本實(shí)用新型屬于醫(yī)療器械領(lǐng)域，具體涉及一種將miR-572作為下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥術(shù)后再狹窄鑒別標(biāo)記物的試劑盒。

背景技術(shù)：

慢性下肢缺血源于下肢動(dòng)脈粥樣硬化狹窄或閉塞導(dǎo)致的下肢供血不足，是最常見(jiàn)的使人失去正常行走能力的一類疾病，稱之為下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥，主要表現(xiàn)為間歇性跛行、下肢靜息痛以及壞疽等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量甚至危及生命。隨著我國(guó)生活水平的改善以及人口老齡化，下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥的發(fā)病率也在逐年提高。

近年來(lái)隨著醫(yī)療技術(shù)的飛速發(fā)展，下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥的治療也呈現(xiàn)多元化，如，旁路術(shù)、內(nèi)膜剝脫術(shù)以及介入治療等均能夠有效恢復(fù)血供、改善癥狀³。在臨床診療中，由于下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥患者罹患疾病時(shí)往往年齡較高，且常合并冠心病、心力衰竭、腦梗等多種疾病，綜合評(píng)估患者一般情況對(duì)旁路術(shù)和內(nèi)膜剝脫術(shù)的耐受性較差。介入治療以其創(chuàng)傷小、術(shù)后恢復(fù)快等優(yōu)點(diǎn)相對(duì)于其他兩種治療方法在下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥的手術(shù)治療中更被廣泛應(yīng)用。與此同時(shí)，有學(xué)者關(guān)注到“暫時(shí)灌注提高”現(xiàn)象，即下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥導(dǎo)致的慢性下肢缺血在介入治療后，閉塞段動(dòng)脈灌注得以暫時(shí)改善，為缺血組織的修復(fù)和閉塞段動(dòng)脈周圍側(cè)枝循環(huán)的形成爭(zhēng)取了一定時(shí)間，但當(dāng)介入干預(yù)后的動(dòng)脈再次狹窄或閉塞時(shí)，就會(huì)使得原有病變處于亞臨床缺血狀態(tài)。因此，術(shù)后再狹窄成為了影響部分患者遠(yuǎn)期療效的關(guān)鍵問(wèn)題之一。

目前，針對(duì)術(shù)后再狹窄的CTA、血管造影等檢查手段，因診療資源有限、檢查費(fèi)用昂貴等多種因素，往往不能在患者長(zhǎng)期隨訪中常規(guī)實(shí)施，而需要患者再次出現(xiàn)間歇性跛行、靜息痛甚至壞疽時(shí)才得以實(shí)施，此時(shí)往往需要再次手術(shù)甚至已失去保肢治療的機(jī)會(huì)，嚴(yán)重者危及患者生命。因此，尋找下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥術(shù)后再狹窄的早期診斷生物標(biāo)記物成為了亟待解決的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題之一，這對(duì)及時(shí)采取有效治療措施、監(jiān)測(cè)病情發(fā)展以及避免嚴(yán)重并發(fā)癥發(fā)生具有重要意義。

Ranasinghe等提出了理想的早期診斷指標(biāo)應(yīng)具備的一般特點(diǎn)：靈敏度高、特異性強(qiáng)、能夠反映疾病的病程轉(zhuǎn)歸、快捷、易用、價(jià)格低廉、具有良好的臨床應(yīng)用前景和廣泛的商業(yè)供應(yīng)商。為下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥術(shù)后再狹窄生物標(biāo)記物的研究提供了理論標(biāo)準(zhǔn)。

在臨床診療過(guò)程中，許多實(shí)驗(yàn)室檢查項(xiàng)目以其迅速、能夠在床邊完成、并且對(duì)疾病具有較高的敏感度和特異度等特點(diǎn)，得到了廣泛應(yīng)用。近年來(lái)科學(xué)的重大發(fā)現(xiàn)微小RNA(mircoRNA，miRNA)是一類在人類和動(dòng)物廣泛存在并高度保守的小分子非編碼RNA，其在心血管組織細(xì)胞發(fā)育與分化及結(jié)構(gòu)形成異常過(guò)程中扮演了極為重要的角色。

新近研究表明，miRNA因具有組織特異性及高度保守的特性，使其具有作為疾病生物標(biāo)記物的強(qiáng)大潛質(zhì)。Ai等通過(guò)急性心肌梗死患者與對(duì)照組比較，結(jié)合模型小鼠中miR-1的過(guò)表達(dá)，證實(shí)在急性心肌梗死患者循環(huán)血中miR-1水平顯著增高，兩周后恢復(fù)到基礎(chǔ)水平的變化趨勢(shì)；荊清教授等報(bào)道了急性心肌梗死患者較健康人循環(huán)血中顯著增高的miR-208a，其血漿水平隨病情轉(zhuǎn)歸而變化，且外周血中miR-208a早于心肌肌鈣蛋白出現(xiàn)的特性，提示miR-208a可能是急性心肌梗死一個(gè)更敏感的早期生物標(biāo)志物。

那么，下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥術(shù)后再狹窄的過(guò)程中是否也伴隨著特定miRNA的表達(dá)改變，這些miRNA中是否會(huì)存在下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥術(shù)后再狹窄潛在生物標(biāo)記物呢，至今尚未有人給出答案。

現(xiàn)有技術(shù)中不乏以miRNA作為鑒別標(biāo)記物的試劑盒，該種試劑盒能夠快速簡(jiǎn)便地將血液或組織中的miRNA提取出來(lái)，并對(duì)其進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)定量PCR以達(dá)到鑒別疾病的目的。

然而，在這些試劑盒中，逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)定量PCR中的試劑瓶是直接插在冰盒內(nèi)的冰中的。若檢測(cè)的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，冰盒里的冰就容易溶化成水，這時(shí)就需要將冰盒里的水倒掉，重新填入冰。進(jìn)行換冰操作時(shí)，首先將試劑瓶全部從冰盒中拿出，將冰盒中的水倒掉，而后重新向內(nèi)裝填冰，然后將試劑瓶挨個(gè)插入冰上，最后將冰盒放入試劑盒內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員均知曉，逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)定量PCR中的試劑瓶多達(dá)幾十種，上述換冰操作不僅會(huì)浪費(fèi)掉操作人員大量的時(shí)間，而且容易致使試劑瓶脫離冰的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而發(fā)生變化，致使無(wú)法有效的將miRNA提取出來(lái)。

實(shí)用新型的內(nèi)容

本實(shí)用新型是為解決上述問(wèn)題而進(jìn)行的，通過(guò)提供一種以miR-572作為下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥術(shù)后再狹窄鑒別標(biāo)記物且其內(nèi)的冰盒中的固定板和冰盒盒體可拆卸連接的試劑盒，從根本上解決上述問(wèn)題。本實(shí)用新型采用了如下技術(shù)方案：

本實(shí)用新型提供的miR-572作為下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥術(shù)后再狹窄鑒別標(biāo)記物的試劑盒，具有盒體和蓋體，具有這樣的特征，盒體被隔板分成四部分，分別為：耗材容納部，被設(shè)置在盒體內(nèi)的左下方，用于容納離心管、配液管以及吸附柱；總RNA提取液容納部，被設(shè)置在盒體內(nèi)的右下方，用于容納提取RNA所用的裝有磁珠的試劑瓶以及分別裝有裂解液、去蛋白液、洗脫液或不含核酸酶的水的試劑瓶；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑容納部，被設(shè)置在盒體內(nèi)的左上方，用于容納裝有RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑的試劑瓶；以及實(shí)時(shí)定量PCR試劑容納部，被設(shè)置在盒體內(nèi)的右上方，用于容納裝有實(shí)時(shí)定量PCR試劑的試劑瓶。

其中，試劑盒內(nèi)還包括冰盒，該冰盒被設(shè)置在所述RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑容納部以及所述實(shí)時(shí)定量PCR試劑容納部的內(nèi)部，用于將RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑以及實(shí)時(shí)定量PCR試劑處于冰點(diǎn)的環(huán)境中，包括：冰盒盒體，用于容納冰；固定板，設(shè)置在冰盒盒體的上方和冰盒盒體可拆卸連接，固定板上設(shè)置有多個(gè)貫穿孔，用于裝有RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑的試劑瓶和裝有實(shí)時(shí)定量PCR試劑的試劑瓶的下半部分穿過(guò)并進(jìn)入冰中；以及保護(hù)蓋，設(shè)置在固定板的上方，和固定板轉(zhuǎn)動(dòng)連接，該保護(hù)蓋由隔熱材料制成，用于將固定板和外界環(huán)境隔離。

進(jìn)一步的，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑容納部以及所述實(shí)時(shí)定量PCR試劑容納部的內(nèi)壁上均設(shè)置有保溫材料層，用于冰盒的保溫。

進(jìn)一步的，固定板的下表面積大于冰盒盒體的上開(kāi)口面積，冰盒盒體的外壁面上分別設(shè)置有兩個(gè)向外延伸的凸起，兩個(gè)凸起之間形成一個(gè)凹槽，固定板和凹槽相對(duì)應(yīng)的位置上設(shè)置有向下延伸的凸片，該凸起和所述凹槽嵌合連接。

進(jìn)一步的，隔板的上表面設(shè)置有標(biāo)簽部，用于粘貼相應(yīng)的標(biāo)簽。

實(shí)用新型的作用與效果

根據(jù)本實(shí)用新型提供的miR-572作為下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥術(shù)后再狹窄鑒別標(biāo)記物的試劑盒，該試劑盒內(nèi)設(shè)置有冰盒，該冰盒包括冰盒盒體、固定板以及保護(hù)蓋。一方面，由于固定板設(shè)置在冰盒盒體的上方和冰盒盒體可拆卸連接，使得在對(duì)于冰盒內(nèi)的冰進(jìn)行更換的時(shí)候，無(wú)需將置于冰上的試劑瓶挨個(gè)取下，只需將固定板和冰盒盒體拆開(kāi)即可對(duì)冰盒內(nèi)的冰進(jìn)行更換；另一方面，由于保護(hù)蓋由隔溫材料制成，并且和固定板轉(zhuǎn)動(dòng)連接，既使得固定板能夠和外界環(huán)境隔離，又能夠在冰盒盒體內(nèi)的冰被更換完畢將固定板安裝在冰盒上時(shí)，對(duì)試劑瓶起到一定的阻擋作用，以便于試劑瓶的下半部分被順利插入冰中。

附圖說(shuō)明

圖1是本實(shí)用新型的miR-572作為下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥術(shù)后再狹窄鑒別標(biāo)記物的試劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2是本實(shí)用新型的冰盒的結(jié)構(gòu)示意圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖來(lái)說(shuō)明本實(shí)用新型的具體實(shí)施方式。

圖1是本實(shí)施例的miR-572作為下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥術(shù)后再狹窄鑒別標(biāo)記物的試劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖。

如圖1所示，試劑盒10包括蓋體11和盒體12，盒體12被橫擋板13和豎擋板14分隔成分成四部分，這四部分分別為耗材容納部15、總RNA提取液容納部16、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑容納部17以及實(shí)時(shí)定量PCR試劑容納部18。橫擋板13和豎擋板14的寬度為8mm，用于粘貼相應(yīng)的標(biāo)簽。

耗材容納部15被設(shè)置在盒體12內(nèi)的左下方，該部分又被擋板分隔成四部分，這四部分分別用于容納離心管、配液管、吸附柱以及其他用量較少的耗材。

總RNA提取液容納部16被設(shè)置在盒體12內(nèi)的右下方，用于容納提取RNA所用的裝有磁珠的試劑瓶以及分別裝有裂解液、去蛋白液、洗脫液或不含核酸酶的水的試劑瓶。

RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑容納部17被設(shè)置在盒體12內(nèi)的左上方，其內(nèi)設(shè)置有冰盒19，裝有RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑的試劑瓶被放置在冰盒內(nèi)。在本實(shí)施例中，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑容納部中容納有十二個(gè)盛放有RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑的離心管，其橫截面為圓形，分別用于盛放RNA酶抑制劑溶液、逆轉(zhuǎn)錄酶溶液、逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液、外源參照物溶液、外源參照物逆轉(zhuǎn)錄引物溶液、miR-572逆轉(zhuǎn)錄引物溶液以及四種脫氧核糖核苷酸的混合溶液(dNTPs)。其中RNA酶抑制劑、逆轉(zhuǎn)錄酶各一管，其他試劑各二管；

實(shí)時(shí)定量PCR試劑容納部18被設(shè)置在盒體12內(nèi)的右上方，和RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑容納部17一樣，其內(nèi)也設(shè)置有冰盒，裝有實(shí)時(shí)定量PCR試劑的試劑瓶同樣被放置在冰盒內(nèi)。在本實(shí)施例中，實(shí)時(shí)定量PCR試劑容納部容納有十二個(gè)盛放有實(shí)時(shí)定量PCR試劑的離心管，橫截面為正六邊形，分別盛放含有DNA聚合酶的實(shí)時(shí)定量PCR混合液、外源參照物特異引物和探針溶液以及miR-572特異引物和探針溶液，其中含有DNA聚合酶的實(shí)時(shí)定量PCR混合液為八管，外源參照物特異引物和探針溶液以及miR-572特異引物和探針溶液各二管。

圖2為本實(shí)施例中的冰盒的結(jié)構(gòu)示意圖。

如圖2所示，冰盒19包括冰盒盒體20、固定板21以及保護(hù)蓋22。冰盒盒體20用于容納冰；固定板21設(shè)置在冰盒盒體20的上方，其下表面積大于冰盒盒體20的上開(kāi)口面積，即，固定板21覆蓋在冰盒盒體上。同時(shí)，固定板21上設(shè)置有多個(gè)貫穿孔26，用于裝有RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑的試劑瓶或裝有實(shí)時(shí)定量PCR試劑的離心管的下半部分穿過(guò)并進(jìn)入冰中；保護(hù)蓋21和固定板21轉(zhuǎn)動(dòng)連接，該保護(hù)蓋由泡沫塑料制成，在離心管均插入冰中后，蓋在固定板21上，使固定板21和外界環(huán)境相隔離。

冰盒盒體20的外壁面上分別設(shè)置有兩個(gè)向外延伸的凸起24，兩個(gè)凸起24之間形成一個(gè)凹槽，固定板21和該凹槽相對(duì)應(yīng)的位置上設(shè)置有向下延伸的凸片23，該凸片和凹槽嵌合連接，使得固定板21能夠和冰盒盒體保持一種可拆卸的連接關(guān)系。

在本實(shí)施例中，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑容納部17以及實(shí)時(shí)定量PCR試劑容納部18的內(nèi)壁上均設(shè)置有一層泡沫塑料層，用于冰盒放入后對(duì)冰盒進(jìn)行保溫。

在本實(shí)施例中，當(dāng)試劑盒敞開(kāi)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，需要對(duì)冰盒中的并進(jìn)行更換時(shí)的步驟為：首先，將冰盒拿出；其次，將覆蓋有保護(hù)蓋22的固定板21向上提起，將其從冰盒盒體20上抽下來(lái)；然后，將冰盒中的水倒出并添加新的并；最后，將固定板安裝在冰盒盒體上，放入試劑盒中即可。

上述RNA提取試劑和耗材與Qiagen公司的miRNeasy Mini Kit相同，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑和實(shí)施定量PCR試劑與ABI公司的MicroRNA Assays貨號(hào)(4427975)、MicroRNA Reverse Transcription Kit(貨號(hào)4366597)和Universal PCR Master Mix II,no UNG(貨號(hào)4440048)相同。其中，MicroRNA Assays包括兩部分，一部分用于逆轉(zhuǎn)錄為：5×RT primer(逆轉(zhuǎn)錄引物)；一部分用于PCR擴(kuò)增，包含了擴(kuò)增引物和特異性探針，為：Small RNA Assay(20×)。ABI公司的miRNA assays使用統(tǒng)一貨號(hào)，具體某個(gè)miRNA又有其編號(hào)，涉及本項(xiàng)目的miR-572的Assays ID為002277；外源參照物cel-miR-39-3p的Assays ID為000200。

實(shí)施例的作用與效果

根據(jù)本實(shí)用新型提供的miR-572作為下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥術(shù)后再狹窄鑒別標(biāo)記物的試劑盒，該試劑盒內(nèi)設(shè)置有冰盒，該冰盒包括冰盒盒體、固定板以及保護(hù)蓋。一方面，由于固定板設(shè)置在冰盒盒體的上方和冰盒盒體可拆卸連接，使得在對(duì)于冰盒內(nèi)的冰進(jìn)行更換的時(shí)候，無(wú)需將置于冰上的試劑瓶挨個(gè)取下，只需將固定板和冰盒盒體拆開(kāi)即可對(duì)冰盒內(nèi)的冰進(jìn)行更換；另一方面，由于保護(hù)蓋由隔溫材料制成，并且和固定板轉(zhuǎn)動(dòng)連接，既使得固定板能夠和外界環(huán)境隔離，又能夠在冰盒盒體內(nèi)的冰被更換完畢將固定板安裝在冰盒上時(shí)，對(duì)試劑瓶起到一定的阻擋作用，以便于試劑瓶的下半部分被順利插入冰中。

本實(shí)用新型不限于具體實(shí)施方式的范圍，對(duì)本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)講，只要各種變化在所述的權(quán)利要求限定和確定的本實(shí)用新型的精神和范圍內(nèi)，這些變化是顯而易見(jiàn)的，一切利用本實(shí)用新型構(gòu)思的發(fā)明創(chuàng)造均在保護(hù)之列。