本發(fā)明屬于環(huán)境微生物資源利用及有機(jī)污染廢水處理領(lǐng)域，具體涉及一種香味菌及其在降解間苯二酚中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

間苯二酚（C6H6O2），亦被稱為雷鎖辛、1,3-苯二酚、間二苯酚，作為一種十分重要的精細(xì)化工原料，主要用于橡膠粘合劑、合成樹脂、染料、醫(yī)藥、分析試劑等方面。間苯二酚是一種重要的有機(jī)化工產(chǎn)品和合成中間體，經(jīng)加工后可加大簾子線與橡膠之間的粘接作用，改善鋼絲對(duì)橡膠的粘接性能，廣泛用于輪胎制造業(yè)、膠管制造業(yè)等橡膠制造行業(yè)。間苯二酚還是許多偶氮染料、毛皮染料的中間體；間苯二酚具有殺菌作用，可用作化妝品等的防腐劑；間苯二酚還可用于醫(yī)藥行業(yè)，主要作為皮膚科非處方藥物，如復(fù)方人參間苯二酚搽劑等的原料。

酚類有機(jī)污染物能夠引起蛋白質(zhì)變性，從而導(dǎo)致細(xì)胞失活或者死亡。間苯二酚同樣屬于對(duì)人體和自然環(huán)境毒害較大的一類酚類污染物：在培養(yǎng)處理48h后，間苯二酚能顯著抑制水生生物多刺裸腹溞體內(nèi)的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）和乙酰膽堿酯酶（AChE）活力，并且對(duì)其半抑制效應(yīng)濃度僅為10.75mg/L；間苯二酚濃度為27.04 mg/L時(shí)即可在24h毒死半數(shù)的泥鰍，且這種毒害作用可隨著間苯二酚在泥鰍體內(nèi)積聚濃度的增大、作用時(shí)間的增加而顯著提高，96h的半致死濃度僅為17.40mg/L。間苯二酚還可隨著生物富集和生物鏈等途徑進(jìn)入陸生動(dòng)物和人體內(nèi)，嚴(yán)重影響人類健康：一定濃度的間苯二酚可通過靜電作用力與牛血清蛋白結(jié)合，繼而破壞牛血清蛋白的空間構(gòu)象并改變某些氨基酸的疏水性；間苯二酚易于被皮膚吸收, 人體吸收少量間苯二酚后可引起皮膚和粘膜的發(fā)炎、痙攣、發(fā)紺、甚至死亡。間苯二酚具有良好的穩(wěn)定性，并且易于在動(dòng)物體內(nèi)積累、難以生物降解，若沒有經(jīng)過處理的含間苯二酚工業(yè)廢水直接排放到環(huán)境中，勢(shì)必會(huì)危害自然環(huán)境和生態(tài)安全。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種香味菌，該香味菌以間苯二酚為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，可有效降解間苯二酚，為有效、安全處理含間苯二酚工業(yè)廢水提供技術(shù)支持和微生物資源。

本發(fā)明還提供了該香味菌在降解間苯二酚中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種香味菌，所述香味菌為香味菌（Myroides sp.）JB-4，于2017年1月13日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)：CGMCC No. 13608。

本發(fā)明的香味菌取樣自山東省曲阜市某污水溝污泥，該菌株經(jīng)過分離、純化、馴化獲得，可利用間苯二酚作為其生長(zhǎng)的唯一碳源。本發(fā)明的香味菌經(jīng)16 SrDNA鑒定屬于香味菌屬（Myroides sp.），在National Center for Biotechnology Information（NCBI，www.ncbi.nlm.nih.gov）上經(jīng)BLAST比對(duì)后，與菌株Myroides sp. TF1-11（登錄號(hào)為KJ127204.1）的同源性可以達(dá)到99%。菌落照片和革蘭氏染色顯微鏡照片如圖1所示；系統(tǒng)發(fā)育樹圖如圖2所示。

所述的，香味菌（Myroides sp.）JB-4單細(xì)胞為短桿狀，屬于革蘭氏陰性菌，在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上純培養(yǎng)時(shí)，菌落呈乳白略帶淡黃色，圓形，表面光滑，有光澤，濕潤(rùn)，不透明，邊緣整齊，易挑取。

所述牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基的配方為：蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化鈉5g、瓊脂20g、蒸餾水1000ml，pH 7.2±0.2，121℃滅菌20 min。一種香味菌（Myroides sp.）JB-4在降解間苯二酚中的應(yīng)用。

所述的，香味菌（Myroides sp.）JB-4降解間苯二酚的具體方法為：將香味菌（Myroides sp.）JB-4懸浮于含間苯二酚的水中，在24-38℃、pH值為5-9的條件下培養(yǎng)42-72h。

所述的，香味菌（Myroides sp.）JB-4的接種量為5%，v/v。

所述的，含間苯二酚的水中間苯二酚的初始濃度不大于700mg/L。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明的香味菌（Myroides sp.）JB-4用于含間苯二酚的工業(yè)廢水或自然水體中降解間苯二酚，不僅具有很高的降解速率和耐受濃度，且無二次污染，使用安全，具有廣闊的應(yīng)用前景。

菌種保藏信息

保藏時(shí)間：2017年01月13日，

保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，

保藏編號(hào)：CGMCC No.13608，

保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼：100101，

分類命名：香味菌Myroides sp.。

附圖說明

圖1為本發(fā)明香味菌Myroides sp. JB-4的照片；

其中：a為菌落照片，b為革蘭氏染色顯微鏡照片；

圖2為本發(fā)明香味菌Myroides sp. JB-4的系統(tǒng)發(fā)育樹圖。

具體實(shí)施方式

以下為列舉的具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但并不因此限制本發(fā)明的內(nèi)容。

本發(fā)明所用的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的配方為：蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化鈉5g、蒸餾水1000ml，pH 7.2±0.2，121℃滅菌20 min。

本發(fā)明所用的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基的配方為：蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化鈉5g、瓊脂20g、蒸餾水1000ml，pH 7.2±0.2，121℃滅菌20 min。

本發(fā)明所用的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基的其配方為：K₂HPO₄?3H₂O 4g、NaH₂PO₄?2H₂O 4g、(NH₄)₂SO₄ 2g、MgSO₄ 0.2g、CaCl₂ 0.01g、MnSO₄?H₂O 0.01g、FeSO₄?7H₂O 0.01g、蒸餾水1000ml，pH 7.2±0.2，121℃滅菌20min。

本發(fā)明所用的無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基的其配方為：K₂HPO₄?3H₂O 4g、NaH₂PO₄?2H₂O 4g、(NH₄)₂SO₄ 2g、MgSO₄ 0.2g、CaCl₂ 0.01g、MnSO₄?H₂O 0.01g、FeSO₄?7H₂O 0.01g、瓊脂20g、蒸餾水1000ml，pH 7.2±0.2，121℃滅菌20min。

本發(fā)明采用比色法測(cè)定水體中間苯二酚的濃度含量。

實(shí)施例1

一種香味菌，所述香味菌為香味菌（Myroides sp.）JB-4，于2017年1月13日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)：CGMCC No. 13608。

本發(fā)明的香味菌取樣自山東省曲阜市某污水溝污泥，該菌株經(jīng)過分離、純化、馴化獲得，可利用間苯二酚作為其生長(zhǎng)的唯一碳源。本發(fā)明的香味菌經(jīng)16 SrDNA鑒定屬于香味菌屬（Myroides sp.），在National Center for Biotechnology Information（NCBI，www.ncbi.nlm.nih.gov）上經(jīng)BLAST比對(duì)后，與菌株Myroides sp. TF1-11（登錄號(hào)為KJ127204.1）的同源性可以達(dá)到99%。

所述的，香味菌（Myroides sp.）JB-4單細(xì)胞為短桿狀，屬于革蘭氏陰性菌，在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上純培養(yǎng)時(shí)，菌落呈乳白略帶淡黃色，圓形，表面光滑，有光澤，濕潤(rùn)，不透明，邊緣整齊，易挑取。

一種香味菌（Myroides sp.）JB-4在降解間苯二酚中的應(yīng)用。

所述的，香味菌（Myroides sp.）JB-4降解間苯二酚的具體方法為：將香味菌（Myroides sp.）JB-4懸浮于含間苯二酚的水中，在24℃、pH值為9的條件下培養(yǎng)42h，間苯二酚的降解率為29.12%。

所述的，香味菌（Myroides sp.）JB-4的接種量為5%，v/v。

所述的，含間苯二酚的水中間苯二酚的初始濃度為600mg/L。

實(shí)施例2

一種香味菌，所述香味菌為香味菌（Myroides sp.）JB-4，于2017年1月13日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)：CGMCC No. 13608。

本發(fā)明的香味菌取樣自山東省曲阜市某污水溝污泥，該菌株經(jīng)過分離、純化、馴化獲得，可利用間苯二酚作為其生長(zhǎng)的唯一碳源。本發(fā)明的香味菌經(jīng)16 SrDNA鑒定屬于香味菌屬（Myroides sp.），在National Center for Biotechnology Information（NCBI，www.ncbi.nlm.nih.gov）上經(jīng)BLAST比對(duì)后，與菌株Myroides sp. TF1-11（登錄號(hào)為KJ127204.1）的同源性可以達(dá)到99%。

所述的，香味菌（Myroides sp.）JB-4單細(xì)胞為短桿狀，屬于革蘭氏陰性菌，在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上純培養(yǎng)時(shí)，菌落呈乳白略帶淡黃色，圓形，表面光滑，有光澤，濕潤(rùn)，不透明，邊緣整齊，易挑取。

一種香味菌（Myroides sp.）JB-4在降解間苯二酚中的應(yīng)用。

所述的，香味菌（Myroides sp.）JB-4降解間苯二酚的具體方法為：將香味菌（Myroides sp.）JB-4懸浮于含間苯二酚的水中，在28℃、pH值為6的條件下培養(yǎng)72h，間苯二酚的降解率為26.35%。

所述的，香味菌（Myroides sp.）JB-4的接種量為5%，v/v。

所述的，含間苯二酚的水中間苯二酚的初始濃度為700mg/L。

在本實(shí)施例條件下，當(dāng)含間苯二酚的水中間苯二酚的初始濃度分別為300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L、700mg/L時(shí)，間苯二酚的降解率分別為：100%、94.58%、30.75%、29.40%、26.35%。

實(shí)施例3

一種香味菌，所述香味菌為香味菌（Myroides sp.）JB-4，于2017年1月13日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)：CGMCC No. 13608。

本發(fā)明的香味菌取樣自山東省曲阜市某污水溝污泥，該菌株經(jīng)過分離、純化、馴化獲得，可利用間苯二酚作為其生長(zhǎng)的唯一碳源。本發(fā)明的香味菌經(jīng)16 SrDNA鑒定屬于香味菌屬（Myroides sp.），在National Center for Biotechnology Information（NCBI，www.ncbi.nlm.nih.gov）上經(jīng)BLAST比對(duì)后，與菌株Myroides sp. TF1-11（登錄號(hào)為KJ127204.1）的同源性可以達(dá)到99%。

所述的，香味菌（Myroides sp.）JB-4單細(xì)胞為短桿狀，屬于革蘭氏陰性菌，在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上純培養(yǎng)時(shí)，菌落呈乳白略帶淡黃色，圓形，表面光滑，有光澤，濕潤(rùn)，不透明，邊緣整齊，易挑取。

一種香味菌（Myroides sp.）JB-4在降解間苯二酚中的應(yīng)用。

所述的，香味菌（Myroides sp.）JB-4降解間苯二酚的具體方法為：將香味菌（Myroides sp.）JB-4懸浮于含間苯二酚的水中，在38℃、pH值為5的條件下培養(yǎng)60h，間苯二酚的降解率為30.35%。

所述的，香味菌（Myroides sp.）JB-4的接種量為5%，v/v。

所述的，含間苯二酚的水中間苯二酚的初始濃度為500mg/L。

香味菌（Myroides sp.）JB-4的初篩、復(fù)篩和馴化

香味菌（Myroides sp.）JB-4是從山東省曲阜市某污水溝污泥取樣，經(jīng)初篩和復(fù)篩得到的一株革蘭氏陰性菌，具體步驟如下：

一、初篩

（1）富集培養(yǎng)：樣品取自山東省濟(jì)寧市曲阜市某污水溝污泥，稱取該污泥5g接種于45ml牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基（內(nèi)含數(shù)粒小玻璃珠，為使污泥更充分分散至培養(yǎng)基中）中，于30℃、150 r/min搖床中富集培養(yǎng)24h，獲得富集菌液；

（2）分離純化：在無菌環(huán)境下，用移液槍取富集菌液0.5ml加入到4.5ml無菌水中，充分混勻，制備成10^-1的菌液；再吸取該稀釋菌液0.5ml加入到4.5ml無菌水中，充分混勻，制備成10^-2的菌液；同樣的方法依次制備成梯度為10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的菌液；分別取稀釋梯度為10-4、10-5、10-6的菌液200μl，涂布于間苯二酚濃度為100mg/L的篩選培養(yǎng)基-無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上，先將制得的平板正置于30℃培養(yǎng)箱中30min，后倒置于30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h；挑取平板上形態(tài)、大小不同的單菌落劃線于純化培養(yǎng)基-牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，倒置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；多次重復(fù)上一步驟，直至獲得純菌落，接種于斜面培養(yǎng)基-牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，于4℃冰箱中保存待用。

二、復(fù)篩

（1）菌株活化：在無菌環(huán)境下，分別挑取初篩步驟（2）獲得的純菌落一環(huán)，接種于活化培養(yǎng)基-牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，倒置于30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，得活化菌株；

（2）種子培養(yǎng)：在無菌環(huán)境下，將活化菌株以5%（V/V）接種量接種于種子培養(yǎng)基-牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，于30℃、150 r/min搖床培養(yǎng)24h，得種子液；

（3）發(fā)酵降解：將種子液以5%（V/V）接種量接種于40ml間苯二酚濃度為100mg/L的發(fā)酵培養(yǎng)基-無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，于30℃、150 r/min搖床培養(yǎng)72h，得發(fā)酵液；

（4）離心：將發(fā)酵液用12000 r/min離心10 min，獲得上清液；

（5）間苯二酚濃度檢測(cè)：采用比色法分別測(cè)定上清液中的間苯二酚的濃度含量，獲得高效降解間苯二酚的香味菌（Myroides sp.）JB-4。

三、馴化

（1）菌株活化：在無菌條件下，挑取復(fù)篩步驟獲得的香味菌（Myroides sp.）JB-4純菌落一環(huán)，接種于5ml活化培養(yǎng)基-牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，置于30℃、150 r/min搖床震蕩培養(yǎng)24h，得活化種子液；

（2）將活化種子液以5%（V/V）接種量接種于40ml間苯二酚濃度為100mg/L的發(fā)酵培養(yǎng)基-無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，于30℃、150 r/min搖床培養(yǎng)72h，得馴化菌液；取馴化發(fā)酵菌液10ml于12000 r/min離心10 min后，取上清液用比色法測(cè)定上清液中間苯二酚濃度含量；

（3）將步驟（2）獲得的馴化菌液以5%（V/V）接種量接種于40ml間苯二酚濃度為200mg/L的發(fā)酵培養(yǎng)基-無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，于30℃、150 r/min搖床培養(yǎng)72h，得馴化菌液；取該馴化發(fā)酵菌液10ml于12000 r/min離心10 min后，取上清液用比色法測(cè)定上清液中間苯二酚濃度含量；

（4）將步驟（3）獲得的馴化菌液以5%（V/V）接種量接種于40ml間苯二酚濃度為300mg/L的發(fā)酵培養(yǎng)基-無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，于30℃、150 r/min搖床培養(yǎng)72h，得馴化菌液；取該馴化發(fā)酵菌液10ml于12000 r/min離心10 min后，取上清液用比色法測(cè)定上清液中間苯二酚濃度含量；

（5）將步驟（4）獲得的馴化菌液以5%（V/V）接種量接種于40ml間苯二酚濃度為400mg/L的發(fā)酵培養(yǎng)基-無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，于30℃、150 r/min搖床培養(yǎng)72h，得馴化菌液；取該馴化發(fā)酵菌液10ml于12000 r/min離心10 min后，取上清液用比色法測(cè)定上清液中間苯二酚濃度含量；

（6）將步驟（5）獲得的馴化菌液以5%（V/V）接種量接種于40ml間苯二酚濃度為500mg/L的發(fā)酵培養(yǎng)基-無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，于30℃、150 r/min搖床培養(yǎng)72h，得馴化菌液；取該馴化發(fā)酵菌液10ml于12000 r/min離心10 min后，取上清液用比色法測(cè)定上清液中間苯二酚濃度含量；

（7）將步驟（6）獲得的馴化菌液以5%（V/V）接種量接種于40ml間苯二酚濃度為600mg/L的發(fā)酵培養(yǎng)基-無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，于30℃、150 r/min搖床中培養(yǎng)72h，得馴化菌液；取該馴化發(fā)酵菌液10ml于12000 r/min離心10 min后，取上清液用比色法測(cè)定上清液中間苯二酚濃度含量；

（8）將步驟（7）獲得的馴化菌液以5%（V/V）接種量接種于40ml間苯二酚濃度為700mg/L的發(fā)酵培養(yǎng)基-無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，于30℃、150 r/min搖床中培養(yǎng)72h，得馴化菌液；取該馴化發(fā)酵菌液10ml于12000 r/min離心10 min后，取上清液用比色法測(cè)定上清液中間苯二酚濃度含量；

（9）將步驟（8）獲得的馴化菌液以5%（V/V）接種量接種于40ml間苯二酚濃度為800mg/L的發(fā)酵培養(yǎng)基-無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，于30℃、150 r/min搖床中培養(yǎng)72h，得馴化菌液；取該馴化發(fā)酵菌液10ml于12000 r/min離心10 min后，取上清液用比色法測(cè)定上清液中間苯二酚濃度含量；

（10）將步驟（9）獲得的馴化菌液以5%（V/V）接種量接種于40ml間苯二酚濃度為900mg/L的發(fā)酵培養(yǎng)基-無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，于30℃、150 r/min搖床中培養(yǎng)72h，得馴化菌液；取該馴化發(fā)酵菌液10ml于12000 r/min離心10 min后，取上清液用比色法測(cè)定上清液中間苯二酚濃度含量；

（11）經(jīng)馴化后發(fā)現(xiàn)間苯二酚降解菌香味菌（Myroides sp.）JB-4能有效降解初始濃度不大于700mg/L的間苯二酚。