本發(fā)明涉及一種抑制杜氏鹽藻養(yǎng)殖過程中雜藻污染的方法，特別適用于杜氏鹽藻養(yǎng)殖企業(yè)在養(yǎng)殖過程中雜藻的污染控制。
背景技術(shù)：
：杜氏鹽藻（dunalselalsalana），是一種嗜鹽的單細(xì)胞真核藻類，是到現(xiàn)在為止發(fā)現(xiàn)最耐鹽和嗜鹽的真核單細(xì)胞生物之一，從屬綠藻門,真綠藻綱,團(tuán)藻目，鹽藻科,杜氏鹽藻沒有細(xì)胞壁，細(xì)胞表面帶有正電荷，是杜氏藻中具有代表性的藻種。杜氏鹽藻在特定的生長環(huán)境中，可產(chǎn)生大量類胡蘿卜素，其中β-胡蘿卜素含量最高，可占其干重的14%。β-胡蘿卜素屬四萜類化合物,是一種重要的天然食用色素,廣泛地存在于植物、藻類和真菌中,是全部類胡蘿卜素中含量最大和研究的最多的一種。β-胡蘿卜素具有很強(qiáng)的清除氧自由基的功能，能防治癌癥、腫瘤和心血管疾病以及老年性癡呆和白內(nèi)障等與年齡有關(guān)的退化性疾病，是一種重要的保健品，而且是維生素a的前體和食品加工業(yè)的天然色素。目前從鹽藻中提取出來的胡蘿卜素已經(jīng)制成多種應(yīng)用于抗輻射、保護(hù)視力、緩解眼疲勞的營養(yǎng)物質(zhì)。因此，杜氏鹽藻具有很高的市場價(jià)值，養(yǎng)殖杜氏鹽藻的企業(yè)也越來越多。杜氏鹽藻在在戶外大規(guī)模養(yǎng)殖過程中，由于養(yǎng)殖條件較為粗獷、企業(yè)多藻種養(yǎng)殖等因素的影響，杜氏鹽藻很容易受到雜藻的污染。而這種污染一方面會與杜氏鹽藻在生長過程中競爭培養(yǎng)基，更不利于杜氏鹽藻的生物量的積累，降低藻液中β-胡蘿卜素的含量，這會直接影響杜氏鹽藻藻粉的質(zhì)量，降低企業(yè)效益，不利于企業(yè)長遠(yuǎn)發(fā)展。而傳統(tǒng)的抑制杜氏鹽藻養(yǎng)殖過程中雜藻污染的方法是增加培養(yǎng)基鹽度（nacl），使跑道池中藻液鹽度達(dá)到17波美以上，但鹽度過高會影響杜氏鹽藻生物量的積累，并且會使養(yǎng)殖成本大大增加。因此，企業(yè)迫切需要找到一種效果更好、養(yǎng)殖成本較低的抑制杜氏鹽藻養(yǎng)殖過程中雜藻污染的方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，降低養(yǎng)殖成本，提高產(chǎn)品質(zhì)量，本發(fā)明提供了一種抑制杜氏鹽藻養(yǎng)殖過程中雜藻污染的方法，包括以下四個(gè)部分:第一部分：確定杜氏鹽藻養(yǎng)殖過程中污染雜藻的種類；具體為:利用普通光學(xué)顯微鏡和熒光倒置顯微鏡對生長到對數(shù)期的被雜藻污染的杜氏鹽藻進(jìn)行取樣、制片和觀察，并拍照記錄藻液中雜藻的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征，同時(shí)參照《淡水微型生物圖譜》、《微藻生物技術(shù)》和《中國淡水藻類》等相關(guān)書籍對污染藻種進(jìn)行分類鑒定；第二部分：確定生長到穩(wěn)定期的杜氏鹽藻藻液中各種污染雜藻的細(xì)胞數(shù)并計(jì)算其與藻液中細(xì)胞總數(shù)和杜氏鹽藻細(xì)胞數(shù)之比；具體操作步驟為:①確定單位體積藻液中藻細(xì)胞總數(shù)a與杜氏鹽藻細(xì)胞數(shù)b；②計(jì)算單位體積藻液中污染雜藻的細(xì)胞數(shù)c，計(jì)算公式為：c=a–b③計(jì)算單位體積藻液中污染雜藻細(xì)胞的比例k1，計(jì)算公式為：k1=c/a×100%④計(jì)算單位體積藻液中污染雜藻細(xì)胞數(shù)與杜氏鹽藻細(xì)胞數(shù)之比k2，計(jì)算公式為：k2=c/b第三部分：確定不同mg2+濃度的培養(yǎng)基條件下單位體積藻液中污染雜藻細(xì)胞所占比例；具體步驟為：①配制杜氏鹽藻培養(yǎng)基：配置具有mg2+濃度梯度的培養(yǎng)液，并將配好的培養(yǎng)基置于容器中；②接種：在每個(gè)容器中接入被雜藻污染的杜氏鹽藻藻液，搖勻后測定β-胡蘿卜素含量與單位體積藻液中污染雜藻細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算單位體積藻液中污染雜藻細(xì)胞所占的比例k1與單位體積藻液中污染雜藻細(xì)胞數(shù)與杜氏鹽藻細(xì)胞數(shù)之比k2；③培養(yǎng)：對接入了被雜藻污染的杜氏鹽藻藻液的杜氏鹽藻進(jìn)行培養(yǎng)；④單位體積藻液中污染雜藻的細(xì)胞數(shù)：在容器中的藻液培養(yǎng)過程中，每天固定時(shí)間（與接種時(shí)間保持一致）對每個(gè)容器中的藻液進(jìn)行取樣并測定β-胡蘿卜素含量與單位體積藻液中污染雜藻細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算單位體積藻液中污染雜藻細(xì)胞所占的比例k1與單位體積藻液中污染雜藻細(xì)胞數(shù)與杜氏鹽藻細(xì)胞數(shù)之比k2，直到藻細(xì)胞生長到穩(wěn)定期為止；第四部分：對第三部分得到的結(jié)果進(jìn)行對比分析，找出培養(yǎng)基所用最佳mg2+濃度。作為進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案，所述第二部分的步驟①中，確定單位體積藻液中藻細(xì)胞總數(shù)與杜氏鹽藻細(xì)胞數(shù)是使用血球計(jì)數(shù)板的方式對企業(yè)內(nèi)長到穩(wěn)定期的隨機(jī)五個(gè)跑道池中養(yǎng)殖的杜氏鹽藻藻液進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)結(jié)果取平均值，可對企業(yè)養(yǎng)殖杜氏鹽藻的污染情況有進(jìn)一步把握。確定長到穩(wěn)定期的單位體積藻液中藻細(xì)胞總數(shù)a與杜氏鹽藻細(xì)胞數(shù)b，能把企業(yè)養(yǎng)殖杜氏鹽藻的污染情況用數(shù)據(jù)表示出來，有利于后續(xù)工作的開展。作為進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案，所述第二部分的步驟②，杜氏鹽藻藻液中污染雜藻種類多，細(xì)胞形態(tài)較杜氏鹽藻細(xì)胞差距大，因此計(jì)算單位體積藻液中污染雜藻的細(xì)胞數(shù)更加簡單并能直接反映問題。作為進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案，所述第三部分的步驟①中，將培養(yǎng)基中mg2+濃度（mgso4·7h2o）設(shè)置成0，1，2，3，4，5mmol/l六個(gè)梯度，每個(gè)梯度三個(gè)平行，且培養(yǎng)基中其他成分與企業(yè)所用鹽藻養(yǎng)殖培養(yǎng)基成分濃度保持一致，并將配好的培養(yǎng)基置于25升的容器中，每個(gè)容器裝10升培養(yǎng)基。分梯度配置培養(yǎng)基，既能把企業(yè)養(yǎng)殖杜氏鹽藻所用培養(yǎng)基中鎂離子的濃度包括進(jìn)去，又可對不同mg2+濃度梯度的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行對比分析，以使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更理想。同時(shí)，對處于每個(gè)mg2+濃度梯度的培養(yǎng)基設(shè)置三個(gè)平行梯度，能讓實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確。另外，除了mg2+濃度，培養(yǎng)基中其他成分與企業(yè)所用鹽藻養(yǎng)殖培養(yǎng)基成分濃度保持一致，可保證單一變量的原則，并能確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。進(jìn)一步，所述第三部分中所述容器為透明塑料桶。使用透明塑料桶，可以方便人們觀察和記錄數(shù)據(jù)，同時(shí)透明塑料桶可以最大限度的保證試驗(yàn)樣品與跑道池中的藻液接受相同的光照。作為進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案，所述第三部分的步驟②，每個(gè)容器中接入被雜藻污染的杜氏鹽藻藻液1l。這可在不影響杜氏鹽藻正常生長的前提下，使接種藻液鎂離子濃度對整個(gè)培養(yǎng)基中鎂離子濃度的影響降到最低。接種搖勻后測定β-胡蘿卜素含量與單位體積藻液中污染雜藻細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)，可對實(shí)驗(yàn)初始藻液的污染程度有一定把握并提供具體的數(shù)據(jù)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提供對比。接種搖勻后計(jì)算單位體積藻液中污染雜藻細(xì)胞所占的比例k1與單位體積藻液中污染雜藻細(xì)胞數(shù)與杜氏鹽藻細(xì)胞數(shù)之比k2，既能對實(shí)驗(yàn)初始藻液的污染程度有進(jìn)一步把握，又可對實(shí)驗(yàn)結(jié)果提供更正確的理論與數(shù)據(jù)依據(jù)。作為進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案，所述第三部分中的培養(yǎng)方式為將接種后的容器放入養(yǎng)殖鹽藻的跑道池中，并用繩子固定，每隔一個(gè)小時(shí)手搖一次。由于企業(yè)養(yǎng)殖杜氏鹽藻的光照強(qiáng)，溫度高，水的比熱容較大，直接將大塑料桶置于光照下，會使大塑料桶內(nèi)藻液溫度急劇升高，藻細(xì)胞很快會死亡，將接種后的透明塑料桶放入養(yǎng)殖鹽藻的跑道池中，并用繩子固定，可利用跑道池藻液表面積大散熱快的特點(diǎn)，既能保證大塑料桶內(nèi)藻液溫度恒定，又能保證與跑道池內(nèi)藻液溫度保持一致，并且接受的光照強(qiáng)度也一致，確保了單一變量的原則。培養(yǎng)過程匯中，對大塑料桶內(nèi)藻液每隔一個(gè)小時(shí)手搖一次，能保證藻液中藻細(xì)胞充分接受光照，提高藻細(xì)胞的光和效率。本發(fā)明技術(shù)效果顯著，主要體現(xiàn)在：杜氏鹽藻在培養(yǎng)基中鎂離子缺乏時(shí)，會啟用上述污染雜藻沒有的光和系統(tǒng)備用保護(hù)機(jī)制，即合成β-胡蘿卜素，因此，降低培養(yǎng)基中鎂離子濃度會抑制藻液中雜藻的生長，但對杜氏鹽藻的生長影響較小，而且鎂離子缺乏會誘導(dǎo)杜氏鹽藻細(xì)胞積累β-胡蘿卜素。本發(fā)明所述方法與現(xiàn)有高鹽度抑制杜氏鹽藻養(yǎng)殖過程中雜藻污染的方法相比，成本低，效果明顯，操作程序簡單，并可誘導(dǎo)杜氏鹽藻細(xì)胞積累β-胡蘿卜素，可謂一舉兩得。用該方法處理，對杜氏鹽藻生物量幾乎沒有影響，因此藻粉產(chǎn)量恒定，并且使藻粉質(zhì)量提高，企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益增長明顯，對于杜氏鹽藻養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展意義重大。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，便于更好的理解本發(fā)明，但不用于限制本發(fā)明。本實(shí)施例中所涉及的實(shí)驗(yàn)技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常用技術(shù)，實(shí)驗(yàn)材料和試劑，如未特別說明，均為市售商品。本發(fā)明提供了一種抑制杜氏鹽藻養(yǎng)殖過程中雜藻污染的方法，包括以下四個(gè)部分:第一部分：確定杜氏鹽藻養(yǎng)殖過程中污染雜藻的種類；具體為:利用普通光學(xué)顯微鏡和熒光倒置顯微鏡對生長到對數(shù)期的被雜藻污染的杜氏鹽藻進(jìn)行取樣、制片和觀察，并拍照記錄藻液中雜藻的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征，同時(shí)參照《淡水微型生物圖譜》、《微藻生物技術(shù)》和《中國淡水藻類》等相關(guān)書籍對污染藻種進(jìn)行分類鑒定；第二部分：確定生長到穩(wěn)定期的杜氏鹽藻藻液中各種污染雜藻的細(xì)胞數(shù)并計(jì)算其與藻液中細(xì)胞總數(shù)和杜氏鹽藻細(xì)胞數(shù)之比；具體操作步驟為：①用血球計(jì)數(shù)板對企業(yè)內(nèi)長到穩(wěn)定期的隨機(jī)五個(gè)跑道池中養(yǎng)殖的杜氏鹽藻藻液進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)結(jié)果取平均值，確定單位體積藻液中藻細(xì)胞總數(shù)a與杜氏鹽藻細(xì)胞數(shù)b和藻液中β胡蘿卜素含量；②計(jì)算單位體積藻液中污染雜藻的細(xì)胞數(shù)c，計(jì)算公式為：c=a–b③計(jì)算單位體積藻液中污染雜藻細(xì)胞的比例k1，計(jì)算公式為：k1=c/a×100%④計(jì)算單位體積藻液中污染雜藻細(xì)胞數(shù)與杜氏鹽藻細(xì)胞數(shù)之比k2，計(jì)算公式為：k2=c/b第三部分：確定不同mg2+濃度的培養(yǎng)基條件下單位體積藻液中污染雜藻細(xì)胞所占比例；具體步驟為：①配制杜氏鹽藻培養(yǎng)基：將培養(yǎng)基中mg2+濃度（mgso4·7h2o）設(shè)置成0，1，2，3，4，5mmol/l六個(gè)梯度，每個(gè)梯度三個(gè)平行，培養(yǎng)基中其他成分與企業(yè)所用鹽藻養(yǎng)殖培養(yǎng)基成分濃度保持一致，將配好的培養(yǎng)基置于25升透明塑料桶中，每個(gè)透明塑料桶裝10升培養(yǎng)基；②接種：每個(gè)透明塑料桶接入被雜藻污染的杜氏鹽藻藻液1l，搖勻后測定β-胡蘿卜素含量與單位體積藻液中污染雜藻細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算單位體積藻液中污染雜藻細(xì)胞所占的比例k1與單位體積藻液中污染雜藻細(xì)胞數(shù)與杜氏鹽藻細(xì)胞數(shù)之比k2；③培養(yǎng)：將接種后的透明塑料桶放入養(yǎng)殖鹽藻的跑道池中，并用繩子固定，每隔一個(gè)小時(shí)手搖一次；④單位體積藻液中污染雜藻的細(xì)胞數(shù)：在透明塑料桶中的藻液培養(yǎng)過程中，每天固定時(shí)間（與接種時(shí)間保持一致）對每個(gè)透明塑料桶中的藻液進(jìn)行取樣并測定β-胡蘿卜素含量與單位體積藻液中污染雜藻細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算單位體積藻液中污染雜藻細(xì)胞所占的比例k1與單位體積藻液中污染雜藻細(xì)胞數(shù)與杜氏鹽藻細(xì)胞數(shù)之比k2，直到藻細(xì)胞生長到穩(wěn)定期為止;第四部分：對第三部分得到的結(jié)果進(jìn)行對比分析，找出培養(yǎng)基所用最佳mg2+濃度。其中第一部分，確定杜氏鹽藻養(yǎng)殖過程中污染雜藻的種類為微小杜氏藻（綠藻門）、小球藻（綠藻門）、擬微球藻（綠藻門）、鹽生隱桿藻（藍(lán)藻門）。其中第二部分的步驟①具體為：用血球計(jì)數(shù)板對企業(yè)跑道池中生長到穩(wěn)定期的杜氏鹽藻藻液中細(xì)胞總數(shù)和杜氏鹽藻細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，分別為85×104個(gè)/ml、64.5×104個(gè)/ml。用有機(jī)溶劑萃取法對藻液中β-胡蘿卜素進(jìn)行萃取，并用分光光度計(jì)在波長450nm處測定吸光度od450,然后利用公式計(jì)算藻液中β-胡蘿卜素含量為6.9mg/l。其中第二部分的步驟②得到單位體積藻液中污染雜藻的細(xì)胞數(shù)c=20.5×104個(gè)/ml。其中第二部分的步驟③得到單位體積藻液中污染雜藻細(xì)胞的比例k1=24.1%。其中第二部分的步驟④得到單位體積藻液中污染雜藻細(xì)胞數(shù)與杜氏鹽藻細(xì)胞數(shù)之比k2=0.318。附表7給出了實(shí)施例1-實(shí)施例6的實(shí)驗(yàn)結(jié)果對比匯總，具體的各實(shí)施例的技術(shù)方案如下：實(shí)施例1：杜氏鹽藻培養(yǎng)基中mg2+濃度為0mmol/l的實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備：透明塑料桶，血球計(jì)數(shù)板、移液管、洗耳球、分光光度計(jì)實(shí)驗(yàn)條件：自然條件實(shí)驗(yàn)結(jié)果如附表1所示：附表1培養(yǎng)時(shí)間（天）123456789藻液β-胡蘿卜素含量（mg/l）0.650.911.422.483.584.365.245.305.48單位體積杜氏鹽藻細(xì)胞數(shù)（104個(gè)/ml）6.258.513.2523.434.2542.7543.243.543.75雜藻所占比例(%)24.120.415.09.24.71.20.40.20.08雜藻與杜氏鹽藻細(xì)胞數(shù)之比0.3180.2780.2050.1310.0720.0180.0060.0040.003實(shí)施例2：杜氏鹽藻培養(yǎng)基中mg2+濃度為1mmol/l的實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備：透明塑料桶，血球計(jì)數(shù)板、移液管、洗耳球、分光光度計(jì)實(shí)驗(yàn)條件：自然條件實(shí)驗(yàn)結(jié)果如附表2所示：附表2培養(yǎng)時(shí)間（天）123456789藻液β-胡蘿卜素含量（mg/l）0.680.951.552.613.844.755.565.875.86單位體積杜氏鹽藻細(xì)胞數(shù)（104個(gè)/ml）6.548.9014.4624.6536.7548.6751.2551.6752.92雜藻所占比例(%)23.823.522.918.413.710.26.85.55.4雜藻與杜氏鹽藻細(xì)胞數(shù)之比0.3200.3170.3080.2420.1800.1340.0890.0650.058實(shí)施例3：杜氏鹽藻培養(yǎng)基中mg2+濃度為2mmol/l的實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備：透明塑料桶，血球計(jì)數(shù)板、移液管、洗耳球、分光光度計(jì)實(shí)驗(yàn)條件：自然條件實(shí)驗(yàn)結(jié)果如附表3所示：附表3培養(yǎng)時(shí)間（天）123456789藻液β-胡蘿卜素含量（mg/l）0.700.991.802.613.024.976.026.106.09單位體積杜氏鹽藻細(xì)胞數(shù)（104個(gè)/ml）6.759.2516.7528.5039.7050.7555.2555.7556.00雜藻所占比例(%)24.023.822.419.715.21210.710.810.2雜藻與杜氏鹽藻細(xì)胞數(shù)之比0.3150.3120.2930.2590.2000.1570.1380.1280.125實(shí)施例4：杜氏鹽藻培養(yǎng)基中mg2+濃度為3mmol/l的實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備：透明塑料桶，血球計(jì)數(shù)板、移液管、洗耳球、分光光度計(jì)實(shí)驗(yàn)條件：自然條件實(shí)驗(yàn)結(jié)果如附表4所示：附表4培養(yǎng)時(shí)間（天）123456789藻液β-胡蘿卜素含量（mg/l）0.651.161.962.683.215.186.206.256.27單位體積杜氏鹽藻細(xì)胞數(shù)（104個(gè)/ml）6.7510.818.2530.0042.4553.7558.559.2560.00雜藻所占比例(%)23.923.823.221.619.517.816.415.916.0雜藻與杜氏鹽藻細(xì)胞數(shù)之比0.3200.3140.3020.2850.2560.2310.2150.2080.204實(shí)施例5：杜氏鹽藻培養(yǎng)基中mg2+濃度為4mmol/l的實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備：透明塑料桶，血球計(jì)數(shù)板、移液管、洗耳球、分光光度計(jì)實(shí)驗(yàn)條件：自然條件實(shí)驗(yàn)結(jié)果如附表5所示：附表5培養(yǎng)時(shí)間（天）123456789藻液β-胡蘿卜素含量（mg/l）0.621.202.082.753.825.526.546.476.60單位體積杜氏鹽藻細(xì)胞數(shù)（104個(gè)/ml）7.0012.4019.8032.2546.557.2563.2563.863.75雜藻所占比例(%)24.124.023.623.222.522.422.422.522.4雜藻與杜氏鹽藻細(xì)胞數(shù)之比0.3160.3150.3120.2980.2840.2800.2830.2790.281實(shí)施例6：杜氏鹽藻培養(yǎng)基中mg2+濃度為5mmol/l的實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備：透明塑料桶，血球計(jì)數(shù)板、移液管、洗耳球、分光光度計(jì)實(shí)驗(yàn)條件：自然條件實(shí)驗(yàn)結(jié)果如附表6所示：附表6培養(yǎng)時(shí)間（天）123456789藻液β-胡蘿卜素含量（mg/l）0.681.482.513.725.025.956.596.656.71單位體積杜氏鹽藻細(xì)胞數(shù)（104個(gè)/ml）7.0215.2524.836.255061.4568.568.9569.25雜藻所占比例(%)24.124.224.224.023.923.923.724.023.9雜藻與杜氏鹽藻細(xì)胞數(shù)之比0.3200.3170.3160.3210.3180.3170.3210.3180.318對上述實(shí)例進(jìn)行對比分析，對比結(jié)果如附表1所示。結(jié)果表明，當(dāng)培養(yǎng)基中mg2+濃度為2mmol/l時(shí)，可使杜氏鹽藻藻液中污染雜藻比例降低50%以上，杜氏鹽藻生物量的增加影響很小，相對增加了β-胡蘿卜素的積累量；附表7為穩(wěn)定期杜氏鹽藻藻液中各項(xiàng)生長指標(biāo)對比分析表：附表7當(dāng)前第1頁12