本發(fā)明屬于微生物肥料及農(nóng)作物逆境保護(hù)研究領(lǐng)域，涉及一株小單孢菌屬放線菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：土壤鹽堿化是當(dāng)前威脅全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及農(nóng)作物產(chǎn)量的主要非生物脅迫因素之一，目前全球近50％的灌溉土地都受到不同程度的鹽脅迫威脅。據(jù)統(tǒng)計，全世界鹽堿土面積約占土地總面積的7％左右，并有逐年增加的趨勢。我國鹽漬化土壤面積約為1.0×108hm2，約占土地總面積37％。土壤鹽漬化不僅影響植物代謝和光合作用，而且能夠降低植物對土壤養(yǎng)分和微量元素的攝入。已有研究表明，nacl是鹽漬化土壤最主要的成分，在其脅迫下植物會出現(xiàn)營養(yǎng)失衡、滲透功能受損和活性氧過量，進(jìn)而導(dǎo)致膜完整性破壞、光合電子傳遞系統(tǒng)失活、激素平衡破壞、生物量積累下降甚至細(xì)胞死亡。因此，如何改良鹽堿化土壤、以及保護(hù)并提高重要的經(jīng)濟(jì)農(nóng)作物抵抗鹽脅迫已成為目前急需解決的問題之一。目前，對于土壤鹽漬化主要采用農(nóng)業(yè)措施、水利工程和化學(xué)改土等傳統(tǒng)措施，但這些措施均存在投入大、周期長和見效慢等缺點。目前主要的生物改良方法措施是培育并種植耐鹽堿的作物，如種植甜菜、玉米、大豆，以及耐鹽植物堿篷、檉柳等，此外還有耐鹽轉(zhuǎn)基因植物的研究，但是該類方法往往周期長、花費(fèi)巨大，而且植物轉(zhuǎn)基因方法還未被社會廣泛接受認(rèn)可。鑒于此，近年來利用植物有益微生物提高植物耐鹽性和改良土壤鹽堿化水平已有相關(guān)研究，植物有益微生物不僅可以促進(jìn)植物生長發(fā)育和提高產(chǎn)量，而且可以提高作物耐受逆境條件的能力，但目前研究較多的植物促生菌為細(xì)菌以及菌根真菌等真菌資源，而有關(guān)放線菌尤其是非鏈霉菌屬的稀有放線菌提高作物在鹽脅迫下生長及相關(guān)菌劑研究鮮有報道。小麥?zhǔn)俏覈闹饕Z食作物，具有廣泛的種植區(qū)域，但是對于大面積的鹽堿土地，如何提高小麥的鹽環(huán)境適應(yīng)能力和產(chǎn)量是目前在鹽堿地種植小麥亟待解決的問題。微生物具有體積小、生長快、易控制等優(yōu)勢，而放線菌是能夠產(chǎn)生活性物質(zhì)最多的微生物，已經(jīng)在醫(yī)藥開發(fā)、農(nóng)林業(yè)保護(hù)等領(lǐng)域中得到了廣泛應(yīng)用。因此，從鹽堿地土著生長的植物根際土壤中獲取具有耐鹽并促進(jìn)小麥在鹽脅迫下生長的放線菌，對于提高小麥的抗鹽能力、促進(jìn)小麥在鹽堿地的生長與耐受能力，對于擴(kuò)大小麥的種植面積、改善鹽漬化土壤具有重要意義。目前有關(guān)小單孢菌屬的稀有放線菌對于小麥鹽脅迫下促生長的研究還未見有報道。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是針對上述技術(shù)問題，提供一株放線菌桔橙小單孢菌。本發(fā)明的另一目的是提供包含放線菌桔橙小單孢菌的小麥耐鹽促生劑。本發(fā)明的又一目的是提供放線菌桔橙小單孢菌在小麥抗鹽生長過程中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)：一方面，本發(fā)明提供一株放線菌桔橙小單孢菌，其特征在于，該菌種屬放線菌桔橙小單孢菌于(micromonosporaaurantiaca)，代號rs019，2017年5月5日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號為gdmcc60177。進(jìn)一步的，所述的放線菌桔橙小單孢菌于(micromonosporaaurantiaca)，代號rs019的16srrna基因序列如seqidno.1所示。進(jìn)一步的，所述的放線菌桔橙小單孢菌于(micromonosporaaurantiaca)，代號rs019生長初期表面呈橘色，后期顏色逐漸變深至黑色；掃描電鏡下可清晰地觀察到孢子單生、無柄，或著生在孢子梗上，孢子梗時常分枝成簇。進(jìn)一步的，所述的rs019的菌種能夠產(chǎn)生吲哚乙酸，能夠產(chǎn)氮，固氮；小麥抗鹽生長過程中的應(yīng)用。一方面，本發(fā)明提供一種含有權(quán)利要求1所述的保藏號為gdmcc60177的rs019菌株的小麥耐鹽促生劑；含rs019菌株的小麥耐鹽促生劑在小麥抗鹽生長過程中的應(yīng)用。一方面，本發(fā)明提供一種包含放線菌桔橙小單孢菌的小麥耐鹽促生劑，其特征在于，是通過以下方法生產(chǎn)而成：1)將保藏編號為gdmcc60177的放線菌桔橙小單孢菌rs019，接種于250ml的isp2液體培養(yǎng)基中(4g酵母浸膏，10g麥芽浸膏，葡萄糖4g，ph7.2，1000ml水)；2)28℃，150rpm搖瓶培養(yǎng)3天后，待菌體生長至對數(shù)生長期時8000rpm離心收集菌體；3)用無菌水洗滌菌體兩次后，無菌水調(diào)節(jié)菌體濃度，菌體濃度約為105-106cfu/ml，即為所述的小麥耐鹽促生劑。另一方面，所述的rs019的菌種在促進(jìn)小麥生長過程中的應(yīng)用。發(fā)明詳述：本發(fā)明通過對海岸帶根際土壤放線菌的分離和耐鹽及促生長特征的篩選，獲得一株較強(qiáng)耐鹽促生活性的菌株，編號為rs019。通過形態(tài)特征、生理生化以及16srrna基因測序與系統(tǒng)發(fā)育分析，確定了其分類學(xué)地位。通過平皿種子萌發(fā)以及盆栽實驗驗證，采用本發(fā)明提供的放線菌桔橙小單孢菌micromonosporaaurantiacars019，具有促進(jìn)小麥在鹽脅迫種子萌發(fā)和幼苗生長、顯著提高其鹽脅迫下的適應(yīng)能力，該方法可發(fā)酵用于菌肥，提高小麥的耐鹽能力，促進(jìn)小麥在鹽堿地的種植。分離菌株為桔橙小單孢菌，代號為rs019，該菌株于2017年5月5日在廣東省微生物菌種保藏中心登記保藏，保藏編號為gdmcc60177。同時本發(fā)明提供了該桔橙小單孢菌的16srrna基因序列(1393bp)，基于序列如seqidno.1所示。此外，本發(fā)明提供了桔橙小單孢菌rs019的菌懸液制備方法，具體步驟為：挑取在isp2固體平板上生長3-5天的桔橙小單孢菌rs019單菌落，接種于250ml的isp2液體培養(yǎng)基中(4g酵母浸膏，10g麥芽浸膏，葡萄糖4g，ph7.2，1000ml水)，28℃，150rpm搖瓶培養(yǎng)3天后，待菌體生長至對數(shù)生長期時8000rpm離心收集菌體，用無菌水洗滌菌體兩次后，無菌水調(diào)節(jié)菌體濃度，菌體濃度約為105-106cfu/ml。同時提供了上述菌懸液的催芽與施肥方法，包括以下步驟：對小麥種子進(jìn)行表面消毒，首先用有效氯含量為5％的naclo浸泡3min后，用無菌水漂洗4-5次；然后用75％的酒精浸泡5min，用無菌水漂洗數(shù)次至種子表面不發(fā)黃，最后用上述制備的rs019菌懸液浸泡24h，同時以無菌水處理作為對照。將浸泡后的種子在超凈工作臺中放入加有兩層濾紙的無菌平板上，加入15ml無菌水，放于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5天后平皿中加入10ml濃度為100mmnacl鹽脅迫處理。12天后觀察并記錄小麥種子的萌發(fā)情況。采用營養(yǎng)土與蛭石以體積比4:1混合得到盆栽基質(zhì)，然后于121℃滅菌一小時，冷卻后分裝至盆栽花盆中(9cm長×9cm寬×9cm高)，每盆約200g。選取長勢一致的小麥幼苗，移栽含營養(yǎng)土的花盆中，放于溫室中生長(溫度為25℃，每天光照12h，無光照12h交替)，用50ml無菌水和菌液澆灌小麥每盆幼苗，每周澆灌2次，以澆無菌水的小麥幼苗作為對照；3周以后，用2％的nacl溶液進(jìn)行鹽脅迫灌根處理，每周灌根一次，連續(xù)灌根3次。平皿上小麥種子催芽實驗可以發(fā)現(xiàn)鹽脅迫的對照組小麥苗已經(jīng)發(fā)黃，而接菌組小麥幼苗鮮綠、長勢明顯更好。在nacl濃度為100mm條件下，對照組發(fā)芽率為29.3％，用桔橙小單孢菌rs019菌懸液浸種的小麥發(fā)芽率為58％，為對照組的近兩倍。以鹽脅迫30天的盆栽測量結(jié)果統(tǒng)計可以發(fā)現(xiàn)，接種桔橙小單孢菌rs019后小麥在0、2％nacl處理下鮮重分別提高了61.5％、27.1％，可見鹽脅迫下菌株rs019對小麥種子的萌發(fā)與幼苗的生長具有顯著促進(jìn)作用。有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明分離篩選的海岸帶土壤桔橙小單孢菌rs019具有固氮、產(chǎn)生植物生長激素吲哚乙酸(iaa)和產(chǎn)氨等多種促生特征，并能夠耐受5％的nacl，通過菌懸液處理后的小麥在nacl濃度為100mm條件下能顯著提高種子發(fā)芽率，菌懸液灌根回接小麥幼苗，具有鹽脅迫下顯著減緩鹽害癥狀、增加生物量從而促進(jìn)小麥生長的效果，有助于提高植物的耐鹽性，減少化學(xué)肥料的使用。附圖說明圖1.菌株桔橙小單孢菌rs019在isp2平板上培養(yǎng)7天的菌落照片及掃描電鏡照片圖2.基于16srrna基因構(gòu)建的菌株rs019系統(tǒng)發(fā)育樹圖3.鹽脅迫條件下接菌與不接菌小麥在平皿中的萌發(fā)生長狀態(tài)的比較圖4.高鹽及無鹽脅迫條件下接菌與不接菌小麥盆栽試驗生長狀態(tài)的比較圖5.高鹽及無鹽脅迫條件下接菌與不接菌小麥幼苗鮮重的比較生物材料保藏信息放線菌桔橙小單孢菌rs019，分類命名為放線菌桔橙小單孢菌(micromonosporaaurantiaca)，保藏于廣東省微生物菌種保藏中心(gdmcc)，地址為廣東省廣州市先烈中路100號大院59號樓廣東微生物菌種保藏中心，保藏編號為gdmcc60177，保藏日期為2017年5月5日。具體實施方式實施例11.放線菌分離土壤樣本采集自江蘇沿海灘涂的鹽堿地，土樣采集帶回實驗室后于48小時內(nèi)完成菌株分離。稱取2個土樣，經(jīng)過成分研磨后加入含有18ml無菌水的試管中，并稀釋至10-1-10-4濃度梯度，取10-2-10-4濃度的樣本稀釋液涂布于分離培養(yǎng)基上(可溶性淀粉2.0g，精氨酸1.0g，k2hpo40.5g，mgso40.5g，kno31.0g，nacl3.0g，feso40.01g，h2o1000ml，ph7.2)。28℃培養(yǎng)7-14d，長出的菌落及時純化并用isp2固體斜面4℃保藏。2.菌株鑒定菌株rs019的形態(tài)與生理生化特征：在生長初期表面呈橘色，后期顏色逐漸變深至黑色。掃描電鏡下可清晰地觀察到孢子單生、無柄，或著生在孢子梗上，孢子梗時常分枝成簇(圖1)。菌株在酵母膏-麥芽膏(isp2)和土豆瓊脂培養(yǎng)基(pda)上生長良好，無可溶性色素產(chǎn)生。能耐受最高濃度為5％的nacl，具有酪蛋白水解酶活性、纖維素酶活性、以及幾丁質(zhì)酶活性。能夠在15-42℃溫度范圍能夠生長，在ph6-9范圍能夠生長。使用isp2液體培養(yǎng)基于28℃，150rpm搖瓶培養(yǎng)5天后8000rpm離心收集菌體，微波法提取菌體基因組dna，用細(xì)菌通用引物27f5'-agagtttgatcctggctcag-3'和1492r：5'-aaggaggtgatccagccgca-3'進(jìn)行16srrna基因pcr擴(kuò)增。pcr反應(yīng)體系為：模板dna2μl，10×buffer5μl，mgcl2(25mmol)3μl，dntp(10mmol/l)1μl，27f(10μmol/l)1μl，1492r(10μmol/l)1μl，taq酶(5u/μl)0.5μl，pcr產(chǎn)物經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至生工(上海)有限公司測序。測序結(jié)果在ncbi以及ezbiocloud網(wǎng)站上比對測序結(jié)果，然后用mega6.0軟件進(jìn)行序列比對及分析，最后用鄰接法(neighbor-joining，nj)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，序列比對發(fā)現(xiàn)該菌株與小單孢菌屬的有效種序列相似性最高，與桔橙小單孢菌micromonosporaaurantiaca的相似性為100％(圖2)。因此，菌株rs019應(yīng)屬于小單孢菌屬的成員，命名為桔橙小單孢菌rs019(micromonosporaaurantiacars019)。3.菌株促生長性能固氮潛在性檢測：挑取少量的菌體用點植法接種到無氮培養(yǎng)基上(蔗糖10.0g，caco31.0g，k2hpo40.5g，mgso4·7h2o0.2g，nacl0.2g，agar15g，h2o1000ml，ph7.2)，放置在28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天左右，觀察其是否生長，若菌株轉(zhuǎn)接5次后還能生長，則說明該菌株具有固氮潛在活性。菌株rs019傳代5次后仍然能在無氮培養(yǎng)基上生長良好，說明rs019具有固定空氣中氮元素的潛能。產(chǎn)氨活性檢測：挑取少量待測菌株接種于5ml蛋白胨液體(10g/l)培養(yǎng)基中，三次重復(fù)，于28℃120r/min搖床振蕩培養(yǎng)3天后，每個試管中加入0.5ml的nessler’s試劑，若出現(xiàn)黃褐色沉淀則說明具有產(chǎn)氨活性，若無則不產(chǎn)氨。菌株rs019培養(yǎng)后顯色反應(yīng)呈陽性，說明rs019具有產(chǎn)氨的能力。產(chǎn)植物生長激素吲哚乙酸(iaa)檢測：將有氮培養(yǎng)液分裝于試管，每管分裝4ml，121℃高壓滅菌。配制5mg/ml的色氨酸溶液，使用微孔濾膜過濾除菌后，加入到已經(jīng)經(jīng)過高壓滅菌的有氮培養(yǎng)基中，使得色氨酸的最終濃度為0.5mg/ml。挑取菌株接種于分裝后的試管中，28℃的搖床避光培養(yǎng)7天后，使用移液槍取出1ml菌液于滅菌后的離心管中，加入2ml的sackowcki’s顯色劑(將150ml的濃硫酸緩緩加入到250ml的去離子水中，邊加邊攪拌，待溶液冷卻后加入7.5ml0.5mol/l的fecl3·6h2o溶液)充分混勻，室溫下顯色30分鐘，溶液呈粉紅色，則為陽性，說明該菌株rs019產(chǎn)iaa。4.菌株應(yīng)用試驗菌株菌懸液制備方法：挑取在isp2固體平板上生長3-5天的桔橙小單孢菌rs019單菌落，接種于250ml的isp2液體培養(yǎng)基中(4g酵母浸膏，10g麥芽浸膏，葡萄糖4g，ph7.2，1000ml水)，28℃，150rpm搖瓶培養(yǎng)3天后，待菌體生長至對數(shù)生長期時8000rpm離心收集菌體，用無菌水洗滌菌體兩次后，無菌水調(diào)節(jié)菌體濃度，菌體濃度約為105-106cfu/ml，作為生物菌劑。平皿中小麥催芽試驗：對小麥種子進(jìn)行表面消毒，首先用有效氯含量為5％的naclo浸泡3min后，用無菌水漂洗4-5次；然后用75％的酒精浸泡5min，用無菌水漂洗數(shù)次至種子表面不發(fā)黃，最后用上述制備的rs019菌懸液浸泡24h，同時以無菌水處理作為對照。將浸泡后的種子在超凈工作臺中放入加有兩層濾紙的無菌平板上，加入15ml無菌水，放于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5天后平皿中加入10ml濃度為100mmnacl鹽脅迫處理。12天后觀察并記錄小麥種子的萌發(fā)情況。結(jié)果如圖3所示，平皿上小麥種子催芽實驗可以發(fā)現(xiàn)鹽脅迫的對照組小麥苗已經(jīng)發(fā)黃，而接菌組小麥幼苗鮮綠、長勢明顯更好。在nacl濃度為100mm條件下，對照組發(fā)芽率為29.3％，用桔橙小單孢菌rs019菌懸液浸種的小麥發(fā)芽率為58％，為對照組的近兩倍。盆栽施肥實驗：采用營養(yǎng)土與蛭石以體積比4:1混合得到盆栽基質(zhì)，然后于121℃滅菌一小時，冷卻后分裝至盆栽花盆中(9cm長×9cm寬×9cm高)，每盆約200g。選取長勢一致的小麥幼苗，移栽含營養(yǎng)土的花盆中，放于溫室中生長(溫度為25℃，每天光照12h，無光照12h交替)，用50ml無菌水和菌液澆灌小麥每盆幼苗，每周澆灌2次，以澆無菌水的小麥幼苗作為對照；3周以后，用2％的nacl溶液進(jìn)行鹽脅迫灌根處理，每周灌根一次，連續(xù)灌根3次。在鹽脅迫后30天隨機(jī)選取植物進(jìn)行拍照、測量、檢測。結(jié)果如圖4所示，左邊兩盆為無鹽脅迫下不接菌(第1盆)與接菌(第2盆)處理的小麥植株幼苗，可以看出，無鹽脅迫下接種rs019菌懸液的小麥幼苗長勢更好。右邊兩盆為2％的nacl鹽脅迫下不接菌(第3盆)與接菌(第4盆)處理的小麥植株幼苗，可以看出，鹽脅迫下接種桔橙小單孢菌rs019的小麥幼苗生長地更好，而未接菌的幼苗，長勢明顯較差。統(tǒng)計可以發(fā)現(xiàn)，接種桔橙小單孢菌rs019后小麥在0、2％nacl處理下鮮重分別提高了61.5％、27.1％(表1，圖5),株高得到顯著提高?？梢婝}脅迫下菌株rs019對小麥種子的萌發(fā)與幼苗的生長具有顯著促進(jìn)作用。表1.接種放線菌rs019對小麥幼苗生長的影響株高(cm)植株鮮重(g)最大葉長(cm)0mmnacl35±1.20b1.3±0.20b360mmnacl+rs01943±2.11c2.1±0.14c442％nacl30.6±1.35a1.07±0.21a332％nacl+rs01938±1.67b1.36±0.22b40實施例2、一種小麥耐鹽促生劑，是通過以下方法制備而得的：挑取在isp2固體平板上生長3-5天的桔橙小單孢菌rs019單菌落，接種于250ml的isp2液體培養(yǎng)基中(4g酵母浸膏，10g麥芽浸膏，葡萄糖4g，ph7.2，1000ml水)，28℃，150rpm搖瓶培養(yǎng)3天后，待菌體生長至對數(shù)生長期時8000rpm離心收集菌體，用無菌水洗滌菌體兩次后，無菌水調(diào)節(jié)菌體濃度，菌體濃度約為105-106cfu/ml，即得小麥耐鹽促生劑。sequencelisting<110>江蘇師范大學(xué)<120>一株小單孢菌屬放線菌及其應(yīng)用<130>2017<160>1<170>patentinversion3.5<210>1<211>1393<212>dna<213>桔橙小單孢菌rs019<400>1ctaccatgcagtcgagcggaaggcccttcggggtactcgagcggcgaacgggtgagtaac60acgtgagcaacctgccccaggctttgggataaccccgggaaaccggggctaataccgaat120atgacctctgaccgcatggttggtggtggaaagtttttcggcttgggatgggctcgcggc180ctatcagcttgttggtggggtgatggcctaccaaggcgacgacgggtagccggcctgaga240gggcgaccggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtgg300ggaatattgcacaatgggcggaagcctgatgcagcgacgccgcgtgagggatgacggcct360tcgggttgtaaacctctttcascagggacgaagcgtaagtgacggtacctgcagaagaag420cgccggccaactacgtgccagcagccgcggtaagacgtagggcgcgagcgttgtccggat480ttattgggcgtaaagagctcgtaggcggcttgtcgcgtcgaccgtgaaaacttggggctc540aaccccaagcctgcggtcgatacgggcaggctagagttcggtaggggagactggaattcc600tggtgtagcggtgaaatgcgcagatatcaggaggaacaccggtggcgaaggcgggtctct660gggccgatactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctgg720tagtccacgctgtaaacgttgggcgctaggtgtggggggcctctccggttccctgtgccg780cagctaacgcattaagcgccccgcctggggagtacggccgcaaggctaaaactcaaagga840attgacgggggcccgcacaagcggcggagcatgcggattaattcgatgcaacgcgaagaa900ccttacctgggtttgacatggccgcaaaactgtcagagatggcaggtccttcgggggcgg960tcacaggtggtgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgca1020acgagcgcaaccctcgttcgatgttgccagcgcgttatggcggggactcatcgaagactg1080ccggggtcaactcggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatgccccttatgtccag1140ggcttcacgcatgctacaatggccggtacaatgggctgcgataccgtgaggtggagcgaa1200tcccaaaaagccggtctcagttcggatcggggtctgcaactcgaccccgtgaagtcggag1260tcgctagtaatcgcagatcagcaacgctgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacac1320cgcccgtcacgtcacgaaagtcggcaacacccgaagccggtggcccaacccttgtggagg1380agccgtcgaagtg1393當(dāng)前第1頁12