本發(fā)明涉及一種羅丹明-間羥基苯硼酸-葡聚糖高分子聚合物的制備方法；本發(fā)明同時還涉及該高分子聚合物作為抗癌藥物智能釋放熒光探針的應用，屬于高分子化學領域和生物醫(yī)藥應用技術領域。

背景技術：

癌癥已經(jīng)成為人類健康的主要威脅之一，且呈明顯上升趨勢。

葡聚糖（glucan）是以葡萄糖為結構單元而形成的高分子聚合多糖的總稱，相對分子量由數(shù)萬到數(shù)百萬，廣泛存在于微生物、動物和植物界，尤其是在真菌中，是自然界中最重要的純多糖。β-葡聚糖具有生物活性，其中以β-(l-3)鍵連接的β-葡聚糖的活性最強，具有抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等藥理活性，因此醫(yī)學上可用作免疫抗癌藥物。β-葡聚糖的結構式如下：

間羥基苯硼酸最重要的特性是可與1,2-羥基化合物（如糖類、糖蛋白、多酚類物質(zhì)等）形成對ph敏感的共價硼酸脂鍵。間羥基苯硼酸其結構式如下：

羅丹明b(rhodamineb)又稱玫瑰紅b，或堿性玫瑰精，俗稱花粉紅，是一種具有鮮桃紅色的人工合成的染料。羅丹明b在溶液中有強烈的熒光。羅丹明b其結構式如下：

因此，將水溶性好的葡聚糖與間羥基苯硼酸和羅丹明b通過一定的方式形成共聚物，利用其熒光進行抗癌藥物的智能釋放和癌細胞的示蹤，同時體現(xiàn)出良好的生物相溶性，以減少對正常組織的傷害，有望為抗癌領域提供了更多的選擇。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種羅丹明-間羥基苯硼酸-葡聚糖高分子聚合物。

本發(fā)明的另一目的是提供一種羅丹明-間羥基苯硼酸-葡聚糖高分子聚合物的制備方法；

本發(fā)明還有一個更重要的目的，就是提供上述羅丹明-間羥基苯硼酸-葡聚糖高分子聚合物在抗癌藥物智能釋放。

一、羅丹明-間羥基苯硼酸-葡聚糖高分子聚合物

本發(fā)明羅丹明-間羥基苯硼酸-葡聚糖高分子聚合物，是將羅丹明b、間羥基苯硼酸酯化后，連接到葡聚糖上形成的一種生物相容良好的高分子聚合物——羅丹明-間羥基苯硼酸-葡聚糖。其具體制備工藝如下：

（1）帶有硼酸熒光體的制備

將羅丹明b與n,n-二環(huán)己基碳二亞胺溶解在二氯甲烷中；間羥基苯硼酸與4-二甲氨基吡啶溶解在四氫呋喃中；兩種溶液混合后于室溫反應20~36小時；過濾反應液除去生成的鹽，減壓蒸餾除溶劑后，用乙酸乙酯與甲醇的混合溶劑進行硅膠柱層析分離純化，得紅褐色固體，即為硼酸熒光體化合物。

n,n-二環(huán)己基碳二亞胺作為脫水縮合劑；羅丹明b與n,n-二環(huán)己基碳二亞胺的摩爾比為1:1.0~1:1.5；

4-二甲氨基吡啶作為催化劑；4-二甲氨基吡啶與n,n-二環(huán)己基碳二亞胺三乙胺的摩爾比為1.0:1~1.1:1；

羅丹明b與間羥基苯硼酸的摩爾比為1:1.0~1:1.3。

帶有硼酸熒光體的結構式為：

（2）高分子聚合物的制備

硼酸熒光體化合物、葡聚糖加熱攪拌溶解于二甲基亞砜，待冷卻至室溫時加入除水劑氫化鈣，然后在氮氣保護下，于20°c~60°c反應10~12h；反應結束后用冰乙醇沉淀，得到橙色固體即為目標化合物——羅丹明-間羥基苯硼酸-葡聚糖高分子聚合物。

硼酸熒光體化合物與葡聚糖的摩爾質(zhì)量比為120:1~150:1；

硼酸熒光體化合物與氫化鈣的摩爾質(zhì)量比為1:1.0~1:1.5。

目標化合物的結構式為：

式中，n=17~20；數(shù)均分子量mn=3.0×10⁴~3.2×10⁴。

圖1、2分別為本發(fā)明制備的羅丹明b-苯硼酸的核磁共振氫譜及含有苯硼酸脂的抗癌藥物智能釋放熒光探針的核磁共振氫譜。通過核磁共振氫譜分析可以得出，化學位移在7.73ppm、6.85ppm和6.23ppm為羅丹明b苯環(huán)上的h，化學位移在3.30ppm和1.15ppm左右會出現(xiàn)羅丹明b上的特征峰-ch2-和-ch3，化學位移在7.08ppm和6.95ppm為間羥基苯硼酸上的苯環(huán)上的h?；瘜W位移在4.718ppm、3.76ppm、3.68ppm、3.48ppm、3.29ppm為葡聚糖上的h。核磁共振氫譜說明用上述方法制備的共聚產(chǎn)物與設計的共聚物結構一致，表明成功合成了該共聚物。

由于上述制備的高分子聚合物中存在硼酸脂鍵，使得其負載模型藥物到達腫瘤部位之后釋放出羅丹明b，不僅降低了藥物毒性，還能在腫瘤細胞內(nèi)智能釋放熒光體；高分子載體葡聚糖的存在，使聚合物體現(xiàn)出良好的生物相溶性，從而減少了對正常組織的傷害，所以在抗癌藥物的智能釋放方面具有很好的應用前景。

二、羅丹明-間羥基苯硼酸-葡聚糖高分子聚合物的性能及應用

體外模擬的水解、釋放性能：通過紫外分光光度計測定了羅丹明b在552nm處的吸光強度計算熒光探針的熒光體釋放率。取兩份10mg聚合物，分別置于100ml的ph7.4（100mm）與100ml的ph5.0（100mm）的緩沖溶液中，透析48小時，按照一定的時間間隔取樣，測紫外吸收，并與聚合物中含有的羅丹明b進行比較，最終釋放率分別為2.2%和60.0%（見圖3）。由圖3可知，羅丹明-間羥基苯硼酸-葡聚糖高分子聚合物可以在酸性環(huán)境及單糖環(huán)境中作出響應，連接間羥基苯硼酸和葡聚糖的硼酸脂鍵斷裂，導致羅丹明的解離，實現(xiàn)細胞內(nèi)藥物的智能釋放。

綜上所述，本發(fā)明制備的高分子聚合物可在癌細胞內(nèi)高酸性的環(huán)境下硼酸脂鍵發(fā)生斷裂，使得熒光探針結構被破壞，從而釋放出羅丹明b；高分子葡聚糖使聚合物體現(xiàn)出良好的生物相溶性，降低了羅丹明b藥物的毒性，減少對正常組織的傷害，因此，該硼酸脂熒光探針具有很好的釋放效果，體現(xiàn)出了良好的生物水溶性，毒性低，對正常組織的傷害少，是一種具有應用前景的智能釋放載體。

附圖說明

圖1為本發(fā)明制備的羅丹明b-苯硼酸的核磁共振氫譜；

圖2為本發(fā)明制備的含有苯硼酸脂的抗癌藥物智能釋放熒光探針的核磁共振氫譜；

圖3為本發(fā)明熒光探針在ph=5.0和ph=7.4，羅丹明釋放的體外模擬曲線。

具體實施方式

下面通過具體實施例對本發(fā)明苯硼酸熒光探針的合成及結構表征作進一步的說明。

實施例1

（1）帶有硼酸熒光體的制備：將0.24g羅丹明b與0.1gn,n-二環(huán)己基碳二亞胺溶解在12ml二氯甲烷中；0.137g間羥基苯硼酸與0.122g4-二甲氨基吡啶溶解在2ml四氫呋喃中；兩種溶液混合加入50ml圓底燒瓶，并將圓底燒瓶置于室溫反應24小時；反應結束后，過濾反應液除去生成的鹽，減壓蒸餾除溶劑后進行硅膠柱層析（乙酸乙酯:v甲醇=6:1v/v）分離純化，得紅褐色固體，即為帶有硼酸熒光體，記為化合物。產(chǎn)率為54.5%。

¹hnmr(400mhz,cdcl3,δ,ppm):8.4(d,1h,-c6h4oocc6hh3ch-),7.82(t,1h,-c6h4oocc6hhh2ch-),7.72(t,1h,-c6h4oocc6h2hhch-),7.66(d,1h,-c6h4oocc6h3hch-),7.37(d,1h,-c6hh3oocc6h4ch-),716-7.08(m,3h,-c6hh3oocc6h4ch-),6.87-6.78(m,4h,-c6h4oocc6h4ch(c6h2h)2-),673-6.69(d,2h,-c6h4oocc6h4ch(c6h2h)2-),3.60-3.56(m,8h,-(ch2)4-),1.29-1.27(t,12h,-(ch3)4)。

（2）目標化合物的制備：稱取0.18g化合物，0.05g葡聚糖加入到schlenk瓶中，加入15ml二甲基亞砜，加熱攪拌溶解，待冷卻至室溫時加入0.013g氫化鈣，抽真空充氮氣循環(huán)3次，密封后60°c反應12h；用冰乙醇沉淀3次，得目標化合物，記為化合物；產(chǎn)率為51.5%。

¹hnmr(400mhz,d2o:dmso-d6=1:1,δ,ppm):8.28-6.08(ar),4.72(-och(ch)o-)380-3.27(-ch-and-ch2-ofdexandrhb),1.78(-ch3)。

目標化合物對應的結構式中，n（苯硼酸）=17，數(shù)均分子量mn=3.0×10⁴。

實施例2

（1）化合物：同實施例1。

（2）目標化合物的制備：稱取0.08g化合物，0.05g葡聚糖加入到schlenk瓶中，加入15ml二甲基亞砜加熱攪拌溶解，待冷卻至室溫時加入0.013g氫化鈣，抽真空充氮氣循環(huán)3次，密封后60°c反應12h；用冰乙醇沉淀3次得到化合物；產(chǎn)率為25.5%。

¹hnmr(400mhz,d2o:dmso-d6=1:1,δ,ppm):8.28-6.08(ar),4.72(-och(ch)o-)380-3.27(-ch-and-ch2-ofdexandrhb),1.78(-ch3)。

目標化合物對應的結構式中，n（苯硼酸）=19，數(shù)均分子量mn=3.1×10⁴。

實施例3

（1）帶有硼酸熒光體的配制：將0.24g羅丹明b與0.1gn,n-二環(huán)己基碳二亞胺溶解在12ml二氯甲烷中；0.274g間羥基苯硼酸與0.244g4-二甲氨基吡啶溶解在4ml四氫呋喃中；混合加入圓底燒瓶。將圓底燒瓶置于室溫反應24小時。反應液過濾除去生成的鹽，減壓蒸餾除溶劑后進行硅膠柱層析[洗脫液為v(乙酸乙酯):v(甲醇)=6:1]分離純化，得紅褐色固體，即為硼酸熒光體化合物；產(chǎn)率為70.0%。

¹hnmr(400mhz,cdcl3,δ,ppm):8.4(d,1h,-c6h4oocc6hh3ch-),7.82(t,1h,-c6h4oocc6hhh2ch-),7.72(t,1h,-c6h4oocc6h2hhch-),7.66(d,1h,-c6h4oocc6h3hch-),7.37(d,1h,-c6hh3oocc6h4ch-),716-7.08(m,3h,-c6hh3oocc6h4ch-),6.87-6.78(m,4h,-c6h4oocc6h4ch(c6h2h)2-),673-6.69(d,2h,-c6h4oocc6h4ch(c6h2h)2-),3.60-3.56(m,8h,-(ch2)4-),1.29-1.27(t,12h,-(ch3)4).

（2）目標化合物的制備：稱取0.27g化合物，0.05g葡聚糖加入到schlenk瓶中，加入15ml二甲基亞砜加熱攪拌溶解，待冷卻至室溫時加入0.050g氫化鈣，抽真空充氮氣循環(huán)3次，密封后60°c反應12h。用冰乙醇沉淀3次得到化合物；產(chǎn)率為64.5%。

¹hnmr(400mhz,d2o:dmso-d6=1:1,δ,ppm):8.28-6.08(ar),4.72(-och(ch)o-)380-3.27(-ch-and-ch2-ofdexandrhb),1.78(-ch3)。

目標化合物對應的結構式中，n（苯硼酸）=20，數(shù)均分子量mn=3.2×10⁴。