本發(fā)明涉及植物遺傳工程，具體涉及一種萬(wàn)壽菊基因、克隆方法、表達(dá)載體及應(yīng)用，從萬(wàn)壽菊中克隆獲得的基因，以及該基因在改變植物葉色、果實(shí)風(fēng)味中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、萬(wàn)壽菊(tagetes?erecta?l.)是一種具有觀(guān)賞和藥用、農(nóng)藝價(jià)值的菊科一年生雙子葉草本植物。由于其色澤鮮艷，且花期較長(zhǎng)，易于栽培，適應(yīng)各種土壤環(huán)境，而成為觀(guān)賞植物，在世界各地廣泛種植。萬(wàn)壽菊花因其艷麗的花色占世界散花的一半以上產(chǎn)量。此外，萬(wàn)壽菊的花、葉和根常用于治療急性上呼吸道感染、百日咳等，也是一種傳統(tǒng)植物藥材。目前，萬(wàn)壽菊已在中國(guó)一些地區(qū)將萬(wàn)壽菊作為特色優(yōu)勢(shì)作物進(jìn)行引種，發(fā)展萬(wàn)壽菊規(guī)模化種植，通過(guò)建設(shè)全產(chǎn)業(yè)鏈，提升經(jīng)濟(jì)效益，使萬(wàn)壽菊形成了一定的產(chǎn)業(yè)化規(guī)模。

2、萬(wàn)壽菊富含類(lèi)胡蘿卜素、多酚、噻吩、生物堿和黃酮類(lèi)等多種次生代謝物質(zhì)，這些次生代謝物質(zhì)具有預(yù)防和治療退行性疾病、抗腫瘤、抗氧化等活性，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及藥用價(jià)值，被廣泛用于醫(yī)藥、保健及食品等行業(yè)。因此，萬(wàn)壽菊也成為提取這些天然次生代謝物質(zhì)的重要植物資源。

3、植物次生代謝物是在其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中受環(huán)境條件作用，由遺傳基因控制，通過(guò)次生代謝途徑產(chǎn)生的小分子有機(jī)化合物，它們對(duì)植物的生命活動(dòng)發(fā)揮至關(guān)重要作用，也是為人類(lèi)所利用的重要的生物活性物質(zhì)。植物體內(nèi)次生代謝物質(zhì)的合成受次生代謝途徑相關(guān)酶的催化，為了進(jìn)一步分離鑒定調(diào)控次生物質(zhì)生物合成的功能基因，利用不同種質(zhì)材料、組織類(lèi)型和發(fā)育階段萬(wàn)壽菊進(jìn)行差異表達(dá)基因的分析成為一種重要方法。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組、蛋白組學(xué)等手段獲取差異表達(dá)序列，從中篩選催化和調(diào)控特定次生代謝物質(zhì)合成積累的候選基因，并通過(guò)進(jìn)一步的遺傳轉(zhuǎn)化、表型分析，確定候選基因功能，為獲得新基因資源并用于植物遺傳性狀改良提供了可能。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種萬(wàn)壽菊基因、克隆方法、表達(dá)載體，從萬(wàn)壽菊中克隆基因序列，命名為tagetes?erecta?leaf?and?flavor?improvement?1(簡(jiǎn)稱(chēng)telfi1)；從萬(wàn)壽菊中進(jìn)行telfi1基因的克隆：利用萬(wàn)壽菊轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)θ~片中高豐度的表達(dá)序列進(jìn)行組裝；然后利用引物設(shè)計(jì)軟件pr?imer?premier設(shè)計(jì)pcr特異引物，從萬(wàn)壽菊葉片提取總rna，反轉(zhuǎn)錄pcr(reverse?transcription-pcr,rt-pcr)，克隆獲得telfi1基因。

2、本發(fā)明還有一個(gè)目的在于提供一種萬(wàn)壽菊基因的應(yīng)用，在改變?nèi)~色中的應(yīng)用、或改良果實(shí)風(fēng)味中的應(yīng)用。

3、本發(fā)明具體技術(shù)方案如下：

4、一種萬(wàn)壽菊基因，簡(jiǎn)稱(chēng)telfi1，其核苷酸序列如seq?id?no.1所示；

5、本發(fā)明提供的一種萬(wàn)壽菊基因的克隆方法，包括以下步驟：

6、1)萬(wàn)壽菊葉片組織rna提??；

7、2)反轉(zhuǎn)錄獲得cdna；

8、3)設(shè)計(jì)引物序列，利用獲得的cdna進(jìn)行telfi1基因克隆。

9、步驟3)中，設(shè)計(jì)引物序列具體為：telfi?1f，序列如seq?id?no.3所示；telfi?1r，序列如seq?id?no.4所示。

10、步驟3)中使用的試劑為：將200μl?ep管放置于冰上，加入試劑：高保真dna聚合酶0.5μl；5×buffer10μl；dntp?4μl；cdna?1μl；telfi?1f?1μl；telfi?1r?1μl；ddh2o?32.5μl；

11、步驟3)中，擴(kuò)增程序?yàn)椋?8℃2min預(yù)變性；98℃10s變性，56℃20s復(fù)性，72℃70s延伸，其中變性-復(fù)性-延伸30個(gè)循環(huán)；72℃5min總延伸。

12、本發(fā)明提供的一種萬(wàn)壽菊基因表達(dá)載體，所述萬(wàn)壽菊基因表達(dá)載體包括上述核苷酸序列如seq?id?no.1。

13、所述萬(wàn)壽菊基因表達(dá)載體，用萬(wàn)壽菊基因telfi1，插入到植物表達(dá)載體pbi121上，構(gòu)建得到重組表達(dá)載體。

14、所述萬(wàn)壽菊基因編碼的氨基酸序列如seq?id?no.2所示：

15、msvaliwvvspnselcnrlettkfadlsksrnclraskiknfekkdkcksfcymnadfsgfsgsnyaknpglisrvvanpggelavsseql

16、vydvvlkqaalvkeqmrnkedievkpdivlpgslgllseaydrcgevcaeyaktfylgtllmtperrkaiwaiyvwcrrtdelvdgpnash

17、itpkaldrwesrledlyngrpfdmldaalsdtvskfpvdiqpfkdmidgmrmdlrksryenfdelylycyyvagtvglmsvpimgiapesn

18、aptesvynaalalgianqltnilrdvgedarrgrvylpqdelaqaglsdedifamkvtdkwrffmkkqikrartffdqaeegvtqlssasrwpvwaslllyrqildeieandynnftkrayvskpkkivalpiayakslvppssrnlvsn。

19、本發(fā)明提供的一種萬(wàn)壽菊基因的應(yīng)用，在改變?nèi)~色中的應(yīng)用、或在改良果實(shí)風(fēng)味中的應(yīng)用。

20、本發(fā)明從萬(wàn)壽菊中克隆獲得了telfi1基因，telfi1基因在萬(wàn)壽菊葉片中表達(dá)量較高。當(dāng)通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化在番茄中表達(dá)telfi1時(shí)，葉片中葉綠素含量明顯降低，可使葉色發(fā)生改變，形成花斑葉或金邊葉。萬(wàn)壽菊沒(méi)有明顯的果實(shí)結(jié)構(gòu)，當(dāng)在番茄中表達(dá)telfi1時(shí)，番茄果實(shí)中的揮發(fā)性物質(zhì)成分發(fā)生改變，與野生型相比，風(fēng)味物質(zhì)3-己烯醇，以及2-己烯醛、1-戊烯-3-酮、2-異丁基噻唑含量顯著升高。如seq?id?no.1所示核苷酸序列的基因在葉片色素物質(zhì)、果實(shí)揮發(fā)性成分形成中發(fā)揮作用，本發(fā)明從萬(wàn)壽菊中所克隆telfi1基因能夠用于改變植物葉色、果實(shí)揮發(fā)性風(fēng)味成分。

21、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的萬(wàn)壽菊基因telfi1為植物性狀改良提供了一種新的基因資源，可用于改變植物葉色、果實(shí)風(fēng)味。

技術(shù)特征：

1.一種萬(wàn)壽菊基因，其特征在于，所述萬(wàn)壽菊基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的萬(wàn)壽菊基因，其特征在于，所述萬(wàn)壽菊基因編碼的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。

3.一種權(quán)利要求1所述的萬(wàn)壽菊基因的克隆方法，其特征在于，所述克隆方法包括以下步驟：

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的克隆方法，其特征在于，步驟3)中，設(shè)計(jì)引物序列具體為：telfi1f，序列如seq?id?no.3所示；telfi1r，序列如seq?id?no.4所示。

5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的克隆方法，其特征在于，步驟3)中使用的試劑為：將200μlep管放置于冰上，加入試劑：高保真dna聚合酶0.5μl；5×buffer?10μl；dntp?4μl；cdna?1μl；telfi1f1μl；telfi1r?1μl；ddh2o?32.5μl。

6.根據(jù)權(quán)利要求3或5所述的克隆方法，其特征在于，步驟3)中，擴(kuò)增程序?yàn)椋?8℃2min預(yù)變性；98℃10s變性，56℃20s復(fù)性，72℃70s延伸，其中變性-復(fù)性-延伸30個(gè)循環(huán)；72℃5min總延伸。

7.一種萬(wàn)壽菊基因表達(dá)載體，其特征在于，所述萬(wàn)壽菊基因表達(dá)載體包括權(quán)利要求1所述的萬(wàn)壽菊基因。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的萬(wàn)壽菊基因表達(dá)載體，其特征在于，用萬(wàn)壽菊基因插入到植物表達(dá)載體pbi121上，構(gòu)建得到重組表達(dá)載體。

9.一種權(quán)利要求1所述萬(wàn)壽菊基因的應(yīng)用，其特征在于，所述萬(wàn)壽菊基因在改變?nèi)~色中的應(yīng)用。

10.一種權(quán)利要求1所述萬(wàn)壽菊基因的應(yīng)用，其特征在于，所述萬(wàn)壽菊基因在改良果實(shí)風(fēng)味中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種萬(wàn)壽菊基因、克隆方法、表達(dá)載體及應(yīng)用，與現(xiàn)有技術(shù)相比，從萬(wàn)壽菊中進(jìn)行TeLFI1基因的克隆：利用萬(wàn)壽菊轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)θ~片中高豐度的表達(dá)序列進(jìn)行組裝；然后利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer?Premier設(shè)計(jì)PCR特異引物，從萬(wàn)壽菊葉片提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄PCR，克隆獲得TeLFI1基因。當(dāng)在番茄中表達(dá)TeLFI1時(shí)，可改變其葉色，形成花斑葉或金邊葉。TeLFI1基因在番茄中的表達(dá)使果實(shí)中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)發(fā)生改變。

技術(shù)研發(fā)人員：張婉,姚國(guó)強(qiáng),孫思琪,田振峰,趙美婷,牛向麗,邱雅瓊,汪雯靜,張恩啟,劉啟超
受保護(hù)的技術(shù)使用者：安徽焦甜香生物科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/11/18