本發(fā)明涉及一種嘧啶硫脲類(lèi)化合物及其用途，具體地說(shuō)，涉及一種由炔丙胺修飾的嘧啶硫脲類(lèi)化合物及其可作為具有多靶點(diǎn)多功能的抗阿爾茨海默病藥物。

背景技術(shù)：

阿爾茨海默病(alzheimer’sdisease，ad)又名早老性癡呆癥，是一種以老年斑(senileplaque，sp)、神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillarytangles，nft)形成及海馬神經(jīng)元丟失為主要病理特征的神經(jīng)退行性疾病。主要臨床表現(xiàn)為記憶能力減退及認(rèn)知功能障礙等，并伴隨有一系列精神病癥狀。ad病因復(fù)雜，發(fā)生發(fā)展過(guò)程中涉及各種復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控因子的變化，單一靶點(diǎn)的藥物很難從根本上解決問(wèn)題。多靶點(diǎn)療法針對(duì)疾病發(fā)病機(jī)制中涉及的多個(gè)靶點(diǎn)來(lái)設(shè)計(jì)小分子化合物，對(duì)于ad這種多病因疾病，通過(guò)多個(gè)靶點(diǎn)的同時(shí)作用對(duì)該疾病治療可能會(huì)達(dá)到更為理想的效果。

在ad眾多發(fā)病機(jī)制中，膽堿能損傷假說(shuō)得到大多數(shù)學(xué)者普遍認(rèn)同，目前臨床上用于治療ad的藥物也多為膽堿酯酶抑制劑。目前fda批準(zhǔn)的抗ad藥物有五個(gè)，分別是多奈哌齊(donepezil)、利斯的明(rivastigmine)、加蘭他敏(galantamine)、他克林(tacrine)、美金剛(memantine)，其中前四個(gè)都是乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，ache)抑制劑，美金剛是n-甲基-d-天門(mén)冬氨酸受體(nmdar)拮抗劑，他克林上市不久后由于肝毒性等副作用而被撤回。此外，石杉?jí)A甲(huperzinea)也是一種高效可逆的競(jìng)爭(zhēng)性ache抑制劑，是國(guó)內(nèi)較為成功的治療ad的藥物。但這些藥物作用靶點(diǎn)單一，只能控制或改善認(rèn)知功能癥狀，并不能從根本上終止疾病進(jìn)程。因此，對(duì)ad治療藥物的研究十分必要，研究開(kāi)發(fā)新穎的ad治療藥物有著重要的醫(yī)學(xué)和社會(huì)學(xué)意義。鑒于針對(duì)ad新靶點(diǎn)新機(jī)制的藥物研發(fā)相繼失敗，ache仍是如今最為有效的治療靶點(diǎn)。因此，研究開(kāi)發(fā)以乙酰膽堿酯酶抑制活性為主，兼具其他靶點(diǎn)的抗ad活性的化合物成為有治療意義和價(jià)值的研究新熱點(diǎn)。

單胺氧化酶(monoamineoxidase，mao)催化內(nèi)源性和外源性單胺類(lèi)物質(zhì)的代謝，氧化脫氨產(chǎn)生過(guò)氧化氫，在人體中被認(rèn)為是老化的標(biāo)志，該酶活性的不斷升高會(huì)引起整個(gè)機(jī)體機(jī)能、尤其是腦功能的逐步退化、衰老。mao-a抑制劑主要影響與抑郁癥和精神紊亂病相關(guān)的神經(jīng)傳遞，用于治療抑郁癥和焦慮癥；mao-b抑制劑則主要影響腦內(nèi)的黑質(zhì)-紋狀體系統(tǒng)，促進(jìn)多巴胺(da)等遞質(zhì)的分泌，可單獨(dú)或組合用于治療老年癡呆癥(riederer，curr.med.chem.2004，11，2033-2043)。此外，在神經(jīng)組織，尤其是在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中mao-b的表達(dá)水平隨機(jī)體的老化而急劇升高，導(dǎo)致多巴胺代謝水平的增加，從而產(chǎn)生過(guò)多的過(guò)氧化氫，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)而導(dǎo)致神經(jīng)元死亡(gaspar，j.med.chem.2011，54，5165-73)。mao-b抑制劑不僅可以促進(jìn)da的釋放，提高腦內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì)水平，改善ad患者的記憶認(rèn)知功能，還可以減少氧化應(yīng)激反應(yīng)給神經(jīng)細(xì)胞帶來(lái)的氧化損傷及神經(jīng)毒性作用，因此，mao-b作為治療ad的一個(gè)重要靶點(diǎn)已受到人們的廣泛關(guān)注。

大量數(shù)據(jù)證明腦內(nèi)的生物金屬離子如cu²⁺，fe²⁺，zn²⁺可以促進(jìn)氧化應(yīng)激(ros)的發(fā)生以及aβ的聚集，而且研究還發(fā)現(xiàn)，ad患者后期腦中都發(fā)現(xiàn)有這些金屬離子的過(guò)度富集，具有氧化還原作用的金屬離子，如鐵離子和銅離子不僅會(huì)導(dǎo)致ros的產(chǎn)生，而且會(huì)將這種氧化作用的危害傳播擴(kuò)散(lee，chem.soc.rev.2014，43，6672-6682.)。研究表明，aβ并不是自發(fā)地聚集，而是與腦中的過(guò)量金屬(如cu²⁺，fe²⁺，zn²⁺)發(fā)生了一種年齡依賴(lài)性的作用，它使aβ沉淀為富含金屬的斑塊。體外實(shí)驗(yàn)表明，金屬離子能促進(jìn)aβ聚集體和淀粉樣斑的形成，而金屬螯合劑能使ad腦的淀粉樣斑塊組織溶解，同時(shí)減輕app轉(zhuǎn)基因鼠的大腦aβ沉淀負(fù)荷?；谶@些研究，合成具有金屬離子鰲合作用的化合物有望成為一種新的治療ad的策略。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)：一種結(jié)構(gòu)新穎的、由炔丙胺修飾的嘧啶硫脲類(lèi)化合物具有膽堿酯酶抑制活性、單胺氧化酶活性、金屬離子螯合性質(zhì)、抑制金屬離子誘導(dǎo)的自由基產(chǎn)生、抑制金屬離子誘導(dǎo)aβ聚集、低細(xì)胞毒性及體外實(shí)驗(yàn)具有良好的血腦透過(guò)率，且其制備工藝簡(jiǎn)潔及制備成本低，有望被開(kāi)發(fā)為一類(lèi)多功能的治療、改善和/或預(yù)防阿爾茨海默病癥的藥物。

本發(fā)明一個(gè)目的在于，提供一種結(jié)構(gòu)新穎的、由炔丙胺修飾的嘧啶硫脲類(lèi)化合物。

本發(fā)明所述的嘧啶硫脲類(lèi)化合物為式i所示化合物、或其在藥學(xué)上可接受的鹽：

式i中，r為氫(h)，c1～c4烴基，c2～c4?；?，或由氰基(cn)或苯基取代的c1～c4烴基；n為1～3的整數(shù)。

本發(fā)明另一個(gè)目的在于，揭示上述嘧啶硫脲類(lèi)化合物的一種用途，即式i所示化合物、或其在藥學(xué)上可接受的鹽在制備抑制乙酰膽堿酯酶、抑制單胺氧化酶a(b)、抑制金屬誘導(dǎo)的aβ聚集和抑制金屬離子誘導(dǎo)的自由基產(chǎn)生活性的抑制劑及金屬離子(如銅離子)螯合劑中的應(yīng)用，或，

式i所示化合物、或其在藥學(xué)上可接受的鹽在制備治療、改善和/或預(yù)防阿爾茨海默病癥的具有多靶點(diǎn)功能的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明還有一個(gè)目的在于，提供一種制備式i所示化合物的方法。所述方法包括如下步驟：

(1)以取代咪唑(m為2或3，下同)為起始原料，由所述的取代咪唑與4-氨基-6-氯嘧啶反應(yīng)，制備中間體(式iia或iib所示化合物)的步驟；

(2)由式iia或iib所示化合物與硫代異氰酸乙酯(chsch2ncs)反應(yīng)，制備中間體(式iiia或iiib所示化合物)的步驟；

(3)由式iiib所示化合物與三溴化磷反應(yīng)，制備中間體(式iv所示化合物)的步驟；

(4)由式iiia或iv所示化合物與炔丙胺或者氮甲基炔丙胺反應(yīng)，得到部分目標(biāo)化合物(式ia或ib所示化合物)的步驟；和，

(5)由式ia所示化合物與鹵代烴或酰氯反應(yīng)，得到另一部分目標(biāo)化合物(式ic所示化合物)的步驟。

其中，r1為c2～c4烴基，c2～c4?；?，或由cn或苯基取代的c1～c4烴基；m為2或3；n為1～3的整數(shù)。

附圖說(shuō)明

圖1.為化合物ia-1和化合物ib-1與金屬離子混合物的紫外吸收光譜；

圖2為cu(ii)-抗壞血酸及cu(ii)-抗壞血酸-化合物ia-1，ib-1，ib-2和ib-3氧化還原體系的熒光值隨時(shí)間的變化曲線(xiàn)；

圖3.為化合物ib-1抑制cu²⁺誘導(dǎo)aβ聚集測(cè)試的tem圖；

其中，(1)為新鮮aβ1-42，(2)為aβ1-42+cu²⁺，(3)為aβ1-42自身聚集，(4)為aβ1-42+cu²⁺+化合物ib-1，(5)為aβ1-42+cu²⁺+cq。

圖4.為dotblotting法測(cè)試化合物ib-1抑制cu²⁺誘導(dǎo)aβ聚集的結(jié)果圖；

其中，1b代表被測(cè)化合物ib-1。

圖5.為化合物ib-1對(duì)胎鼠原代皮層神經(jīng)元的細(xì)胞毒性測(cè)試結(jié)果圖；

其中，1b代表被測(cè)化合物ib-1。

圖6.為化合物ib-1抑制cu²⁺誘導(dǎo)的aβ聚集所致細(xì)胞毒性測(cè)試結(jié)果圖；

其中，1b代表被測(cè)化合物ib-1。

具體實(shí)施方式

在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，r為h，c1～c4烷基，乙酰基，丙炔基(曲線(xiàn)標(biāo)記處為取代位，下同)或由cn或苯基取代的c1～c4烷基；

在進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案中，r為h，甲基，乙基，正丙基，正丁基，乙?；?，或芐基。

適宜的本發(fā)明所述嘧啶硫脲類(lèi)化合物(式i所示化合物)的藥用鹽為：由式i所示化合物與酸成鹽。例如，與無(wú)機(jī)酸或有機(jī)酸的單或二酸所成的鹽，所成的鹽可以是鹽酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽、三氟乙酸鹽、氫溴酸鹽、酒石酸鹽、富馬酸鹽、馬來(lái)酸鹽、枸櫞酸鹽、對(duì)甲苯磺酸鹽或甲磺酸鹽等。這些鹽可通過(guò)公知的成鹽方法由式i的化合物與相應(yīng)的酸反應(yīng)制得。

本發(fā)明所述制備式i所示化合物的方法，具體包括如下步驟：

(1)將4-氨基-6-氯嘧啶和碳酸銫或碳酸鉀置于反應(yīng)器中，加人n，n′-二甲基甲酰胺(dmf)作溶劑，再加入取代咪唑升溫至100℃-140℃，反應(yīng)過(guò)夜。加入適量水，并用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗，無(wú)水硫酸鈉干燥，然后過(guò)濾，減壓蒸除溶劑，殘留物用硅膠柱層析純化，便得到中間體(式iia或iib所示化合物)；

(2)將式iia或iib所示化合物和dmf置于反應(yīng)器中，加入氫化鈉，室溫?cái)嚢柚辽?分鐘后，再加入硫代異氰酸乙酯(ch3ch2ncs)，在此狀態(tài)保持至少半小時(shí)，向反應(yīng)器中加適量水(猝滅反應(yīng))，用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，減壓蒸除溶劑，殘留物用硅膠柱層析純化，得到中間體(式iiia或iiib所示化合物)；

(3)將式iiib所示化合物和二氯甲烷(溶劑)置于反應(yīng)中，在室溫條件下，滴加三溴化磷，并在室溫狀態(tài)保持至少十二小時(shí)，蒸除溶劑，殘留物用硅膠柱層析純化，得到中間體(式iv所示化合物)；

(4)將式iiia所示化合物與甲醇和二氯甲烷的混合物(甲醇∶二氯甲烷＝1∶1，v/v)置于反應(yīng)其中，依次向該反應(yīng)器中加入炔丙胺或者氮甲基炔丙胺氰基硼氫化鈉和醋酸，在室溫狀態(tài)保持至少十二小時(shí)，再向該反應(yīng)器中加入適量水(猝滅反應(yīng))，用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，蒸除溶劑，殘留物用硅膠柱層析純化，得到部分目標(biāo)化合物(式ia或ib所示化合物)；或，

將式iv所示化合物和炔丙胺或氮甲基炔丙胺置于反應(yīng)其中，向該反應(yīng)器中加入碳酸鉀，在室溫狀態(tài)保持至少十二小時(shí)，濃縮，殘留物用硅膠柱層析純化，得到部分目標(biāo)化合物(式ia或ib所示化合物)；和，

(5)將式ia所示化合物和乙腈(溶劑)置于反應(yīng)器中，依次向該反應(yīng)器中加入相應(yīng)的鹵代烴(r1x，r1為c2～c4烴基、或由cn或苯基取代的c1～c4烴基，x為鹵素(f、cl、br或i))，三乙胺和催化量的碘化鉀，在回流狀態(tài)保持至少十二小時(shí)，蒸除溶劑，殘留物用硅膠柱層析純化，得到另一部分目標(biāo)化合物(式ic所示化合物)；或，

將式ia所示化合物和二氯甲烷(溶劑)置于反應(yīng)器中，向該反應(yīng)器中加入酰氯(r2為c1～c3烷基)，在室溫狀態(tài)保持至少十二小時(shí)，蒸除溶劑，殘留物用硅膠柱層析純化，得到另一部分目標(biāo)化合物(化合物ic)。

下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步闡述，其目的僅在于更好理解本發(fā)明的內(nèi)容。因此，所舉之例不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1

1-(6-氨基密啶-4-基)-1h-咪唑-4-甲醛(式iia所示化合物)的制備：

將0.96g(10mmol)1h-咪唑-4-甲醛溶于20ml的dmf中，依次加入1.30g(10mmol)的4-氨基-6-氯嘧啶，2.07g(15mmol)的碳酸鉀，升溫至100℃，攪拌反應(yīng)12h。加入適量水，并用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗，無(wú)水硫酸鈉干燥，然后過(guò)濾，減壓蒸除溶劑，殘留物用硅膠柱層析純化，洗脫劑為甲醇∶二氯甲烷＝1∶30，得白色固體0.87g(式iia所示化合物)，產(chǎn)率為46％。

¹hnmr(400mhz，dmso)δ9.83(s，1h)，8.70(s，1h)，8.64(s，1h)，8.37(s，1h)，7.35(s，2h)，6.72(s，1h).

實(shí)施例2

2-(1-(6-氨基密啶-4-基)-1h-咪唑-4-基)乙-1-醇(式iib-1所示化合物)的制備：

將1.12g(10mmol)的2-(1h-咪唑-4-基)乙-1-醇溶于20ml的dmf中，依次加入1.30g的(10mmol)的4-氨基-6-氯嘧啶，3.91g(12mmol)的碳酸銫，升溫至140℃，攪拌反應(yīng)12h。加入適量水，并用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗，無(wú)水硫酸鈉干燥，然后過(guò)濾，減壓蒸除溶劑，殘留物用硅膠柱層析純化，洗脫劑為甲醇∶二氯甲烷＝1∶30，得白色固體1.19g(式iib-1所示化合物)，產(chǎn)率為58％。

¹hnmr(400mhz，dmso)δ8.33(s，1h)，8.29(s，1h)，7.54(s，1h)，7.16(s，2h)，6.50(s，1h)，4.74-4.59(m，1h)，3.70-3.60(m，2h)，2.66(t，j＝6.9hz，2h).

實(shí)施例3

3-(1-(6-氨基密啶-4-基)-1h-咪唑-4-基)丙-1-醇(式iib-2所示化合物)的制備：

將1.26g(10mmol)的3-(1h-咪唑-4-基)丙-1-醇溶于20ml的dmf中，依次加入1.30g(10mmol)的4-氨基-6-氯嘧啶，3.91g(12mmol)的碳酸銫，升溫至140℃，攪拌反應(yīng)12h。加入適量水，并用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗，無(wú)水硫酸鈉干燥，然后過(guò)濾，減壓蒸除溶劑，殘留物用硅膠柱層析純化，洗脫劑為甲醇∶二氯甲烷＝1∶30，得白色固體0.90g(式iib-2所示化合物)，產(chǎn)率為41％。

¹hnmr(400mhz，dmso)δ8.33(d，j＝1.1hz，1h)，8.29(s，1h)，7.50(s，1h)，7.13(s，1h)，6.50(d，j＝0.7hz，1h)，4.47(t，j＝5.2hz，1h)，3.44(dd，j＝11.7，6.3hz，2h)，2.59-2.51(m，2h)，1.81-1.69(m，2h).

實(shí)施例4

1-乙基-3-(6-(4-甲?；?1h-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)硫脲(式iiia所示化合物)的制備：

將378mg(2mmol)的1-(6-氨基密啶-4-基)-1h-咪唑-4-甲醛(式iia所示化合物)溶于10ml的dmf中，加入96mg(2.4mmol)氫化鈉，室溫?cái)嚢?min，然后加入174mg(2mmol)硫代異氰酸乙酯，室溫?cái)嚢?.5h。加適量水猝滅反應(yīng)，用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗，無(wú)水硫酸鈉干燥，然后過(guò)濾，減壓蒸除溶劑，殘留物用硅膠柱層析純化，洗脫劑為甲醇∶二氯甲烷＝1∶40，得白色固體331mg(式iiia所示化合物)，產(chǎn)率為60％。

¹hnmr(400mhz，dmso)δ11.13(t，j＝5.1hz，1h)，11.10(s，1h)，9.88(s，1h)，8.83(s，1h)，8.61(s，2h)，7.42(s，1h)，3.72-3.57(m，2h)，1.23(t，j＝7.2hz，3h).

實(shí)施例5

1-乙基-3-(6-(4-(2-羥乙基)-1h-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)硫脲(式iiib-1所示化合物)的制備

除2-(1-(6-氨基密啶-4-基)-1h-咪唑-4-基)乙-1-醇(式iib-1所示化合物)替換1-(6-氨基密啶-4-基)-1h-咪唑-4-甲醛(式iia所示化合物)外，其它步驟同實(shí)施例4，得白色固體239mg(式iiib-1所示化合物)，產(chǎn)率41％。

¹hnmr(400mhz，meod)δ8.69(d，j＝0.9hz，1h)，8.52(d，j＝1.2hz，1h)，7.64(s，1h)，6.98(d，j＝0.9hz，1h)，3.84(t，j＝6.7hz，2h)，3.74(q，j＝7.3hz，2h)，2.82(t，j＝6.7hz，2h)，1.31(t，j＝5.6hz，3h).hrms(ei)：m/zcalcdc12h16n6os(m⁺)292.1106，found292.1116.

實(shí)施例6

1-乙基-3-(6-(4-(2-羥丙基)-1h-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)硫脲(式iiib-2所示化合物)的制備

除3-(1-(6-氨基密啶-4-基)-1h-咪唑-4-基)丙-1-醇(式iib-2所示化合物)替換1-(6-氨基密啶-4-基)-1h-咪唑-4-甲醛(式iia所示化合物)外，其它步驟同實(shí)施例4，得白色固體214mg，產(chǎn)率35％(式iiib-2所示化合物)。

¹hnmr(400mhz，dmso)δ11.19(t，j＝5.0hz，1h)，10.92(s，1h)，8.74(s，1h)，8.35(s，1h)，7.42(s，1h)，7.25(s，1h)，4.48(t，j＝5.2hz，1h)，3.70-3.59(m，2h)，3.45(dd，j＝11.7，6.3hz，2h)，2.56(t，j＝7.5hz，2h)，1.81-1.71(m，2h)，1.22(t，j＝7.2hz，3h).

實(shí)施例7

1-(6-(4-(2-溴乙基)-1h-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)-3-乙基硫脲(式iv-1所示化合物)的制備：

將584mg(2mmol)的1-乙基-3-(6-(4-(2-羥乙基)-1h-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)硫脲(式iiib-1所示化合物)溶于30ml的二氯甲烷中，滴加541mg(2mmol)的pbr3，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。減壓蒸除溶劑，殘留物用硅膠柱層析純化，洗脫劑為甲醇∶二氯甲烷體系，得白色固體199mg(式iv-1所示化合物)，產(chǎn)率為28％。

¹hnmr(400mhz，dmso)δ11.19(t，j＝5.6hz，1h)，10.98(s，1h)，8.75(s，1h)，8.40(s，1h)，7.61(s，1h)，7.27(s，1h)，3.76(t，j＝6.9hz，2h)，3.64(dt，j＝14.1，7.1hz，2h)，3.11(t，j＝6.9hz，2h)，1.22(t，j＝5.8hz，3h).

實(shí)施例8

1-(6-(4-(2-溴丙基)-1h-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)-3-乙基硫脲(式iv-2所示化合物)的制備：

除以式iiib-2所示化合物替換式iiib-1所示化合物外，其它步驟與實(shí)施例7相同，得221mg白色固體(標(biāo)題化合物)，產(chǎn)率為30％。

¹hnmr(400mhz，dmso)δ11.27(s，1h)，11.03(t，j＝5.4hz，1h)，9.88(s，1h)，8.88(s，1h)，8.00(d，j＝1.3hz，1h)，7.46(s，1h)，4.36(t，j＝7.3hz，2h)，3.69-3.58(m，2h)，3.02(t，j＝7.0hz，2h)，2.63-2.54(m，2h)，1.21(t，j＝7.2hz，3h).

實(shí)施例9

1-乙基-3-(6-(4-((丙-2-炔-1-基氨基)甲基)-1h-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)硫脲(目標(biāo)化合物ia-1)的制備：

將1-乙基-3-(6-(4-甲?；?1h-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)硫脲(式iiia所示化合物)溶于20ml的甲醇和二氯甲烷的混合物(甲醇∶二氯甲烷＝1∶1)中，依次加入41mg(0.75mmol)的炔丙胺和45mg(0.75mmol)的醋酸，室溫?cái)嚢?0分鐘，再加入63mg(1mmol)的氰基硼氫化鈉，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。減壓蒸除溶劑，殘留物用硅膠柱層析純化，洗脫劑為甲醇∶二氯甲烷體系，得84mg白色固體(標(biāo)題化合物)，產(chǎn)率為53％。

¹hnmr(400mhz，meod)δ8.71(d，j＝0.9hz，1h)，8.55(d，j＝1.2hz，1h)，7.76(s，1h)，7.02(d，j＝1.0hz，1h)，3.86(s，2h)，3.74(q，j＝7.2hz，2h)，3.46(d，j＝2.5hz，2h)，2.67(t，j＝2.5hz，1h)，1.31(t，j＝7.3hz，3h).hrms(ei)：m/zcalcdc14h17n7s(m⁺)315.1266，found315.1269.

實(shí)施例10

1-乙基-3-(6-(4-(2-(丙-2-炔-1-基氨基)乙基)-1h-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)硫脲(目標(biāo)化合物ia-2)的制備：

將178mg(0.5mmol)的1-(6-(4-(2-溴乙基)-1h-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)-3-乙基硫脲(式iv-1所示化合物)溶于1ml的炔丙胺，加入172mg(1.25mmol)的碳酸鉀，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。減壓蒸除溶劑，殘留物用硅膠柱層析純化，洗脫劑為甲醇∶二氯甲烷體系，得115mg黃色固體(標(biāo)題化合物)，mp159-160℃，產(chǎn)率為70％。

¹hnmr(400mhz，meod)δ8.70(d，j＝0.9hz，1h)，8.52(d，j＝1.3hz，1h)，7.63(s，1h)，6.98(d，j＝0.9hz，1h)，3.74(q，j＝7.2hz，2h)，3.44(d，j＝2.5hz，2h)，3.00(t，j＝7.2hz，2h)，2.81(t，j＝7.2hz，2h)，2.62(t，j＝2.5hz，1h)，1.31(t，j＝7.3hz，3h).hrms(ei)：m/zcalcdc15h19n7s(m⁺)329.1423，found329.1424.

實(shí)施例11

1-乙基-3-(6-(4-(3-(丙-2-炔-1-基氨基)丙基)-1h-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)硫脲(目標(biāo)化合物ia-3)的制備

除以1-(6-(4-(2-溴丙基)-1h-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)-3-乙基硫脲(式iv-2所示化合物)替換式iv-1所示化合物外，其它步驟同實(shí)施例10，得黃色固體120mg，mp122-124℃，產(chǎn)率為65％。

¹hnmr(400mhz，dmso)δ11.19(t，j＝5.3hz，1h)，10.92(s，1h)，8.74(s，1h)，8.35(d，j＝1.1hz，1h)，7.44(s，1h)，7.24(s，1h)，3.68-3.60(m，2h)，3.30(d，j＝2.3hz，2h)，3.10(t，j＝2.3hz，1h)，2.56-2.52(m，2h)，2.38(t，j＝7.2hz，2h)，2.19(s，3h)，1.80-1.67(m，2h)，1.22(t，j＝7.2hz，3h).hrms(ei)：m/zcalcdc17h23n7s(m⁺)357.1736，found357.1739.

實(shí)施例12

1-乙基-3-(6-(4-((甲基(丙-2-炔-1-基)氨基)甲基)-1h-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)硫脲(目標(biāo)化合物ib-1)的制備

除氮甲基炔丙胺替換實(shí)施例9中炔丙胺外，其它具體實(shí)施步驟同實(shí)施例9，得49mg白色固體(標(biāo)題化合物)，mp183-184℃，產(chǎn)率為30％。

¹hnmr(400mhz，meod)δ8.71(d，j＝1.0hz，1h)，8.54(d，j＝1.3hz，1h)，7.78(s，1h)，7.02(d，j＝1.0hz，1h)，3.74(q，j＝7.3hz，2h)，3.65(s，2h)，3.39(d，j＝2.4hz，2h)，2.71(t，j＝2.4hz，1h)，2.38(s，3h)，1.31(t，j＝7.3hz，3h).hrms(ei)：m/zcalcdc15h19n7s(m⁺)329.1423，found329.1425.

實(shí)施例13

1-乙基-3-(6-(4-(2-(甲基(丙-2-炔-1-基)氨基)乙基)-1h-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)硫脲(目標(biāo)化合物ib-2)的制備：

除氮甲基炔丙胺替換實(shí)施例10中炔丙胺外，其它具體實(shí)施步驟同實(shí)施例10，得007mg黃色固體(標(biāo)題化合物)，mp162-164℃，產(chǎn)率為68％。

¹hnmr(400mhz，meod)δ8.70(d，j＝0.9hz，1h)，8.51(d，j＝1.3hz，1h)，7.65(s，1h)，6.98(d，j＝0.9hz，1h)，3.74(q，j＝7.3hz，2h)，3.44(d，j＝2.4hz，2h)，2.87-2.77(m，4h)，2.69(t，j＝2.4hz，1h)，2.40(s，3h)，1.35-1.31(m，3h).hrms(esi)：m/zcalcdc16h21n7s[m+h]⁺344.1613，found344.1657.

實(shí)施例14

1-乙基-3-(6-(4-(3-(甲基(丙-2-炔-1-基)氨基)丙基)-1h-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)硫脲(目標(biāo)化合物ib-3)的制備：

除以1-(6-(4-(2-溴丙基)-1h-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)-3-乙基硫脲(式iv-2所示化合物)替換式iv-1所示化合物及氮甲基炔丙胺替換炔丙胺外，其它具體實(shí)施步驟同實(shí)施例10，得127mg黃色固體(標(biāo)題化合物)，mp122-124℃，產(chǎn)率為71％。

¹hnmr(400mhz，dmso)δ11.19(t，j＝5.3hz，1h)，10.92(s，1h)，8.74(s，1h)，8.35(d，j＝1.1hz，1h)，7.44(s，1h)，7.24(s，1h)，3.68-3.60(m，2h)，3.30(d，j＝2.3hz，2h)，3.10(t，j＝2.3hz，1h)，2.56-2.52(m，2h)，2.38(t，j＝7.2hz，2h)，2.19(s，3h)，1.80-1.67(m，2h)，1.22(t，j＝7.2hz，3h).hrms(ei)：m/zcalcdc17h23n7s(m⁺)357.1736，found357.1739.

實(shí)施例15

1-乙基-3-(6-(4-((乙基(丙-2-炔-1-基)氨基)甲基)-1h-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)硫脲(目標(biāo)化合物ic-1)的制備：

將158mg(0.5mmol)的1-乙基-3-(6-(4-((丙-2-炔-1-基氨基)甲基)-1h-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)硫脲(目標(biāo)化合物ia-1)溶于8ml乙腈中，依次加入86mg(0.55mmol)碘乙烷，101mg(1mmol)三乙胺和催化量的碘化鉀，反應(yīng)液回流反應(yīng)12h，減壓蒸除溶劑，殘留物用硅膠柱層析純化，洗脫劑為甲醇∶二氯甲烷體系，得46mg黃色固體(標(biāo)題化合物)，mp163-164℃，產(chǎn)率為27％。

¹hnmr(400mhz，dmso)δ11.18(s，1h)，10.91(s，1h)，8.75(s，1h)，8.39(s，1h)，7.54(s，1h)，7.24(d，j＝32.3hz，1h)，3.64(dt，j＝15.4，7.7hz，2h)，3.58(s，2h)，3.38(s，2h)，3.14(s，1h)，2.59-2.52(m，2h)，1.22(t，j＝6.3hz，3h)，1.03(t，j＝7.0hz，3h).hrms(ei)：m/zcalcdc16h21n7s(m⁺)343.1579，found343.1583.

實(shí)施例16

1-乙基-3-(6-(4-((丙-2-炔-1-基(丙基)氨基)甲基)-1h-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)硫脲(目標(biāo)化合物ic-2)的制備：

除以1-碘丙烷替換實(shí)施例15中碘乙烷外，其它具體實(shí)施步驟同實(shí)施例15，得54mg白色固體(標(biāo)題化合物)，mp158-159℃，產(chǎn)率為30％。

¹hnmr(400mhz，meod)δ8.71(d，j＝1.0hz，1h)，8.53(d，j＝1.3hz，1h)，7.75(s，1h)，7.02(d，j＝1.0hz，1h)，3.74(q，j＝7.3hz，2h)，3.69(s，2h)，3.43(d，j＝2.4hz，2h)，2.65(t，j＝2.4hz，1h)，2.56(dd，j＝8.7，6.7hz，2h)，1.56(dq，j＝14.9，7.4hz，2h)，1.31(t，j＝7.3hz，3h)，0.93(t，j＝7.4hz，3h).hrms(ei)：m/zcalcdc17h23n7s(m⁺)357.1736，found357.1734.

實(shí)施例17

1-乙基-3-(6-(4-((丁基(丙-2-炔-1-基)氨基)甲基)-1h-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)硫脲(目標(biāo)化合物ic-3)的制備：

除以1-碘丁烷替換實(shí)施例15中碘乙烷外，其它具體實(shí)施步驟同實(shí)施例15，得52mg淺黃色固體(標(biāo)題化合物)，mp112-114℃，產(chǎn)率為28％。

¹hnmr(400mhz，meod)δ8.71(d，j＝0.9hz，1h)，8.53(d，j＝1.2hz，1h)，7.76(s，1h)，7.03(d，j＝0.9hz，1h)，3.74(dd，j＝14.5，7.2hz，2h)，3.70(s，2h)，3.44(d，j＝2.4hz，2h)，2.66(t，j＝2.3hz，1h)，2.63-2.58(m，2h)，1.53(dt，j＝15.1，7.5hz，2h)，1.41-1.34(m，2h)，1.31(t，j＝7.3hz，3h)，0.94(t，j＝7.3hz，3h).hrms(ei)：m/zcalcdc18h25n7s(m⁺)371.1892，found371.1895.

實(shí)施例18

1-乙基-3-(6-(4-((氰甲基(丙-2-炔-1-基)氨基)甲基)-1h-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)硫脲(目標(biāo)化合物ic-4)的制備：

除以2-溴乙腈替換實(shí)施例15中碘乙烷外，其它具體實(shí)施步驟同實(shí)施例15，得64mg黃色固體(標(biāo)題化合物)，mp151-152℃，產(chǎn)率為36％。

¹hnmr(400mhz，meod)δ8.72(d，j＝0.9hz，1h)，8.57(d，j＝1.2hz，1h)，7.84(s，1h)，7.02(d，j＝0.9hz，1h)，3.82-3.77(m，4h)，3.74(dd，j＝14.5，7.3hz，2h)，3.51(d，j＝2.4hz，2h)，2.79(t，j＝2.4hz，1h)，1.31(t，j＝7.3hz，3h).hrms(esi)：m/zcalcdc16h18n8s[m+h]⁺355.1409，found355.1454.

實(shí)施例19

n-(1-(6-(3-乙基硫脲)嘧啶-4-基)-1h-咪唑-4-基)甲基-n-(丙-2-炔-1-基)乙酰胺(目標(biāo)化合物ic-5)的制備：

將158mg(0.5mmol)1-乙基-3-(6-(4-((丙-2-炔-1-基氨基)甲基)-1h-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)硫脲(目標(biāo)化合物ia-1)溶于5ml二氯甲烷中，依次加入47mg(0.75mmol)乙酰氯和101mg(1mmol)三乙胺，反應(yīng)液室溫反應(yīng)12h，減壓蒸除溶劑，殘留物用硅膠柱層析純化，洗脫劑為甲醇∶二氯甲烷體系，得80mg白色固體，mp197-199℃，產(chǎn)率為45％。

¹hnmr(400mhz，meod)δ8.76-8.69(m，1h)，8.57(dd，j＝15.0，1.1hz，1h)，7.84(d，j＝33.9hz，1h)，7.03(d，j＝7.2hz，1h)，4.67(d，j＝19.6hz，2h)，4.25(d，j＝2.3hz，2h)，3.75(q，j＝7.2hz，2h)，2.74(dt，j＝59.9，2.5hz，1h)，2.28(d，j＝20.2hz，3h)，1.33(t，j＝7.3hz，3h).hrms(esi)：m/zcalcdc16h19n7os[m+h]⁺358.1405，found358.1448.

實(shí)施例20

1-(6-(4-((芐基(丙-2-炔-1-基)氨基)甲基)-1h-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)-3-乙基硫脲(目標(biāo)化合物ic-6)的制備

除以芐溴替換實(shí)施例15中碘乙烷外，其它具體實(shí)施步驟同實(shí)施例15，得97mg白色固體(標(biāo)題化合物)，mp146-147℃，產(chǎn)率為48％。

¹hnmr(400mhz，meod)δ8.71(d，j＝0.9hz，lh)，8.55(d，j＝1.3hz，1h)，7.78(s，1h)，7.40(d，j＝7.0hz，2h)，7.31(t，j＝7.3hz，2h)，7.25(t，j＝7.2hz，1h)，7.03(d，j＝0.9hz，1h)，3.84-3.62(m，6h)，2.71(t，j＝2.3hz，1h)，1.31(t，j＝7.3hz，3h).hrms(ei)：m/zcalcdc21h23n7s(m⁺)405.1736，found405.1737.

實(shí)施例21

1-(6-(4-((雙(丙-2-炔-1-基)氨基)甲基)-1h-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)-3-乙基硫脲(目標(biāo)化合物ic-7)的制備：

除以3-溴丙-1-炔替換實(shí)施例15中碘乙烷外，其它具體實(shí)施步驟同實(shí)施例15，得64mg白色固體(標(biāo)題化合物)，mp151-153℃，產(chǎn)率為36％。

¹hnmr(400mhz，dmso)δ11.19(t，j＝5.3hz，1h)，10.93(s，1h)，8.76(s，1h)，8.40(d，j＝0.9hz，1h)，7.56(s，1h)，7.29(s，1h)，3.68-3.61(m，2h)，3.59(s，2h)，3.40(d，j＝2.1hz，4h)，3.22(t，j＝2.1hz，2h)，1.22(t，j＝7.2hz，3h).hrms(ei)：m/zcalcdc17h19n7s(m⁺)353.1423，found353.1402.

實(shí)施例22

1-乙基-3-(6-(4-(2-(乙基(丙-2-炔-1-基)氨基)乙基)-1h-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)硫脲(目標(biāo)化合物ic-8)的制備：

除以1-乙基-3-(6-(4-(2-(丙-2-炔-1-基氨基)乙基)-1h-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)硫脲(目標(biāo)化合物ia-2)替換實(shí)施例15中目標(biāo)化合物ia-1外，其它具體實(shí)施步驟同實(shí)施例15，得61mg白色固體(標(biāo)題化合物)，mp154-155℃，產(chǎn)率為33％。

¹hnmr(400mhz，meod)δ8.69(d，j＝0.8hz，1h)，8.51(d，j＝1.2hz，1h)，7.64(s，1h)，6.97(d，j＝0.8hz，1h)，3.73(q，j＝7.3hz，2h)，3.54(d，j＝2.3hz，2h)，2.95-2.86(m，2h)，2.86-2.79(m，2h)，2.70(dd，j＝14.4，7.2hz，2h)，2.66(t，j＝2.3hz，1h)，1.29(t，j＝7.2hz，3h)，1.12(t，j＝7.2hz，3h).hrms(ei)：m/zcalcdc17h23n7s(m⁺)357.1736，found357.1738.

實(shí)施例23

1-(6-(4-(2-((氰甲基)(丙-2-炔-1-基)氨基)乙基)-1h-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)-3-乙基硫脲(化合物ic-9)的制備：

除以1-乙基-3-(6-(4-(2-(丙-2-炔-1-基氨基)乙基)-1h-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)硫脲(目標(biāo)化合物ia-2)替換實(shí)施例15中目標(biāo)化合物ia-1，及以溴乙腈替換實(shí)施例15中碘乙烷外，得64mg白色固體(標(biāo)題化合物)，mp159-160℃，產(chǎn)率為35％。

¹hnmr(400mhz，dmso)δ11.19(t，j＝5.3hz，1h)，10.95(s，1h)，8.74(s，1h)，8.36(d，j＝1.3hz，1h)，7.52(s，1h)，7.25(s，1h)，3.84(s，2h)，3.68-3.59(m，2h)，3.45(d，j＝2.4hz，2h)，3.30(t，j＝2.4hz，1h)，2.83(t，j＝6.9hz，2h)，2.77-2.71(m，2h)，1.22(t，j＝7.2hz，3h).hrms(ei)：m/zcalcdc17h20n8s(m⁺)368.1532，found368.1515.

實(shí)施例24

發(fā)明所述的嘧啶硫脲類(lèi)化合物對(duì)乙酰膽堿酯酶(ache)和丁酰膽堿酯酶(buche)的活性抑制測(cè)試及結(jié)果。

選取大鼠皮層酶原作為乙酰膽堿酯酶酶原，在最適的酶反應(yīng)條件和反應(yīng)體系中，可將本發(fā)明所述的嘧啶硫脲類(lèi)化合物(簡(jiǎn)稱(chēng)為“底物”)加到反應(yīng)模板上，通過(guò)ache與底物的反應(yīng)，用比色法來(lái)檢測(cè)ache抑制活性。

同樣，以大鼠皮層酶原的丁酰膽堿酯酶(buche)作為酶原，在最適的酶反應(yīng)條件和反應(yīng)體系中，可將底物加到反應(yīng)模板上，通過(guò)buche與底物的反應(yīng)用比色法來(lái)檢測(cè)酶的活性，活性數(shù)據(jù)如表1(發(fā)明所述的嘧啶硫脲類(lèi)化合物對(duì)ache和buche抑制活性數(shù)據(jù))所示。

表1.

si定義為ic50(rbuche)/ic50(rache)。

由表1可知，發(fā)明所述的嘧啶硫脲類(lèi)化合物對(duì)乙酰膽堿酯酶(ache)均具有抑制活性(抑制活性最好的化合物ic50值為228nm)。說(shuō)明發(fā)明所述的嘧啶硫脲類(lèi)化合物可以被研發(fā)為ache抑制劑類(lèi)抗ad藥物。

本發(fā)明所述的嘧啶硫脲類(lèi)化合物對(duì)丁酰膽堿酯酶(buche)的抑制活性比較弱(ic50值大于40μm)，說(shuō)明該類(lèi)化合物對(duì)ache具有較好的選擇抑制活性，可以被研發(fā)為選擇性ache抑制劑類(lèi)抗ad藥物。

實(shí)施例25

發(fā)明所述的嘧啶硫脲類(lèi)化合物對(duì)單胺氧化酶a(b)的抑制活性和體外抗氧化活性測(cè)試：

一、發(fā)明所述的嘧啶硫脲類(lèi)化合物對(duì)單胺氧化酶a(b)的抑制活性測(cè)試：

采用invtrogen公司的mao試劑盒測(cè)試發(fā)明所述的嘧啶硫脲類(lèi)化合物對(duì)人重組單胺氧化酶的抑制活性。具體操作步驟如下：

1、溶液的配制：

(1)1×buffer配置：取5×buffer5ml，加入去離子水20ml，現(xiàn)配現(xiàn)用。

(2)mao-a儲(chǔ)備液分裝(sigma，0.5ml)：將mao-a在37℃水浴快速解凍，在冰分裝為10μl×50管，每管含蛋白50μg，約為4.8u。

(3)mao-a測(cè)試液配置(1.0ml)：將mao-a儲(chǔ)備液10μl在37℃水浴快速解凍，用冷的1×buffer稀釋至4.0ml，置于冰上備用。

(4)mao-b儲(chǔ)備液分裝(sigma，0.5ml)：將mao-b在37℃水浴快速解凍，在冰分裝為30μl×16管，每管含蛋白150μg。

(5)mao-b測(cè)試液配置：將mao-a儲(chǔ)備液30μl在37℃水浴快速解凍，用冰1×buffer稀釋至2ml，置于冰上備用。

(6)100mmmao-a底物(對(duì)羥基苯乙胺，tyramine)儲(chǔ)備液配置：將對(duì)羥基苯乙胺溶于1.2ml1×buffer中，分裝為200μl×6管。置于-20℃保存。

(7)100mmmao-b底物(苯乙胺，benzeylamine)儲(chǔ)備液配置：將苯乙胺溶于1.2ml1×buffer中，分裝為200μl×6管。置于-20℃保存。

(8)0.5mmmao-a抑制劑(氯吉蘭，clorgyline)儲(chǔ)備液配置：將氯吉蘭溶于1.0ml去離子水中。置于-20℃保存。

(9)0.5mmmao-b抑制劑(巴吉林，pargyline)儲(chǔ)備液配置：將巴吉林溶于1.0ml去離子水中。置于-20℃保存。

(10)200u/mlhrp儲(chǔ)備液配置：將hrp溶于1ml1×buffer中，分裝為100μl×10管。-20℃保存。

(11)20mmamplexredreagent(componenta)儲(chǔ)備液配置：將1mgamplexredreagent溶于200μldmso中，避光保存?zhèn)溆谩?/p>

(12)10mmh2o2儲(chǔ)備液配置：取3％h2o2溶液11.5μl加入488.5μl1×buffer稀釋?zhuān)褂脮r(shí)配置到適當(dāng)濃度。

(13)化合物溶液制備：測(cè)試時(shí)用1×buffer將10mmdmso儲(chǔ)備液稀釋至所需濃度。

2、mao-a(b)測(cè)試步驟

(1)依次在96孔板中加入mao-a(b)測(cè)試液80μl，20μl不同濃度化合物溶液37℃避光孵育15min。對(duì)照組用20μl1×buffer代替化合物溶液。

(2)在暗室中將100mmmao-a(b)底物(對(duì)羥基苯乙胺或苯乙胺)儲(chǔ)備液200μl，200u/mlhrp儲(chǔ)備液100μl，20mmamplexredreagent儲(chǔ)備液200μl加入至9.5ml1×buffer中作為amplexredreagent工作溶液。

(3)在暗室中將100μl上述amplexredreagent工作溶液分別加入96孔黑板中，混勻，37℃避光孵育15min測(cè)熒光值，激發(fā)波長(zhǎng)：545nm；發(fā)射波長(zhǎng)590nm。

具體測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表2.(發(fā)明所述的嘧啶硫脲類(lèi)化合物對(duì)單胺氧化酶a(b)的抑制活性及抗氧化活性數(shù)據(jù))。

二、發(fā)明所述的嘧啶硫脲類(lèi)化合物體外抗氧化活性測(cè)試：

采用orac-tl法測(cè)試發(fā)明所述的嘧啶硫脲類(lèi)化合物的體外抗氧化能力。具體是以水溶性維生e(trolox)作為標(biāo)準(zhǔn)，被測(cè)化合物的orac值用化合物的抗氧化能力與trolox的抗氧化能力的比值表示(trolox的orac值等于1)。具體操作步驟如下：吸取不同濃度的化合物或trolox20μl與fl(0.117μmol/l)120μl置于96孔黑板中，混勻后37℃孵育10min，快速加入aaph(40.0mm)60μl引發(fā)自由基反應(yīng)，以激發(fā)波長(zhǎng)485nm，發(fā)射波長(zhǎng)535nm每隔2min記錄一次熒光值，共記錄3h，以20μl緩沖液代替化合物作為空白。保護(hù)面積按照下式計(jì)算：

其中f0是在0min的熒光值，fi是在imin的熒光值.

樣品orac值以trolox值當(dāng)量表達(dá)，計(jì)算公式為：[(aucsample-aucblank)/(auctrolox-aucblank)]×[trolox的濃度/樣品的濃度)]。

具體測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表2.(發(fā)明所述的嘧啶硫脲類(lèi)化合物對(duì)單胺氧化酶a(b)的抑制活性及抗氧化活性數(shù)據(jù))。

表2.

續(xù)表1

表2中，si定義為ic50(mao-a)/ic50(mao-b)，n.t.表示未測(cè)試，抑制率為：[1-(fi-fblank)/(fcontrol-fblank))]×100％，其中fblank為背景吸收，fcontrol為對(duì)照組熒光值，fi為化合物組熒光值。

由表2.可知，化合物ia-1，ib-1，ib-2和ib-3具有較好的mao-a(b)抑制活性，其中化合物ia-1和ib-2對(duì)mao-a和mao-b都具有較好的抑制活性，ib-1和ib-3對(duì)mao-b抑制活性較好，而對(duì)mao-a抑制活性較弱，說(shuō)明化合物ib-1和ib-3是較好的mao-b選擇性抑制劑。說(shuō)明本發(fā)明的部分化合物可以發(fā)展成為ache/mao-b雙重抑制劑用于阿爾茨海默病的治療。

此外，在發(fā)明所述的嘧啶硫脲類(lèi)化合物中有一半左右具有較好的抗氧化能力(orac值大于1)，其中化合物ic-1抗氧化能力最好(orac值為1.383)。因此，部分發(fā)明所述的嘧啶硫脲類(lèi)化合物有望被開(kāi)發(fā)為新一類(lèi)抗氧化劑。

實(shí)施例26

發(fā)明所述的嘧啶硫脲類(lèi)化合物對(duì)金屬離子螯合作用的測(cè)試：

以化合物ia-1和化合物ib-1為例，測(cè)試其與金屬離子的螯合作用。以紫外吸收分光光度計(jì)測(cè)量化合物與金屬混合后的紫外吸收變化，以考察化合物是否與金屬離子有螯合作用。具體操作步驟如下：

1、溶液配制方法

20mmph為7.4hepes(150mmnacl)緩沖溶液配制：稱(chēng)取hepes2.383g，nacl4.383g加入超純水定容至500ml，用少量naoh溶液調(diào)ph為7.4。

金屬離子溶液配制：稱(chēng)取一定量的cuso4、feso4和zncl2用超純水配制到濃度為10mm。然后再用20mmhepes緩沖溶液稀釋至400μm。

化合物溶液配制：稱(chēng)取一定量化合物用dmso配制到10mm。然后再用20mmhepes緩沖溶液稀釋至50μm。

2、操作步驟

取5支2ml離心管，每管加150μl的hepes緩沖溶液和800μl的50μm的化合物溶液，再分別加入50μl的400μm的cuso4、feso4、fecl3和zncl2溶液和50μl的hepes緩沖溶液?？瞻诪?μl的dmso溶液加996μl的hepes緩沖溶液溶液?；靹蚝笤谑覝叵路胖?h，倒入英皿測(cè)其在200-500nm的吸收，每個(gè)測(cè)三次，取平均值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1可知，化合物ia-1和化合物ib-1選擇性螯合cu²⁺，而與fe²⁺、fe³⁺、zn²⁺沒(méi)有螯合作用(上述實(shí)施例中制備的其它化合物也有類(lèi)似性質(zhì)，在此不再一一贅述)。所以，發(fā)明所述的嘧啶硫脲類(lèi)化合物是一類(lèi)選擇性cu²⁺螯合劑。

實(shí)施例27

發(fā)明所述的嘧啶硫脲類(lèi)化合物對(duì)金屬銅離子(i/ii)引起的自由基的抑制作用實(shí)驗(yàn)。

以化合物ia-1，化合物ib-1，化合物ib-2和化合物ib-3為例，以已報(bào)道的金屬離子螯合劑edta為陽(yáng)性對(duì)照，具體實(shí)驗(yàn)方法如下：

1、溶液的配制：

20mmph為7.4磷酸緩沖溶液(150mmnacl)配制：稱(chēng)取kh2po41.09g，2.383g，nacl2.34g加入超純水定容至400ml，用少量naoh溶液調(diào)ph為7.4。

20mmph為9.0磷酸緩沖溶液(150mmnacl)配制稱(chēng)取kh2po41.09g，2.383g，nacl2.34g加入超純水定容至400ml，用少量naoh溶液調(diào)ph為9.0。

1mm甲磺酸去鐵胺溶液配制：稱(chēng)取65.7mg甲磺酸去鐵胺用100.0ml20mmph為7.4磷酸緩沖溶液溶解，-20℃保存。測(cè)試時(shí)用20mmph為7.4磷酸緩沖溶液稀釋至20μm。

5mm香豆素-3-羧酸溶液配制：稱(chēng)取19.0mg香豆素-3-羧酸用20.0ml20mmph為9.0磷酸緩沖溶液溶解，再調(diào)ph值至7.4，-20℃保存。測(cè)試時(shí)用20mmph為7.4磷酸緩沖溶液稀釋至500μm。

10mm抗壞血酸溶液配制(現(xiàn)配現(xiàn)用)：稱(chēng)取17.6mg抗壞血酸溶液用10.0ml20mmph為7.4磷酸緩沖溶液溶解。然后再用20mmph為7.4磷酸緩沖溶液稀釋至300μm。

金屬離子溶液配制：稱(chēng)取一定量的cuso4用超純水配制到濃度為10mm。然后再用20mmph為7.4磷酸緩沖溶液稀釋至100μm。

化合物溶液配制：稱(chēng)取一定量化合物用甲醇配制到5mm。然后再用20mmph為7.4磷酸緩沖溶液稀釋至50μm。

2、操作步驟：

在96孔黑板中選取6個(gè)孔，分別依次加入60μl50μm化合物(或60μl20mmph為7.4磷酸緩沖溶液)，10μl100μmcuso4溶液，10μl20μm甲磺酸去鐵胺溶液，20μl500μm香豆素-3-羧酸溶液，然后快速加入100μl300μm抗壞血酸溶液37℃引發(fā)自由基反應(yīng)，以激發(fā)波長(zhǎng)390nm，發(fā)射波長(zhǎng)450nm每隔30s記錄一次熒光值，共記錄40min，以20μl緩沖液代替化合物作為空白。每孔均含甲醇0.1％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可以看出，化合物ia-1，化合物ib-1，化合物ib-2和化合物ib-3具有抑制金屬離子誘導(dǎo)的自由基產(chǎn)生的能力(上述實(shí)施例中制備的其它化合物也有類(lèi)似性質(zhì)，恕不一一贅述)。因此發(fā)明所述的嘧啶硫脲類(lèi)化合物可以發(fā)展為一類(lèi)多功能抗ad藥物。

實(shí)施例28

發(fā)明所述的嘧啶硫脲類(lèi)化合物抑制cu²⁺誘導(dǎo)aβ聚集的測(cè)試。

以化合物ib-1為例，以已報(bào)道的金屬離子螯合劑cq為陽(yáng)性對(duì)照，以透射電子顯微鏡(tem)的方法和dotblotting方法測(cè)試化合物對(duì)cu²⁺誘導(dǎo)aβ聚集抑制活性，實(shí)驗(yàn)方法如下：

1、溶液的配制：

(1)20μmph為6.6hepes(150μmnacl)緩沖溶液配制稱(chēng)取hepes2.38mg，nacl4.38mg加入超純水500ml溶解，用少量naoh溶液調(diào)ph至6.6。

(2)75μmaβ1-42蛋白溶液配制：將0.1mg蛋白溶解于10μl1％nh4oh溶液中，加256μl20μmph為6.6hepes緩沖溶液稀釋至75μm，分裝10μl每管，置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2、樣品制備

化合物樣品：取10μl分裝好的aβ1-42，加入10μl75μmcu²⁺，室溫放置2min，再加化合物ib-1或cq(75mm)10μl?；靹?7℃孵育24h。

對(duì)照樣品1：取10μl分裝好的aβ1-42，加入10μl75μmcu²⁺，室溫放置2min，再加20μmph為6.6hepes緩沖溶液10μl，混勻37℃孵育24h。

對(duì)照樣品2：取10μl分裝好的aβ1-42，加入20μmph6.6hepes緩沖溶液20μl，混勻37℃孵育24h。

對(duì)照樣品3：取10μl分裝好的新鮮aβ1-42，加入20μmph6.6hepes緩沖溶液20μl，混勻37℃孵育0h。

3、透射電子顯微鏡(tem)方法測(cè)試化合物ib-1抑制cu²⁺誘導(dǎo)aβ聚集：

取10μl樣品(化合物樣品及對(duì)照樣品1～3)置于銅網(wǎng)上15min，然后用濾紙吸除多余的液體，置于銅網(wǎng)上的樣品再與10μl2％磷鎢酸作用20s，然后再用濾紙吸除多余的液體。用jem-1400電鏡對(duì)制備好的觀測(cè)樣品進(jìn)行觀察，選取不同的區(qū)域進(jìn)行拍照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可知，aβ1-42在有cu²⁺存在的情況下，孵育24h后聚集程度很?chē)?yán)重(圖3-2)，而當(dāng)加入化合物ib-1和cq時(shí)，aβ1-42的聚集程度得到改善(上述實(shí)施例中制備的其它化合物也有類(lèi)似性質(zhì)，恕不贅述)。因此，發(fā)明所述的嘧啶硫脲類(lèi)化合物具有抑制cu²⁺誘導(dǎo)aβ聚集的能力。

4、dotblotting方法測(cè)試化合物ib-1抑制cu²⁺誘導(dǎo)aβ聚集：

化合物ib-1和aβ的處理方法同電鏡實(shí)驗(yàn)，樣品37℃孵育24h后取5μl滴于0.2μm的nc膜上，室溫風(fēng)干30min后加入5％脫脂奶粉封閉1h后，分別加入a11(1∶500)和6e10(1∶1000)一抗4℃孵育過(guò)夜，tbst洗3次后加入相應(yīng)二抗室溫孵育2h，tbst洗3次，ecl化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4.。圖4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與圖3電鏡實(shí)驗(yàn)的結(jié)果是一致的，cu²⁺可誘導(dǎo)aβ1-42加速聚集，化合物ib-1和陽(yáng)性藥cq可顯著抑制cu²⁺誘導(dǎo)的aβ聚集。

實(shí)施例28

發(fā)明所述的嘧啶硫脲類(lèi)化合物的細(xì)胞毒性測(cè)試：

采用mtt法檢測(cè)發(fā)明所述的嘧啶硫脲類(lèi)化合物對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的毒性。以化合物ib-1為例，多奈哌齊為陽(yáng)性藥。具體操作步驟如下：

將孕17天的孕鼠脫頸椎處死，放入75％酒精中消毒片刻，暴露腹腔后取出胎鼠，解剖顯微鏡下分離皮層，用眼科剪剪碎，溫?zé)岬囊让?含0.4％v/v的dnasei)37℃消化15min。吸取可見(jiàn)的組織團(tuán)塊到dmem-hg培養(yǎng)液(10％fbs)中終止消化，吹散組織后靜置過(guò)篩網(wǎng)，稀釋至3×10⁵個(gè)/ml種96孔板。4h后換成neurobasal培養(yǎng)液(含2％v/vb27，0.5mm谷氨酰胺，0.1％v/v雙抗)，后每隔3天半換液。

原代皮層神經(jīng)元培養(yǎng)至第9天后，換成新鮮培養(yǎng)液并加入相應(yīng)濃度待測(cè)藥物，37℃孵育24h后加入mtt，3h后棄上清液加入100μl的dmso裂解細(xì)胞搖勻，酶標(biāo)儀490nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5.。

由圖5可知，原代皮層神經(jīng)元經(jīng)不同濃度化合物ib-1處理24h后展現(xiàn)出較低的細(xì)胞毒性，10μm和30μm的化合物對(duì)原代皮層神經(jīng)元均無(wú)顯著毒性，100μm化合物呈現(xiàn)出顯著但較低的細(xì)胞毒性(上述實(shí)施例中制備的其它化合物也有類(lèi)似性質(zhì)，恕不贅述)。因此，發(fā)明所述的嘧啶硫脲類(lèi)化合物表現(xiàn)出低細(xì)胞毒性。

此外，由于發(fā)明所述的嘧啶硫脲類(lèi)化合物具有金屬離子螯合作用，可以抑制由金屬離子誘導(dǎo)的β-淀粉樣蛋白(aβ)的聚集，所以此類(lèi)化合物可抑制cu²⁺誘導(dǎo)的aβ聚集所致細(xì)胞毒性。具體測(cè)試實(shí)驗(yàn)的步驟如下：

原代皮層神經(jīng)元培養(yǎng)9天后，加入相應(yīng)組別aβ樣品，37℃孵育24h進(jìn)行mtt檢測(cè)細(xì)胞存活率。egcg和cq分別為aβ自發(fā)聚集和cu2+誘導(dǎo)的aβ聚集的陽(yáng)性藥。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6.。

由圖6可知，aβ+cu²⁺組較aβ(alone)組具有更高的細(xì)胞毒性，化合物ib-1可顯著逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象(上述實(shí)施例中制備的其它化合物也有類(lèi)似性質(zhì)，恕不贅述)。因此，發(fā)明所述的嘧啶硫脲類(lèi)化合物對(duì)于cu²⁺誘導(dǎo)的aβ聚集所致細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用。

實(shí)施例29

發(fā)明所述的嘧啶硫脲類(lèi)化合物透過(guò)血腦屏障能力的測(cè)定：

采用平行人造膜通透性測(cè)定方法(parallelartificialmembranepermeabilityassay，pampa)測(cè)定化合物透過(guò)血腦屏障的能力。該方法通過(guò)化合物的透膜常數(shù)pe的值來(lái)評(píng)價(jià)其透過(guò)血腦屏障的能力，具體操作步驟如下：

取4μl的2％(pbl)溶液加于maipn4550的96孔板的疏水膜上，定量吸取200μl待測(cè)樣品液(100μg/ml)加入到96孔板中的膜上方作為給藥池，膜的另一側(cè)加入300μl緩沖鹽(ph為7.4的pbs∶乙醇＝70∶30)為接受池，注意保持接受液與膜的充分接觸；室溫靜止12h后，小心移除給藥池，用酶標(biāo)儀測(cè)試接受池內(nèi)化合物吸光度值(250-500nm)；吸取200μl待測(cè)樣品液與300μl緩沖鹽(ph為7.4的pbs∶乙醇＝70∶30)充分混勻，作為理論平衡溶液，測(cè)試其吸光度值(250-500nm)，需要用acceptor板測(cè)試；

根據(jù)公式計(jì)算pe值：

vd：給藥池體積，va：接受池體積，a：疏水膜表面積，t：作用時(shí)間，[drug]acceptor：接收池中化合物吸光度，[drug]equilibrium：理論上接收池中化合物吸光度。

平行人造膜通透性測(cè)定方法透過(guò)血腦屏障的臨界值劃分見(jiàn)表3.。

表3.

測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表4.(化合物的透膜常數(shù)(pe)及其能否通過(guò)血腦屏障的預(yù)測(cè))。

表4.

由表4.可知，被測(cè)樣品大部分能夠透過(guò)血腦屏障或處于不確定狀態(tài)，具有良好的成藥性。

綜上，發(fā)明所述的嘧啶硫脲類(lèi)化合物為一類(lèi)新結(jié)構(gòu)的小分子化合物，其具有膽堿酯酶抑制活性，單胺氧化酶活性，金屬離子螯合性質(zhì)，抑制金屬離子誘導(dǎo)的自由基產(chǎn)生，抑制金屬離子誘導(dǎo)aβ聚集，低細(xì)胞毒性，及體外實(shí)驗(yàn)具有良好的血腦透過(guò)率。且其制備工藝簡(jiǎn)潔，生產(chǎn)成本低，因此有望發(fā)展成為一類(lèi)新結(jié)構(gòu)的多功能抗ad藥物。