nkg2a在檢測小鼠人源腫瘤模型中人nk細(xì)胞中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
1.本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及nkg2a在檢測小鼠人源腫瘤模型中人nk細(xì)胞中的應(yīng)用。


背景技術(shù)：

2.nk細(xì)胞一般指自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，nk)，是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，其胞漿豐富，含有較大的嗜天青顆粒，顆粒的含量與nk細(xì)胞的殺傷活性呈正相關(guān)，以分泌穿孔素及腫瘤壞死因子，摧毀目標(biāo)細(xì)胞。nk細(xì)胞不僅與抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調(diào)節(jié)有關(guān)，而且在某些情況下參與超敏反應(yīng)和自身免疫性疾病的發(fā)生，能夠識別靶細(xì)胞、殺傷介質(zhì)。常見的nk細(xì)胞有外周血來源的nk細(xì)胞、臍血來源的nk細(xì)胞以及hpsc分化而來的nk細(xì)胞等。
3.nk細(xì)胞不表達(dá)基因重排的抗原特異性受體，而是依賴一系列種系基因編碼的受體。nk細(xì)胞表面活化性受體(nkp46，nkp44、nkp30、nkg2d等)或抑制性受體(nkg2a、tigit、人抑制性kir、小鼠ly49受體等)。nkg2家族蛋白是復(fù)雜的受體-配體信號網(wǎng)絡(luò)中的一類受體，兼具抑制性和激活性，是開發(fā)免疫檢查點(diǎn)抑制劑非常有吸引力的靶點(diǎn)。nkg2蛋白是c型凝集素，可與細(xì)胞表面的cd94二聚。nkg2a是nkg2家族中的“抑制性”成員，表達(dá)在cd56hi nk細(xì)胞、nkt細(xì)胞和cd8+αβt細(xì)胞一個亞群中。
4.隨著nk細(xì)胞研究的不斷深入，近年來nk細(xì)胞已逐漸廣泛應(yīng)用到臨床，但是目前現(xiàn)有技術(shù)研究領(lǐng)域中，眾多研究主要集中在如何獲得有活性的nk細(xì)胞、nk功能研究、nk細(xì)胞擴(kuò)增等方面，而對于獲得的nk細(xì)胞輸注入治療體后，在生物體組織中檢測nk細(xì)胞的方法卻少有報道，因此研究輸注體內(nèi)的治療性nk細(xì)胞的存留時間、體內(nèi)組織分布等藥物代謝研究內(nèi)容也就很少。
5.細(xì)胞治療類藥物，研究其在體內(nèi)藥代動力學(xué)是判斷其療效和毒副作用必不可少的環(huán)節(jié)。不同于傳統(tǒng)的藥物，對于細(xì)胞治療藥物進(jìn)入體內(nèi)后的動態(tài)變化規(guī)律，包括吸收、分布、代謝和排泄的過程和特征，目前國際上也未建立明確的體內(nèi)藥代動力學(xué)研究方法。
6.非臨床藥代動力學(xué)研究，特別是動物實驗，在新藥研發(fā)的評價過程中通過研究其在體內(nèi)的動態(tài)，預(yù)測治療方案，對降低細(xì)胞治療的不確定性、增加療效和減少毒副作用，都有很大的幫助。nk細(xì)胞是一種治療性細(xì)胞藥物，因此在藥物開發(fā)中要明確藥物代謝動力學(xué)等相關(guān)研究資料，因此需要研究藥物進(jìn)入生物體后分布。nk細(xì)胞是淋巴細(xì)胞中的免疫細(xì)胞之一，是一種具有強(qiáng)大細(xì)胞殺傷能力的細(xì)胞。通常nk細(xì)胞在人體內(nèi)巡邏，發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞或被病毒感染的異常細(xì)胞時就會發(fā)動攻擊，給t細(xì)胞等其他細(xì)胞攻擊癌細(xì)胞爭取時間。但是nk細(xì)胞僅占10％，所以可以通過增加nk細(xì)胞的數(shù)量來控制癌細(xì)胞的增長。目前nk細(xì)胞療法是最被看好的種子選手，并且科學(xué)家們不斷研究、拓展nk細(xì)胞療法。nk細(xì)胞作為機(jī)體固有免疫系統(tǒng)中重要的組成部分，在腫瘤免疫方面發(fā)揮重要作用?，F(xiàn)在研究領(lǐng)域中，已經(jīng)有了即用型的nk細(xì)胞藥物，但是更多的研究還需要開展，目前研究的還不徹底，部分在臨床階段。
7.探究輸注生物體內(nèi)的nk細(xì)胞的組織分布、動態(tài)變化對后續(xù)科學(xué)研究及其臨床具有
重要意義。因此建立檢測生物體組織中異體nk細(xì)胞的方法對nk細(xì)胞及其臨床研究具有重要意義。
8.目前，研究細(xì)胞在實驗動物中非臨床藥代動力學(xué)研究的方法主要有動物活體成像(如熒光蛋白標(biāo)記，熒光素、fe離子等標(biāo)記細(xì)胞)、免疫組化、qpcr等。其中熒光蛋白標(biāo)記細(xì)胞在動物活體成像中應(yīng)用比較廣泛，但在非臨床評價中需使用與臨床用相同生產(chǎn)工藝的細(xì)胞，無法使用熒光蛋白標(biāo)記的細(xì)胞；nk細(xì)胞進(jìn)入小鼠體內(nèi)后，會持續(xù)擴(kuò)增比較長的時間，熒光素、fe離子等方法標(biāo)記細(xì)胞后，會隨著細(xì)胞的擴(kuò)增而逐漸稀釋，且細(xì)胞死亡后殘留的熒光素、fe離子會在體內(nèi)殘留比較長的時間，因此無法真實的反映細(xì)胞在體內(nèi)的存留情況。而相比于免疫組化，qpcr法通過在實驗中檢測受試體的血液或組織中的dna或rna表達(dá)來實現(xiàn)人源細(xì)胞在動物中的更高靈敏度的限量分析，操作相對簡單、省時。雖然現(xiàn)有技術(shù)中報道過一些區(qū)分人與不同動物的dna序列，但無法應(yīng)用于無基因編輯的人源細(xì)胞在有人源腫瘤動物體內(nèi)的組織分布研究，因為這些人特異性的dna序列無法區(qū)分治療用人源細(xì)胞和人源腫瘤細(xì)胞。因此需要建立一種靈敏度更高、準(zhǔn)確性更高，更廣泛適合于nk細(xì)胞治療中非臨床藥代動力學(xué)研究的方法。


技術(shù)實現(xiàn)要素：

9.有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種nkg2a在檢測小鼠人源腫瘤模型中人nk細(xì)胞中的應(yīng)用，nkg2a能夠區(qū)分小鼠荷瘤腫瘤模型中人源細(xì)胞(nk細(xì)胞)和人源腫瘤細(xì)胞，更有利于非臨床藥代動力學(xué)的研究，且檢測方法更準(zhǔn)確，靈敏度高、檢測時間短。
10.本發(fā)明提供了nkg2a在檢測小鼠人源腫瘤模型中人nk細(xì)胞中的應(yīng)用。
11.優(yōu)選的，所述nkg2a包括nkg2a蛋白、nkg2a基因和nkg2a的編碼序列中任意一種。
12.優(yōu)選的，所述nkg2a的編碼序列的核苷酸序列包括以下一種dna片段；
13.1)核苷酸序列如seq id no:1所示的dna片段；
14.2)在seq id no:1的基礎(chǔ)上截取15％以上長度的dna片段。
15.優(yōu)選的，所述nkg2a的編碼序列的核苷酸序列如seq id no:2所示。
16.優(yōu)選的，所述檢測包括利用qpcr技術(shù)檢測nkg2a基因表達(dá)水平和利用免疫印跡檢測nkg2a蛋白表達(dá)水平。
17.優(yōu)選的，所述利用qpcr技術(shù)檢測nkg2a基因表達(dá)水平的試劑包括特異性擴(kuò)增nkg2a基因的引物對nkg2a-f1/nkg2a-r1。
18.優(yōu)選的，所述nkg2a-f1的核苷酸序列如seq id no:3所示；
19.所述nkg2a-r1的核苷酸序列如seq id no:4所示。
20.本發(fā)明提供了檢測nkg2a表達(dá)量的試劑在制備區(qū)分人nk細(xì)胞和人腫瘤細(xì)胞的試劑盒中的應(yīng)用。
21.本發(fā)明提供了一種用于檢測小鼠荷瘤腫瘤模型中人nk細(xì)胞的試劑盒，包括特異性擴(kuò)增nkg2a基因的引物對nkg2a-f1/nkg2a-r1或能特異性結(jié)合nkg2a蛋白的抗體或適配體。
22.本發(fā)明提供了一種適合于nk細(xì)胞治療中非臨床藥代動力學(xué)研究的方法，包括以下步驟：
23.以nkg2a蛋白、nkg2a基因和nkg2a的編碼序列中任意一種作為檢測靶點(diǎn)，檢測待測樣品的表達(dá)量。
24.優(yōu)選的，采用所述應(yīng)用中特異性擴(kuò)增nkg2a基因的引物對通過qpcr技術(shù)檢測待測樣品中nkg2a基因的表達(dá)量。
25.本發(fā)明提供了nkg2a在檢測小鼠人源腫瘤模型中人nk細(xì)胞中的應(yīng)用。本發(fā)明首先檢測候選特異性基因cd2、nkg2a、nkp46在nk細(xì)胞、molm13細(xì)胞中的表達(dá)水平，結(jié)果表明nkg2a和nkp46僅在人nk細(xì)胞中表達(dá)，而不會在molm13細(xì)胞中表達(dá)。進(jìn)一步篩選發(fā)現(xiàn)，nkg2a和nkp46在小鼠組織和molm13中均不表達(dá)，nkg2a僅在人nk細(xì)胞中表達(dá)，并且nkg2a比nkp46的檢測靈敏度更低?？梢?，采用nkg2a片段作為檢測靶點(diǎn)，可以在實驗小鼠荷瘤腫瘤模型中區(qū)分人源細(xì)胞(nk細(xì)胞)和人源腫瘤細(xì)胞，有利于非臨床藥代動力學(xué)的研究。
26.進(jìn)一步的，本發(fā)明提供的應(yīng)用具體限定了檢測方法。所述應(yīng)用能夠在短時間內(nèi)進(jìn)行檢測，檢測時間可以縮短為5-6小時即可完成，大大提高了檢測效率、準(zhǔn)確度和靈敏度(0.01％)；本發(fā)明在檢測時，僅需要編碼序列提取、反轉(zhuǎn)錄以及qpcr試劑，成本低；并且由于nkg2a是nk細(xì)胞特異表達(dá)的基因，使本發(fā)明的檢測方法具有準(zhǔn)確性高的特點(diǎn)；同時本發(fā)明提供的應(yīng)用為非臨床藥代動力學(xué)研究，特別是動物實驗，在細(xì)胞治療研發(fā)的過程中探究其體內(nèi)的動態(tài)，預(yù)測治療方案，對降低細(xì)胞治療的不確定性、增加療效和減少毒副作用，有很大的幫助，具有重要的臨床指導(dǎo)意義。
附圖說明
27.圖1為含有nkg2a、nkp46標(biāo)記基因的質(zhì)粒dna標(biāo)準(zhǔn)品的結(jié)構(gòu)圖；
28.圖2為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品δct平均值線性分析圖；
29.圖3為細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)品δct平均值線性分析圖。
具體實施方式
30.本發(fā)明提供了nkg2a在檢測小鼠人源腫瘤模型中人nk細(xì)胞中的應(yīng)用。
31.在本發(fā)明中，所述nkg2a優(yōu)選包括nkg2a蛋白、nkg2a基因和nkg2a的編碼序列中任意一種。本發(fā)明對所述nkg2a蛋白、nkg2a基因的序列沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域所熟知的nkg2a蛋白、nkg2a基因的序列即可。所述nkg2a的編碼序列的核苷酸序列優(yōu)選包括以下一種dna片段；
32.1)核苷酸序列如seq id no:1所示的dna片段；
33.2)在seq id no:1的基礎(chǔ)上截取15％以上長度的dna片段。在本發(fā)明實施例中，通過檢測seq id no:2(agctccattttagcaactgaacaggaaataacctatgcggaattaaaccttcaaaaagcttctcaggattttcaagggaatgacaaaacctatcactgcaaagatttaccatcagctccagagaagctcattgttgggatcctgggaattatctgtcttatcttaatggcctctgtggtaacgatagttg)所示的nkg2a編碼序列的表達(dá)量來說明nkg2a在人nk細(xì)胞中高特異性表達(dá)。
34.在本發(fā)明中，所述檢測優(yōu)選包括利用qpcr技術(shù)檢測nkg2a基因表達(dá)水平和利用免疫印跡檢測nkg2a蛋白表達(dá)水平。所述利用qpcr技術(shù)檢測nkg2a基因表達(dá)水平的試劑優(yōu)選包括特異性擴(kuò)增nkg2a基因的引物對nkg2a-f1和nkg2a-r1。所述nkg2a-f1核苷酸序列如seq id no:3(agctccattttagcaactgaaca)所示；nkg2a-r1核苷酸序列如seq id no:4(caactatcgttaccacagaggc)所示。引物對nkg2a-f1/nkg2a-r1所得擴(kuò)增片段如seq id no:2所示。所述qpcr技術(shù)檢測程序優(yōu)選如下：94℃30s；94℃5min，60℃15s，72℃10s，40循環(huán)。所
述免疫印跡檢測蛋白表達(dá)水平的方法沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域所熟知的免疫印跡方法即可。在qpcr檢測時，內(nèi)參基因優(yōu)選為gapdh。所述gapdh的擴(kuò)增引物優(yōu)選包括gapdh-f1和gapdh-r1。gapdh-f1的核苷酸序列如seq id no:5所示。gapdh-r1的核苷酸序列如seq id no:6所示。
35.本發(fā)明實施例中，采用qpcr技術(shù)檢測nkg2a基因表達(dá)水平證明nkg2a基因僅在人nk細(xì)胞中表達(dá)，而不在人腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，因此，可以作為區(qū)分人nk細(xì)胞和人腫瘤細(xì)胞的檢測靶點(diǎn)。鑒于qpcr技術(shù)檢測nkg2a基因僅特異性在人nk細(xì)胞中表達(dá)，能夠合理推知基因表達(dá)的產(chǎn)物蛋白僅在人nk細(xì)胞中表達(dá)，不在人腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，因此，通過檢測nkg2a蛋白的表達(dá)量也能夠?qū)崿F(xiàn)區(qū)分人nk細(xì)胞和人腫瘤細(xì)胞的目的。
36.本發(fā)明提供了檢測nkg2a表達(dá)量的試劑在制備區(qū)分人nk細(xì)胞和人腫瘤細(xì)胞的試劑盒中的應(yīng)用。所述試劑包括特異性擴(kuò)增nkg2a基因的引物或特異性結(jié)合nkg2a蛋白的抗體或適配體。在本發(fā)明實施例中，以特異性擴(kuò)增nkg2a基因的引物為例加以說明，但不能理解為對本發(fā)明的限制。
37.本發(fā)明提供了一種用于檢測小鼠荷瘤腫瘤模型中人nk細(xì)胞的試劑盒，包括特異性擴(kuò)增nkg2a基因的引物對nkg2a-f1和nkg2a-r1或特異性結(jié)合nkg2a蛋白的抗體或適配體。所述引物對nkg2a-f1和nkg2a-r1同上述記載，在此不做贅述。本發(fā)明對所述特異性結(jié)合nkg2a蛋白的抗體或適配體的來源不做特殊限制，采用本領(lǐng)域所熟知的能夠特異性結(jié)合nkg2a蛋白的抗體或適配體即可。所述試劑盒根據(jù)檢測原理的不同包括不同種類的試劑。當(dāng)試劑盒包括引物對nkg2a-f1和nkg2a-r1時，所述試劑盒優(yōu)選還包括qpcr擴(kuò)增用試劑和反轉(zhuǎn)錄試劑。當(dāng)試劑盒包括nkg2a蛋白的抗體，所述試劑盒包括免疫印跡用試劑。本發(fā)明對所述試劑盒的使用方法沒有特殊限制，按照本領(lǐng)域所熟知的qpcr法操作或根據(jù)常規(guī)的免疫印跡檢測方法即可。
38.本發(fā)明提供了一種適合于nk細(xì)胞治療中非臨床藥代動力學(xué)研究的方法，包括以下步驟：
39.以nkg2a蛋白、nkg2a基因和nkg2a的編碼序列中任意一種作為檢測靶點(diǎn)，檢測待測樣品的表達(dá)量。
40.在本發(fā)明中，經(jīng)檢測nkg2a基因的檢測靈敏度為0.01％(nk細(xì)胞數(shù)占比)。
41.在本發(fā)明中，所述檢測待測樣品的表達(dá)量的方法沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域所熟知的基于蛋白、基因以及編碼序列的表達(dá)量的檢測方法即可，例如rt-qpcr、免疫印跡或酶聯(lián)免疫法等。當(dāng)檢測nkg2a基因表達(dá)量時，優(yōu)選構(gòu)建含nkg2a基因片段的重組載體。本發(fā)明對構(gòu)建nkg2a基因片段的重組載體的方法沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域所熟知的重組載體的構(gòu)建方法即可。
42.在本發(fā)明中，nkp46(基因、編碼序列或蛋白)在僅在人nk細(xì)胞中表達(dá)，不在人腫瘤細(xì)胞和小鼠體內(nèi)表達(dá)，因此，本發(fā)明將nkg2a聯(lián)合nkp46在區(qū)分人nk細(xì)胞和人腫瘤細(xì)胞中應(yīng)用，用于非臨床藥代動力學(xué)的研究。nkp46基因表達(dá)量的擴(kuò)增引物對包括nkp46-f1/nkp46-r1和nkp46-f2/nkp46-r2。所述nkp46-f1的核苷酸序列如seq id no:7(tggacccgaagtgatctcg)所示。nkp46-r1的核苷酸序列如seq id no:8(tccttgagcagtaagaacatgc)所示。所述nkp46-f2的核苷酸序列如seq id no:9(ccaccgagggacataccgat)所示。nkp46-r2的核苷酸序列如seq id no:10
(gtgcaaggctggtgttctca)所示。其中引物對nkp46-f1/nkp46-r1擴(kuò)增nkp46基因所得擴(kuò)增片段如seq id no:11(tggacccgaagtgatctcgggagagaaggtgaccttctactgccgtctagacactgcaacaagcatgttcttactgctcaagga)所示。nkp46-f2/nkp46-r2擴(kuò)增nkp46基因所得擴(kuò)增片段如seq id no:12(ccaccgagggacataccgatgttttggctcctataacaaccatgcctggtctttccccagtgagccagtgaagctcctggtcacaggcgacattgagaacaccagccttgcac)所示。將nkg2a聯(lián)合nkp46在區(qū)分人nk細(xì)胞和人腫瘤細(xì)胞中應(yīng)用，有利于提高區(qū)分的準(zhǔn)確性，同時為非臨床藥代動力學(xué)研究提供了重要指導(dǎo)意義。
43.下面結(jié)合實施例對本發(fā)明提供的nkg2a基因在檢測小鼠人源腫瘤模型中人nk細(xì)胞中的應(yīng)用進(jìn)行詳細(xì)的說明，但是不能把它們理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。
44.以下對本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。除非另有限定，本文中所使用的的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所述技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。如本文所述的術(shù)語
‘
dna序列’中是指編碼蛋白的dna序列，例如，但不限于，存在于細(xì)胞基因組中的編碼蛋白的dna序列。
45.以下實施例中，總mrna的提取方法，總mrna的逆轉(zhuǎn)錄以及qpcr檢測涉及的試劑，rna抽提試劑盒購自tiangen生物公司；rna逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自：vazyme(諾唯贊)公司；qpcr試劑盒購自：transgene(北京全式金生物技術(shù)有限公司)。molm13細(xì)胞購自于南京科佰生物科技有限公司。pbnk、ink來自于安徽中盛溯源生物科技有限公司，其中ink參見cn202010153358.3制備方法，pbnk來自于本領(lǐng)域常規(guī)制備方法獲得。其中本發(fā)明所述的小鼠荷瘤腫瘤模型中檢測人nk細(xì)胞方法不僅適用于上述制備方法獲得的pbnk/ink細(xì)胞，還適用于本領(lǐng)其他方法獲得的pbnk/ink細(xì)胞。小鼠購自于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。實施例中涉及的引物在南京金斯瑞公司合成。質(zhì)粒來自南京金斯瑞公司合成，其合成方法為本領(lǐng)域技術(shù)常規(guī)技術(shù)。
46.其中本技術(shù)中所述的人胚胎干細(xì)胞來源的nk細(xì)胞，如涉及人胚胎干細(xì)胞，其是未經(jīng)過體內(nèi)發(fā)育的受精14天以內(nèi)的人類胚胎分離或者獲取干細(xì)胞，以及是經(jīng)過商業(yè)化獲批的胚胎干細(xì)胞或干細(xì)胞。
47.實施例1
48.候選基因的篩選
49.1、篩選候選基因：通過ncbi官方網(wǎng)址，檢索nk細(xì)胞和molm13細(xì)胞的表達(dá)譜，篩選一系列基因在人體nk細(xì)胞中高表達(dá)，molm13細(xì)胞(人腫瘤細(xì)胞)不表達(dá)或者極少數(shù)細(xì)胞中表達(dá)的基因。
50.檢測候選特異性基因cd2、nkg2a、nkp46在nk細(xì)胞、molm13細(xì)胞中的表達(dá)水平。
51.首先利用tiangen rna抽提試劑盒(rnaprep pure cell/bacteria kit，#dp403)對nk細(xì)胞、molm13細(xì)胞樣本進(jìn)行總mrna的提??；按照2ug rna的量，通過vazyme rna逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(hiscript ii q rt supermix for qprc，#r223-01)將mrna逆轉(zhuǎn)錄為cdna，最后按照transgege qpcr試劑盒(top green qpcr supermix，#aq131)，通過rt-qpcr檢測方法檢測nk細(xì)胞、molm13細(xì)胞中cd2、nkg2a、nkp46基因的表達(dá)，反應(yīng)體系見表1。用于擴(kuò)增三個基因的引物序列見表2。
52.表1 rt-qpcr反應(yīng)體系
[0053][0054][0055]
表2設(shè)計引物序列表
[0056]
引物名稱序列序列編號cd2-f1tcaagagagggtctcaaaaccaseq id no:13cd2-r1ccattcattacctcacaggtcagseq id no:14cd2-f2acctgtgaggtaatgaatggaacseq id no:15cd2-r2gtggtccacttgtgtgtgatgseq id no:16cd2-f3agcctgagtgcaaaattcaagtseq id no:17cd2-r3aaaacgagcagtgccacaaagseq id no:18nkg2a-f1agctccattttagcaactgaacaseq id no:3nkg2a-r1caactatcgttaccacagaggcseq id no:4nkp46-f1tggacccgaagtgatctcgseq id no:7nkp46-r1tccttgagcagtaagaacatgcseq id no:8nkp46-f2ccaccgagggacataccgatseq id no:9nkp46-r2gtgcaaggctggtgttctcaseq id no:10
[0057]
使用qpcr試劑盒(transgene，#aq131)進(jìn)行qpcr，所有操作在冰上進(jìn)行。反應(yīng)體系為每孔10μl，具體反應(yīng)體系配制如表1，每個樣本設(shè)3個復(fù)孔，qpcr條件：94℃30s；94℃5s,60℃15s，72℃10，40循環(huán)，記錄ct值。
[0058]
通過rt-qpcr檢測結(jié)果如表3所示，可以看出：nkg2a和nkp46-1和nkp46-2在molm13上沒有擴(kuò)增，在ink和pbnk中均有擴(kuò)增；雖然cd2的3對引物也在molm13中沒有擴(kuò)增，但在pbnk和ink中的擴(kuò)增ct值差異太大。
[0059]
表3 rt-qpcr檢測結(jié)果
[0060]
[0061][0062]
實施例2
[0063]
將篩選獲得的基因nkg2a和nkp46在小鼠組織、molm13細(xì)胞和nk細(xì)胞中的表達(dá)情況。
[0064]
小鼠組織制備：提前準(zhǔn)備好研缽和液氮；將新鮮試驗小鼠脾臟取出后直接放在倒有液氮的研缽中，邊研磨邊加液氮，保持液氮一直存在；將研磨好的脾臟組織粉末分裝到2個1.5ml eb管中；立即一支加入1ml trizol，另一支加入700μl dp430試劑盒的裂解液，充分渦旋裂解，5min(2種rna提取方法)，兩種提取方法如表4。
[0065]
表4小鼠組織2種rna提取方法
[0066]
樣本提取方法洗脫體積洗脫濃度(ng/μl)260/280260/2301/2小鼠脾臟粉末dp43030μl1239.42.142.021/2小鼠脾臟粉末trizol50μl13042.052.05
[0067]
然后按照上述方法進(jìn)行rna抽提、逆轉(zhuǎn)錄為cdna和rt-qpcr操作。使用引物與上述對應(yīng)引物相同。
[0068]
通過rt-qpcr檢測結(jié)果如表5所示，通過表5可知，確定三對引物都是能夠擴(kuò)增nk細(xì)胞的特異性引物，且在小鼠組織和molm13中均不表達(dá)。
[0069]
表5 rt-qpcr檢測結(jié)果
[0070]
[0071][0072]
備注：ct值大于/等于35視為不表達(dá)。
[0073]
實施例3
[0074]
質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品、細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)品制備及檢測限確定
[0075]
1.質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的配制
[0076]
本實施例中，載體質(zhì)粒為puc57；puc57作為一種常用的載體質(zhì)粒，其不與nkg2a、nkp46等基因引物產(chǎn)生特異性結(jié)合，使檢測更準(zhǔn)確。采用載體質(zhì)粒制備含有nkg2a、nkp46標(biāo)記基因結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒dna作為標(biāo)準(zhǔn)品，該標(biāo)準(zhǔn)品的結(jié)構(gòu)如圖1所示。質(zhì)粒合成3對引物的擴(kuò)增序列如表6所示。
[0077]
表6質(zhì)粒合成3對引物
[0078]
[0079][0080]
將三對引物擴(kuò)增序列首尾相連形成融合基因(seq id no:19，agctccattttagcaactgaacaggaaataacctatgcggaattaaaccttcaaaaagcttctcaggattttcaagggaatgacaaaacctatcactgcaaagatttaccatcagctccagagaagctcattgttgggatcctgggaattatctgtcttatcttaatggcctctgtggtaacgatagttgtggacccgaagtgatctcgggagagaaggtgaccttctactgccgtctagacactgcaacaagcatgttcttactgctcaaggaccaccgagggacataccgatgttttggctcctataacaaccatgcctggtctttccccagtgagccagtgaagctcctggtcacaggcgacattgagaacaccagccttgcac)克隆到puc57載體質(zhì)粒中(南京金斯瑞公司)：
[0081]
標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：取出puc57-nk質(zhì)粒(注:puc57-nk儲存濃度為100ng/μl)。將質(zhì)粒稀釋成6.79ng/ul的濃度。再按表7將puc57-nk質(zhì)粒用nuclease-free h2o稀釋成濃度梯度，作為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品樣本，并做好標(biāo)記：“質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品溶液#1-8”。注：質(zhì)?？截悢?shù)是根據(jù)puc57-nk質(zhì)粒堿基數(shù)(3097bp)按以下公式i計算得出：
[0082]
(6.02
×
10
23
)
×
(ng
×
10-9
)/(dna length
×
660)＝copies
???????
公式i
[0083]
表7質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品樣本的準(zhǔn)備
[0084][0085]
按表8將對照組小鼠組織cdna和nk細(xì)胞cdna混合成相應(yīng)百分比的細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)品樣本，并做好標(biāo)記：“細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)品溶液#1-5”。
[0086]
表8細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)品樣本的準(zhǔn)備
[0087]
樣品編號nk比例對照組小cdna體積nk細(xì)胞cdna體積#10.001％90μl10μl#2#20.01％90μl10μl#3#30.1％90μl10μl#4#41％99μl1μl#5#5100％-100μl
[0088]
按表9將各cdna樣本分別稀釋成最終rt-qpcr模板。
[0089]
表9樣品模板的準(zhǔn)備
[0090]
[0091][0092]
使用qpcr試劑盒(transgene，#aq131)對上述表9試樣進(jìn)行qpcr，所有操作在冰上進(jìn)行。反應(yīng)體系為每孔10μl，具體反應(yīng)體系配制如表1，每個樣本設(shè)3個復(fù)孔，引物信息見表10。gadph為本領(lǐng)域常規(guī)應(yīng)用內(nèi)參基因。
[0093]
表10引物信息
[0094][0095]
表11質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品、細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)品qpcr檢測結(jié)果
[0096]
[0097]
[0098][0099]
根據(jù)表11中qpcr檢測結(jié)果的ct值，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品δct平均值計算如表12，同時針對不同濃度下對應(yīng)的δct做線性分析，結(jié)果如圖2所示，當(dāng)選用6個及以上梯度濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品做線性分析時，其線性r2總是小于0.99(圖2)，當(dāng)選用5個及以下梯度濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品做線性分析時，其線性r2可以呈現(xiàn)大于0.99(見圖3)，因此選用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品#4時的δct作為判斷nkg2a引物的最低檢測量的標(biāo)準(zhǔn)，即為δct值《19.55時，判定有nk細(xì)胞存在并可被檢測。
[0100]
表12質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品δct
[0101]
名稱δct質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品#1(0)21.95質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品#2(10)21.26質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品#3(100)20.51質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品#4(103)19.55質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品#5(104)17.405質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品#6(105)14.10667質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品#7(106)10.84667質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品#8(107)7.58
[0102]
細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)品δct平均值計算如表13，根據(jù)δct值《19.55，得出nk細(xì)胞檢測下限是細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)品#2(0.01％)。
[0103]
表13細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)品δct
[0104]
細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)品δct細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)品#1(0.001％)20.55細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)品#2(0.01％)19.32細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)品#3(0.1％)16.323細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)品#4(1％)12.382細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)品#5(100％)5.777
[0105]
實施例4
[0106]
小鼠荷瘤腫瘤模型各部位組織中人nk細(xì)胞檢測
[0107]
注入人nk細(xì)胞的小鼠荷瘤腫瘤模型，利用rt-qpcr方法檢測nkg2a基因的表達(dá)來檢測人nk細(xì)胞。實驗組中設(shè)置荷瘤小鼠對照組和荷瘤小鼠治療組，并在注入nk細(xì)胞治療后的4h、2d取小鼠肝、脾、肺，分別檢測這些組織中人nk細(xì)胞的分布情況。
[0108]
按照實施例2記載方法制備質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)品。
[0109]
小鼠組織準(zhǔn)備(制備方法參見實施例1)，抽提rna并逆轉(zhuǎn)成cdna，與h2o按1:1混合，見表9(#10，#11，#12)，檢測方法參見實施例2。
[0110]
通過rt-qpcr檢測方法(方法參見實施例1)檢測細(xì)胞中nkg2a基因的表達(dá)，反應(yīng)體系見表1。所用的nkg2a引物同實施例2，每個樣本重復(fù)檢測3次，結(jié)果見表14。標(biāo)準(zhǔn)品實驗數(shù)據(jù)參見實施例2表11結(jié)果，試驗在同一條件下同一次進(jìn)行。
[0111]
表14待測樣品rt-qpcr檢測結(jié)果
[0112]
[0113][0114]
備注：δct值《19.55時，判定有nk細(xì)胞存在并可被檢測?；蛘邫z測ct值判斷，當(dāng)實驗組小于對照組時，也可認(rèn)為nk細(xì)胞被檢測，有nk細(xì)胞存在。
[0115]
由上述實驗結(jié)果得出：荷瘤小鼠在注射人nk細(xì)胞后，4h時在肝和肺檢測不到，治療2天后能在肝臟和肺臟中檢測到nk細(xì)胞；而在小鼠的脾4h時可以檢測到人nk，2天后未檢測到人nk細(xì)胞。
[0116]
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。