本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種特異性抑制肺癌細(xì)胞增殖的鉑(II)金屬配合物及其合成方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

肺癌是癌癥中導(dǎo)致死亡的最常見(jiàn)病因之一，占腫瘤死亡率的1/3。而目前臨床上常見(jiàn)的80％肺癌為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，且70％的NSCLC患者確診時(shí)已屬晚期，故難以通過(guò)手術(shù)或放療等手段進(jìn)行根治性治療(Yang,J.J.；et al.Oncology Progress,2010,8:538-545.)。這就迫切地需要科研工作者們?nèi)ピO(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)一種或一系列對(duì)于肺癌細(xì)胞具有高活性或高選擇性的新型抗腫瘤藥物。從已有的研究成果來(lái)看，從天然產(chǎn)物活性成分中發(fā)現(xiàn)以及衍生新型抗肺癌化療藥物具有良好前景，如半枝蓮提取物對(duì)體外培養(yǎng)的人肺癌A549有一定的抑制作用，可以在一定程度上抑制腫瘤細(xì)胞中的DNA復(fù)制(梁憲梅,等.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2011,17:155-158.)；另有研究表明重樓對(duì)小鼠肺腺癌細(xì)胞株LA795的生長(zhǎng)也有很強(qiáng)抑制作用(顏璐璐,等.中草藥，2009，40:424-428.)；貓眼草能較好的誘導(dǎo)Lewis肺癌凋亡(肖寶紅,等.中國(guó)臨床康復(fù),2006,10:48-51.)；此外，文殊蘭葉的提取物在體外能夠有效抑制非小細(xì)胞肺癌NCI-H460細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，并能很好的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和將細(xì)胞周期阻滯于G1/S期(陳建榮,等.腫瘤防治研究,2011,38:628-631.)。這些發(fā)現(xiàn)促使研究者們更為積極地基于天然產(chǎn)物化學(xué)庫(kù)進(jìn)行新型化合物的有效設(shè)計(jì)研究(包括金屬基抗腫瘤化合物)。

自Rosenberg發(fā)現(xiàn)順鉑對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖有抑制作用后，使得鉑配合物的抗腫瘤活性成為科研人員研究的熱點(diǎn)之一，它的發(fā)現(xiàn)推動(dòng)著無(wú)機(jī)藥物化學(xué)和生物無(wú)機(jī)化學(xué)的發(fā)展(Rosenberg,B.；et al.Nature,1965,205:698-699.)。到目前為止，已形成以第一代順鉑、第二代卡鉑和第三代奧沙利鉑為主的市場(chǎng)用藥(Florea,A.M.；et al.Cancers,2011,3:1351-1371.)。雖然順鉑等鉑類藥物在臨床應(yīng)用非常廣泛,但是經(jīng)典的鉑類藥物存在毒副作用強(qiáng)，腎毒性、耳毒性、神經(jīng)毒性大等缺點(diǎn)(Yang,M.；et al.J.Inorg.Biochem.,2005,99:376-382.)。因此，設(shè)計(jì)合成具有高選擇性、低毒性的鉑類抗腫瘤藥物將是創(chuàng)新型金屬基藥物的重點(diǎn)研究方向，其中以天然活性化合物(如氧化阿樸啡堿)為配體的抗腫瘤金屬配合物研究取得了顯著成果(Chen Z.-F.,et al.Dalton Trans.,2009,262-272.)。

基于中藥活性成分的抗腫瘤金屬配合物的設(shè)計(jì)理念，本申請(qǐng)人已廣泛研究了以氧化異阿樸啡堿為配體的系列金屬配合物，從中發(fā)現(xiàn)了其顯著的抗腫瘤活性。其中氧化異阿樸啡和6-羥基氧化異阿樸啡-鉑(II)配合物可有效抑制卵巢癌順鉑耐藥株SK-OV-3/DDP的生長(zhǎng)(Chen,Z.F.；et al.J.Med.Chem.2015,58:2159-2179.)；9-氨基氧化異阿樸啡-鉑(II)配合物則對(duì)人肝癌Hep-G2細(xì)胞有較好的選擇抑制作用，其IC₅₀值為9.89±0.47μM(Chen,Z.F.；et al.Eur.J.Med.Chem.2016,417-427.)；大環(huán)氧化異阿樸啡-鈷(III)配合物對(duì)卵巢癌順鉑耐藥株SK-OV-3/DDP的活性高達(dá)1.0±0.8μM(Chen,Z.F.；et al.Eur.J.Med.Chem.2016,380-392.)；而6-氨基氧化異阿樸啡-鉑(II)配合物對(duì)肝癌Hep-G2細(xì)胞有選擇性的抑制作用，其IC₅₀值為4.94±0.46μM(陳振鋒,等.專利號(hào)為ZL201310469432.2)。然而，在該類型的金屬配合物的抗腫瘤活性研究中，尚未發(fā)現(xiàn)對(duì)肺癌細(xì)胞(如典型非小細(xì)胞肺癌腫瘤株NCI-H460)具有特異性增殖抑制作用的抗腫瘤金屬配合物。本申請(qǐng)人認(rèn)為，在我們已經(jīng)報(bào)道的氧化異阿樸啡-金屬配合物中，其特點(diǎn)是通過(guò)氧化異阿樸啡配體的母環(huán)上的1-N和11-C雙齒螯合配位方式與金屬離子(如鉑(II))配位，這在一定程度上破壞了氧化異阿樸啡母環(huán)的平面性和獨(dú)立性，從而影響了其電子云密度和可能的活性位點(diǎn)，進(jìn)而可能會(huì)影響到配合物的抗腫瘤活性和優(yōu)勢(shì)。因此，如何設(shè)計(jì)和尋找肺癌細(xì)胞高度敏感的新型抗腫瘤配合物成為我們新的挑戰(zhàn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種特異性抑制肺癌細(xì)胞增殖的鉑(II)金屬配合物，以及它的合成方法和應(yīng)用。

本發(fā)明涉及下述式(I)所示化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽：

上述式(I)所示化合物的化學(xué)名稱為二氯·9-(2'-吡啶乙胺基-3-丙酰胺基)-氧化異阿樸啡合鉑(II)配合物，化學(xué)式為C₂₆H₂₄Cl₂N₄O₂Pt，分子量為687.1g/mol。

上述式(I)所示化合物的合成方法為：取下述式(II)所示化合物和二氯·二(二甲基亞砜)合鉑(II)，溶于極性溶劑中，于加熱或不加熱條件下反應(yīng)，即得到含目標(biāo)產(chǎn)物的反應(yīng)液；

上述合成方法中涉及的原料原料二氯·二(二甲基亞砜)合鉑(II)為順式二氯·二(二甲基亞砜)合鉑(II)，可參考現(xiàn)有文獻(xiàn)(Al-Allaf T.A.K.,et al.Trans.Met.Chem.,1998)進(jìn)行制備；另一種原料式(II)所示化合物即9-(2'-吡啶乙胺基-3-丙酰胺基)-氧化異阿樸啡作為配體參與反應(yīng)，在本申請(qǐng)中也簡(jiǎn)稱為L(zhǎng)，該式(II)所示化合物可自行設(shè)計(jì)合成路線進(jìn)行制備，優(yōu)選按下述方法進(jìn)行制備：

取9-(3-氯丙酰胺基)-氧化異阿樸啡和2-(2-氨乙基)吡啶，溶于有機(jī)溶劑中，于加熱或不加熱條件下反應(yīng)，即得；其中，所述的有機(jī)溶劑為選自甲醇、乙醇和乙腈中的一種或兩種以上的組合。

上述式(II)所示化合物的制備方法中，涉及的原料9-(3-氯丙酰胺基)-氧化異阿樸啡可參考現(xiàn)有文獻(xiàn)(Tang,H.；et al.Eur.J.Med.Chem.,2009,44:2523-2532.)進(jìn)行制備。

上述式(II)所示化合物的制備方法中，有機(jī)溶劑的用量可以根據(jù)需要確定，通常情況下，1mmol的9-(3-氯丙酰胺基)-氧化異阿樸啡和10mmol的2-(2-氨乙基)吡啶可用10～100mL的極性溶劑來(lái)溶解。在具體的溶解步驟中，可將9-(3-氯丙酰胺基)-氧化異阿樸啡用極性溶劑溶解后，再與2-(2-氨乙基)吡啶混合在一起反應(yīng)；也可將9-(3-氯丙酰胺基)-氧化異阿樸啡和2-(2-氨乙基)吡啶混合后再加極性溶劑溶解。

上述式(II)所示化合物的制備方法中，反應(yīng)優(yōu)選是在加熱條件下進(jìn)行，進(jìn)一步優(yōu)選是在小于或等于120℃條件下進(jìn)行。通常將反應(yīng)控制在常溫至90℃條件下進(jìn)行，進(jìn)一步控制在35～90℃條件下進(jìn)行，在此溫度條件下反應(yīng)至完全大約需要的時(shí)間是6～72h。反應(yīng)完成后，反應(yīng)物過(guò)濾，分離出固體，即得到式(II)所示化合物。采用該方法合成式(II)所示化合物的產(chǎn)率約為65～95％。

上述方法制備得到的是式(II)所示化合物的粗產(chǎn)物，為了進(jìn)一步提高式(II)所示化合物的純度，更有利于后續(xù)反應(yīng)的進(jìn)行，優(yōu)選是對(duì)上述所得粗產(chǎn)物進(jìn)行純化操作后再用于本發(fā)明目標(biāo)產(chǎn)物的合成方法中。所述的純化操作與現(xiàn)有技術(shù)相同，具體可以是將粗產(chǎn)物上硅膠柱層析純化，以得到式(II)所示化合物純品；在上硅膠柱層析時(shí)，所用的洗脫劑為氯仿和甲醇按100：1～10：1的體積比組成的混合溶劑。

本發(fā)明式(I)所示化合物的合成方法中，所述的極性溶劑為選自甲醇、乙醇、乙腈、丙酮和二甲基亞砜中的一種或兩種以上的組合，當(dāng)極性溶劑的選擇為上述選擇中的任意兩種以上的組合時(shí)，它們的配比可以為任意配比。所述的極性溶劑也可以是水與選自甲醇、乙醇、乙腈、丙酮和二甲基亞砜中的一種或兩種以上的組合，此時(shí)，水在極性溶劑中所占的比例為≤90％體積，優(yōu)選水在極性溶劑中所占的比例為≤70％體積。所述極性溶劑的用量可根據(jù)需要確定，通常情況下，0.5mmol的式(II)所示化合物和0.5～1.5mmol二氯·二(二甲基亞砜)合鉑(II)用15～90mL的極性溶劑來(lái)溶解。在具體的溶解步驟中，可將式(II)所示化合物和二氯·二(二甲基亞砜)合鉑(II)分別用極性溶劑溶解(此時(shí)，用來(lái)溶解式(II)所示化合物的極性溶劑最好選用甲醇、乙醇、乙腈、丙酮和二甲基亞砜中的一種或兩種以上的組合)，再混合在一起反應(yīng)；也可將式(II)所示化合物和二氯·二(二甲基亞砜)-鉑(II)混合后再加極性溶劑溶解。

本發(fā)明式(I)所示化合物的合成方法中，反應(yīng)優(yōu)選是在加熱條件下進(jìn)行，進(jìn)一步優(yōu)選是在小于或等于120℃條件下進(jìn)行。通常將反應(yīng)控制在常溫至90℃條件下進(jìn)行，進(jìn)一步控制在35～90℃條件下進(jìn)行，這樣可以獲得較高的產(chǎn)率。

本發(fā)明所式(I)所示化合物的合成方法中，所述式(II)所示化合物和二氯·二(二甲基亞砜)合鉑(II)的物質(zhì)的量之比可以是1：0.5～3。

本發(fā)明所述式(I)所示化合物在具體合成時(shí)，可采用常壓溶液法或高壓溶劑熱法進(jìn)行合成。

當(dāng)采用常壓溶液法時(shí)，其合成方法包括：取式(II)所示化合物和二氯·二(二甲基亞砜)合鉑(II)，溶于極性溶劑中，所得混合液于加熱或不加熱條件下反應(yīng)，反應(yīng)物除去部分溶劑，靜置，析出，分離出晶體，即得目標(biāo)產(chǎn)物。

上述常壓溶液法中，反應(yīng)通常是在20℃至極性溶劑的回流溫度范圍內(nèi)進(jìn)行，優(yōu)選采用回流反應(yīng)，進(jìn)一步優(yōu)選反應(yīng)是在35℃至極性溶劑的回流溫度范圍內(nèi)進(jìn)行。本方法中，如果前序步驟中極性溶劑的加入量較大(如接近配比的上限)或溶劑對(duì)產(chǎn)物的溶解性較好，則反應(yīng)后溶液可能呈澄清狀態(tài)，這是因?yàn)樗纬傻漠a(chǎn)物沉淀被極性溶劑溶解所致，此時(shí)可將所得反應(yīng)液濃縮或減壓蒸餾以除去部分溶劑，通常是濃縮除去極性溶劑加入量的50～75％。反應(yīng)是否完全可采用薄層層析跟蹤檢測(cè)，當(dāng)配位反應(yīng)是35～90℃條件下進(jìn)行時(shí)，反應(yīng)至完全大約需要6～52h的時(shí)間；也可根據(jù)需要將反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)至52h以上。采用常壓溶液法合成時(shí)，目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率可達(dá)75％以上，約為75～95％。

當(dāng)高壓溶劑熱法時(shí)，其合成方法包括：取二氯·二(二甲基亞砜)合鉑(II)，溶于極性溶劑中，所得混合液置于容器中，經(jīng)液氮冷凍后抽至真空，熔封，然后于60～120℃條件下反應(yīng)，得到目標(biāo)產(chǎn)物。

上述高壓溶劑熱法中，所述的容器通常為厚壁硼硅玻璃管，當(dāng)反應(yīng)在60～120℃條件下進(jìn)行時(shí)，反應(yīng)的時(shí)間優(yōu)選控制在8～36h，也可根據(jù)實(shí)際情況延長(zhǎng)至36h以上。進(jìn)一步優(yōu)選混合溶液是在60～90℃條件下進(jìn)行反應(yīng)。采用高壓溶劑熱法合成時(shí)，目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率可達(dá)63％以上，約為63～90％。

本發(fā)明還包括上述式(I)所示化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明還包括以上述式(I)所示化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽為活性成分制備的抗腫瘤藥物。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了一種結(jié)構(gòu)新穎的氧化異阿樸啡鉑(II)金屬配合物及其合成方法和應(yīng)用，申請(qǐng)人通過(guò)考察該配合物及其配體對(duì)多種人腫瘤細(xì)胞株(包括NCI-H460、SK-OV-3、BEL-7402、Hep-G2和HCT-8腫瘤細(xì)胞)和一株正常肝細(xì)胞HL-7702的增殖抑制活性，結(jié)果表明該配合物能特異性抑制肺癌細(xì)胞NCI-H460的增殖，其IC₅₀值高達(dá)5.01±0.54μM，體現(xiàn)出了較好的潛在藥用價(jià)值，有望用于特異性抗肺癌藥物的制備。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中制得的9-(3-氯丙酰胺基)-氧化異阿樸啡的電噴霧質(zhì)譜譜圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1制得的最終產(chǎn)物的紅外譜圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例1制得的最終產(chǎn)物的電噴霧質(zhì)譜譜圖；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例1制得的最終產(chǎn)物的核磁共振氫譜譜圖；

圖5為本發(fā)明實(shí)施例1制得的最終產(chǎn)物的核磁共振碳譜譜圖；

圖6為本發(fā)明實(shí)施例4制得的最終產(chǎn)物的紅外譜圖；

圖7為本發(fā)明實(shí)施例4制得的最終產(chǎn)物的核磁共振氫譜譜圖；

圖8為本發(fā)明實(shí)施例4制得的最終產(chǎn)物的核磁共振碳譜譜圖；

圖9為本發(fā)明實(shí)施例4制得的最終產(chǎn)物的電噴霧質(zhì)譜譜圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳述,以更好地理解本發(fā)明的內(nèi)容,但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。

實(shí)施例1：配體L即9-(3-氯丙酰胺基)-氧化異阿樸啡的合成

按下述合成路線合成配體L：

具體的合成方法為：

1)制備9-(3-氯丙酰胺基)-氧化異阿樸啡參考現(xiàn)有文獻(xiàn)(Tang,H.；et al.Eur.J.Med.Chem.,2009,44:2523-2532.)進(jìn)行，其詳細(xì)步驟如下所示：

1.1)將15.0g(約0.1mol)鄰苯二甲酸酐和12.0g(約0.1mol)β-苯乙胺溶于100mL乙醇中，回流5小時(shí)，趁熱過(guò)濾，冷卻至室溫，析出結(jié)晶，抽濾，得到白色片狀晶體化合物a，產(chǎn)率75％。將75g(0.56mol)的無(wú)水三氯化鋁和15g氯化鈉混合加熱至140℃熔融，向其緩慢加入53g(0.2mol)的化合物a，加入完畢，升溫至180℃，攪拌反應(yīng)2小時(shí)，乘熱導(dǎo)入研磨中，冷卻，搗碎，得到化合物b，最后分批加入到80℃的100mL濃硫酸中，加入完畢，升溫至260℃，攪拌反應(yīng)2小時(shí)，冷卻，倒入到約600g的冰中，用NaOH調(diào)節(jié)pH值約2-3，析出大量固體，抽濾，水洗，得到粗產(chǎn)品。粗產(chǎn)品用醋酸重結(jié)晶，140℃真空干燥24小時(shí)，得到黃色的1-氮雜苯并蒽酮，產(chǎn)率約31％(Chen,Z.F.；et al.J.Med.Chem.2015,58:2159-2179)；

1.2)在冰浴中，向含有63％的硝酸1.2mL和12mL濃硫酸的混合液中加入2.3g(0.01mol)l-氮雜苯并蒽酮，反應(yīng)于冰浴中反應(yīng)l小時(shí)，室溫反應(yīng)l小時(shí)，55℃反應(yīng)1小時(shí)，冷卻后導(dǎo)入約100g的冰中，用氨水中和至pH值為7-8。過(guò)濾，用水洗滌。粗產(chǎn)品用甲苯重結(jié)晶，得到橙黃色針狀晶體—9-硝基-1-氮雜苯并蒽酮，產(chǎn)率約55％。將9-硝基-1-氮雜苯并蒽酮2.8g(0.01mol)和九水合硫化鈉5.5g(22.5mmol)在100mL乙醇和水(乙醇：水(體積比)＝7：3)回流6小時(shí)，冷卻，減壓蒸掉乙醇，靜置，抽濾，得到粗產(chǎn)品。粗產(chǎn)品用甲苯重結(jié)晶，得到暗紅色固體的9-氨基氧化異阿樸啡；

1.3)將9-氨基氧化異阿樸啡1.0g(4.0mmol)與β-氯丙酰氯15.0mL混合攪拌回流8.0小時(shí)，冷卻，抽濾，濾出物用乙醚洗滌，粗產(chǎn)品用DMF/乙醇(v：v＝1：2)混合溶劑重結(jié)晶，得到黃色固體9-(3-氯丙酰胺基)-氧化異阿樸啡，產(chǎn)率約78.2％。所得產(chǎn)物的電噴霧質(zhì)譜譜圖如圖1所示；ESI-MS m/z:371.1[M+Cl]^-，M為9-(3-氯丙酰胺基)-氧化異阿樸啡的分子量；

2)稱取4mmol的9-(3-氯丙酰胺基)-氧化異阿樸啡和8mmol的2-(2-氨乙基)吡啶，以乙腈作為溶劑，乙腈的用量為50mL，溶解后得到混合溶液，在65℃下反應(yīng)16小時(shí)，所得反應(yīng)物抽濾，用乙醚洗滌，干燥，之后用硅膠柱層析(氯仿/甲醇＝100:1→25：1，體積比)純化得到黃色固體產(chǎn)物(產(chǎn)率95％)。

對(duì)本實(shí)施所得最終產(chǎn)物(黃色固體產(chǎn)物)進(jìn)行鑒定：

(1)紅外光譜，其譜圖如圖2所示；

IR(KBr):3855,3747,3676,3415,3276,2932,2843,2773,2668,2599,2450,2347,2296,2134,1881,1663,1596,1565,1523,1479,1435,1395,1325,1288,1218,1154,1112,1053,1005,969,906,850,774,710,655,617,589,512,442,409cm^-1。

(3)電噴霧質(zhì)譜，其譜圖如圖3所示；

ESI-MS m/z:457.1[M+Cl]^-，其中M為L(zhǎng)的分子量。

(4)核磁共振氫譜，其譜圖如圖4所示；

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ10.88(s,1H),9.18(s,1H),8.76(dd,J＝12.2,7.1Hz,2H),8.61(d,J＝2.2Hz,1H),8.54(dt,J＝5.6,2.8Hz,2H),8.44–8.39(m,1H),8.11–8.02(m,2H),7.98(d,J＝5.6Hz,1H),7.77(td,J＝7.7,1.8Hz,1H),7.36(d,J＝7.8Hz,1H),7.29(dd,J＝7.1,5.4Hz,1H),3.38(t,J＝7.5Hz,3H),3.31(s,2H),3.20(t,J＝7.5Hz,2H),2.97(t,J＝6.9Hz,2H).

(5)核磁共振碳譜，其譜圖如圖5所示；

¹³C NMR(126MHz,DMSO-d₆)δ182.71(s),169.49(s),163.56(s),157.77(s),149.47(s),147.96(s),144.49(s),141.53(s),137.44(s),135.25(s),134.75(s),132.95(s),131.77(s),131.48(s),130.30(s),126.55(s),125.09(s),123.87(s),122.55(s),122.02(s),121.32(s),116.89(s),46.55(s),43.23(s),33.41(s),32.92(s).

(6)本實(shí)施例最終產(chǎn)物和實(shí)施例4所得最終產(chǎn)物的元素分析結(jié)果，如表1所示。

表1配體L和實(shí)施例4所得最終產(chǎn)物的元素分析結(jié)果

因此，可以確定所得黃色固體即為配體L，其結(jié)構(gòu)式如下式(II)所示：

實(shí)施例2：配體L的合成

1)同實(shí)施例1；

2)稱取1mmol的9-(3-氯丙酰胺基)-氧化異阿樸啡和0.8mmol的2-(2-氨乙基)吡啶，以乙醇作為溶劑，乙醇的用量為10mL，溶解后得到混合溶液，在37℃下反應(yīng)72小時(shí)，所得反應(yīng)物抽濾，用乙醚洗滌，干燥，之后用硅膠柱層析(氯仿/甲醇＝100:1→10：1，體積比)純化得到黃色固體產(chǎn)物(產(chǎn)率65％)。

對(duì)所得產(chǎn)物進(jìn)行紅外光譜、高分辨質(zhì)譜、核磁共振氫譜、核磁共振碳譜等分析，確定為目標(biāo)產(chǎn)物配體L。

實(shí)施例3：配體L的合成

1)同實(shí)施例1；

1)稱取1mmol的9-(3-氯丙酰胺基)-氧化異阿樸啡和10mmol的2-(2-氨乙基)吡啶，以甲醇為溶劑，甲醇的用量約為100mL，溶解后得到混合溶液，在90℃下反應(yīng)6小時(shí)，所得反應(yīng)物抽濾，用乙醚洗滌，干燥，之后用硅膠柱層析(氯仿/甲醇＝50：1→15：1，體積比)純化得到黃色固體產(chǎn)物(產(chǎn)率80％)。

對(duì)所得產(chǎn)物進(jìn)行紅外光譜、高分辨質(zhì)譜、核磁共振氫譜、核磁共振碳譜等分析，確定為目標(biāo)產(chǎn)物配體L。

實(shí)施例4：本發(fā)明所述配合物的合成

準(zhǔn)確稱量物質(zhì)的量為0.8mmol的配體L與0.8mmol二氯·二(二甲基亞砜)合鉑(II)，將L溶解于65mL的75％(體積)甲醇和乙腈(體積比為1:1)中，將二氯·二(二甲基亞砜)合鉑(II)溶解于5mL的二甲基亞砜和丙酮(體積比為4:1)的混合溶液中，兩種溶液混合，在65℃下反應(yīng)24小時(shí)，濃縮蒸發(fā)除去大部分溶劑(溶劑加入量的65％)后，冷卻至室溫靜置，析出紅棕色固體產(chǎn)物(產(chǎn)率95％)。

對(duì)所得紅棕色固體產(chǎn)物進(jìn)行鑒定：

(1)紅外光譜，其譜圖如圖6所示；

IR(KBr):3855,3747,3450,3267,3204,3117,2939,2376,2344,2277,1692,1655,1597,1564,1534,1487,1439,1392,1343,1238,1154,1064,1029,971,912,843,771,716,655,591,539,496,443cm^-1.

(2)核磁共振氫譜，其譜圖如圖7所示；

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ10.54(s,1H),8.98(d,J＝5.3Hz,1H),8.73(dd,J＝36.4,6.3Hz,2H),8.54(d,J＝6.7Hz,1H),8.46(s,1H),8.41(d,J＝7.7Hz,1H),8.02(dt,J＝20.6,10.1Hz,4H),7.54(d,J＝7.5Hz,1H),7.42(t,J＝6.4Hz,1H),6.91(s,1H),3.30–3.23(m,2H),3.01(d,J＝9.7Hz,2H),2.90–2.76(m,2H),2.54(s,2H).

(3)核磁共振碳譜，其譜圖如圖8所示；

¹³C NMR(151MHz,DMSO-d₆)δ182.24(s),169.18(s),159.13(s),153.34(s),147.55(s),144.08(s),141.16(s),139.53(s),134.81(s),134.28(s),132.40(s),131.02(s),129.83(s),128.25(s),126.02(s),124.85(s),124.57(s),123.76(s),121.52(s),120.81(s),116.56(s),116.37(s),50.81(s),45.61(s),40.41(s),34.95(s).

(4)電噴霧質(zhì)譜，其譜圖如圖9所示；

ESI-MS m/z:723.1[M+Cl]^-，其中M為配合物1的分子量。

(5)元素分析結(jié)果，如表1所示。

因此，可以確定所得紅棕色固體產(chǎn)物即為目標(biāo)配合物即二氯·9-(2'-吡啶乙胺基-3-丙酰胺基)-氧化異阿樸啡合鉑(II)配合物，其結(jié)構(gòu)式如下式(I)所示：

實(shí)施例5：本發(fā)明所述配合物的合成

準(zhǔn)確稱量物質(zhì)的量為1mmol的L與0.5mmol二氯·二(二甲基亞砜)合鉑(II)，將L溶解于15mL的45％(體積)甲醇和乙腈(體積比為1:2)混合溶液中，將二氯·二(二甲基亞砜)合鉑(II)溶解于3mL的丙酮中，兩種溶液混合，在70℃下反應(yīng)28小時(shí)，濃縮蒸發(fā)除去大部分溶劑(溶劑加入量的55％)后，冷卻至室溫靜置，析出紅棕色固體產(chǎn)物(產(chǎn)率75％)。

對(duì)所得產(chǎn)物進(jìn)行紅外光譜、高分辨質(zhì)譜、核磁共振氫譜、核磁共振碳譜等分析，確定為目標(biāo)配合物即二氯·9-(2'-吡啶乙胺基-3-丙酰胺基)-氧化異阿樸啡合鉑(II)配合物。

實(shí)施例6：本發(fā)明所述配合物的合成

準(zhǔn)確稱量物質(zhì)的量為1mmol的L與1.5mmol二氯·二(二甲基亞砜)合鉑(II)，將L溶解于50mL的60％(體積)甲醇和乙腈(體積比為5:1)混合溶液中，將二氯·二(二甲基亞砜)合鉑(II)溶解于1.0mL二甲基亞砜和丙酮(體積比為10:1)中，兩種溶液混合，在37℃下反應(yīng)52小時(shí)，濃縮蒸發(fā)除去大部分溶劑(溶劑加入量的75％)后，冷卻至室溫靜置，析出紅棕色固體產(chǎn)物(產(chǎn)率80％)。

對(duì)所得產(chǎn)物進(jìn)行紅外光譜、高分辨質(zhì)譜、核磁共振氫譜、核磁共振碳譜等分析，確定為目標(biāo)配合物即二氯·9-(2'-吡啶乙胺基-3-丙酰胺基)-氧化異阿樸啡合鉑(II)配合物。

實(shí)施例7：本發(fā)明所述配合物的合成

準(zhǔn)確稱量物質(zhì)的量為2mmol的L與4mmol二氯·二(二甲基亞砜)合鉑(II)，將L溶解于60mL的80％(體積)甲醇和乙腈(體積比為1:100)混合溶液中，將二氯·二(二甲基亞砜)合鉑(II)溶解于5mL的水(加熱溶解)中，兩種溶液混合，在80℃下反應(yīng)24小時(shí)，濃縮蒸發(fā)除去大部分溶劑(溶劑加入量的60％)后，冷卻至室溫靜置，析出紅棕色固體產(chǎn)物(產(chǎn)率85％)。

對(duì)所得產(chǎn)物進(jìn)行紅外光譜、高分辨質(zhì)譜、核磁共振氫譜、核磁共振碳譜等分析，確定為目標(biāo)配合物即二氯·9-(2'-吡啶乙胺基-3-丙酰胺基)-氧化異阿樸啡合鉑(II)配合物。

實(shí)施例8：本發(fā)明所述配合物的合成

準(zhǔn)確稱量物質(zhì)的量為1mmol的L與3mmol二氯·二(二甲基亞砜)合鉑(II)，將L溶解于90mL的乙腈混合溶液中，將二氯·二(二甲基亞砜)合鉑(II)溶解于6mL乙醇中，兩種溶液混合，在90℃下反應(yīng)6小時(shí)，濃縮蒸發(fā)除去大部分溶劑(溶劑加入量的68％)后，冷卻至室溫靜置，析出紅棕色固體產(chǎn)物(產(chǎn)率78％)。

對(duì)所得產(chǎn)物進(jìn)行紅外光譜、高分辨質(zhì)譜、核磁共振氫譜、核磁共振碳譜等分析，確定為目標(biāo)配合物即二氯·9-(2'-吡啶乙胺基-3-丙酰胺基)-氧化異阿樸啡合鉑(II)配合物。

實(shí)施例9：本發(fā)明所述配合物的合成

準(zhǔn)確稱量物質(zhì)的量為1mmol的配體L與3mmol二氯·二(二甲基亞砜)合鉑(II)，置于一端開(kāi)口的厚壁硼硅玻璃管中，加入10mL甲醇，在抽真空的條件下，將開(kāi)口端熔封，然后在80℃條件下充分反應(yīng)36小時(shí)，得到紅棕色固體產(chǎn)物(產(chǎn)率86％)。

對(duì)所得產(chǎn)物進(jìn)行紅外光譜、高分辨質(zhì)譜、核磁共振氫譜、核磁共振碳譜等分析，確定為目標(biāo)配合物即二氯·9-(2'-吡啶乙胺基-3-丙酰胺基)-氧化異阿樸啡合鉑(II)配合物。

實(shí)施例10：本發(fā)明所述配合物的合成

準(zhǔn)確稱量物質(zhì)的量為1mmol的配體L與1mmol二氯·二(二甲基亞砜)合鉑(II)，置于一端開(kāi)口的厚壁硼硅玻璃管中，加入15mL丙酮，在抽真空的條件下，將開(kāi)口端熔封，然后在60℃條件下充分反應(yīng)48小時(shí)，得到紅棕色固體產(chǎn)物(產(chǎn)率63％)。

對(duì)所得產(chǎn)物進(jìn)行紅外光譜、高分辨質(zhì)譜、核磁共振氫譜、核磁共振碳譜等分析，確定為目標(biāo)配合物即二氯·9-(2'-吡啶乙胺基-3-丙酰胺基)-氧化異阿樸啡合鉑(II)配合物。

實(shí)施例11：本發(fā)明所述配合物的合成

準(zhǔn)確稱量物質(zhì)的量為1mmol的配體L與3mmol二氯·二(二甲基亞砜)合鉑(II)，置于一端開(kāi)口的厚壁硼硅玻璃管中，加入15mL由乙腈和水按1：2的體積比組成的混合溶劑，在抽真空的條件下，將開(kāi)口端熔封，然后在80℃條件下充分反應(yīng)24小時(shí)，得到紅棕色固體產(chǎn)物(產(chǎn)率90％)。

對(duì)所得產(chǎn)物進(jìn)行紅外光譜、高分辨質(zhì)譜、核磁共振氫譜、核磁共振碳譜等分析，確定為目標(biāo)配合物即二氯·9-(2'-吡啶乙胺基-3-丙酰胺基)-氧化異阿樸啡合鉑(II)配合物。

為了充分說(shuō)明本發(fā)明所述的配體L和本發(fā)明所述配合物(以下簡(jiǎn)稱配合物1)在制藥中的用途，申請(qǐng)人對(duì)配體L和配合物1進(jìn)行了抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)。

一、配體L和配合物1對(duì)多種人腫瘤細(xì)胞株的增殖抑制活性實(shí)驗(yàn)：

1、細(xì)胞株與細(xì)胞培養(yǎng)

本實(shí)驗(yàn)選用人肺癌細(xì)胞NCI-H460、人肝癌細(xì)胞Hep-G2、卵巢癌細(xì)胞SK-OV-3和BEL-7402、人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞HCT-8以及人正常肝細(xì)胞HL-7702等6種人類細(xì)胞株。

所有細(xì)胞株均培養(yǎng)在含10wt％小牛血、100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液內(nèi)，置37℃含體積濃度5％CO₂孵箱中培養(yǎng)。

2、待測(cè)化合物的配制

所用的配體L和配合物1的純度≥95％，將其DMSO儲(chǔ)液用生理緩沖液稀釋后配制成20μmol/L的終溶液，其中助溶劑DMSO的終濃度≤1％，測(cè)試該濃度下化合物對(duì)各種腫瘤細(xì)胞增殖的抑制程度。

3、細(xì)胞生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)(MTT法)

(1)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后，用含10％小牛血清的培養(yǎng)液配制成濃度為5000個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，以每孔190μL接種于96孔培養(yǎng)板中，使待測(cè)細(xì)胞密度至1000～10000孔(邊緣孔用無(wú)菌PBS填充)；

(2)5％CO₂，37℃孵育24h，至細(xì)胞單層鋪滿孔底，每孔加入一定濃度梯度的藥物10μL，每個(gè)濃度梯度設(shè)4個(gè)復(fù)孔；

(3)5％CO₂，37℃孵育48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察；

(4)每孔加入10μL的MTT溶液(5mg/mL PBS，即0.5％MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4h；

(5)終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150μL的DMSO充分溶解甲瓚沉淀，振蕩器混勻后，在酶標(biāo)儀用波長(zhǎng)為570nm，參比波長(zhǎng)為450nm測(cè)定各孔的光密度值；

(6)同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔(培養(yǎng)基、MTT、DMSO)，對(duì)照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、DMSO)。

(7)根據(jù)測(cè)得的光密度值(OD值)，來(lái)判斷活細(xì)胞數(shù)量，OD值越大，細(xì)胞活性越強(qiáng)。利用公式：

計(jì)算化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率，再以Bliss法分別計(jì)算各受試化合物對(duì)幾種腫瘤細(xì)胞株的IC₅₀值。其結(jié)果如以下表2所示。

表2：配體L和配合物1對(duì)不同腫瘤細(xì)胞株的IC₅₀值(μM)

從IC₅₀值的抗腫瘤活性測(cè)試結(jié)果來(lái)看，配體L對(duì)各種典型細(xì)胞株(包括5種人腫瘤細(xì)胞株及人正常肝細(xì)胞株)均無(wú)活性，IC₅₀值均>100μM，說(shuō)明這一新型設(shè)計(jì)的氧化阿樸啡衍生物并不表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性，不具有藥用價(jià)值。但其鉑(II)配合物即配合物1則能夠特異性地抑制肺癌NCI-H460細(xì)胞的增殖，其IC₅₀值為5.01±0.54μM，而對(duì)其它幾種典型腫瘤細(xì)胞株則無(wú)增殖抑制活性。因此，與配體L相比，配合物1表現(xiàn)出顯著的體外抗肺癌細(xì)胞活性；且其活性也顯著高于臨床抗癌藥物-順鉑，約為順鉑的3.6倍。另一方面，配合物1對(duì)人正常肝臟細(xì)胞HL-7702也不表現(xiàn)顯著的細(xì)胞毒性，毒性選擇性突出，顯示出配合物1對(duì)肺癌細(xì)胞具有非常優(yōu)異的特異性增殖抑制活性。

綜上所述，本發(fā)明所述的配合物1，表現(xiàn)出特異性抑制肺癌NCI-H460細(xì)胞增殖的能力，抗腫瘤活性顯著優(yōu)于配體L。由此可見(jiàn)，本發(fā)明所述的具有特異性抑制肺癌細(xì)胞增殖的配合物1具有良好的潛在藥用價(jià)值，是一種較好的抗肺癌金屬配合物，有望用于各種抗腫瘤藥物的制備。