本發(fā)明涉及農(nóng)藥檢測，特別是涉及一種ache@aunps固定化酶紙芯片及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、農(nóng)藥殘留檢測作為食品安全的重要環(huán)節(jié)，近年來受到了廣泛的關(guān)注，農(nóng)藥殘留量高效、快速檢測成為了許多學(xué)者的研究熱點(diǎn)。農(nóng)藥殘留的檢測方法種類繁多，目前普遍使用色譜法、酶聯(lián)免疫分析法、生物傳感器法、酶抑制法等，這些方法在農(nóng)藥定性、定量檢測發(fā)方面發(fā)揮了重大作用。色譜法是一種用途廣泛、分離效率高、分析速度快、靈敏度好且易于純化的檢測方法，但是均存在著樣品前處理復(fù)雜、儀器設(shè)備昂貴、分析費(fèi)時(shí)長、要求技術(shù)人員專業(yè)水平高等問題，不能滿足樣品現(xiàn)場快速檢測的要求。酶聯(lián)免疫分析法所需設(shè)備簡單，對于液體食品可以不用前處理就可檢測，固體樣品可以在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)多批次樣品檢測，很適合農(nóng)藥殘留現(xiàn)場檢測，但是這種方法存在以下缺點(diǎn)：儀器體積較大、樣品本身的基質(zhì)干擾大、測定小分子物質(zhì)時(shí)精密度較低。生物傳感器法選擇性高、操作簡單、響應(yīng)速度快，但是這種方法對儀器設(shè)備要求較高，檢測成本高，選擇性也不好。酶抑制法簡便、快捷、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，但是這種方法在定性定量上不夠理想，可檢測的農(nóng)藥種類少，適應(yīng)性差，覆蓋面比較窄，而且容易出現(xiàn)假陰性、假陽性現(xiàn)象。可見，目前這些檢測方法在一定程度上可以滿足實(shí)際農(nóng)藥檢測的需求，然而，受到場地、設(shè)備、技術(shù)、成本等因素的限制，這些方法難以滿足大量樣品現(xiàn)場、快速篩查的實(shí)際需求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種ache@aunps固定化酶紙芯片及其制備方法和應(yīng)用，以解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了如下方案：

3、本發(fā)明的技術(shù)方案之一：一種ache@aunps固定化酶紙芯片的制備方法，包括以下步驟：

4、在紙片上滴加haucl4溶液，靜置后滴加還原劑溶液進(jìn)行反應(yīng)，然后滴加表面活性劑溶液和緩沖液，反應(yīng)后得到原位生成納米金的紙芯片；

5、在原位生成納米金的紙芯片上滴加刀豆蛋白a溶液，反應(yīng)后滴加牛血清白蛋白溶液進(jìn)行反應(yīng)，最后滴加ache溶液，反應(yīng)后得到ache@aunps固定化酶體系；

6、所述ache@aunps固定化酶體系和檢測區(qū)構(gòu)成所述ache@aunps固定化酶紙芯片。

7、進(jìn)一步地，所述還原劑溶液包括檸檬酸鈉溶液；所述表面活性劑溶液包括ctab溶液；

8、所述緩沖液為ph＝8，10mmol/l的pbs緩沖液；

9、所述haucl4溶液中的haucl4、還原劑溶液中的還原劑以及表面活性劑溶液中的表面活性劑的摩爾比為6:1:0.3。

10、進(jìn)一步地，滴加還原劑溶液后的反應(yīng)時(shí)間為5min；滴加表面活性劑溶液和緩沖液后的反應(yīng)時(shí)間為15min。

11、進(jìn)一步地，所述haucl4溶液中的haucl4和ache溶液中的ache的用量比為6mmol:50000u；

12、所述刀豆蛋白a溶液中的刀豆蛋白、牛血清白蛋白溶液中的牛血清白蛋白以及ache溶液中的ache的用量比為1.1mg:5mg:10u。

13、進(jìn)一步地，滴加刀豆蛋白a溶液后的反應(yīng)時(shí)間為60～120min；滴加牛血清白蛋白溶液后的反應(yīng)時(shí)間為15min；滴加ache溶液后的反應(yīng)時(shí)間為30～150min。

14、更進(jìn)一步地，滴加刀豆蛋白a溶液后的反應(yīng)時(shí)間為110min；滴加牛血清白蛋白溶液后的反應(yīng)時(shí)間為15min；滴加ache溶液后的反應(yīng)時(shí)間為90min。

15、本發(fā)明的技術(shù)方案之二：一種上述制備方法制備的ache@aunps固定化酶紙芯片。

16、本發(fā)明的技術(shù)方案之三：一種上述ache@aunps固定化酶紙芯片在檢測抑制ache活性的農(nóng)藥中的應(yīng)用。

17、本發(fā)明的技術(shù)方案之四：一種抑制ache活性的農(nóng)藥的檢測方法，包括以下步驟：

18、在上述ache@aunps固定化酶紙芯片的ache@aunps固定化酶體系上滴加顯色反應(yīng)底物和抑制ache活性的農(nóng)藥，反應(yīng)后與檢測區(qū)連接，然后在檢測區(qū)滴加顯色劑進(jìn)行顯色反應(yīng)，最后根據(jù)顯色程度確定rgb值，并根據(jù)rgb值計(jì)算得到抑制ache活性的農(nóng)藥的含量；

19、所述顯色反應(yīng)底物為atch；所述顯色劑為5,5’-二硫代二(2-硝基苯甲酸)(dtnb)。

20、進(jìn)一步地，所述抑制ache活性的農(nóng)藥包括有機(jī)磷類農(nóng)藥。

21、更進(jìn)一步地，所述抑制ache活性的農(nóng)藥包括馬拉硫磷、樂果等小分子物質(zhì)。

22、更進(jìn)一步地，當(dāng)制備ache@aunps固定化酶紙芯片采用的ache溶液的濃度為10u/ml、用量為6.0μl時(shí)，顯色反應(yīng)底物溶液的濃度為8.65mmol/l、用量為3～8μl。

23、更進(jìn)一步地，當(dāng)制備ache@aunps固定化酶紙芯片采用的ache溶液的濃度為10u/ml、用量為5.0μl時(shí)，顯色反應(yīng)底物溶液的用量為6μl，濃度為5.19～12.10mmol/l。

24、ache@aunps固定化酶紙芯片檢測有機(jī)磷類農(nóng)藥的原理：

25、在一定條件下，有機(jī)磷類農(nóng)藥對ache的活性具有抑制作用，抑制程度與農(nóng)藥濃度呈正相關(guān)。本發(fā)明是以ache和aunps固定化酶為反應(yīng)體系，以atch作為酶顯色反應(yīng)底物，dtnb作顯色劑進(jìn)行顯色反應(yīng)。當(dāng)樣品中不含有目標(biāo)農(nóng)藥時(shí)，ache正常催化atch(碘化乙酰硫代膽堿)水解生成硫代膽堿(tch)，硫代膽堿(tch)與顯色劑dtnb發(fā)生顯色反應(yīng)，顏色從無色變?yōu)辄S色(底物atch顯色原理圖見圖1)；反之，若樣品中含有目標(biāo)農(nóng)藥，則ache活性受到抑制，產(chǎn)物量減少甚至無產(chǎn)物生成。讀取反應(yīng)后rgb值，計(jì)算酶抑制率來定量分析樣品中農(nóng)藥殘留。

26、本發(fā)明公開了以下技術(shù)效果：

27、(1)本發(fā)明ache@aunps固定化酶紙芯片具有制備成本低、使用便攜、檢測快速、結(jié)果分明、無需使用高端設(shè)備、對技術(shù)人員要求低等優(yōu)點(diǎn)。

28、(2)本發(fā)明的ache@aunps固定化酶紙芯片既具有類酶活性，又具有納米材料性能的雙重特性，可以提高酶分子的穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)對農(nóng)藥更靈敏、精確的檢測。

29、(3)本發(fā)明ache@aunps固定化酶紙芯片具有檢測準(zhǔn)確性好、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好等特性，可用于蔬菜、水果中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的檢測。

技術(shù)特征：

1.一種ache@aunps固定化酶紙芯片的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述還原劑溶液包括檸檬酸鈉溶液；所述表面活性劑溶液包括ctab溶液；

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，滴加還原劑溶液后的反應(yīng)時(shí)間為5min；滴加表面活性劑溶液和緩沖液后的反應(yīng)時(shí)間為15min。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述haucl4溶液中的haucl4和ache溶液中的ache的用量比為6mmol:50000u；

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，滴加刀豆蛋白a溶液后的反應(yīng)時(shí)間為60～120min；滴加牛血清白蛋白溶液后的反應(yīng)時(shí)間為15min；滴加ache溶液后的反應(yīng)時(shí)間為30～150min。

6.一種權(quán)利要求1～5任一項(xiàng)所述的制備方法制備的ache@aunps固定化酶紙芯片。

7.一種權(quán)利要求6所述的ache@aunps固定化酶紙芯片在檢測抑制ache活性的農(nóng)藥中的應(yīng)用。

8.一種抑制ache活性的農(nóng)藥的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的檢測方法，其特征在于，所述抑制ache活性的農(nóng)藥包括有機(jī)磷類農(nóng)藥。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種AChE@AuNPs固定化酶紙芯片及其制備方法和應(yīng)用，屬于農(nóng)藥檢測技術(shù)領(lǐng)域。AChE@AuNPs固定化酶紙芯片的制備方法，包括以下步驟：在紙片上滴加HAuCl<subgt;4</subgt;溶液，靜置后滴加還原劑溶液進(jìn)行反應(yīng)，然后滴加表面活性劑溶液和緩沖液，反應(yīng)后得到原位生成納米金的紙芯片；在原位生成納米金的紙芯片上滴加刀豆蛋白A溶液，反應(yīng)后滴加牛血清白蛋白溶液進(jìn)行反應(yīng)，最后滴加AChE溶液，反應(yīng)后得到AChE@AuNPs固定化酶體系；AChE@AuNPs固定化酶體系和檢測區(qū)構(gòu)成AChE@AuNPs固定化酶紙芯片。本發(fā)明AChE@AuNPs固定化酶紙芯片具有制備成本低、使用便攜、檢測快速、結(jié)果分明等優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)研發(fā)人員：張劍,劉春葉,王璐,馮永輝,張博,賀茂芳,鄭志鴻
受保護(hù)的技術(shù)使用者：西安醫(yī)學(xué)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/11/18