提供了重組大腸桿菌。

3、本發(fā)明提供的重組大腸桿菌是將大腸桿菌進(jìn)行多項(xiàng)改造得到的；

4、所述多項(xiàng)改造包括改造(a)和改造(e)；

5、改造(a)包括如下改造(a1)-(a9)：

6、改造(a1)：敲除pfka基因；

7、改造(a2)：敲除pfkb基因；

8、改造(a3)：敲除zwf基因；

9、改造(a4)：敲除manxyz基因；

10、改造(a5)：敲除nage基因；

11、改造(a6)：敲除nagb基因；

12、改造(a7)：增強(qiáng)arae基因的表達(dá)；

13、改造(a8)：ptsg基因替換為glk基因；

14、改造(a9)：galr基因替換為zglf基因；

15、改造(e)：導(dǎo)入并表達(dá)ecglms基因和btglmp基因。

16、為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了產(chǎn)d-氨基葡萄糖的重組大腸桿菌的構(gòu)建方法。

17、本發(fā)明提供的產(chǎn)d-氨基葡萄糖的重組大腸桿菌的構(gòu)建方法包括如下步驟：將大腸桿菌進(jìn)行多項(xiàng)改造；所述多項(xiàng)改造包括改造(a)和改造(e)；

18、改造(a)包括如下改造(a1)-(a9)：

19、改造(a1)：敲除pfka基因；

20、改造(a2)：敲除pfkb基因；

21、改造(a3)：敲除zwf基因；

22、改造(a4)：敲除manxyz基因；

23、改造(a5)：敲除nage基因；

24、改造(a6)：敲除nagb基因；

25、改造(a7)：增強(qiáng)arae基因的表達(dá)；

26、改造(a8)：ptsg基因替換為glk基因；

27、改造(a9)：galr基因替換為zglf基因；

28、改造(e)：導(dǎo)入并表達(dá)ecglms基因和btglmp基因。

29、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述多項(xiàng)改造還包括改造(b)；所述改造(b)包括如下改造(b1)-(b9)：

30、改造(b1)：敲除fadr基因；

31、改造(b2)：增強(qiáng)fadd基因的表達(dá)；

32、改造(b3)：增強(qiáng)fadl基因的表達(dá)；

33、改造(b4)：增強(qiáng)stha基因的表達(dá)；

34、改造(b5)：增強(qiáng)atosc基因簇的表達(dá)；

35、改造(b6)：敲除fabf基因；

36、改造(b7)：敲除fabh基因；

37、改造(b8)：敲除lpxm基因；

38、改造(b9)：敲除iclr基因。

39、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述多項(xiàng)改造還包括改造(c)；所述改造(c)包括如下改造(c1)-(c4)：

40、改造(c1)：敲除alse基因；

41、改造(c2)：敲除mana基因；

42、改造(c3)：敲除mtld基因；

43、改造(c4)：敲除srld基因。

44、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述多項(xiàng)改造還包括改造(d)；所述改造(d)包括如下改造(d1)-(d5)：

45、改造(d1)：敲除glsa基因；

46、改造(d2)：敲除glsb基因；

47、改造(d3)：敲除glnb基因；

48、改造(d4)：敲除glne基因；

49、改造(d5)：ldha基因替換為谷氨酰胺合成酶基因。

50、上述任一所述敲除pfka基因、敲除pfkb基因、敲除zwf基因、敲除manxyz基因、敲除nage基因、敲除nagb基因、敲除fadr基因、敲除fabf基因、敲除fabh基因、敲除lpxm基因、敲除iclr基因、敲除alse基因、敲除mana基因、敲除mtld基因、敲除srld基因、敲除glsa基因、敲除glsb基因、敲除glnb基因、敲除glne基因均通過(guò)用于敲除上述基因的打靶片段、pcp20質(zhì)粒和pkd46質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)。

51、其中，用于敲除pfka基因的打靶片段為pfkaup-kan-pfkadown，所述pfkaup-kan-pfkadown可以大腸桿菌菌株jw1176基因組dna為模板，采用引物pfka-1/pfka-2進(jìn)行pcr擴(kuò)增獲得。

52、用于敲除pfkb基因的打靶片段為pfkbup-kan-pfkbdown，所述pfkbup-kan-pfkbdown可以大腸桿菌菌株jw1176基因組dna為模板，采用引物pfkb-1/pfkb-2進(jìn)行pcr擴(kuò)增獲得。

53、用于敲除zwf基因的打靶片段為zwfup-kan-zwfdown，所述zwfup-kan-zwfdown可以大腸桿菌菌株jw1176基因組dna為模板，采用引物zwf-1/zwf-2進(jìn)行pcr擴(kuò)增獲得。

54、用于敲除manxyz基因的打靶片段為manxyzup-kan-manxyzdown，所述manxyzup-kan-manxyzdown可以大腸桿菌菌株jw1176基因組dna為模板，采用引物manxyz-1/manxyz-2進(jìn)行pcr擴(kuò)增獲得。

55、用于敲除nage基因的打靶片段為nageup-kan-nagedown，所述nageup-kan-nagedown可以大腸桿菌菌株jw1176基因組dna為模板，采用引物nage-1/nage-2進(jìn)行pcr擴(kuò)增獲得。

56、用于敲除nagb基因的打靶片段為nagbup-kan-nagbdown，所述nagbup-kan-nagbdown可以大腸桿菌菌株jw1176基因組dna為模板，采用引物nagb-1/nagb-2進(jìn)行pcr擴(kuò)增獲得。

57、用于敲除fadr基因的打靶片段為fadrup-kan-fadrdown，所述fadrup-kan-fadrdown可以大腸桿菌菌株jw1176基因組dna為模板，采用引物fadr-1/fadr-2進(jìn)行pcr擴(kuò)增獲得。

58、用于敲除fabf基因的打靶片段為fabfup-kan-fabfdown，所述fabfup-kan-fabfdown可以大腸桿菌菌株jw1176基因組dna為模板，采用引物fabf-1/fabf-2進(jìn)行pcr擴(kuò)增獲得。

59、用于敲除fabh基因的打靶片段為fadhup-kan-fadhdown，所述fadhup-kan-fadhdown可以大腸桿菌菌株jw1176基因組dna為模板，采用引物fadh-1/fadh-2進(jìn)行pcr擴(kuò)增獲得。

60、用于敲除lpxm基因的打靶片段為lpxmup-kan-lpxmdown，所述lpxmup-kan-lpxmdown可以大腸桿菌菌株jw1176基因組dna為模板，采用引物lpxm-1/lpxm-2進(jìn)行pcr擴(kuò)增獲得。

61、用于敲除iclr基因的打靶片段為iclrup-kan-iclrdown，所述iclrup-kan-iclrdown可以大腸桿菌菌株jw1176基因組dna為模板，采用引物iclr-1/iclr-2進(jìn)行pcr擴(kuò)增獲得。

62、用于敲除alse基因的打靶片段為alseup-kan-alsedown，所述alseup-kan-alsedown可以大腸桿菌菌株jw1176基因組dna為模板，采用引物alse-1/alse-2進(jìn)行pcr擴(kuò)增獲得。

63、用于敲除mana基因的打靶片段為manaup-kan-manadown，所述manaup-kan-manadown可以大腸桿菌菌株jw1176基因組dna為模板，采用引物mana-1/mana-2進(jìn)行pcr擴(kuò)增獲得。

64、用于敲除mtld基因的打靶片段為mtldup-kan-mtlddown，所述mtldup-kan-mtlddown可以大腸桿菌菌株jw1176基因組dna為模板，采用引物mtld-1/mtld-2進(jìn)行pcr擴(kuò)增獲得。

65、用于敲除srld基因的打靶片段為srldup-kan-srlddown，所述srldup-kan-srlddown可以大腸桿菌菌株jw1176基因組dna為模板，采用引物srld-1/srld-2進(jìn)行pcr擴(kuò)增獲得。

66、用于敲除glsa基因的打靶片段為glsaup-kan-glsadown，所述glsaup-kan-glsadown可以大腸桿菌菌株jw1176基因組dna為模板，采用引物glsa-1/glsa-2進(jìn)行pcr擴(kuò)增獲得。

67、用于敲除glsb基因的打靶片段為glsbup-kan-glsbdown，所述glsbup-kan-glsbdown可以大腸桿菌菌株jw1176基因組dna為模板，采用引物glsb-1/glsb-2進(jìn)行pcr擴(kuò)增獲得。

68、用于敲除glnb基因的打靶片段為glnbup-kan-glnbdown，所述glnbup-kan-glnbdown可以大腸桿菌菌株jw1176基因組dna為模板，采用引物glnb-1/glnb-2進(jìn)行pcr擴(kuò)增獲得。

69、用于敲除glne基因的打靶片段為glneup-kan-glnedown，所述glneup-kan-glnedown可以大腸桿菌菌株jw1176基因組dna為模板，采用引物glne-1/glne-2進(jìn)行pcr擴(kuò)增獲得。

70、上述任一所述增強(qiáng)arae基因的表達(dá)通過(guò)在arae基因上游插入大腸桿菌組成型啟動(dòng)子pcpa1實(shí)現(xiàn)。進(jìn)一步的，所述在arae基因上游插入大腸桿菌組成型啟動(dòng)子pcpa1通過(guò)打靶片段araeup-kan-pcpa1-araedown、pcp20質(zhì)粒和pkd46質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)。更進(jìn)一步的，所述打靶片段araeup-kan-pcpa1-araedown可以基因片段(5’到3’依次由seq?id?no.5所示的araeup、seqid?no.1所示的frt-kan-frt篩選標(biāo)記片段、seq?id?no.3所示的pcpa1啟動(dòng)子片段和seq?idno.6所示的araedown組成)為模板，采用引物arae-1/arae-2進(jìn)行pcr擴(kuò)增獲得。

71、上述任一所述增強(qiáng)fadd基因的表達(dá)通過(guò)在fadd基因上游插入大腸桿菌組成型啟動(dòng)子pcpa1實(shí)現(xiàn)。進(jìn)一步的，所述在fadd基因上游插入大腸桿菌組成型啟動(dòng)子pcpa1通過(guò)打靶片段faddup-kan-pcpa1-fadddown、pcp20質(zhì)粒和pkd46質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)。更進(jìn)一步的，所述打靶片段faddup-kan-pcpa1-fadddown可以基因片段(5’到3’依次由seq?id?no.13所示的faddup、seqid?no.1所示的frt-kan-frt篩選標(biāo)記片段、seq?id?no.3所示的pcpa1啟動(dòng)子片段和seq?idno.14所示的fadddown組成)為模板，采用引物fadd-1/fadd-2進(jìn)行pcr擴(kuò)增獲得。

72、上述任一所述增強(qiáng)fadl基因的表達(dá)通過(guò)在fadl基因上游插入大腸桿菌組成型啟動(dòng)子pcpa1實(shí)現(xiàn)。進(jìn)一步的，所述在fadl基因上游插入大腸桿菌組成型啟動(dòng)子pcpa1通過(guò)打靶片段fadlup-kan-pcpa1-fadldown、pcp20質(zhì)粒和pkd46質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)。更進(jìn)一步的，所述打靶片段fadlup-kan-pcpa1-fadldown可以基因片段(5’到3’依次由seq?id?no.15所示的fadlup、seqid?no.1所示的frt-kan-frt篩選標(biāo)記片段、seq?id?no.3所示的pcpa1啟動(dòng)子片段和seq?idno.16所示的fadldown組成)為模板，采用引物fadl-1/fadl-2進(jìn)行pcr擴(kuò)增獲得。

73、上述任一所述增強(qiáng)stha基因的表達(dá)通過(guò)在stha基因上游插入大腸桿菌組成型啟動(dòng)子pcpa1實(shí)現(xiàn)。進(jìn)一步的，所述在stha基因上游插入大腸桿菌組成型啟動(dòng)子pcpa1通過(guò)打靶片段sthaup-kan-pcpa1-sthadown、pcp20質(zhì)粒和pkd46質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)。更進(jìn)一步的，所述打靶片段sthaup-kan-pcpa1-sthadown可以基因片段(5’到3’依次由seq?id?no.17所示的sthaup、seqid?no.1所示的frt-kan-frt篩選標(biāo)記片段、seq?id?no.3所示的pcpa1啟動(dòng)子片段和seq?idno.18所示的sthadown組成)為模板，采用引物stha-1/stha-2進(jìn)行pcr擴(kuò)增獲得。

74、上述任一所述增強(qiáng)atosc基因簇的表達(dá)通過(guò)在atosc基因簇上游插入大腸桿菌組成型啟動(dòng)子pcpa1實(shí)現(xiàn)。進(jìn)一步的，所述在atosc基因簇上游插入大腸桿菌組成型啟動(dòng)子pcpa1通過(guò)打靶片段atosup-kan-pcpa1-atosdown、pcp20質(zhì)粒和pkd46質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)。更進(jìn)一步的，所述打靶片段atosup-kan-pcpa1-atosdown可以基因片段(5’到3’依次由seq?id?no.19所示的atosup、seq?id?no.1所示的frt-kan-frt篩選標(biāo)記片段、seq?id?no.3所示的pcpa1啟動(dòng)子片段和seq?id?no.20所示的atosdown組成)為模板，采用引物atos-1/atos-2進(jìn)行pcr擴(kuò)增獲得。

75、上述任一所述ptsg基因替換為glk基因?yàn)閜tsg基因替換為組成型啟動(dòng)子p119和glk基因。進(jìn)一步的，所述ptsg基因替換為組成型啟動(dòng)子p119和glk基因通過(guò)打靶片段ptsgup-kan-p119-glk-ptsgdown、pcp20質(zhì)粒和pkd46質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)。更進(jìn)一步的，所述打靶片段ptsgup-kan-p119-glk-ptsgdown可以基因片段(5’到3’依次由seq?id?no.7所示的ptsgup、seq?idno.1所示的frt-kan-frt篩選標(biāo)記片段、seq?id?no.4所示的p119啟動(dòng)子片段、glk基因、seqid?no.2所示的trrnb終止子片段、seq?id?no.8所示的ptsgdown組成)為模板，采用ptsg-1/ptsg-2為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增獲得。

76、上述任一所述galr基因替換為zglf基因?yàn)間alr基因替換為組成型啟動(dòng)子pcpa1和glk基因。進(jìn)一步的，所述將galr基因替換為組成型啟動(dòng)子pcpa1和glk基因通過(guò)打靶片段galrup-kan-pcpa1-zglf-galrdown、pcp20質(zhì)粒和pkd46質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)。更進(jìn)一步的，所述打靶片段galrup-kan-pcpa1-zglf-galrdown可以基因片段(5’到3’依次由seq?id?no.9所示的galrup、seq?id?no.1所示的frt-kan-frt篩選標(biāo)記片段、seq?id?no.3所示的pcpa1啟動(dòng)子、zglf基因、seq?id?no.2所示的trrnb終止子片段、seq?id?no.10所示的galrdown組成)為模板，采用galr-1/galr-2為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增獲得。

77、上述任一所述谷氨酰胺合成酶基因可為來(lái)源于谷氨酸棒狀桿菌(corynebacterium?glutamicum)的cggs基因或來(lái)源于釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)的scgs基因或來(lái)源于嗜酸乳桿菌(lactobacillus?acidophilus)的lags基因。所述ldha基因替換為谷氨酰胺合成酶基因可為ldha基因替換為組成型啟動(dòng)子pcpa1和cggs基因或ldha基因替換為組成型啟動(dòng)子pcpa1和scgs基因或ldha基因替換為組成型啟動(dòng)子pcpa1和lags基因。

78、進(jìn)一步的，所述ldha基因替換為組成型啟動(dòng)子pcpa1和cggs基因通過(guò)打靶片段ldhaup-kan-pcpa1-cggs-ldhadown、pcp20質(zhì)粒和pkd46質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)。

79、所述ldha基因替換為組成型啟動(dòng)子pcpa1和scgs基因通過(guò)打靶片段ldhaup-kan-pcpa1-scgs-ldhadown、pcp20質(zhì)粒和pkd46質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)。

80、所述ldha基因替換為組成型啟動(dòng)子pcpa1和lags基因通過(guò)打靶片段ldhaup-kan-pcpa1-lags-ldhadown、pcp20質(zhì)粒和pkd46質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)。

81、更進(jìn)一步的，所述打靶片段ldhaup-kan-pcpa1-cggs-ldhadown可以基因片段(5’到3’依次由seq?id?no.11所示的ldhaup、seq?id?no.1所示的frt-kan-frt篩選標(biāo)記片段、seqid?no.3所示的pcpa1啟動(dòng)子片段、cggs基因、seq?id?no.2所示的trrnb終止子片段和seq?idno.12所示的ldhadown組成)為模板，采用ldha-1/ldha-2為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增獲得。

82、所述打靶片段ldhaup-kan-pcpa1-scgs-ldhadown可以基因片段(5’到3’依次由seqid?no.11所示的ldhaup、seq?id?no.1所示的frt-kan-frt篩選標(biāo)記片段、seq?id?no.3所示的pcpa1啟動(dòng)子片段、scgs基因、seq?id?no.2所示的trrnb終止子片段和seq?id?no.12所示的ldhadown組成)為模板，采用ldha-1/ldha-2為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增獲得。

83、所述打靶片段ldhaup-kan-pcpa1-lags-ldhadown可以基因片段(5’到3’依次由seqid?no.11所示的ldhaup、seq?id?no.1所示的frt-kan-frt篩選標(biāo)記片段、seq?id?no.3所示的pcpa1啟動(dòng)子片段、lags基因、seq?id?no.2所示的trrnb終止子片段和seq?id?no.12所示的ldhadown組成)為模板，采用ldha-1/ldha-2為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增獲得。

84、上述任一所述ecglms基因和btglmp基因通過(guò)重組表達(dá)載體ptrc99a-ecglms-btglmp導(dǎo)入。所述重組表達(dá)載體ptrc99a-ecglms-btglmp可通過(guò)gibson組裝方法將ecglms-btglmp片段與ptrc片段進(jìn)行連接獲得；所述ecglms-btglmp片段依次由seq?id?no.22和seqid?no.24組成；所述ptrc片段可以質(zhì)粒ptrc99a為模板，采用引物ptrc99a-01f/ptrc99a-01r進(jìn)行pcr擴(kuò)增獲得。

85、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述大腸桿菌為含有所述pfka基因、所述pfkb基因、所述zwf基因、所述manxyz基因、所述nage基因、所述nagb基因、所述arae基因、所述ptsg基因、所述galr基因、所述fadr基因、所述fadd基因、所述fadl基因、所述stha基因、所述atosc基因簇、所述fabf基因、所述fabh基因、所述lpxm基因、所述iclr基因、所述alse基因、所述mana基因、所述mtld基因、所述srld基因、所述glsa基因、所述glsb基因、所述glnb基因、所述glne基因、所述ldha基因的大腸桿菌。

86、在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述大腸桿菌為大腸桿菌bw25113菌株。

87、上述任一所述引物序列如下文實(shí)施例中的表1所示。

88、上述任一所述重組大腸桿菌或方法在制備d-氨基葡萄糖中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

89、為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了一種d-氨基葡萄糖的制備方法。

90、本發(fā)明提供的d-氨基葡萄糖的制備方法包括如下步驟：以d-葡萄糖為原料，采用上述重組大腸桿菌進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，得到d-氨基葡萄糖。

91、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包括以甘油和/或油脂為碳源培養(yǎng)所述重組大腸桿菌的步驟。

92、在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述油脂包括甘油三酯(如大豆油、色拉油和玉米油等)和脂肪酸(如棕櫚酸、硬脂酸、軟脂酸等)。

93、在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述甘油從油脂中提取獲得。

94、在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述甘油通過(guò)發(fā)酵法或合成法生產(chǎn)獲得(如由二氧化碳或石油化工原料制備獲得)。

95、在本發(fā)明的又一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述油脂從地溝油中提煉獲得。具體地，所述提煉的方法包括回收、預(yù)處理、酯化和蒸餾等步驟。

96、在本發(fā)明的再一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述油脂從植物或動(dòng)物組織中提取獲得。

97、上述任一所述pfka基因的核苷酸序列如gene?bank中g(shù)ene?id：948412所示，該基因編碼的6-磷酸果糖激酶1的氨基酸序列如ncbi中參考序列號(hào)caa26356.1所示。

98、上述任一所述pfkb基因的核苷酸序列如gene?bank中g(shù)ene?id：946230所示，該基因編碼的6-磷酸果糖激酶2的氨基酸序列如ncbi中參考序列號(hào)np_416237所示。

99、上述任一所述zwf基因的核苷酸序列如gene?bank中g(shù)ene?id：94637所示，該基因編碼的6-磷酸葡萄糖脫氫酶的氨基酸序列如ncbi中參考序列號(hào)np_416366所示。

100、上述任一所述manxyz基因包含manx基因、many基因和manz基因，所述manx基因、所述many基因和所述manz基因的核苷酸序列分別如gene?bank中g(shù)ene?id：946334、gene?id：946332和gene?id：946342所示，所述manx基因、所述many基因和所述manz基因編碼的manx蛋白、many蛋白和manz蛋白的氨基酸序列分別如ncbi中參考序列號(hào)np_416331、參考序列號(hào)np_416332和參考序列號(hào)np_416333所示。

101、上述任一所述nage基因的核苷酸序列如gene?bank中g(shù)ene?id：945292所示，該基因編碼的n-乙酰葡糖胺特異性pts轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的氨基酸序列如ncbi中參考序列號(hào)np_415205所示。

102、上述任一所述nagb基因的核苷酸序列如gene?bank中g(shù)ene?id：945290所示，該基因編碼的氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨酶的氨基酸序列如ncbi中參考序列號(hào)np_415204所示。

103、上述任一所述arae基因的核苷酸序列如gene?bank中947341所示，該基因編碼的阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的氨基酸序列如ncbi中參考序列號(hào)np_417318所示。

104、上述任一所述ptsg基因的核苷酸序列如gene?bank中g(shù)ene?id：947341所示，該基因編碼的磷酸轉(zhuǎn)移酶g亞基的氨基酸序列如ncbi中參考序列號(hào)np_415619所示。

105、上述任一所述glk基因的核苷酸序列如gene?bank中g(shù)ene?id：94734所示，該基因編碼的葡萄糖激酶的氨基酸序列如ncbi中參考序列號(hào)np_416889所示。

106、上述任一所述galr基因的核苷酸序列如gene?bank中g(shù)ene?id：947314所示，該基因編碼的半乳糖阻遏因子的氨基酸序列如ncbi中參考序列號(hào)np_417314所示。

107、上述任一所述zglf基因的核苷酸序列如ncbi中參考序列號(hào)m60615.1的基因組序列的第185-1606位所示，該基因編碼的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)輔助因子的氨基酸序列如ncbi中參考序列號(hào)aaa27691.1所示。

108、上述任一所述ecglms基因的核苷酸序列如seq?id?no.22所示，該基因編碼的ecglms蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.21所示。

109、上述任一所述btglmp基因的核苷酸序列如seq?id?no.24所示，該基因編碼的btglmp蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.23所示。

110、上述任一所述fadr基因的核苷酸序列如gene?bank中g(shù)ene?id：94865所示，該基因編碼的脂肪酸降解轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列如ncbi中參考序列號(hào)np_415705所示。

111、上述任一所述fadd基因的核苷酸序列如gene?bank中g(shù)ene?id：94632所示，該基因編碼的脂肪酰輔酶a合成酶的氨基酸序列如ncbi中參考序列號(hào)np_416319所示。

112、上述任一所述fadl基因的核苷酸序列如gene?bank中g(shù)ene?id：946820所示，該基因編碼的長(zhǎng)鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的氨基酸序列如ncbi中參考序列號(hào)np_416846所示。

113、上述任一所述stha基因的核苷酸序列如gene?bank中g(shù)ene?id：94846所示，該基因編碼的nad(p)轉(zhuǎn)氫酶的氨基酸序列如ncbi中參考序列號(hào)np_418397所示。

114、上述任一所述atosc基因簇含有atos基因和atoc基因，所述atos基因和所述atoc基因的核苷酸序列分別如gene?bank中g(shù)ene?id：949011和gene?id：947444所示，所述atos基因和所述atoc基因編碼的atos蛋白和atoc蛋白的氨基酸序列分別如ncbi中參考序列號(hào)np_416723和參考序列號(hào)np_416724所示。

115、上述任一所述fabf基因的核苷酸序列如gene?bank中g(shù)ene?id：946665所示，該基因編碼的β-酮脂酰-acp合酶ii的氨基酸序列如ncbi中參考序列號(hào)np_415613所示。

116、上述任一所述fabh基因的核苷酸序列如gene?bank中g(shù)ene?id：946003所示，該基因編碼的β-酮脂酰-acp合酶iii的氨基酸序列如ncbi中參考序列號(hào)np_415609所示。

117、上述任一所述lpxm基因的核苷酸序列如gene?bank中g(shù)ene?id：945143所示，該基因編碼的類(lèi)脂a生物合成肉豆蔻酰基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列如ncbi中參考序列號(hào)np_416369所示。

118、上述任一所述iclr基因的核苷酸序列如gene?bank中g(shù)ene?id：948524所示，該基因編碼的異檸檬酸裂解酶抑制因子的氨基酸序列如ncbi中參考序列號(hào)np_418442所示。

119、上述任一所述alse基因的核苷酸序列如gene?bank中g(shù)ene?id：948595所示，該基因編碼的d-阿洛酮糖-6-磷酸差向異構(gòu)酶的氨基酸序列如ncbi中參考序列號(hào)np_418509所示。

120、上述任一所述mana基因的核苷酸序列如gene?bank中g(shù)ene?id：944840所示，該基因編碼的甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶的氨基酸序列如ncbi中參考序列號(hào)np_416130所示。

121、上述任一所述mtld基因的核苷酸序列如gene?bank中g(shù)ene?id：948117所示，該基因編碼的甘露醇-1-磷酸5-脫氫酶的氨基酸序列如ncbi中參考序列號(hào)np_418057所示。

122、上述任一所述srld基因的核苷酸序列如gene?bank中g(shù)ene?id：948937所示，該基因編碼的山梨糖醇-6-磷酸2-脫氫酶的氨基酸序列如ncbi中參考序列號(hào)np_417185所示。

123、上述任一所述glsa基因的核苷酸序列如gene?bank中g(shù)ene?id：946187所示，該基因編碼的谷氨酰胺酶a的氨基酸序列如ncbi中參考序列號(hào)np_415018所示。

124、上述任一所述glsb基因的核苷酸序列如gene?bank中g(shù)ene?id：944973所示，該基因編碼的谷氨酰胺酶b的氨基酸序列如ncbi中參考序列號(hào)np_416041所示。

125、上述任一所述glnb基因的核苷酸序列如gene?bank中g(shù)ene?id：947016所示，該基因編碼的氮調(diào)節(jié)蛋白的氨基酸序列如ncbi中參考序列號(hào)np_417048所示。

126、上述任一所述glne基因的核苷酸序列如gene?bank中g(shù)ene?id：947552所示，該基因編碼的谷氨酰胺合成酶腺苷化酶/腺苷酰轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列如ncbi中參考序列號(hào)np_417525所示。

127、上述任一所述ldha基因的核苷酸序列如gene?bank中g(shù)ene?id：946315所示，該基因編碼的乳酸脫氫酶的氨基酸序列如ncbi中的參考序列號(hào)np_415898所示。

128、上述任一所述cggs基因的核苷酸序列如ncbi中參考序列號(hào)cp007724.1的基因組序列的第2185037-2186470位所示，該基因編碼的谷氨酰胺合成酶的氨基酸序列如ncbi中參考序列號(hào)aik85642所示。

129、上述任一所述scgs基因的核苷酸序列如gene?bank中g(shù)ene?id：856147所示，該基因編碼的谷氨酰胺合成酶的氨基酸序列如ncbi中參考序列號(hào)np_015360所示。

130、上述任一所述lags基因的核苷酸序列如ncbi中參考序列號(hào)cp020620.1的基因組序列的第1491778-1493115位所示，該基因編碼的谷氨酰胺合成酶的氨基酸序列如ncbi中參考序列號(hào)ajp46821所示。

131、上述任一所述組成型啟動(dòng)子pcpa1的核苷酸序列如seq?id?no.3所示。

132、上述任一所述組成型啟動(dòng)子p119的核苷酸序列如seq?id?no.4所示。

133、本發(fā)明對(duì)大腸桿菌的改造包括如下(1)-(5)：

134、(1)油脂同化途徑的增強(qiáng)：包括增強(qiáng)fadd基因的表達(dá)、增強(qiáng)fadl基因的表達(dá)、增強(qiáng)stha基因的表達(dá)、增強(qiáng)atosc基因簇的表達(dá)、敲除lpxm基因、敲除fadr基因、敲除fabf基因、敲除fabh基因、敲除iclr基因；

135、(2)d-氨基葡萄糖合成途徑的增強(qiáng)：包括增強(qiáng)arae基因的表達(dá)、galr基因替換為zglf基因、ptsg基因替換為glk基因、導(dǎo)入并表達(dá)ecglms基因和btglmp基因；

136、(3)d-葡萄糖與d-氨基葡萄糖消耗途徑減弱或阻斷：包括敲除pfka基因、敲除pfkb基因、敲除zwf基因、敲除manxyz基因、敲除nage基因、敲除nagb基因；

137、(4)l-谷氨酰胺合成途徑增強(qiáng)消耗途徑減弱或阻斷：ldha基因替換為谷氨酰胺合成酶基因、敲除glsa基因、敲除glsb基因、敲除glnb基因、敲除glne基因；

138、(5)副產(chǎn)物相關(guān)基因的減弱或阻斷：包括敲除alse基因、敲除mana基因、敲除mtld基因、敲除srld基因。

139、本發(fā)明制備了可利用甘油或油脂為碳源生長(zhǎng)并積累生物量，同時(shí)利用積累的生物量進(jìn)一步將d-葡萄糖轉(zhuǎn)化合成d-氨基葡萄糖的重組大腸桿菌，該重組大腸桿菌可用于d-氨基葡萄糖的工業(yè)化生產(chǎn)，一方面，高效合理利用地溝油，不僅降低了生產(chǎn)成本同時(shí)還減少了環(huán)境污染，另一方面，高效合成了d-氨基葡萄糖，提高了d-氨基葡萄糖產(chǎn)量，具有極大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)價(jià)值。