本發(fā)明涉及診斷學(xué)，具體涉及一種基于母體的胎兒外膜滋養(yǎng)層細(xì)胞的胎兒遺傳檢測方法。

背景技術(shù)：

胎兒dna的獲得主要有兩種方式：一是傳統(tǒng)的侵入性方法，包括羊膜穿刺術(shù)(amniocentesis)，絨毛膜取樣(chorionicvillussampling，cvs)，臍血取樣等，這些方法雖能準(zhǔn)確地診斷，但可能造成胎兒損傷，導(dǎo)致產(chǎn)婦流產(chǎn)等不良后果，而且在孕期較晚時間(8～20周，或者更晚)才能檢測；二是非侵入性方法，非侵入性方法獲取胎兒dna的是從母體血漿和循環(huán)的胎兒細(xì)胞，在懷孕的早期，可在母體的血液中檢測到胎兒的遺傳物質(zhì)的一種基于無細(xì)胞的胎兒游離dna(cfdna)開發(fā)的非侵入性診斷策略，然而，根據(jù)研究分析，在妊娠的早期和妊娠晚期，cfdna分別僅占總血漿dna的大約3.4％和6.2％，而且，其含量受到孕婦的年齡，體重，懷孕的時間影響，此外，cfdna是短片段的dna，這對精確的分析來說是很大的挑戰(zhàn)。另外一種技術(shù)是基于母體血液的胎兒有核紅細(xì)胞，以及評估獲取細(xì)胞的核苷酸序列。

在母體樣本中富集胎兒有核紅細(xì)胞的方法中：首先，通過密度梯度離心，去除母體血液中多種無核的細(xì)胞，之后通過親和力的原理富集與純化胎兒有核紅細(xì)胞；例如，有核紅細(xì)胞的前體細(xì)胞表面大量表達(dá)半乳糖分子，其可被凝集素捕獲；此外，可利用細(xì)胞表面特異性的抗原，富集胎兒有核紅細(xì)胞；例如，胎兒有核紅細(xì)胞大量表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶14前體或轉(zhuǎn)鐵蛋白前體。但該細(xì)胞在血液中的含量非常稀少，在10⁶～10⁷的母體細(xì)胞中可能只含有1個胎兒的有核紅細(xì)胞，這對于分離來說，是非常困難，而且這些方法只能在孕期較晚時間(12～26周)才能檢測，存在局限性。評估獲取細(xì)胞的核苷酸序列方法中：評估富集胎兒細(xì)胞的核苷酸序列的包括：靶核苷酸測序方法和基因組dna測序、使用特定的檢測探針與感興趣的序列雜交、細(xì)胞里某些基因rna表達(dá)水平的評估等。

目前廣泛使用的三種檢測方法存在局限性：羊水穿刺術(shù)和絨毛膜絨毛取樣(cvs)技術(shù)具有侵入性，而且在孕期較晚時間(8～20周，或者更晚)才能檢測；胎兒游離dna(cfdna)檢測存在胎兒dna含量過低的問題，而且在孕期較晚時間(12～26周)才能檢測。此外，基于母體血液的胎兒有核紅細(xì)胞的方法，但該細(xì)胞在血液中的含量非常稀少，在10⁶～10⁷的母體細(xì)胞中可能只含有1個胎兒的有核紅細(xì)胞，這對于分離來說，是非常困難。

在胚胎發(fā)育成桑椹胚后，桑椹胚進(jìn)一步發(fā)育，細(xì)胞開始出現(xiàn)分化。聚集在胚胎的一端，個體較大的細(xì)胞，稱為內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(innercellmass，icm)，將來發(fā)育成胎兒的各種組織，而沿透明帶內(nèi)壁擴(kuò)展和排列的，個體較小的細(xì)胞，稱為滋養(yǎng)層細(xì)胞，它們將來發(fā)育成胎膜和胎盤。滋養(yǎng)層細(xì)胞有囊胚外圍的滋養(yǎng)外胚層發(fā)育分化而來，覆蓋于絨毛的表面，內(nèi)層為細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞，外層為合體滋養(yǎng)層細(xì)胞。在胚胎發(fā)育過程中，絨毛表面的細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞不斷增加，逐步發(fā)育成胎膜和胎盤。近年來，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)有少量的滋養(yǎng)層細(xì)胞會遷移到孕婦的子宮頸口。這類細(xì)胞保持與胎兒相同的dna序列，可用于胎兒診斷，但現(xiàn)有技術(shù)中的流程需要將hla-g的抗體與磁珠上的二抗過夜孵育，流程繁瑣，耗時，且存在磁珠表面的二抗與樣本里面的細(xì)胞非特異性結(jié)合，降低檢測的準(zhǔn)確性。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供一種基于母體的胎兒外膜滋養(yǎng)層細(xì)胞的胎兒遺傳檢測方法。本發(fā)明所述方法簡便、快速、特異性高。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)手段為：

一種基于母體的胎兒外膜滋養(yǎng)層細(xì)胞的胎兒遺傳檢測方法，包括如下步驟：

1)提供含有胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞的樣本；

2)將樣品固定，加冰醋酸消化，離心，緩沖液重懸，胰酶消化，緩沖液重懸；

3)加入磁性納米顆粒偶聯(lián)的hla-g單克隆抗體，孵育；

4)磁力架收集，緩沖液沖洗離心，純化磁性納米顆粒捕獲的細(xì)胞；

5)dna酶處理，挑取單個細(xì)胞，進(jìn)行單細(xì)胞基因組擴(kuò)增，對基因組dna進(jìn)行打斷建庫；

6)測序分析。

本發(fā)明還提供一種胎兒外膜滋養(yǎng)層細(xì)胞的純化方法，包括以下步驟：

1)提供含有胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞的樣本；

2)將樣品固定，加冰醋酸消化，離心，緩沖液重懸，胰酶消化，緩沖液重懸；

3)加入磁性納米顆粒偶聯(lián)的hla-g單克隆抗體，孵育；

4)磁力架收集，緩沖液沖洗離心，純化磁性納米顆粒捕獲的細(xì)胞。

本發(fā)明還提供所述胎兒外膜滋養(yǎng)層細(xì)胞的純化方法在胎兒遺傳中的應(yīng)用。

本發(fā)明步驟1)所述的樣品，妊娠5周或5周以上即可獲得，可以通過巴氏涂片獲得含有完整的胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞的母體(孕婦)宮頸管的樣本；更具體的，可以將細(xì)胞刷深入到宮頸內(nèi)管大約2cm，并旋轉(zhuǎn)360度；如果第一次沒有得到宮頸黏液，可再次采集樣本。盡量減少與宮頸壁接觸，以減少母親的細(xì)胞的污染。

本發(fā)明步驟2)樣品固定可以用本領(lǐng)域常用的細(xì)胞固定液，如：95％的乙醇、甲醇、5％的冰醋酸、carnoy固定液(配方：無水乙醇60ml，氯仿30ml，冰醋酸10ml)、丙酮、4％的多聚甲醛溶液、10％的甲醛溶液等；優(yōu)選carnoy固定液，carnoy固定液能固定胞漿和胞核，尤其適宜于染色體等。

本發(fā)明步驟2)所采用的具體方法可以為：將采集到的樣品轉(zhuǎn)移到固定液中，加入冰醋酸，室溫放置4-6min；離心去上清，緩沖液清洗，離心去上清，緩沖液重懸，加入胰酶35-38℃消化10-20min，離心去上清，緩沖液重懸。

本發(fā)明步驟2)中離心選用的條件優(yōu)選為1000-2000rpm離心4-6min；緩沖液優(yōu)選pbs。步驟2)中加冰醋酸可以消化樣本的黏液，同時使紅細(xì)胞膨脹而破碎。加胰酶的處理有利于消化成單個細(xì)胞，便于后面的質(zhì)控以及細(xì)胞捕獲實驗。

本發(fā)明步驟3)中的hla-g單克隆抗體為兔源hla-g單克隆抗體。

本發(fā)明步驟4)純化磁性納米顆粒捕獲的細(xì)胞之后，可以取部分細(xì)胞，質(zhì)控富集細(xì)胞的純度。質(zhì)控方法可以為本領(lǐng)域常用的方法，如：取部分富集細(xì)胞轉(zhuǎn)移到載玻片上，38-42℃處理樣本4-6min，按照免疫熒光的方法，用cy3偶鏈的hcg的抗體檢測細(xì)胞是否表達(dá)hcg(正常情況下，凡是表達(dá)hla-g的細(xì)胞都會表達(dá)hcg)，質(zhì)控富集細(xì)胞的純度。

本發(fā)明步驟5)dna酶處理可以消化外源的母體dna，避免母體細(xì)胞dna的影響，具體方法可以為：dna酶室溫處理4-6min。

本發(fā)明的步驟5)挑取單個細(xì)胞，裂解細(xì)胞，之后用dna聚合酶擴(kuò)增基因組。優(yōu)選高保真的dna聚合酶?？梢允悄蜔岬母弑Ｕ鎑na聚合酶，也可以是常溫的dna聚合酶。

本發(fā)明一種更為具體的基于母體的胎兒外膜滋養(yǎng)層細(xì)胞的胎兒遺傳檢測方法，包括以下步驟：

1)妊娠5周或5周以上的孕婦，利用巴氏涂片捕獲得含有完整的胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞的孕婦宮頸管的樣本；

2)將步驟1)捕獲的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到細(xì)胞固定液中，3-5℃保存；向樣本中加入冰醋酸，室溫放置4-6min，1000-2000rpm離心4-6min收集細(xì)胞樣本；

3)緩沖液重懸細(xì)胞樣本，離心，去上清，重復(fù)3次；

4)緩沖液重懸細(xì)胞樣本，加入胰酶35-37℃消化處理細(xì)胞10-20min，1000-2000rpm離心4-6min收集細(xì)胞樣本；

5)緩沖液重懸細(xì)胞樣本，離心，去上清，重復(fù)3次；

6)加入磁性納米顆粒偶聯(lián)的hla-g單克隆抗體，3-5℃孵育過夜；

7)磁力架收集之后再用冷的緩沖液重懸，重復(fù)收集-重懸3次，純化磁性納米顆粒捕獲的細(xì)胞；

8)取一部分細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到載玻片上，38-42℃處理樣本4-6min，按照免疫熒光的方法，用cy3偶鏈的hcg的抗體檢測細(xì)胞是否表達(dá)hcg；

9)剩余細(xì)胞用dna酶室溫處理4-6min，離心收集細(xì)胞，加入緩沖液，再離心，反復(fù)洗3次，進(jìn)一步洗掉磁珠和母體dna；

10)挑取單個的細(xì)胞，進(jìn)行單細(xì)胞基因組擴(kuò)增，對基因組dna進(jìn)行打斷建庫；

11)測序分析。

本發(fā)明所述技術(shù)方案的有益效果：

1)滋養(yǎng)層細(xì)胞發(fā)育形成胎盤，它們攜帶有與發(fā)育的胚胎和胎兒相同的基因組。因此，檢測巴氏涂片上滋養(yǎng)層細(xì)胞中的dna，可以提供與其他檢測方法相同的信息，而且檢測時間更早，侵入性更??；本發(fā)明所述方法可以在妊娠更早期(5周)進(jìn)行的可靠檢測；它是非侵入性的，可以讓很多患者更放心；

2)本發(fā)明選用兔源hla-g單克隆抗體，結(jié)合本發(fā)明捕獲方法的改進(jìn)，相對于傳統(tǒng)的方法，使抗體的親和力提高100-1000倍，顯著性的提高捕獲的效率，提高靈敏度、準(zhǔn)確度；

3)另外一方面，將hla-g單克隆抗體偶聯(lián)在磁珠上，減少二抗的非特異性結(jié)合，進(jìn)一步提高結(jié)果的準(zhǔn)確度；

4)直接用捕獲的細(xì)胞做單細(xì)胞擴(kuò)增，避免了現(xiàn)有技術(shù)中把細(xì)胞貼在載玻片上，分離細(xì)胞核，去除粘附的母源dna，裂解滋養(yǎng)層細(xì)胞的細(xì)胞核，釋放出的胎兒dna等繁瑣的步驟，操作更簡便，不需要極高的技術(shù)要求，時間更短。

附圖說明

圖1是hla-g陽性細(xì)胞捕獲的流程圖；

圖2是捕獲細(xì)胞的質(zhì)控與單細(xì)胞建庫分析；

圖3是實施例1捕獲細(xì)胞的質(zhì)控結(jié)果；

圖4是實施例2捕獲細(xì)胞的質(zhì)控結(jié)果；

圖5是實施例1和實施例2樣品中捕獲的陽性細(xì)胞與對比例的比例對比；

圖6是實施例3和對比例的流程示意圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，下面實施例未注明具體條件的實驗方法，通常按照本領(lǐng)域的公知手段。

實施例1臨床樣本的采集和處理

1.1樣本收集：樣本孕婦選擇孕期超過5周女性，利用巴氏涂片捕獲得含有完整的胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞的孕婦宮頸管的樣本，具體的操作包括將細(xì)胞刷(購買于hologic公司)深入到宮頸內(nèi)管大約2cm，并旋轉(zhuǎn)360度；如果第一次沒有得到宮頸黏液，可再次采集樣本。盡量減少與宮頸壁接觸，以減少母親的細(xì)胞的污染。

1.2樣本保存：將細(xì)胞刷在20ml的固定液(購買于hologic公司)中涮洗，將剛才采集到的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到固定液中，4度保存。

1.3向上述的細(xì)胞樣本中加入500ul的冰醋酸，室溫放置5分鐘，用以消化樣本的黏液，同時使紅細(xì)胞膨脹而破碎。離心收集細(xì)胞樣本，離心條件可以選擇1000rpm5分鐘。

1.4去上清，將沉淀重懸在20ml的pbs的緩沖液中，離心，去上清。重復(fù)3次。離心步驟1000rpm5分鐘，選擇在4度的條件下進(jìn)行；

1.5之后用1.5mlpbs重懸細(xì)胞，加入1.5毫升胰酶(購買于thermofisher公司)消化處理細(xì)胞15分鐘，在37度的條件下進(jìn)行。用胰酶的處理有利于消化成單個細(xì)胞，便于后面的質(zhì)控以及細(xì)胞捕獲實驗。離心步驟1000-2000rpm5分鐘，選擇在4度的條件下進(jìn)行；將沉淀重懸在1.5ml的pbs的緩沖液中，離心，去上清。重復(fù)3次.

實施例2模擬樣本的采集和處理

1.1將移液器和移液槍、15ml離心管、離心管架、100cm2新的細(xì)胞培養(yǎng)皿放于生物安全柜中，按照生物安全柜的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，將生物安全柜的紫外開啟半小時。

1.2將含10％胎牛血清(購買于thermofisher公司)和100u/ml雙抗(購買于thermofisher公司)的mem((購買于thermofisher公司)，添加nahco31.5g/l，sodiumpyruvate0.11g/l)及pbs放于37℃水浴鍋中預(yù)熱。

1.3將已長到80％-90％的人絨毛膜細(xì)胞株jeg-3細(xì)胞(購買于中國科學(xué)院細(xì)胞庫)，培養(yǎng)皿從37℃，5％的co2培養(yǎng)箱中取出，先用75％的酒精噴灑于瓶表面，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶旋轉(zhuǎn)放于生物安全柜中，用無菌的移液管吸凈其中的培養(yǎng)基，加5ml的預(yù)熱的pbs洗滌一次，吸凈pbs。同時，將已長到80％-90％的子宮頸癌細(xì)胞的細(xì)胞系hela細(xì)胞(購買于中國科學(xué)院細(xì)胞庫)培養(yǎng)皿從37℃，5％的co2培養(yǎng)箱中取出，先用75％的酒精噴灑于瓶表面，將細(xì)胞培養(yǎng)皿旋轉(zhuǎn)放于生物安全柜中，用無菌的移液管吸凈其中的培養(yǎng)基，加5ml的預(yù)熱的pbs洗滌一次，吸凈pbs。

1.4將含edta-0.25％tyption(購買于thermofisher公司)用pbs稀釋兩陪到五倍，向該100cm2培養(yǎng)皿中加入3ml稀釋好的edta-0.25％tyption，讓其充分平鋪于細(xì)胞表面。蓋好瓶蓋，將細(xì)胞瓶放在顯微鏡下觀察，直到細(xì)胞變圓，加含10％胎牛血清的mem培養(yǎng)基到15ml無菌的離心管中，1000rpm離心3分鐘。

1.5將離心上清吸棄掉，用手指輕輕拍打離心管底將底部細(xì)胞分散開，再加3ml

carnoy固定液(配方：無水乙醇60ml，購買于國藥，氯仿30ml，購買于國藥，冰醋酸10ml，購買于國藥)將分散的細(xì)胞重懸稀釋開，室溫固定5分鐘。

1.6將上述樣本離心1000rpm，室溫3分鐘，去上清，加入5mlpbs重懸，再離心，去上清，反復(fù)洗三次，最后用10ml的pbs重懸該細(xì)胞。取一定量的細(xì)胞液進(jìn)行10倍稀釋后計數(shù)，按照細(xì)胞計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行。計數(shù)方法：按圖計算計數(shù)板的四角大方格(每個大方格又分16個小方格)內(nèi)的細(xì)胞數(shù)。計數(shù)時，只計數(shù)完整的細(xì)胞，若聚成一團(tuán)的細(xì)胞則按一個細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。在一個大方格中，如果有細(xì)胞位于線上，一般計下線細(xì)胞不計上線細(xì)胞，計左線細(xì)胞不計右線細(xì)胞。二次重復(fù)計數(shù)誤差不應(yīng)超過±5％。鏡下觀察，凡折光性強(qiáng)而不著色者為活細(xì)胞，染上藍(lán)色者為死細(xì)胞。計數(shù)的換算：計完數(shù)后，需換算出每ml懸液中的細(xì)胞數(shù)。由于計數(shù)板中每一方格的面積為0.01cm²，高為0.01cm，這樣它的體積為0.0001cm³，即0.1mm³。由于1ml＝1000mm³，所以每一大方格內(nèi)細(xì)胞數(shù)×10000＝細(xì)胞數(shù)/ml，故可按下式計算：細(xì)胞懸液細(xì)胞數(shù)/ml＝4個大格細(xì)胞總數(shù)/4×10000，如計數(shù)前已稀釋，可再乘稀釋倍數(shù)。

1.7計數(shù)好之后細(xì)胞，在1.5ml的pbs加入200000個hela細(xì)胞和200個jeg-3細(xì)胞，模擬臨床的樣本。

實施例3基于母體的胎兒外膜滋養(yǎng)層細(xì)胞的胎兒遺傳檢測方法

如圖1、圖2和圖6所示，包括如下步驟：

1)選擇實施例1或?qū)嵤├?采集或處理后的細(xì)胞；

2)將兔源hla-g(hla-g是滋養(yǎng)層和胎盤細(xì)胞特有的人類白細(xì)胞抗原)單克隆抗體(公司自產(chǎn)的)連接到磁性納米顆粒表面；

3)在步驟1)中的樣本中，加入偶聯(lián)兔源hla-g抗體的磁珠，4度孵育過夜，如圖1所示；

4)用磁力架收集磁珠之后在用冷的pbs重懸，用磁力架收集，再加入pbs，重復(fù)3次，去掉未結(jié)合的母體細(xì)胞；純化磁珠捕獲下來的細(xì)胞；如圖1所示，用磁力架回收hla-g的陽性細(xì)胞，用pbs洗掉hla-g的陰性細(xì)胞；

5)取一小部分細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到載玻片上，40度處理樣本5分鐘。按照免疫熒光的方法，用cy3偶鏈的hcg的抗體(購買于thermofisher公司)檢測細(xì)胞是否表達(dá)hcg(正常情況下，凡是表達(dá)hla-g的細(xì)胞都會表達(dá)hcg)，質(zhì)控富集的hcg細(xì)胞的認(rèn)純度，如圖2所示。

免疫熒光的步驟：①pbs浸洗玻片3次，每次3min，吸水紙吸干pbs，在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉30min；②吸水紙吸掉封閉液，不洗，每張玻片滴加足夠量的稀釋好的cy3偶鏈的hcg一抗(1:300購買于thermofisher公司)并放入濕盒，4℃孵育過夜；后面所有操作步驟都盡量在較暗處進(jìn)行；③pbst浸洗3次，每次3min，吸水紙吸干玻片上多余液體后滴加dapi(購買于sigma公司)，避光孵育5min，對標(biāo)本進(jìn)行染核，pbst5min×4次洗去多余的dapi；④用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

6)剩余的細(xì)胞樣本用dna酶室溫處理5分鐘，離心收集細(xì)胞，加入pbs緩沖液，再離心，反復(fù)洗3次，進(jìn)一步洗掉磁珠和母體dna。

7)挑取單個的細(xì)胞，利用本公司的單細(xì)胞擴(kuò)增試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司，貨號n602)進(jìn)行單細(xì)胞基因組擴(kuò)增，具體方法參見產(chǎn)品說明書，如圖2所示。

8)擴(kuò)增純化的基因組dna(南京諾唯贊生物科技有限公司，貨號nd602)，利用本公司的nd604試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司，貨號nd604)建庫，具體方法參見產(chǎn)品說明書；

9)上機(jī)測序，利用二代測序的技術(shù)，對胎兒dna進(jìn)行分析。

對比實驗：如圖6所示，包括以下步驟：

1)同樣選擇實施例1或?qū)嵤├?采集或處理后的細(xì)胞樣品；加入5ug的鼠源hla-g抗體與樣本4度過夜孵育；

2)加入偶聯(lián)有羊抗鼠二抗抗體的磁珠加上到樣本中，4度孵育6小時；

3)用磁力架收集磁珠之后在用冷的pbs重懸，用磁力架收集，再加入pbs，重復(fù)3次，去掉未結(jié)合的母體細(xì)胞；純化磁珠捕獲下來的細(xì)胞；

4)取一小部分細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到載玻片上，40度處理樣本5分鐘。按照免疫熒光的方法，用cy3偶鏈的hcg的抗體(購買于thermofisher公司)檢測細(xì)胞是否表達(dá)hcg(正常情況下，凡是表達(dá)hla-g的細(xì)胞都會表達(dá)hcg)，質(zhì)控富集的hcg細(xì)胞的認(rèn)純度，如圖2所示。

5)剩余的hla-g陽性的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到載玻片上，40度處理樣本5分鐘。

6)用胃蛋白酶溶液(0.01g胃蛋白酶溶解在100ml0.1n的鹽酸)處理11分鐘，裂解細(xì)胞。pbs溶液洗3次，去掉細(xì)胞膜和母體dna。

7)用dna酶室溫處理5分鐘，用pbs緩沖液洗3次，進(jìn)一步洗掉磁珠和母體dna。

8)加dna裂解液，65度過夜處理，裂解細(xì)胞核。95度30分鐘，失活。

9)最終，收集滋養(yǎng)層細(xì)胞釋放出的胎兒dna。

10)上機(jī)測序，利用二代測序的技術(shù)，對胎兒dna進(jìn)行分析。

實驗結(jié)果：

1)實施例3方法中純化的胎兒外膜滋養(yǎng)層細(xì)胞的質(zhì)控結(jié)果

實施例1樣品捕獲細(xì)胞的質(zhì)控結(jié)果如圖3所示，用標(biāo)記cy3的hla-g抗體檢測表達(dá)hcg的細(xì)胞，用dapi染色統(tǒng)計總的細(xì)胞數(shù)目，利用熒光顯微鏡統(tǒng)計細(xì)胞總數(shù)與hcg的陽性細(xì)胞的數(shù)目，可以看到在富集之前，樣本中有大量的細(xì)胞，其中hcg的陽性細(xì)胞非常的少，幾乎看不到，在富集之后，所有的細(xì)胞都是hcg陽性的細(xì)胞。

實施例2樣品捕獲細(xì)胞的質(zhì)控結(jié)果如圖4所示，用標(biāo)記cy3的hla-g抗體檢測表達(dá)hcg的細(xì)胞，用dapi染色統(tǒng)計總的細(xì)胞數(shù)目，利用熒光顯微鏡統(tǒng)計細(xì)胞總數(shù)與hcg的陽性細(xì)胞的數(shù)目；可以看到在富集之前，樣本中有大量的細(xì)胞，其中hcg的陽性細(xì)胞非常的少，幾乎看不到。在富集之后，所有的細(xì)胞都是hcg陽性的細(xì)胞。

結(jié)果表明，本發(fā)明所述方法，純化效果好，幾乎可以實現(xiàn)100％純化。

2)實施例1和實施例2的樣品經(jīng)過實施例3或?qū)Ρ葘嶒灥臋z測方法，捕獲的陽性細(xì)胞的比例如圖5所示。雖然實施例3中利用1μg兔源的hla-g抗體而對比實驗中用了5μg鼠源的hla-g抗體，但結(jié)果顯示通過實施例3所述方法用1ug的兔源的hla-g抗體捕獲的效果比對比實驗中5ug鼠源的hla-g抗體捕獲的陽性率高，且構(gòu)成顯著性差異。因此，本發(fā)明所述方法特異性更好，靈敏度更高，同時使用的抗體少，成本低。

3)實施例3所用方法相對于對比實驗流程更簡便，時間更短，從拿到樣本到提取樣本的基因組dna，現(xiàn)在的方法在13.5小時便可以完成，其中動手時間在1.5小時左右；而對比實驗流程需要長達(dá)33小時才能完成流程，其中動手時間需要2小時以上。