本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及一種具有抑制ATG4B酶活性的抑制劑及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

細(xì)胞自噬是真核細(xì)胞所特有的對細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器及長壽命蛋白通過溶酶體途徑進行降解的細(xì)胞生物學(xué)過程。自噬對于維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)細(xì)胞物質(zhì)能量代謝具有重要意義，因此2016年諾貝爾生理與醫(yī)學(xué)獎就授予細(xì)胞自噬的研究專家大隅良典。細(xì)胞自噬是一個動態(tài)變化的過程，可大致分為以下幾個階段：誘導(dǎo)與成核、延伸、自噬體的成熟、自噬體與溶酶體的融合及其內(nèi)容物的降解^[3]。在這一過程中，有多種自噬相關(guān)基因(Autophagy-related genes,ATG)的參與，其中兩條泛素樣通路ATG12-ATG5-ATG16和ATG8-PE(phosphatidylethanolamine)在自噬體的延伸和成熟過程中起著重要的作用，而ATG12-ATG5-ATG16復(fù)合物作為E3樣酶有助于ATG8與PE的結(jié)合。ATG8必須經(jīng)過一個蛋白水解過程暴露C末端的甘氨酸才能錨定在自噬泡膜上。ATG4作為C54家族的一種半胱氨酸蛋白酶，在ATG8連接系統(tǒng)中起了非常關(guān)鍵的作用。ATG4可以剪切ATG8的C端精氨酸，使其暴露出C端的甘氨酸殘基，以便與PE共價連接形成ATG8-PE錨定在自噬泡膜上。接下來ATG4還能去脂化ATG8-PE，以便使自噬體與溶酶體融合。因此，通過調(diào)控ATG4介導(dǎo)的ATG8-PE的去脂化過程能調(diào)控整個自噬的過程。

ATG4家族成員在脂化與去脂化ATG8家族成員以形成自噬體的過程中扮演著非常重要的作用。ATG4在酵母中僅有一個成員，其功能的缺失將阻斷整個自噬的進程。而在哺乳動物細(xì)胞中ATG4有四個家族成員：ATG4A、ATG4B、ATG4C和ATG4D。ATG4B作為ATG4家族中研究最為廣泛的成員，對ATG8家族成員(LC3家族及GABARAP家族)均具有酶切活性。

已有文獻報道，ATG4B在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起了重要作用。ATG4B被認(rèn)為是一個致癌基因，能促進結(jié)腸癌細(xì)胞的生長且獨立于其自噬調(diào)節(jié)作用。除此之外，在慢性髓細(xì)胞性白血病及骨肉瘤細(xì)胞中，ATG4B也被看作致癌基因。另外使用ATG4B的小分子抑制劑NSC185058能抑制骨肉瘤細(xì)胞的生長。不僅如此，ATG4B在博來霉素誘導(dǎo)的心肌纖維化過程中起了重要作用。目前關(guān)于ATG4B小分子抑制劑的研究較少，抑制劑效價偏低。因此，開發(fā)高特異性和效價的ATG4B抑制劑對各類腫瘤治療具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明解決的問題在于通過前期藥物篩選，提供一種針對ATG4B酶的抑制劑AG-690及其類似物，可以用于抗腫瘤藥物、慢性髓細(xì)胞白血病藥物、抗心肌纖維化藥物的制備。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種自噬關(guān)鍵蛋白ATG4B酶抑制劑，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：

其中，R¹，R²為單取代、雙取代或多取代，取代基獨立選自H、鹵素、-CF₃、-CN、-NO₂、-OH、-NH₂、-L-C1-C6的烷基、-L-C1-C6的烯基、-L-取代或非取代的雜芳基、或-L-取代或非取代的芳基，其中L是鍵、O、S、-S(＝O)、-S(＝O)₂、NH、C(O)、CH₂、-NHC(O)O、-HC(O)或-C(O)NH中的一種或多種。

所述的ATG4B酶抑制劑，優(yōu)選地，所述的R¹為雙取代，甲基取代位于羥基的鄰位，硝基取代位于羥基的對位，R²為氫，命名為AG-690，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：

所述的抑制劑在抑制ATG4B酶上的應(yīng)用。

所述的抑制劑在制備治療腫瘤藥物中應(yīng)用。

所述的抑制劑在制備治療結(jié)腸癌藥物中應(yīng)用。

本發(fā)明通過原核表達和親和純化技術(shù)獲得高純度的酶ATG4B蛋白以及底物FRET-GATE16，通過蛋白電泳檢測底物酶切后的條帶亮度變化來判斷化合物抑制ATG4B酶活的能力。

本發(fā)明還利用熒光能量熒光功能轉(zhuǎn)移的方法，通過酶標(biāo)儀檢測底物酶切后熒光的變化來判斷化合物抑制ATG4B酶活的能力。

本發(fā)明采用非特異性的半胱氨酸蛋白酶抑制劑NEM作為ATG4B抑制劑的陽性對照。

本發(fā)明檢測了化合物對其他半胱氨酸蛋白酶如Caspase3的酶活抑制能力，以判斷抑制能力是否特異。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點：

(1)本發(fā)明抑制劑可以通過特異性的抑制ATG4B活性，降低細(xì)胞自噬水平，對腫瘤細(xì)胞活力有明顯抑制，進而發(fā)揮阻止腫瘤細(xì)胞生長的作用，實現(xiàn)其作為抗腫瘤藥物的應(yīng)用。

(2)本發(fā)明抑制劑比已報道的抑制劑NSC185058化合物效價高。

(3)本發(fā)明采用結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116檢測不同濃度抑制劑下細(xì)胞的活力變化，證明抑制劑對結(jié)腸癌細(xì)胞具有細(xì)胞毒活性。

附圖說明

圖1為底物FRET-GATE16經(jīng)過ATG4B酶切后的電泳圖。

圖2為非特異性半胱氨酸蛋白酶抑制劑作為陽性對照抑制ATG4B的IC50曲線。

圖3為不同濃度AG-690抑制ATG4B的酶切能力(電泳圖)。

圖4為AG-690抑制ATG4B活性的IC50曲線。

圖5為不同化合物抑制Caspase3活性的差異效果圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。凡是依照本發(fā)明公開內(nèi)容所做出的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護范圍。

實施例1：重組蛋白的表達純化

將重組質(zhì)粒FRET-GATE-16和ATG4B分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)CodonPlus和BL21(DE3)PLYSs中。LB平板挑取單克隆接種到LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220rpm過夜培養(yǎng)，1:100進行擴增培養(yǎng)，當(dāng)OD600達到0.6-0.8時加入0.5mM的IPTG進行誘導(dǎo)，16℃，16h培養(yǎng)后收菌。離心收集菌體，加入濕菌重量5到10倍的結(jié)合緩沖液(含5mM的咪唑)稀釋菌體后超聲破碎菌體。離心收集上清，使用鎳NTA填料進行純化，加入菌液上清使目的蛋白掛柱，之后分別用20mM和50mM的咪唑緩沖液進行梯度洗脫，最后用200mM的咪唑洗脫并收集洗脫液。將收集到的洗脫液過脫鹽柱后濃縮并于-80℃冰箱保存。為保證該體系的可靠性和穩(wěn)定性，用考馬斯亮藍(lán)染色的方法對純化出來的兩種蛋白的純度及活性進行了驗證。FRET-GATE16(4μg)與合適量的ATG4B(3ng)在37℃共孵育0min或30min。如圖1所示，全長的FRET-GATE16(0min)的純度(＞90％)可以用于接下來的實驗，而30min時全長的FRET-GATE16(0min)幾乎可以完全被3ng的ATG4B酶切為CFP-GATE16和CFP兩部分，說明ATG4B的活性良好。

實施例2：FRET方法檢測AG-690抑制ATG4B的酶活性

384孔黑板中加入終濃度為100μM的抑制劑(AG-690)與0.75mg·L^-1的ATG4B在Tris緩沖液中37℃共孵育30min，之后加入50mg·L^-1的FRET-GATE16，反應(yīng)總體系為50μL，反應(yīng)時間為30min。該體系的中含有0.1％DMSO終濃度。527/477nm的RFUs比值在反應(yīng)30min時測定。ATG4B相對酶切活性的計算公式為：抑制率(％)＝(RFU_max-RFU_X)/(RFU_max-RFU_min))*100％，其中RFU_max指沒發(fā)生酶切反應(yīng)時的527/477nm的比值，RFU_min指酶切反應(yīng)進行到最徹底的527/477nm的比值，RFU_X指在特定化合物處理條件下的527/477nm的比值。我們選擇半胱氨酸蛋白酶的通用型抑制劑N-乙基馬來酰亞胺(NEM)作為本次篩選的陽性對照，利用該檢測體系測得NEM的IC50值為134.2μM(圖2)。

實施例3：SDS-PAGE方法檢測AG-690抑制ATG4B酶活性

將3ng的ATG4B單獨或與0-100μM的抑制劑(AG-690)在緩沖液中37℃共孵育30min，之后加入4μg的底物蛋白FRET-GATE16，反應(yīng)總體系為20μL，反應(yīng)時間為30min。用5X上樣緩沖液終止反應(yīng)，將蛋白變性，采用SDS-PAGE進行電泳，電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)染色方法對條帶進行著色，之后脫色進行分析。為進一步驗證AG-690對ATG4B的體外抑制活性，采用考馬斯亮藍(lán)染色的方法檢測該化合物對ATG4B的酶切抑制效果。如圖3所示，AG-690能劑量依賴性地抑制ATG4B的活性，且在100μM的條件下幾乎可以完全抑制住ATG4B的活性。FRET方法測得該化合物的IC50值為36.8μM(圖4)。

實施例4：AG-690特異性抑制作用分析

Hela細(xì)胞于含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃，5％CO2的孵箱中培養(yǎng)。用星形孢菌素(1μM,5hrs)來誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡，對照組細(xì)胞不做任何處理在同樣的條件下培養(yǎng)。非變性提取細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒檢測細(xì)胞蛋白含量，上樣量為10μg。384孔黑板中加入終濃度為100μM的指定化合物與10μg的細(xì)胞裂解液在Tris緩沖液中37℃共孵育30min，之后加入終濃度為25μM的熒光底物Ac-DEVE-AFC，反應(yīng)總體系為50μL，立即檢測熒光值，測定時間為60min，反應(yīng)溫度為37℃。分別于激發(fā)光400nm和發(fā)射光505nm處檢測熒光AFC的動力學(xué)曲線。如圖5所示，星形孢菌素能有效的誘導(dǎo)Hela細(xì)胞產(chǎn)生凋亡。Caspase-3的特異性抑制劑Z-VAD-FMK在50μM的濃度下能有效抑制Caspase-3的酶切活性。而AG-690在100μM的濃度下對Caspase-3的酶切活性沒有影響，說明該化合物不是普遍的半胱氨酸蛋白酶抑制劑。

實施例5：AG-690抑制腫瘤細(xì)胞活力的測定

本實施例采用結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116檢測不同濃度抑制劑下細(xì)胞的活力變化。在96孔板中接種結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116，每孔100μl，細(xì)胞于含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃，5％CO2的孵箱中培養(yǎng)16小時。之后更換培養(yǎng)基含有濃度為200μM，100μM，50μM，25μM，12.5μM，6.2μM，3.1μM，0μM的AG-690，繼續(xù)培養(yǎng)48小時后，加入10μl的CCK8溶液。放置2-4個小時后取出，在450nm下讀取OD值，根據(jù)不同濃度下的細(xì)胞相對活力，計算得到化合物AG-690抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116活力的IC50為25μM。