本發(fā)明涉及一種定量監(jiān)測(cè)根據(jù)所附權(quán)利要求的前序部分的造紙廠或制板廠的含水環(huán)境中的內(nèi)生孢子的方法。

細(xì)菌細(xì)胞通常存在于造紙廠和制板廠的含水環(huán)境中。通常通過(guò)使用各種措施例如將殺生物劑注入到工藝中來(lái)監(jiān)測(cè)和限制工藝中的細(xì)菌生長(zhǎng)。然而，某些細(xì)菌細(xì)胞形成內(nèi)生孢子，其高度耐受諸如加熱、消毒劑、化學(xué)殺生物劑、干燥劑、紫外光和電離輻射的通常的細(xì)菌破壞方法。內(nèi)生孢子能夠在長(zhǎng)時(shí)間甚至數(shù)年保持成活和休眠直到外部條件變得有利，此后發(fā)生細(xì)菌內(nèi)生孢子的轉(zhuǎn)化，即萌發(fā)。

尤其是在紙巾和食品和/或飲料包裝紙板的生產(chǎn)中，最終產(chǎn)品的衛(wèi)生級(jí)別是特別重要的。最終產(chǎn)品不應(yīng)包含高水平的細(xì)菌內(nèi)生孢子，因?yàn)閮?nèi)生孢子可能污染與最終產(chǎn)品接觸的物質(zhì)，例如包裝在食品或液體包裝紙板中的食品。例如，對(duì)于用于比薩盒、咖啡杯等的食品包裝紙板，最大內(nèi)生孢子含量通常<1000cfu/g干紙板，并且存在最大允許內(nèi)生孢子含量<250cfu/g干紙板的最終用途。

傳統(tǒng)上，通過(guò)使用常規(guī)培養(yǎng)方法來(lái)檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)生孢子，這是耗時(shí)的。通常，培養(yǎng)方法僅在取樣48-72小時(shí)后才能提供結(jié)果。應(yīng)當(dāng)理解，在紙或紙板的連續(xù)生產(chǎn)中，該延遲不是最佳的。例如，及時(shí)調(diào)整孢子控制殺生物劑程序朝向變化的工藝條件是不可能，因?yàn)楹罄m(xù)培養(yǎng)結(jié)果僅在上述指出的延遲之后才能獲得。這使得殺生物劑的進(jìn)料不必要地復(fù)雜并且難以優(yōu)化。因此，極需快速監(jiān)測(cè)造紙廠或制板廠的含水工藝中的細(xì)菌內(nèi)生孢子。

本發(fā)明的一個(gè)目的是最小化或甚至可以消除現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點(diǎn)。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于定量監(jiān)測(cè)造紙廠或制板廠的含水環(huán)境中的細(xì)菌內(nèi)生孢子的快速和有成本有效的方法。

通過(guò)具有以下給出的在獨(dú)立權(quán)利要求書(shū)的特征部分中的特征的本發(fā)明來(lái)實(shí)現(xiàn)這些目的。

本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案在從屬權(quán)利要求中給出。

根據(jù)本發(fā)明的用于定量監(jiān)測(cè)造紙廠或制板廠的含水環(huán)境中的細(xì)菌內(nèi)生孢子的通常方法包括至少以下步驟：

-獲得來(lái)自含水環(huán)境的至少第一含水樣品，

-通過(guò)適當(dāng)處理，優(yōu)選通過(guò)將第一樣品加熱至所期望的高溫來(lái)破壞第一樣品中的細(xì)菌繁殖體，

-向經(jīng)處理的第一樣品加入插入劑，并允許其與被破壞的細(xì)菌進(jìn)行相互作用，和

-通過(guò)使用定量聚合酶鏈反應(yīng)(qpcr)來(lái)測(cè)定第一樣品中的內(nèi)生孢子水平。

現(xiàn)在已經(jīng)令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，通過(guò)使用包括破壞細(xì)菌繁殖體，與插入劑的相互作用和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qpcr)的步驟的方法，能夠獲得對(duì)于源自造紙或制板的樣品中細(xì)菌內(nèi)生孢子水平的快速測(cè)定。監(jiān)測(cè)方法為造紙廠或制板廠的含水環(huán)境中的內(nèi)生孢子水平提供了可靠的測(cè)定結(jié)果。因此，根據(jù)本發(fā)明的方法提供了快速檢測(cè)由諸如ph或氧化還原波動(dòng)等工藝條件的意外變化引起的內(nèi)生孢子爆發(fā)的可能性。以這種方式可將質(zhì)量差的例如包裝級(jí)紙或紙板產(chǎn)品的生產(chǎn)最小化。此外，能夠避免向工藝進(jìn)料錯(cuò)誤的殺生物劑，即避免非殺死劑量的殺生物劑的進(jìn)料(其可引發(fā)由于例如氧化應(yīng)激的內(nèi)生孢子形成)。

在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“內(nèi)生孢子”被理解為由細(xì)菌形成的休眠和非生殖結(jié)構(gòu)體。內(nèi)生孢子包含細(xì)菌的dna及其一部分由保護(hù)性外覆蓋物包裹的細(xì)胞質(zhì)。在有利條件下，內(nèi)生孢子可萌發(fā)至代謝活性狀態(tài)，即繁殖態(tài)。

根據(jù)本發(fā)明，從造紙廠或制板廠的含水環(huán)境中獲得或采集至少第一含水樣品。樣品量通常在10-100ml，優(yōu)選20-30ml的范圍內(nèi)，且通常樣品的可用性不是限制因素。作為實(shí)例，可以給出在某些紙和紙板的制造過(guò)程中，在期望通過(guò)使用高的殺生物劑劑量將總的內(nèi)生孢子含量保持在非常低的水平，例如<1000cfu/ml的情況下，可使用100ml的樣品量。另一方面，在其中細(xì)菌細(xì)胞含量可能處于高水平，即約10⁸cfu/ml的水平的工藝水中，可認(rèn)為25ml的樣品量更實(shí)用。

樣品可包含纖維素纖維和/或原纖維，并且具有高達(dá)2至8重量％的固體含量。樣品通常還包含用于紙或紙板制造的各種化學(xué)品和/或化合物，例如淀粉；無(wú)機(jī)填料顆粒；合成聚合物，例如聚丙烯酰胺。

在本發(fā)明的方法開(kāi)始時(shí)，通過(guò)使用合適的處理來(lái)破壞細(xì)菌繁殖體。合適的處理可以是物理處理，其中樣品經(jīng)受例如輻射，例如uv或加熱，或化學(xué)處理，其中樣品經(jīng)受合適劑量水平的殺生物劑，該劑量水平破壞細(xì)菌繁殖體，但在隨后的方法步驟期間不干擾插入劑的性能。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，將第一樣品加熱至至少60℃，優(yōu)選至少70℃，更優(yōu)選至少75℃的所期望的高溫。使用的最高溫度通常為100℃，優(yōu)選80℃。將樣品保持在高溫下至少10分鐘，優(yōu)選至少15分鐘，更優(yōu)選至少20分鐘。換言之，破壞細(xì)菌繁殖體的一種優(yōu)選方法是將樣品加熱到75-80℃的溫度，并將樣品保持在該高溫下15-60分鐘，優(yōu)選20-40分鐘。各種在標(biāo)準(zhǔn)大氣壓下和在升高壓力下的熱處理方法都是本領(lǐng)域已知的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，熱處理步驟在現(xiàn)場(chǎng)和/或工業(yè)條件下是容易、快速和實(shí)用的，其中它可通過(guò)使用常壓下的水浴來(lái)進(jìn)行。將第一樣品加熱至上述定義的高溫導(dǎo)致樣品的巴氏殺菌并破壞存在于樣品中的細(xì)菌繁殖體細(xì)胞。加熱后，樣品包含破裂的，即被殺死和破壞的細(xì)菌繁殖體細(xì)胞，和通常未受影響的細(xì)菌內(nèi)生孢子。

在破壞步驟之前，優(yōu)選通過(guò)加熱，可任選但優(yōu)選將第一樣品過(guò)濾以從樣品的液相中分離出不需要的固體顆粒物質(zhì)，例如固體顆粒、纖維、原纖維等。這種用于分離不需要的固體顆粒物質(zhì)的初步過(guò)濾通常是快速的并且例如通過(guò)布氏漏斗，通過(guò)使用具有約3mm開(kāi)口的過(guò)濾器進(jìn)行。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，在破壞步驟之后過(guò)濾第一樣品，以從樣品的液相中分離經(jīng)破壞的細(xì)菌繁殖體細(xì)胞以及內(nèi)生孢子?？赏ㄟ^(guò)使用具有例如0.4μm開(kāi)口的過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾。收集細(xì)菌細(xì)胞和內(nèi)生孢子和/或附著在過(guò)濾器上，這簡(jiǎn)化了經(jīng)處理的第一樣品的進(jìn)一步處理。

優(yōu)選在上述過(guò)濾步驟之后，向經(jīng)處理的第一樣品加入插入劑，并使試劑與被破壞的細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行相互作用。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，插入劑選自疊氮溴化丙錠(pma)、疊氮溴化乙錠(ema)、溴化乙錠、小檗堿、普羅黃素、柔紅霉素、阿霉素和沙利度胺。優(yōu)選的插入劑是疊氮溴化丙錠(pma)。優(yōu)選以使得來(lái)自經(jīng)破壞的細(xì)菌細(xì)胞的所有dna都與插入劑發(fā)生相互作用的量將插入劑加入到經(jīng)處理的第一樣品中。因此，能夠保證在后續(xù)的qpcr步驟中沒(méi)有來(lái)自細(xì)菌繁殖體細(xì)胞的dna被倍增，并且它們?cè)趒pcr步驟中不產(chǎn)生信號(hào)。然而，優(yōu)選避免不必要的夸張過(guò)量的插入劑的添加，因?yàn)樗赡墚a(chǎn)生插入劑擴(kuò)散至內(nèi)生孢子中并開(kāi)始與內(nèi)生孢子dna相互作用的風(fēng)險(xiǎn)。通常以提供<100μm，優(yōu)選10-90μm，更優(yōu)選25-75μm，甚至更優(yōu)選40-60μm的插入劑濃度的量將插入劑加入到樣品中。

在加入插入劑后，允許第一樣品避光孵育。孵育時(shí)間為1-30分鐘，優(yōu)選2-10分鐘，更優(yōu)選4-6分鐘。當(dāng)在室溫下暴露于優(yōu)選具有約400-500nm的波長(zhǎng)的強(qiáng)烈藍(lán)光時(shí)，插入劑能夠共價(jià)交聯(lián)來(lái)自經(jīng)破壞的細(xì)菌細(xì)胞的dna雙鏈?？衫缤ㄟ^(guò)使用發(fā)光二極管led來(lái)產(chǎn)生藍(lán)光。暴露時(shí)間可為1-30分鐘，優(yōu)選2-10分鐘，更優(yōu)選4-6分鐘。

在添加插入劑之前，樣品優(yōu)選不進(jìn)行干燥。這意味著該方法優(yōu)選不含將樣品干燥的步驟。優(yōu)選地，破壞步驟和插入劑的添加之間的時(shí)間延遲在實(shí)際操作中是盡可能短。

在允許第一樣品與插入劑相互作用后，通過(guò)使用定量聚合酶鏈反應(yīng)qpcr測(cè)定第一樣品中的內(nèi)生孢子水平。通過(guò)使用qpcr來(lái)提取和倍增來(lái)自內(nèi)生孢子的dna。以下文獻(xiàn)描述了用于從該物質(zhì)分離的細(xì)胞的合適的dna提取的實(shí)例：etal.,developmentofanextensivesetof16srdna-targetedprimersforquantificationofpathogenicandindigenousbacteriainfaecalsamplesbyreal-timepcr.j.appl.microbiol.2004；97(6):1166-1177。在示例性步驟中，將裂解試劑加入到具有玻璃珠的管中，并以6.5m/s的速度使用fastprep珠磨器3次，時(shí)間為1分鐘。將該管在65℃下孵育20分鐘，每隔2分鐘用恒溫混勻儀進(jìn)行渦流。加入800μl的苯酚-氯仿-異戊醇(24:23:1)，混合并以10000g離心5分鐘。將600μl的液相轉(zhuǎn)移到新管中，并用氯仿:異戊醇(24:1)萃取。270μl的100％異丙醇用于沉淀dna，并在+4℃下以20000g離心15分鐘，之后除去液體。用1ml(-20℃)的70％的etoh將顆粒洗滌兩次，并在+4℃下以20000g離心5分鐘。離心后，將顆粒在真空激發(fā)器中在+45℃下干燥20分鐘，并在+55℃下溶解于45μl的tris-edta緩沖液中1.5-2小時(shí)。合適的qpcr方法和步驟對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是已知的并且是可商購(gòu)的。合適的qpcr方法的一個(gè)實(shí)例描述在以下文獻(xiàn)中：r.etal.,can.j.microbiol.59:407–412(2013)。在示例性方法中，通過(guò)使用sybrgreeni(rochediagnostics，germany)作為熒光報(bào)告物，用abisds7000(appliedbiosystems，uk)測(cè)量16srrna基因拷貝的量。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解其它合適的dna提取和/或qpcr程序的知識(shí)。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，從相同的含水環(huán)境中獲得或采集至少第二含水樣品。優(yōu)選地，同時(shí)采集第一和第二樣品，更優(yōu)選地，第一和第二樣品都源自一個(gè)單一的原始樣品，其被分為第一、第二和可能的連續(xù)樣品以用于測(cè)定含水環(huán)境中的內(nèi)生孢子水平。

通過(guò)使用定量聚合酶鏈反應(yīng)qpcr，優(yōu)選地在預(yù)過(guò)濾步驟之后從第二樣品中直接測(cè)定細(xì)菌繁殖體即細(xì)菌繁殖體細(xì)胞的量。第二樣品不經(jīng)受任何例如通過(guò)熱處理或與插入劑的相互作用的破壞步驟。

然后，將來(lái)自第一樣品的經(jīng)測(cè)定的內(nèi)生孢子水平與第二樣品中經(jīng)測(cè)定的細(xì)菌繁殖體細(xì)胞的量進(jìn)行比較。以這種方式，能夠獲得關(guān)于造紙廠或制板廠的含水環(huán)境中的細(xì)菌繁殖體細(xì)胞的總量及在相同環(huán)境中其與內(nèi)生孢子水平的比例的信息。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，獲得的關(guān)于細(xì)菌繁殖體細(xì)胞的總量和內(nèi)生孢子的量的信息用于在造紙或制板生產(chǎn)中快速及時(shí)地調(diào)節(jié)用于內(nèi)生孢子控制的殺生物劑進(jìn)料方案。該信息能夠提供關(guān)于造紙廠或制板廠的含水環(huán)境的細(xì)菌條件的有價(jià)值的知識(shí)和見(jiàn)解，并且該知識(shí)可用于例如確定正確的殺生物劑進(jìn)料方案，以識(shí)別該過(guò)程的問(wèn)題區(qū)域和/或檢測(cè)高和/或波動(dòng)的孢子水平。換言之，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，將至少一種殺生物劑進(jìn)料到含水環(huán)境中，并且基于測(cè)定的內(nèi)生孢子水平確定進(jìn)料的殺生物劑的量。

本發(fā)明能實(shí)現(xiàn)有效的殺生物劑的使用，否則其對(duì)于連續(xù)使用可能太貴，因?yàn)榭苫陉P(guān)于該方法中的細(xì)菌孢子和細(xì)菌繁殖體細(xì)胞的量的信息來(lái)準(zhǔn)確地測(cè)定殺生物劑的劑量和時(shí)間。殺生物劑可以是例如氧化或非氧化的殺生物劑?；讷@得的測(cè)定結(jié)果，將一個(gè)或幾個(gè)關(guān)鍵過(guò)程位置中的殺生物劑劑量調(diào)整到一定水平，其使生產(chǎn)的紙/紙板中的內(nèi)生孢子水平降低至<1000cfu/g干的紙/紙板，或者<250cfu/g干的紙/紙板。

從破壞步驟開(kāi)始到qpcr步驟結(jié)束的總時(shí)間可以為小于24小時(shí)，優(yōu)選6-24小時(shí)，更優(yōu)選7-9小時(shí)。這意味著通過(guò)使用本方法追蹤殺生物劑功效可以每天進(jìn)行，或甚至每天進(jìn)行幾次。根據(jù)本發(fā)明的方法優(yōu)選在現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，該方法用于監(jiān)測(cè)例如來(lái)自已知在造紙或制板機(jī)的工藝條件下生長(zhǎng)的芽孢桿菌(bacillus)、短芽胞桿菌(brevibacillus)和/或類芽孢桿菌(paenibacillus)的內(nèi)生孢子。這些屬能夠生產(chǎn)耐熱內(nèi)生孢子，其耐受造紙或制板機(jī)的干燥器部的熱量。因此，本發(fā)明提供了監(jiān)測(cè)這些屬的內(nèi)生孢子水平并啟動(dòng)具體和正確的殺生物劑進(jìn)料的良好可能性。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，該方法用于生產(chǎn)食品和/或液體包裝級(jí)紙或紙板。通常，包裝級(jí)紙板的克重可以為150-400g/m²，優(yōu)選200-360g/m²，更優(yōu)選240-300g/m²。用于食品和/或液體包裝的紙和紙板級(jí)別通常是聚合物涂覆的或箔層壓的以用于阻隔性能。用于涂覆的合適的聚合物是例如聚烯烴，例如聚乙烯或聚丙烯；聚乙烯醇；聚乙烯胺；聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯；聚對(duì)苯二甲酸丁二醇酯。

實(shí)施例

在以下非限制性實(shí)施例中描述本發(fā)明的一些實(shí)施方案。

實(shí)施例1

該現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)在堿法造紙機(jī)上進(jìn)行，其產(chǎn)生3層的食品包裝紙板，以追蹤孢子控制殺生物劑程序的性能。在三個(gè)工藝位置；在破壞塔、樺木漿塔和松木漿塔的出口中進(jìn)行兩輪取樣，一次在上午且一次在下午。

首先通過(guò)使用具有3mm孔徑的布氏漏斗過(guò)濾第一1升的各個(gè)工藝樣品，以從樣品中除去纖維和固體。此后，將得到的濾液分成六個(gè)50ml的falcon管；將3個(gè)平行樣品在80℃下熱處理15分鐘，以殺死細(xì)菌繁殖體細(xì)胞，并將3個(gè)平行樣品保持未處理。此后，通過(guò)0.4μm的濾紙過(guò)濾所有6個(gè)平行樣品。在避光中用pma(50μm，1ml)染色經(jīng)過(guò)濾的熱處理的樣品，接觸時(shí)間為5分鐘，然后暴露于藍(lán)色led光5分鐘。之后，如下通過(guò)使用dna提取和qpcr方法分析經(jīng)處理的樣品以及未處理的樣品二者的dna。

簡(jiǎn)言之，將裂解試劑加入到具有玻璃珠的管中，并以6.5m/s的速度使用fastprep珠磨器3次，時(shí)間為1分鐘。將管在65℃下孵育20分鐘，每隔2分鐘用恒溫混勻儀進(jìn)行渦流。加入800μl的苯酚-氯仿-異戊醇(24:23:1)，混合并以10000g離心5分鐘。將600μl的液相轉(zhuǎn)移到新管中，并用氯仿:異戊醇(24:1)萃取。270μl的100％異丙醇用于沉淀dna，并在+4℃下以20000g離心15分鐘，之后除去液體。用1ml(-20℃)的70％的etoh將顆粒洗滌兩次，并在+4℃下以20000g離心5分鐘。離心后，將顆粒在真空激發(fā)器中在+45℃下干燥20分鐘，并在+55℃下溶解于45μl的tris-edta緩沖液中1.5至2小時(shí)。用qpcr分析dna。通過(guò)使用sybrgreeni(rochediagnostics，germany)作為熒光報(bào)告物，用abisds7000(appliedbiosystems，uk)測(cè)量16srrna基因拷貝的量。總共16srrna基因代表總的細(xì)菌，且芽孢桿菌16srrna基因內(nèi)生孢子形成細(xì)菌。作為參考，在外部實(shí)驗(yàn)室通過(guò)使用常規(guī)培養(yǎng)方法(平板計(jì)數(shù)瓊脂，+45℃/+37℃，孵育2天)測(cè)量總需氧菌和細(xì)菌孢子數(shù)。在細(xì)菌孢子測(cè)定前，將樣品在+80℃下巴氏殺菌20分鐘。結(jié)果示于表1中。

表1實(shí)施例1的結(jié)果

從培養(yǎng)方法獲得的結(jié)果表明，取樣日期間該方法的微生物狀態(tài)處于良好水平，因?yàn)榭傂柩蹙?<100cfu/ml)和內(nèi)生孢子(<10cfu/ml)二者都低于檢測(cè)限。此外，在熱處理和染色的樣品中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌16srrna基因，因此本發(fā)明的方法的結(jié)果表明，在取樣日期間在本方法中不存在內(nèi)生孢子。該方法中的這個(gè)良好的微生物情況也在最終的紙板上觀察到；最終紙板中的有氧孢子數(shù)低于250cfu/g生產(chǎn)的紙板(結(jié)果未示出)。有趣的是，從進(jìn)入的漿塔獲得的結(jié)果顯示了一些(2×10³-5×10³)芽孢桿菌16srrna基因，因此這兩個(gè)漿塔都包含芽孢桿菌細(xì)菌，其可在不利的生長(zhǎng)條件例如在突然的ph或氧化還原沖擊情況下產(chǎn)生內(nèi)生孢子。因此，所描述的本發(fā)明的方法可有效地用于監(jiān)測(cè)關(guān)鍵過(guò)程點(diǎn)的微生物質(zhì)量，并且快速地，即在一個(gè)工作日內(nèi)，檢測(cè)潛在的孢子形成。這使得能夠以實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)上可行的方法來(lái)調(diào)整孢子控制殺生物劑程序，并最終最大限度地減少孢子污染的紙板的生產(chǎn)，以及最后減少紙板制造商的召回。

實(shí)施例2

在生產(chǎn)3層折疊盒紙板的堿法造紙機(jī)上進(jìn)行微生物現(xiàn)場(chǎng)追蹤試驗(yàn)，以追蹤目前殺生物劑程序?qū)ζ茐乃墟咦有纬杉?xì)菌的性能。從破壞塔的出口進(jìn)行總共六輪取樣。

如實(shí)施例1所述處理和加工工藝樣品。結(jié)果示于表2中。

從表2獲得的結(jié)果表明破壞塔包含很多細(xì)菌；在所有三個(gè)取樣日期間，總的需氧細(xì)菌數(shù)在5×10⁶–1×10⁷cfu/ml之間變化，總的16srrna基因在5×10⁷–3×10⁸之間變化且芽孢桿菌16srrna基因在1×10⁶–4×10⁷之間變化。因此，結(jié)果表明，為了有效地控制破壞塔中的總細(xì)菌和芽孢桿菌種群，需要額外的殺生物劑。有趣的是，在所有未處理的樣品中，芽孢桿菌16srrna基因的數(shù)量較高(1×10⁶–4×10⁷)，這表明許多繁殖性細(xì)胞存在于破壞塔中。然而，在熱處理和染色的樣品中，芽孢桿菌16srrna基因在低(2×10²)至高(2×10⁶)之間顯著變化，這表明成熟的孢子水平在破壞塔中有波動(dòng)。已知作為新孢子形成的芽孢桿菌種群的孢子形成趨勢(shì)被高度調(diào)節(jié)，并且取決于工藝條件。從傳統(tǒng)培養(yǎng)結(jié)果獲得的結(jié)果沒(méi)有顯示出這樣的孢子形成潛力，因?yàn)闄z測(cè)到的孢子數(shù)在<10至300個(gè)孢子/ml之間變化。通過(guò)使用所描述的本發(fā)明的方法，能夠在關(guān)鍵過(guò)程點(diǎn)追蹤微生物狀態(tài)，并快速檢測(cè)(即在一個(gè)工作日內(nèi))在該過(guò)程中的新孢子形成。這能在該過(guò)程中實(shí)現(xiàn)有效和經(jīng)濟(jì)上可行的孢子控制，使孢子污染的紙板的生產(chǎn)最小化，并最終減少紙板制造商的召回。

表2實(shí)施例2的結(jié)果

實(shí)施例3

進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)室測(cè)試，以評(píng)價(jià)孢子控制殺生物劑對(duì)從生產(chǎn)3層食品包裝紙板的堿法造紙機(jī)采集的破碎樣品中的真實(shí)細(xì)菌種群的效力。如此儲(chǔ)存第一破壞樣品和具有150ppm劑量的測(cè)試孢子控制殺生物劑的第二破壞樣品。儲(chǔ)存在+45℃且在不混合下進(jìn)行。在測(cè)試(未處理的)開(kāi)始時(shí)和在接觸3天(經(jīng)處理的和未處理的樣品)后，通過(guò)使用常規(guī)培養(yǎng)方法(平板計(jì)數(shù)瓊脂，+45℃/+37℃，孵育2天)測(cè)定總的需氧菌和需氧孢子數(shù)，以及ph和氧化還原測(cè)量。

結(jié)果示于表3中。

表3實(shí)施例3的結(jié)果

獲得的結(jié)果表明，在3天的接觸時(shí)間期間，未處理的破壞樣品中發(fā)生強(qiáng)烈腐?。豢傂柩蹙鷶?shù)高(3×10⁷cfu/ml)，且需氧孢子水平增加至高達(dá)5×10³cfu/ml。此外，ph(8.2→6.5)和氧化還原(134mv→-107mv)顯著下降。與之相比，150ppm劑量的測(cè)試孢子控制殺生物劑，有效地保持破壞的樣品；總需氧菌(<100cfu/ml)和細(xì)菌孢子(<10cfu/ml)保持低于檢測(cè)限，且ph(7.3)以及氧化還原(83mv)值保持在良好水平。因此，結(jié)果表明，測(cè)試的孢子控制殺生物劑(例如150ppm劑量)可用于控制破壞樣品中的新孢子形成?；谖墨I(xiàn)和自己的實(shí)驗(yàn)室結(jié)果(數(shù)據(jù)未示出)，已知這種處理在殺死成熟細(xì)菌孢子方面是無(wú)效的。因此，對(duì)于在造紙過(guò)程中有效的孢子控制，與嘗試殺死成熟孢子相比，經(jīng)濟(jì)上更可行的是控制過(guò)程中新孢子的形成。

即使參照目前看來(lái)最實(shí)用和優(yōu)選的實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不局限于上述實(shí)施方案，并且本發(fā)明旨在包括落入所附權(quán)利要求范圍內(nèi)的不同修改和等同技術(shù)方案。