本發(fā)明涉及漁業(yè)病害防控，尤其涉及一種靶向魚類無乳鏈球菌sip蛋白的納米抗體nb12及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、羅非魚(oreochromis?sp.)是聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(fao)向全球推薦的最重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一。2023年我國(guó)羅非魚養(yǎng)殖產(chǎn)量高達(dá)181.68萬噸，是全球最大的羅非魚生產(chǎn)國(guó)。近年來，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大和養(yǎng)殖密度的增加，我國(guó)羅非魚主要養(yǎng)殖地區(qū)暴發(fā)以無乳鏈球菌(streptococcus?agalactiae，gbs)為主的鏈球菌病，其危害之大，被稱為羅非魚養(yǎng)殖業(yè)的“h1n1”，給羅非魚養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，抗生素仍是養(yǎng)殖環(huán)境中防控?zé)o乳鏈球菌病的主要方法。然而抗生素的長(zhǎng)期使用和濫用，不但導(dǎo)致無乳鏈球菌產(chǎn)生嚴(yán)重的耐藥性，還引起了環(huán)境污染、食品安全等一系列問題。

2、在羅非魚無乳鏈球菌病的發(fā)展過程中，無乳鏈球菌毒力因子在入侵以及裂解宿主細(xì)胞等方面發(fā)揮重要作用。毒力因子有許多種，可以分為兩大類：結(jié)構(gòu)產(chǎn)物和分泌產(chǎn)物。結(jié)構(gòu)產(chǎn)物一般與菌體的黏附與定植有關(guān)，而分泌產(chǎn)物常常與入侵和損傷機(jī)體細(xì)胞、組織有關(guān)。其中，表面免疫原性蛋白(surface?immunogenic?protein，sip)是gbs的結(jié)構(gòu)產(chǎn)物，位于細(xì)菌的表面，并參與菌體對(duì)宿主細(xì)胞和組織的黏附、定植過程。各類血清型gbs都能表達(dá)sip蛋白，且sip基因在gbs中高度保守，具有潛在的免疫原性，是無乳鏈球菌疫苗抗原的重要候選蛋白。

3、20世紀(jì)90年代，hamers等發(fā)現(xiàn)駱駝科動(dòng)物血清中存在著一種天然缺失了輕鏈部分，只含有重鏈部分的重鏈抗體(heavy-chain?antibodies，hcabs)。將駱駝科動(dòng)物體內(nèi)hcabs的可變區(qū)基因進(jìn)行克隆，可以得到一種僅由重鏈可變區(qū)構(gòu)成的重鏈可變區(qū)單域抗體(variable?domain?of?heavy-chain?antibodies，vhh)，又稱納米抗體(nanobodies，nbs)。vhh的單結(jié)構(gòu)域具有分子量小、組織穿透能力強(qiáng)、耐受力強(qiáng)、親和力高、水溶性好、易克隆重組、產(chǎn)量高和成本低等優(yōu)良的特性，推動(dòng)了其在疾病診斷和治療等領(lǐng)域的應(yīng)用。

4、為此，亟需利用vhh的優(yōu)異特性開發(fā)出一種針對(duì)無乳鏈球菌的新型綠色防控方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)以上不足，本發(fā)明提供一種靶向魚類無乳鏈球菌sip蛋白的納米抗體nb12，能夠用于制備抑制無乳鏈球菌感染魚類的中和抗體，解決當(dāng)前魚類缺乏有效防控?zé)o乳鏈球菌病中和抗體的問題。具體技術(shù)方案如下：

2、一種靶向魚類無乳鏈球菌sip蛋白的納米抗體nb12，所述納米抗體nb12包含重鏈可變區(qū)vhh，所述vhh包括4個(gè)抗體可變區(qū)內(nèi)骨架區(qū)fr1、fr2、fr3、fr4和3個(gè)互補(bǔ)決定簇cdr1、cdr2、cdr3，如下：

3、fr1的氨基酸序列如seq?id?no.1所示，即avqlvesgggmvqaggslklscvas；

4、fr2的氨基酸序列如seq?id?no.2所示，即mgwfrqaqgkereiiag；

5、fr3的氨基酸序列如seq?id?no.3所示，即yyqdsvkdrftifrdnakntvflqmnslrpedtgvyyc；

6、fr4的氨基酸序列如seq?id?no.4所示，即wgqgtqvtvss；

7、cdr1的氨基酸序列如seq?id?no.5所示，即grtfstlg；

8、cdr2的氨基酸序列如seq?id?no.6所示，即iswtgqat；

9、cdr3的氨基酸序列如seq?id?no.7所示，即aasrsdydplfgs；

10、所述骨架區(qū)fr1-4和互補(bǔ)決定簇cdr1-3按順序交錯(cuò)排列，重鏈可變區(qū)vhh的氨基酸序列如seq?id?no:8所示，即：

11、avqlvesgggmvqaggslklscvasmgwfrqaqgkereiiagyyqdsvkdrftifr?dnakntvflqmnslrpedtgvyycwgqgtqvtvssgrtfstlgiswtgqataasrsdyd?plfgs。

12、本發(fā)明還提供以上所述的靶向魚類無乳鏈球菌sip蛋白的納米抗體nb12的制備方法，包括如下步驟：

13、s1、利用基因工程技術(shù)將編碼vhh基因插入到噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因中，隨著噬菌體的繁殖，vhh會(huì)以融合蛋白的方式表達(dá)在子代噬菌體的衣殼蛋白上；

14、s2、然后利用包被于固定介質(zhì)中的抗原與vhh之間的親和作用，將特異性結(jié)合抗原的vhh選擇性親和淘選；

15、s3、經(jīng)過2-4輪親和淘選后所得的噬菌體陽性單克隆子進(jìn)行elisa測(cè)定，對(duì)陽性克隆菌株進(jìn)行擴(kuò)培送并測(cè)序分析，即可得到sip蛋白的納米抗體nb12。

16、進(jìn)一步，所述親和淘選的具體步驟為：

17、在免疫管上將包被純化復(fù)性后sip蛋白用脫脂奶粉進(jìn)行封閉，并加入vhh噬菌展示體庫，充分孵育，然后用洗滌液洗滌15-25次除去未特異性結(jié)合sip蛋白的噬菌體；用洗脫液洗脫剩余的結(jié)合噬菌體顆粒，隨后加入10％?aebsf終止洗脫；最后，將洗脫的噬菌體感染復(fù)合菌株，感染后35-40℃下過夜擴(kuò)陪，使用peg/2.5m?nacl溶液沉淀純化擴(kuò)增的噬菌體，收集沉淀并用pbs溶液重懸，即為特異性結(jié)合的噬菌體顆粒，用于下一輪的篩選過程。

18、進(jìn)一步，所述洗滌液為含0.05％?tween?20的pbs溶液t溶液。

19、進(jìn)一步，所述洗脫液為0.25mg/ml的trypsin溶液。

20、進(jìn)一步，所述復(fù)合菌株為大腸桿菌ss320菌株和m13k07輔助噬菌體。

21、本發(fā)明還提供了一種上述靶向魚類無乳鏈球菌sip蛋白的納米抗體nb12的應(yīng)用，本發(fā)明的納米抗體nb12與無乳鏈球菌sip蛋白蛋白可特異性結(jié)合，應(yīng)用于制備抑制無乳鏈球菌感染魚類的中和抗體，以及應(yīng)用于相關(guān)漁業(yè)病害防控。

22、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

23、本發(fā)明制備的納米抗體nb12，能夠高親和靶向羅非魚無乳鏈球菌sip蛋白，為開發(fā)新一代綠色抗菌藥劑的開發(fā)提供基礎(chǔ)，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)特征：

1.一種靶向魚類無乳鏈球菌sip蛋白的納米抗體nb12，其特征在于，所述納米抗體nb12包含重鏈可變區(qū)vhh，所述vhh包括4個(gè)抗體可變區(qū)內(nèi)骨架區(qū)fr1、fr2、fr3、fr4和3個(gè)互補(bǔ)決定簇cdr1、cdr2、cdr3；

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向魚類無乳鏈球菌sip蛋白的納米抗體nb12，其特征在于，所述骨架區(qū)fr1-4和互補(bǔ)決定簇cdr1-3按順序交錯(cuò)排列，重鏈可變區(qū)vhh的氨基酸序列如seq?id?no:8所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求1～2任一項(xiàng)所述的靶向魚類無乳鏈球菌sip蛋白的納米抗體nb12的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的靶向魚類無乳鏈球菌sip蛋白的納米抗體nb12的制備方法，其特征在于，所述s2步驟中，進(jìn)行2-4輪親和淘選。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的靶向魚類無乳鏈球菌sip蛋白的納米抗體nb12的制備方法，其特征在于，親和淘選的具體步驟為：

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的靶向魚類無乳鏈球菌sip蛋白的納米抗體nb12的制備方法，其特征在于，所述洗滌液為含0.05％tween?20的pbs溶液t溶液。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的靶向魚類無乳鏈球菌sip蛋白的納米抗體nb12的制備方法，其特征在于，所述洗脫液為0.25mg/ml的trypsin溶液。

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的靶向魚類無乳鏈球菌sip蛋白的納米抗體nb12的制備方法，其特征在于，所述復(fù)合菌株為大腸桿菌ss320菌株和m13k07輔助噬菌體。

9.權(quán)利要求1～2所述的任一項(xiàng)所述的靶向魚類無乳鏈球菌sip蛋白的納米抗體nb12在漁業(yè)病害防控中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種靶向魚類無乳鏈球菌SIP蛋白的納米抗體Nb12制備及其應(yīng)用，涉及漁業(yè)病害防控技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明的用噬菌體展示技術(shù)篩選的以羅非魚源無乳鏈球菌SIP蛋白為靶標(biāo)的納米抗體具有重鏈可變區(qū)VHH，所述VHH包括4個(gè)抗體可變區(qū)內(nèi)骨架區(qū)FR1、FR2、FR3、FR4和3個(gè)互補(bǔ)決定簇CDR1、CDR2、CDR3。本發(fā)明提供的納米抗體Nb12與無乳鏈球菌SIP蛋白具有較高的親和力，通過該抗體可靶向作用于SIP蛋白，且有效抑制了GBS在羅非魚體內(nèi)的增殖，具有優(yōu)異的抗菌活性，應(yīng)用于羅非魚的病害防治。

技術(shù)研發(fā)人員：王文歡,黃愛國(guó),郭靖,張雄賢,王志燊
受保護(hù)的技術(shù)使用者：廣西產(chǎn)研院綠色低碳技術(shù)研究所有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/12