本發(fā)明涉及生物技術(shù)和畜牧領(lǐng)域，尤其涉及一種豬結(jié)腸微生物組體外模擬培養(yǎng)的發(fā)酵參數(shù)，主要為培養(yǎng)基配方，還包括發(fā)酵液體體積、ph值、發(fā)酵時(shí)間、溫度、攪拌速度、氧分壓、補(bǔ)料和出料速度。

背景技術(shù)：

動(dòng)物腸道中生活著大量的微生物，其數(shù)量和基因數(shù)都超過(guò)宿主(baekhed等，2005；qin等，2010)，并與宿主有著緊密聯(lián)系。結(jié)腸中微生物在豐度、種類和功能上占主導(dǎo)地位。腸道微生物具有重要的營(yíng)養(yǎng)、免疫、抗腫瘤和抗衰老等作用(王珊珊等，2015)，微生物不僅能發(fā)酵底物為宿主提供宿主所需能量的10％，合成維生素，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收；還能促進(jìn)免疫器官的發(fā)育和免疫細(xì)胞的增殖分化，抑制病原菌在體內(nèi)的增殖等。因此，腸道微生物被稱為動(dòng)物體的一個(gè)“新器官”(hattori等，2009)。

研究腸道微生物的功能和機(jī)制時(shí)，多采用動(dòng)物或人體試驗(yàn)，通過(guò)收糞或屠宰采集腸道中微生物樣品，但面臨著成本高、操作復(fù)雜、糞便代表性低及潛在倫理等問(wèn)題。此外，菌群移植技術(shù)不僅是治療腸道疾病的有效手段，對(duì)艱難梭菌感染、炎性腸病、腸易綜合征和克羅恩病等有較高治愈率，還能提高糖尿病患者胰島敏感性(bakke等，2011；vermerire等，2012；vrieze等，2012；anderson等，2012)；接受菌群移植后的家畜還能表現(xiàn)出與供體動(dòng)物比較一致的健康水平、飼料轉(zhuǎn)化效率和肥胖狀況等表型。但菌群移植的研究面臨著供體篩選程序復(fù)雜、來(lái)源少、標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一、成本高及潛在的倫理問(wèn)題等因素的制約，因此，急需一種技術(shù)手段代替動(dòng)物試驗(yàn)研究腸道微生物的功能和機(jī)制、代替糞便提供大量穩(wěn)定、成本低的腸道菌群用于菌群移植。

體外連續(xù)發(fā)酵模擬培養(yǎng)是解決上述問(wèn)題的有效手段。該系統(tǒng)能夠模擬腸道的主要生理特征如ph值、流加速度、溫度等，加上合適的培養(yǎng)基，理論上可以讓微生物在發(fā)酵系統(tǒng)中與腸道內(nèi)有相似的生長(zhǎng)繁殖特性。因此，該系統(tǒng)可以代替動(dòng)物試驗(yàn)在體外研究腸道微生物的功能和機(jī)制，并且能夠生產(chǎn)出大量質(zhì)量穩(wěn)定的腸道菌群代替糞便中的菌群用于微生物移植，消除了上述存在的一系列制約因素。

已有大量研究表明，單相連續(xù)發(fā)酵系統(tǒng)具有較高水平的穩(wěn)定性，不同培養(yǎng)批次之間的微生物菌群結(jié)構(gòu)相似度基本都在90％以上(陳波，2012；)，并且已經(jīng)在部分食物原料和抗生素等藥物對(duì)人體腸道微生物影響的研究方面取得了進(jìn)展(郭衛(wèi)革，2012；范彬，2016)。美國(guó)食品藥品監(jiān)督局也利用類似的體外系統(tǒng)作為新型的藥物評(píng)價(jià)手段。甚至有研究人員將此系統(tǒng)用于篩選和生產(chǎn)益生菌，對(duì)動(dòng)物生產(chǎn)性能有明顯的促進(jìn)作用(楊偉平，2015)。生產(chǎn)出的微生態(tài)制劑用于糞便移植，研究腸道微生物與宿主的相互作用(yin等，2010)。

培養(yǎng)基的配制是影響體外培養(yǎng)腸道微生物效果最重要的因素，也是決定體外培養(yǎng)系統(tǒng)可靠性的重要因素。營(yíng)養(yǎng)供給直接決定了能夠在體外生長(zhǎng)增殖的細(xì)菌。此外，由于腸道微生物的種類多樣性和代謝網(wǎng)路的復(fù)雜性，一種微生物的代謝產(chǎn)物可能影響著其他好多種微生物的生長(zhǎng)增殖(alain等，2009)。因此，培養(yǎng)基的配制也是最具有挑戰(zhàn)性的技術(shù)難點(diǎn)。已有大量關(guān)于連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)系統(tǒng)穩(wěn)定性和重復(fù)性的研究，及利用該系統(tǒng)評(píng)價(jià)各種飼料原料和藥物對(duì)腸道微生物影響的研究，但對(duì)系統(tǒng)培養(yǎng)的微生物與腸道微生物之間的相似性研究卻很少，造成體外模擬培養(yǎng)的微生物菌群結(jié)構(gòu)與腸道實(shí)際情況有較大差異，試驗(yàn)結(jié)果可信度大打折扣，嚴(yán)重制約了體外培養(yǎng)系統(tǒng)研究腸道微生物的發(fā)展與應(yīng)用。

豬作為重要家畜，對(duì)人們生活水平和健康具有不可替代的作用。腸道微生物對(duì)豬的健康、營(yíng)養(yǎng)利用及其肉品質(zhì)有較大影響。同時(shí)，豬也是重要的模式動(dòng)物，對(duì)人類醫(yī)學(xué)研究也有重要的參考價(jià)值。結(jié)腸是豬腸道微生物聚集和發(fā)揮作用的主要部位，具有重要研究意義。

動(dòng)物體內(nèi)，腸道微生物能夠接觸并利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)主要來(lái)源于飼料。除部分人工合成的氨基酸外，實(shí)際生產(chǎn)中天然飼料原料占主要組成部分。葡萄糖和可溶性淀粉作為快速水解糖類，只有很小一部分能夠到達(dá)后腸段供大腸微生物利用。此外，動(dòng)物自身分泌的消化酶無(wú)法消化的低聚糖和細(xì)胞壁保護(hù)的細(xì)胞內(nèi)的糖也能進(jìn)入大腸。大腸微生物種類豐富，利用的糖種類也復(fù)雜多樣、且組成結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜。因此，葡萄糖和可溶性淀粉作為主要糖來(lái)源用于體外培養(yǎng)大腸微生物似乎并不能滿足需求。豬飼料中的蛋白質(zhì)主要為植物源，培養(yǎng)基中的胰蛋白示和牛肉浸粉均為動(dòng)物源蛋白質(zhì)，這可能是體外模擬培養(yǎng)的限制因素之一。消化道分泌的消化酶和其它分泌蛋白都能被微生物進(jìn)一步利用。

糖蜜(molasses,mol)是制糖工業(yè)的副產(chǎn)物，其主要組成為：干物質(zhì)75％，全糖分46-52％，蔗糖28-32％，還原糖18-20％，非發(fā)酵糖類2-4％，非糖有機(jī)物9-12％，可溶性樹膠及其他碳水化合物4％，還有少量的蛋白質(zhì)、維生素和無(wú)機(jī)鹽(tate等，1979)。玉米漿(cornsteepliquor，csl)是濕磨法生產(chǎn)玉米可溶性淀粉時(shí)的副產(chǎn)物，主要組成為：干物質(zhì)40-50％，粗蛋白質(zhì)16-30％，氨基酸8-12％，還原糖5-7％，維生素0.7-1mg/l總酸8-13％，乳酸7-12％，磷4-4.5％，鉀2-2.5％(李海燕，2013)。糖蜜和玉米漿被廣泛的應(yīng)用抗生素、氨基酸、酶制劑等發(fā)酵工業(yè)中(左瑩等，2013)。

目前沒有比較完善的針對(duì)豬結(jié)腸微生物組的體外模擬培養(yǎng)參數(shù)，從針對(duì)人或動(dòng)物的培養(yǎng)體系照搬過(guò)來(lái)使用，效果較差，微生物組相似性較低，導(dǎo)致體外模型研究豬腸道微生物可靠性較差。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

解決豬結(jié)腸微生物組體外模擬培養(yǎng)效果較差的問(wèn)題，使模擬培養(yǎng)的腸道微生物組與結(jié)腸微生物組相似度達(dá)到一個(gè)較高水平，使體外發(fā)酵模擬培養(yǎng)系統(tǒng)代替動(dòng)物試驗(yàn)研究豬結(jié)腸道微生物更加可靠、可信。

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一套高效的、可靠的、用于體外模擬培養(yǎng)豬結(jié)腸微生物的發(fā)酵參數(shù)，特別是培養(yǎng)基。

本發(fā)明提供的培養(yǎng)基，包括溶質(zhì)，所述溶質(zhì)由牛肉浸粉、胰蛋白示、l-半胱氨酸-hcl、葡萄糖、酵母浸粉、氯化鈉、可溶性淀粉和糖蜜組成。

牛肉浸粉，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，01-008a；

酵母浸粉，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，01-012；

可溶性淀粉(來(lái)源于玉米)，北京索萊寶科技有限公司，g8300；

l-半胱氨酸-hcl(l－cysteine-hcl)，北京索萊寶科技有限公司，c0011；

糖蜜，北京索萊寶科技有限公司，fa0070；

胰蛋白示，oxiod；

葡萄糖，國(guó)藥，40165664；

氯化鈉，國(guó)藥，10019308；

上述培養(yǎng)基中，所述牛肉浸粉、所述胰蛋白示、所述l-半胱氨酸-hcl、所述葡萄糖、所述酵母浸粉、所述氯化鈉、所述可溶性淀粉和所述糖蜜的質(zhì)量比為2-5：20：0.5-1：2-3：5：5：1：5；

或所述牛肉浸粉、所述胰蛋白示、所述l-半胱氨酸-hcl、所述葡萄糖、所述酵母浸粉、所述氯化鈉、所述可溶性淀粉和所述糖蜜的質(zhì)量比為2.4：20：0.6：2.5：5：5：1：5。

本發(fā)明提供的發(fā)酵參數(shù)，包括發(fā)酵液體體積330ml，ph＝6.4±0.1溫度37±0.1℃，攪拌速度120rpm，補(bǔ)料和出料速度330ml/天，發(fā)酵天數(shù)12天，嚴(yán)格厭氧環(huán)境，發(fā)酵時(shí)間：①未開啟進(jìn)出料的悶罐發(fā)酵時(shí)間16h，②開啟進(jìn)出料的連續(xù)發(fā)酵時(shí)間8-14d。

上述可溶性淀粉為玉米可溶性淀粉(來(lái)源于玉米)。

上述培養(yǎng)基中，所述牛肉浸粉在所述培養(yǎng)基中的濃度為2.4g/l；

所述胰蛋白示在所述培養(yǎng)基中的濃度為20g/l；

所述l-半胱氨酸-hcl在所述培養(yǎng)基中的濃度為0.6g/l；

所述葡萄糖在所述培養(yǎng)基中的濃度為2.5g/l；

所述酵母浸粉在所述培養(yǎng)基中的濃度為5g/l；

所述氯化鈉在所述培養(yǎng)基中的濃度為5g/l；

所述可溶性淀粉在所述培養(yǎng)基中的濃度為1g/l；

所述糖蜜在所述培養(yǎng)基中的濃度為5g/l。

上述培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基還包括溶劑，所述培養(yǎng)基由溶質(zhì)和溶劑組成。

上述培養(yǎng)基中，所述溶劑為水。

上述培養(yǎng)基中，所述豬腸道為豬結(jié)腸。

本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種用于體外模擬培養(yǎng)豬腸道微生物的培養(yǎng)基的制備方法。

本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：將上述的培養(yǎng)基的溶質(zhì)中各組分按照所述濃度溶解于溶劑中，得到培養(yǎng)基。

上述的培養(yǎng)基在體外模擬培養(yǎng)豬腸道微生物中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

上述的培養(yǎng)基在體外培養(yǎng)與豬結(jié)腸微生物組具有高水平相似度的發(fā)酵微生物組中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

上述的培養(yǎng)基在制備體外模擬培養(yǎng)豬腸道微生物產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

上述培養(yǎng)基在體外培養(yǎng)與豬結(jié)腸微生物組具有高水平相似度的發(fā)酵微生物組中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

上述培養(yǎng)基在制備體外培養(yǎng)與豬結(jié)腸微生物組具有高水平相似度的發(fā)酵微生物組產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

上述培養(yǎng)基在代替豬糞便用于菌群移植中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

上述培養(yǎng)基在制備代替豬糞便用于菌群移植產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

本發(fā)明第3個(gè)目的是提供一種體外模擬培養(yǎng)豬腸道微生物的方法。

本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：將離體豬結(jié)腸食糜在上述的培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)；所述發(fā)酵培養(yǎng)的發(fā)酵條件：ph6.4±0.1，溫度37.0±0.1℃，進(jìn)料和出料速度為0.042每小時(shí)的置換率(補(bǔ)料和出料速度13.75ml/h)，發(fā)酵天數(shù)8-14天，厭氧發(fā)酵。

上述發(fā)酵培養(yǎng)的攪拌速度120rpm，上述發(fā)酵培養(yǎng)的總體系體積為330ml。

本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明通過(guò)優(yōu)化體外連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)模型的發(fā)酵參數(shù)，培養(yǎng)出與豬腸道較高相似度的微生物組，可使體外模擬培養(yǎng)的豬結(jié)腸微生物組與豬結(jié)腸微生物組的相似度達(dá)到68.5％，比原始的培養(yǎng)基vl的30.7％高出一倍多。大大提高了模型用于體外研究豬腸道微生物可靠性，為代替動(dòng)物試驗(yàn)研究豬腸道微生物的功能和機(jī)制提供一個(gè)可靠有力的實(shí)用工具；其次，該模型發(fā)酵生產(chǎn)出的高相似度水平的微生物組可代替糞便用于菌群移植，解決了成本高、供體少和標(biāo)準(zhǔn)不一等問(wèn)題，對(duì)豬的生產(chǎn)和人類健康研究起到積極地推動(dòng)作用。

附圖說(shuō)明

圖1為體外連續(xù)發(fā)酵模型示意圖。

圖2為本發(fā)明的技術(shù)路線。

圖3為vi1培養(yǎng)基、vl1培養(yǎng)基、vi2培養(yǎng)基和vl2培養(yǎng)基培養(yǎng)后微生物屬和食糜微生物屬水平相對(duì)含量。

圖4為培養(yǎng)基vl2、vlc、vlg、vlcmc培養(yǎng)后微生物屬和食糜微生物屬水平相對(duì)含量。

圖5為培養(yǎng)基vlmol、vlcsl、vlm、zh培養(yǎng)后微生物屬和食糜微生物屬水平相對(duì)含量。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

糖蜜，北京索萊寶科技有限公司，fa0070

玉米漿干粉，北京索萊寶科技有限公司，fa0090

玉米可溶性淀粉，北京索萊寶科技有限公司，g8300

胰蛋白胨：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，01-002

蛋白胨：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，01-001

牛肉浸粉，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，01-008a

酵母浸粉，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，01-012

粘液素，sigma公司，m2378

纖維素，sigma公司，gf08832191-1ea

胰蛋白示，oxiod公司，lp0047b

葡萄糖，國(guó)藥，40165664

氯化鈉，國(guó)藥，10019308

l-半胱氨酸-hcl(l－cysteine-hcl)，北京索萊寶科技有限公司，c0011

羧甲基纖維素鈉，國(guó)藥，30036328

下述實(shí)施例中體外連續(xù)發(fā)酵模型示意圖如圖1所示，下面發(fā)酵在此模型中。

下述實(shí)施例的流程圖如圖2所示。

實(shí)施例1、豬結(jié)腸微生物組體外模擬培養(yǎng)的培養(yǎng)基的發(fā)現(xiàn)和優(yōu)化

一、豬結(jié)腸食糜和vi1、vl1培養(yǎng)基的獲得及檢測(cè)

1、豬結(jié)腸食糜、vi1和vl1培養(yǎng)基的獲得

使用45kg的杜長(zhǎng)大三元雜交去勢(shì)公豬6頭、母豬6頭。先空腹8h，再自由采食12h。頸部放血致死后，迅速打開腹腔，對(duì)空腸、回腸、盲腸和結(jié)腸進(jìn)行結(jié)扎，再收集結(jié)腸食糜，-80℃保存。vi1和vl1培養(yǎng)基按照配方表稱量、混勻。

2、豬結(jié)腸食糜、vi1和vl1培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)組成檢測(cè)

測(cè)定豬結(jié)腸食糜樣、vi1和vl1的粗蛋白質(zhì)、可溶性糖和總能指標(biāo)，方法如下：

干物質(zhì)：gb/t6435-2014

粗蛋白質(zhì)：gb/t6432-1994

可溶性糖：ny/t2742-2015

總能：gb/t12456-2008

結(jié)果如表1所示。

表1結(jié)腸食糜和vi和vl培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)組成

二、培養(yǎng)基的優(yōu)化

1、vi2培養(yǎng)基和vl2培養(yǎng)基的獲得

1)vi2培養(yǎng)基和vl2培養(yǎng)基的配方

現(xiàn)有用于人腸道微生物的vi1培養(yǎng)基和雞腸道微生物的vl1培養(yǎng)基溶質(zhì)組分如下表2和表3所示，溶劑為水，培養(yǎng)基由溶質(zhì)和溶劑組成。

根據(jù)豬結(jié)腸食糜的營(yíng)養(yǎng)組成初步優(yōu)化得到培養(yǎng)基vi2和vl2，配方如表2和表3所示。

表2vi1和vi2培養(yǎng)基配方(g/l)

表3為vl1和vl2培養(yǎng)基配方(g/l)

檢測(cè)豬結(jié)腸食糜、vi1培養(yǎng)基、vl1培養(yǎng)基、vi2培養(yǎng)基和vl2培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)組成，

檢測(cè)方法：

干物質(zhì)：gb/t6435-2014

粗蛋白質(zhì)：gb/t6432-1994

可溶性糖：ny/t2742-2015

總能：gb/t12456-2008

結(jié)果如表4所示。

表4為四種培養(yǎng)基和食糜主要營(yíng)養(yǎng)組成

2)vi2培養(yǎng)基和vl2培養(yǎng)基在體外模擬培養(yǎng)豬結(jié)腸微生物

(1)體外模擬培養(yǎng)豬結(jié)腸微生物

將vi1、vi2、vl1和vl2培養(yǎng)基配制好后，分別加入500ml的發(fā)酵罐和10l的補(bǔ)料瓶中，密封，121℃高壓滅菌30min后，趁熱連入發(fā)酵系統(tǒng)中，接入氮?dú)獗ＷC厭氧環(huán)境。發(fā)酵罐中參數(shù)設(shè)定：液體體積300ml，ph6.4±0.1、溫度37.0±0.1℃、攪拌120rpm。

厭氧條件下收集新鮮豬結(jié)腸食糜用pbs((nacl8.0g，kh2po40.2g，na2hpo42.9g，kcl0.2g，純化水定容至1000ml，調(diào)ph至7.4)溶解并稀釋10倍(m/v)，無(wú)菌紗布過(guò)濾去掉殘?jiān)?，形成接種液。再以體積比1:10的比例接種到發(fā)酵罐中，罐內(nèi)液體體積達(dá)到330ml。悶罐培養(yǎng)16h后，再開啟進(jìn)出料，維持罐內(nèi)體積的恒定，維護(hù)發(fā)酵設(shè)備在運(yùn)行中各個(gè)指標(biāo)保持在設(shè)定值，待穩(wěn)定后停止發(fā)酵。

整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵參數(shù)為：發(fā)酵體積330ml，ph6.4±0.1，溫度37.0±0.1℃，攪拌速度120rpm，進(jìn)料和出料速度330ml/天，發(fā)酵天數(shù)12天，嚴(yán)格厭氧環(huán)境。

(2)體外培養(yǎng)后微生物檢測(cè)

利用16srdna二代焦磷酸測(cè)序技術(shù)，hiseq2500對(duì)結(jié)腸道食糜和發(fā)酵產(chǎn)物中的微生物v3-v4區(qū)進(jìn)行測(cè)序，此部分由北京市計(jì)算中心完成。

a、dna的提取

采用ctab或sds方法分別提取結(jié)腸道食糜和發(fā)酵產(chǎn)物的基因組dna。

采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)dna的純度和濃度，取適量的樣品于離心管中，使用無(wú)菌水稀釋樣品至終濃度為1ng/μl。

b、pcr擴(kuò)增

稀釋后的基因組dna為模板，使用帶barcode的特異引物341f和806r，使用高效和高保真的酶進(jìn)行pcr，得到約400bppcr產(chǎn)物，含有16srdna的v3-v4區(qū)。

pcr反應(yīng)體系及反應(yīng)條件

反應(yīng)條件：95℃5min；95℃1min，50℃1min，72℃1min，25個(gè)循環(huán)；72℃7min，4℃∞。

c、pcr產(chǎn)物的混樣和純化

pcr產(chǎn)物使用2％濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，使用thermoscientific公司的genejet膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。

d、文庫(kù)構(gòu)建和上機(jī)測(cè)序

使用newenglandbiolabs公司的nebultra^tmdnalibraryprepkitforillumina建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)的構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)過(guò)qubit定量和文庫(kù)檢測(cè)，合格后，使用hiseq2500，每個(gè)樣品單獨(dú)建庫(kù)測(cè)序，與genbank上的數(shù)據(jù)比對(duì)，確定每個(gè)樣品微生物組成和其占整個(gè)腸道微生物數(shù)量的百分比(即含量)。

vi1培養(yǎng)基、vl1培養(yǎng)基、vi2培養(yǎng)基和vl2培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物和結(jié)腸道食糜含量前20的微生物組成和含量的檢測(cè)結(jié)果如表5和圖3所示。

表5為含量前20的微生物含量(％)

注：¹此次發(fā)酵接種的食糜

用pearson距離函數(shù)計(jì)算之間的相似度，分析差異菌群，得到結(jié)腸食糜微生物組和各個(gè)培養(yǎng)基體外培養(yǎng)后微生物組菌群相似度，結(jié)果如表6。

表6為模擬微生物組與結(jié)腸微生物組相似度(％)

注：¹此次發(fā)酵接種的食糜

根據(jù)上述結(jié)果可以看出，

在屬水平上，培養(yǎng)基vi2和vi1對(duì)擬桿菌有很強(qiáng)的富集作用，含量分別為76.4％和57.9％，vl2和vl1能夠較好的培養(yǎng)擬桿菌屬和一種未知的微生物屬，培養(yǎng)基vl1能夠富集pyarmidobacter(36.5％)，vl2中沒有明顯富集的細(xì)菌，分布比較均勻；與結(jié)腸食糜微生物結(jié)構(gòu)相似度從高到低依次是vl238.7％，vl130.8％，vi226.5％，vi119.9％。四種培養(yǎng)幾乎都不能培養(yǎng)出腸道中豐度較高的普氏菌屬(prevotella)。優(yōu)化前后vl系列比vi系列高，優(yōu)化之后兩種培養(yǎng)基的相似度都有提高，證明優(yōu)化思路是比較可靠的。

vl2培養(yǎng)基相似度最高，因此被選作再次優(yōu)化的基礎(chǔ)。

2、vl2培養(yǎng)基再次優(yōu)化

1)vlg、vlc和vlcmc培養(yǎng)基的配方

由于腸道食糜中除了可溶性糖，還有部分纖維被微生物發(fā)酵利用，因此粗纖維類的糖類對(duì)微生物應(yīng)該比較重要。

優(yōu)化vl2培養(yǎng)基中的葡萄糖、纖維素和羧甲基纖維素鈉，得到優(yōu)化后培養(yǎng)基vlg、vlc和vlcmc，培養(yǎng)基由溶質(zhì)和溶劑組成，溶質(zhì)組分如表7所示，溶劑為水。

表7為vl2培養(yǎng)基及其優(yōu)化后配方比對(duì)(g/l)

2)優(yōu)化后培養(yǎng)基vlg、vlc和vlcmc在體外模擬培養(yǎng)豬結(jié)腸微生物

(1)體外模擬培養(yǎng)豬結(jié)腸微生物

按照上述1的2)(1)中的方法體外模擬培養(yǎng)豬結(jié)腸微生物。

(2)體外培養(yǎng)后微生物檢測(cè)

按照上述1的2)(2)中的方法檢測(cè)，培養(yǎng)基配方如表7所示。

vl2培養(yǎng)基、vlg培養(yǎng)基、vlc培養(yǎng)基和vlcmc培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物和結(jié)腸道食糜含量前20的微生物組成和含量的檢測(cè)結(jié)果如表8和圖4所示。

表8含量前20的微生物含量(％)

注：¹此次發(fā)酵用于接種的結(jié)腸食糜

按照上述1的2)(2)中的方法計(jì)算結(jié)腸食糜微生物組和各個(gè)培養(yǎng)基體外培養(yǎng)后微生物組菌群相似度，結(jié)果如表9所示。

表9為模擬微生物組與結(jié)腸微生物組相似度(％)

從上述可以看出，在屬水平上，四個(gè)培養(yǎng)基對(duì)擬桿菌富集效果最強(qiáng)，幾乎都在50％以上，vl2最高，達(dá)到54.3％。結(jié)腸中，普氏菌屬(prevotella)占結(jié)腸微生物的50％以上，是豐度最高的菌屬。四個(gè)培養(yǎng)基均未能對(duì)普氏菌屬(prevotella)有較好的富集作用。與結(jié)腸微生物的相似度上，四個(gè)培養(yǎng)基從高到低依次為vlg48.9％，vl223.5％，vlcmc16.7％，vlc11.9％。

試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，溶于水的羧甲基纖維素鈉和不溶的纖維素對(duì)體外模擬培養(yǎng)均有不利影響，降低了模擬培養(yǎng)菌群與腸道菌群的相似度；二者之間的菌群結(jié)構(gòu)相似度達(dá)93.9％，與vl2的相似度分別為97.7％和96.1％，表明這兩種纖維源幾乎沒有被微生物發(fā)酵利用，同時(shí)也證明了發(fā)酵系統(tǒng)的穩(wěn)定和可靠性。從上述可以看出，vlg培養(yǎng)基添加葡萄糖以提高可溶性糖(也是總糖)含量，達(dá)到0.66％，高于結(jié)腸食糜0.43％的可溶性糖，仍然提高了相似度，表明腸道微生物在腸道內(nèi)還利用了相當(dāng)一部分的不可溶性糖，培養(yǎng)基中糖含量很可能仍不夠微生物生長(zhǎng)所需。

(3)體外培養(yǎng)后微生物代謝產(chǎn)物檢測(cè)

檢測(cè)豬結(jié)腸食糜、培養(yǎng)基vl2體外發(fā)酵產(chǎn)物、培養(yǎng)基vlg體外發(fā)酵產(chǎn)物、培養(yǎng)基vlc體外發(fā)酵產(chǎn)物、培養(yǎng)基vlcmc體外發(fā)酵產(chǎn)物中揮發(fā)性脂肪酸。

揮發(fā)酸測(cè)定：離子色譜法

檢測(cè)方法：稱取0.5g樣品于10ml聚丙烯離心管中，加入8ml去離子水，超聲30min后8000轉(zhuǎn)離心10min，取上清液稀釋10倍，用0.22μm濾膜過(guò)濾待上機(jī)。25μl樣品溶液經(jīng)ics-3000離子色譜儀分析(戴安，美國(guó))電導(dǎo)檢測(cè)。多種有機(jī)酸經(jīng)as11分析柱(250mm×4mm)及ag11保護(hù)柱分離，流動(dòng)相洗脫條件：氫氧化鉀梯度，0-5min，0.8-1.5mm；5-10min，1.5-2.5mm；10-15min，2.5mm，流速為1ml/min。

結(jié)果如表10所示。

表10為食糜和培養(yǎng)基vl2、vlg、vlc、vlcmc發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性脂肪酸(mg/g)

注：¹用于此次發(fā)酵接種的結(jié)腸食糜

總體上，在四種發(fā)酵液和結(jié)腸食糜中，乙酸、丙酸、丁酸都是最主要的揮發(fā)性脂肪酸，其中乙酸(0.56～1.34mg/g)＞丁酸(0.24～0.43mg/g)≥丙酸(0.15～0.55mg/g)，這三種揮發(fā)性脂肪酸的比值差異不大。

根據(jù)微生物組間的相似度和發(fā)酵產(chǎn)物，將vlg選作下一次優(yōu)化的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

3、vlg培養(yǎng)基再次優(yōu)化

1)vlmol、vlcsl、vlm、zh培養(yǎng)基的配方

實(shí)際生產(chǎn)中，豬飼料中所含的糖和蛋白質(zhì)主要為植物來(lái)源，并且營(yíng)養(yǎng)和組成較為豐富，因此體外發(fā)酵時(shí)微生物應(yīng)該更傾向于利用與腸道內(nèi)食糜來(lái)源和類型相似的營(yíng)養(yǎng)底物。本試驗(yàn)參考前面部分試驗(yàn)結(jié)果，確定vlg為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，旨在研究糖蜜(molasses,vlmol)替代一半葡萄糖作為糖源、玉米漿干粉(cornsteerliquor，vlcsl)替代一半胰蛋白示作為蛋白來(lái)源和添加消化道分泌的黏蛋白(mucin,vlm)及這三種物質(zhì)的組合(zh)對(duì)豬結(jié)腸微生物組體外模擬培養(yǎng)的影響。培養(yǎng)基由溶質(zhì)和溶劑組成，溶質(zhì)組分如表11所示，溶劑為水

表11為培養(yǎng)基vlmol、vlcsl、vlm、zh配方(g/l)

2)優(yōu)化后培養(yǎng)基vlmol、vlcsl、vlm和zh在體外模擬培養(yǎng)豬結(jié)腸微生物

(1)體外模擬培養(yǎng)豬結(jié)腸微生物

按照上述1的2)(1)中的方法體外模擬培養(yǎng)豬結(jié)腸微生物。

(2)體外培養(yǎng)后微生物檢測(cè)

按照上述1的2)(2)中的方法檢測(cè)

vlmol、vlcsl、vlm和zh培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物和結(jié)腸道食糜含量前20的微生物組成和含量的檢測(cè)結(jié)果如表12和圖5所示。

表12含量前20的微生物含量(％)

注：¹用于此次發(fā)酵接種的結(jié)腸食糜

按照上述1的2)(2)中的方法計(jì)算結(jié)腸食糜微生物組和各個(gè)培養(yǎng)基體外培養(yǎng)后微生物組菌群相似度，結(jié)果如表13所示。

表13為模擬微生物組與結(jié)腸微生物組相似度(％)

注：¹用于此次發(fā)酵接種的結(jié)腸食糜

試驗(yàn)結(jié)果表明，糖蜜和玉米漿干粉能夠富集普氏菌屬(prevotella)，含量分別為25.3％和26.6％，大幅度提高體外模擬培養(yǎng)的效果，而黏蛋白和綜合培養(yǎng)基zh對(duì)體外模擬培養(yǎng)有不利影響。模擬培養(yǎng)效果最好的培養(yǎng)基依次是vlmol、vlcsl、vlm和zh，與結(jié)腸微生物組的相似度分別為68.5％、52.3％、10.7％和5.0％。

(3)體外培養(yǎng)后微生物代謝產(chǎn)物檢測(cè)

檢測(cè)豬結(jié)腸食糜、培養(yǎng)基vlmol體外發(fā)酵產(chǎn)物、培養(yǎng)基vlcsl體外發(fā)酵產(chǎn)物、培養(yǎng)基vlm體外發(fā)酵產(chǎn)物、培養(yǎng)基zh體外發(fā)酵產(chǎn)物中揮發(fā)性脂肪酸(離子色譜，方法步驟同上)。

結(jié)果如表14所示。

表14為培養(yǎng)基vlmol、vlcsl、vlm、zh發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性脂肪酸

注：¹用于此次發(fā)酵接種的結(jié)腸食糜

揮發(fā)性脂肪酸總量上vlmol(1.64mg/g)與食糜相近，vlcsl、vlm和zh與食糜相比有較大幅度提升(3.18、2.80和2.99vs.1.70mg/g)，vfa以乙酸、丙酸和丁酸為主，平均值分別為43.0％、18.0％、25.0％；體外發(fā)酵大大提高了丁酸的濃度(0.69、0.82、0.56和0.81vs.0.13mg/g)和比例(42.0％、26.0％、20.0％和27.0％vs.8.0％、)，而乙酸濃度(0.49、1.22、1.26和1.25vs.1.02mg/g)比較接近。

上述表明，在培養(yǎng)基中添加復(fù)合成分的糖源物質(zhì)糖蜜代替部分葡萄糖和植物來(lái)源的蛋白玉米漿干粉代替部分胰蛋白示，可大幅度提高體外模擬培養(yǎng)的微生物組與腸道微生物組的相似性，特別對(duì)豬結(jié)腸豐度最高的普氏菌屬有重要的促生長(zhǎng)作用。

因此，與豬腸道微生物組具有高度相似性的培養(yǎng)基為vlmol，可使體外模擬培養(yǎng)的豬腸道微生物組與豬腸道微生物組的相似度達(dá)到68.5％，比原始的培養(yǎng)基vl的30.7％高出一倍多，大大提高了模型用于體外研究豬腸道微生物可靠性。