本發(fā)明屬于生物醫(yī)用高分子材料技術領域，具體地說，涉及一種可注射型骨填充用生物活性玻璃復合材料的制備方法。
背景技術：
生物活性骨修復材料是以多孔生物活性玻璃為主要原料的生物醫(yī)學材料。該材料的高生物化學活性，在水溶液中材料表面會發(fā)生快速的離子交換反應，最終在材料表面形成類似于人體骨組織的羥基磷灰石(HCA)層，HCA層對于材料植入骨組織缺損處后可以在較短時間內同活的骨組織形成化學鍵合起到關鍵性的作用，從而對骨缺損或患病骨組織起到良好的修復作用，其應用前景非常樂觀，市場作用十分巨大。生物玻璃的化學組成與人體骨骼類似，具有良好的生物相容性和降解性，植入人體后可以有效促進組織分化、骨愈合。然而現有的玻璃微粉強度與活性難以兼顧，并且現有的人工骨修復材料大多為塊狀或粉末固體，作為骨填充材料時與缺損組織間存在空隙，難以與基體組織完美結合，導致修復效果不是很理想。
技術實現要素：
有鑒于此，本發(fā)明針對現有骨填充材料強度低、使用時與缺損組織間存在空隙的問題，提供了一種可注射型骨填充用生物活性玻璃復合材料的制備方法，有足夠強度并且可與骨頭緊密貼合，生物相容性好。
為了解決上述技術問題，本發(fā)明公開了一種可注射型骨填充用生物活性玻璃復合材料的制備方法，以正硅酸四乙酯、磷酸三乙酯、NaNO3、Ca(NO3)2·4H2O、Mg(NO3)2原料作前軀體，聚乙烯醇及聚二甲基硅氧烷作為造孔劑，在催化劑作用下通過溶膠-凝膠法制得生物活性玻璃凝膠，經洗滌、干燥、研磨后得到多孔生物活性玻璃微粉；所述多孔生物活性玻璃微粉與N-異丙基丙烯酰胺的混合溶液進行聚合反應，得到膏狀可注射型骨填充用生物活性玻璃復合材料。
進一步地，上述方法包括以下步驟：
步驟1，制備生物活性玻璃凝膠；
以正硅酸四乙酯、磷酸三乙酯、NaNO3、Ca(NO3)2·4H2O、Mg(NO3)2五種原料為前軀體，聚乙烯醇及聚二甲基硅氧烷作為造孔劑，在催化劑作用下通過溶膠-凝膠法制得生物活性玻璃凝膠；
步驟2，將得到的生物活性玻璃凝膠，經洗滌、梯度升溫干燥、研磨后得到多孔生物活性玻璃微粉；
步驟3，制備生物活性玻璃微粉/聚N-異丙基丙烯酰胺復合材料
將所述多孔生物活性玻璃粉末均勻分散于水中，加入N-異丙基丙烯酰胺，攪拌溶解后，在引發(fā)劑作用下進行聚合反應，將聚合產物洗滌、干燥后得到生物活性玻璃微粉/聚N-異丙基丙烯酰胺復合材料，即膏狀可注射型骨填充用生物活性玻璃復合材料。
進一步地，所述正硅酸四乙酯、磷酸三乙酯、NaNO3、Ca(NO3)2·4H2O、Mg(NO3)2的質量比為16～20︰1～3︰7～9︰11～14︰1。
進一步地，所述聚乙烯醇的用量為前軀體質量的20～36wt％，所述聚二甲基硅氧烷的用量為前軀體質量的16～28wt％。
進一步地，所述催化劑與前軀體的摩爾比為10︰1，所述催化劑為硝酸溶液或檸檬酸溶液，硝酸溶液的濃度為2M，檸檬酸溶液的濃度為5mM。
進一步地，所述梯度升溫干燥具體為：60℃干燥12h，然后升溫至200℃干燥5h，再升溫至700℃干燥2h。
進一步地，所述多孔生物活性玻璃粉末與N-異丙基丙烯酰胺的質量比為1︰9～2︰8，總固含量為7.5wt％～10.0wt％。
進一步地，所述引發(fā)劑為過硫酸鉀-四甲基乙二胺氧化-還原引發(fā)體系，所述引發(fā)劑摩爾數為N-異丙基丙烯酰胺的0.5～2％，其中過硫酸鉀與四甲基乙二胺的摩爾比為1︰2。
進一步地，所述聚合反應的溫度為15℃，時間為10～15min。
進一步地，所述聚合反應在惰性氣體保護下進行。
與現有技術相比，本發(fā)明可以獲得包括以下技術效果：
(1)本發(fā)明通過添加微量Mg、Ca元素提高玻璃微粉的強度，同時在復配造孔劑的作用下，制得高活性的多孔生物活性玻璃微粉，克服了現有骨填充材料強度低的缺陷。
(2)本發(fā)明通過將具有溫敏性的N-異丙基丙烯酰胺(NIPAM)單體與多孔生物活性玻璃微粉復合，聚合得到膏狀的可注射型PNIPAM/玻璃微粉均相復合材料。這種材料用于骨填充時，由于具有流動性，可以很好地與填充部位吻合；又由于人體體溫稍高于PNIPAM/生物活性玻璃微粉復合體系的相轉變溫度，當注射入人體后，復合材料會收縮硬化并與人骨緊密貼合在一起，克服了現有塊狀或粉末狀骨填充材料在使用時與缺損組織間存在空隙的問題。
(3)生物活性玻璃微粉與人體良好的生物相容性與高生物化學活性使其能夠與人骨組織生長在一起并具有傳遞生物介質屬性，從而對骨缺損或患病骨組織起到良好的修復作用。
當然，實施本發(fā)明的任一產品并不一定需要同時達到以上所述的所有技術效果。
具體實施方式
以下將配合實施例來詳細說明本發(fā)明的實施方式，藉此對本發(fā)明如何應用技術手段來解決技術問題并達成技術功效的實現過程能充分理解并據以實施。
本發(fā)明可注射型骨填充用生物活性玻璃復合材料的制備方法，具體包括以下步驟：
步驟1，制備生物活性玻璃凝膠；
以正硅酸四乙酯(TEOS)、磷酸三乙酯(TEP)、NaNO3、Ca(NO3)2.4H2O、Mg(NO3)2五種原料為前軀體，聚乙烯醇(PVA)及聚二甲基硅氧烷(PDMS)作為造孔劑，在催化劑作用下通過溶膠-凝膠法制得生物活性玻璃凝膠；
其中，所述正硅酸四乙酯、磷酸三乙酯、NaNO3、Ca(NO3)2.4H2O、Mg(NO3)2的質量比為16～20︰1～3︰7～9︰11～14︰1，優(yōu)選18.6︰1.8︰8.0︰12.3︰1，該比例范圍可以使所制得的生物活性玻璃的成份與人體骨組織的羥基磷灰石(HA)層相似。
優(yōu)選的，所述聚乙烯醇用量為20～36wt％(相對于前軀體)，聚二甲基硅氧烷的用量為16～28wt％(相對于前軀體)，選取該比例范圍可以減緩整個造孔劑的分解過程，避免了在較高造孔劑含量時材料的坍塌，從而提高玻璃微粉的孔隙率。
優(yōu)選的，所述催化劑為硝酸溶液、檸檬酸溶液中任一種，催化劑與前軀體的摩爾比為10︰1，硝酸優(yōu)選濃度為2M的硝酸溶液，檸檬酸優(yōu)選濃度為5mM的檸檬酸溶液。催化劑為硝酸時，在35℃下進行溶膠-凝膠反應；催化劑為檸檬酸時，在20℃下進行溶膠-凝膠反應。
步驟2，將得到的生物活性玻璃凝膠，經洗滌、梯度升溫干燥、研磨后得到多孔生物活性玻璃微粉；
進一步地，所述梯度升溫干燥具體為：60℃干燥12h，然后升溫至200℃干燥5h，再升溫至700℃干燥2h。
該種升溫方式的好處：①溶劑去除的速度最終決定凝膠的孔隙率分布，這樣有利于得到孔隙分布均勻的材料；②有利于進一步縮合反應，提高材料的致密度，進而提高力學強度。
步驟3，制備生物活性玻璃微粉/聚N-異丙基丙烯酰胺復合材料
將所述多孔生物活性玻璃粉末均勻分散于水中，加入N-異丙基丙烯酰胺(NIPAM)，攪拌溶解后，在引發(fā)劑作用下進行聚合反應，將聚合產物洗滌、干燥后得到生物活性玻璃微粉/聚N-異丙基丙烯酰胺復合材料，即膏狀可注射型骨填充用生物活性玻璃復合材料。
優(yōu)選的，所述多孔生物活性玻璃粉末與N-異丙基丙烯酰胺的質量比為1︰9～2︰8、總的固含量為7.5wt％～10.0wt％，選取該比例范圍可以使所得材料具有一定流動性，同時保證材料有足夠的力學強度。
優(yōu)選的，所述引發(fā)劑為過硫酸鉀(KPS)-四甲基乙二胺(TEMDA)氧化-還原引發(fā)體系，所述引發(fā)劑摩爾數為N-異丙基丙烯酰胺的0.5～2％，選取該比例范圍的好處在于：①使聚N-異丙基丙烯酰胺(PNIPAM)聚合度適中，保證材料有足夠的力學強度；②使聚合速率適中，便于反應過程的控制；③使材料具有適宜的相轉變溫度。
其中KPS與TEMDA的摩爾比為1︰2，該比例可以使每個引發(fā)劑分子盡可能只產生一個自由基，這樣有利于得到分子量分布較窄的聚合產物。
優(yōu)選的，所述聚合反應的溫度為15℃，時間為10～15min。
進一步地，所述聚合反應在惰性氣體保護下進行，所述惰性氣體包括但不限于：氮氣和氬氣。
實施例1
步驟1，制備生物活性玻璃凝膠
以正硅酸四乙酯(TEOS)、磷酸三乙酯(TEP)、NaNO3、Ca(NO3)2·4H2O、Mg(NO3)2為前軀體，所述TEOS、TEP、NaNO3、Ca(NO3)2·4H2O、Mg(NO3)2的質量比為18.6︰1.8︰8.0︰12.3︰1，以硝酸為催化劑，硝酸水溶液(濃度為2M)與五種前驅體總的摩爾比均為10︰1，聚乙烯醇(PVA)及聚二甲基硅氧烷(PDMS)作為造孔劑，所述PVA用量為36wt％(相對于前軀體)、PDMS用量為16wt％(相對于前軀體)，在35℃下通過溶膠-凝膠法制得生物活性玻璃凝膠；
步驟2，將得到的生物活性玻璃凝膠，經洗滌、梯度升溫干燥(60℃/12h→200℃/5h→700℃/2h)、研磨后得到高強度、高活性多孔生物活性玻璃微粉；
步驟3，制備生物活性玻璃微粉/聚N-異丙基丙烯酰胺復合材料
通過超聲振蕩后磁力攪拌，將所述多孔生物活性玻璃粉末均勻分散于水中，得玻璃微粉懸浮液，并向液面下通入N2；控制溫度為15℃，將N-異丙基丙烯酰胺(NIPAM)單體加入玻璃微粉懸浮液中，所述多孔生物活性玻璃粉末與N-異丙基丙烯酰胺的質量比為1︰9，總的固含量為7.5wt％，攪拌使NIPAM充分溶解，然后將N2改為從液面上通入，以降低溶液中氣體含量；
一次性加入過硫酸鉀(KPS)-四甲基乙二胺(TEMDA)氧化-還原引發(fā)體系，所述引發(fā)劑總摩爾量相對N-異丙基丙烯酰胺為0.5％，其中KPS與TEMDA的摩爾比為1:2，在引發(fā)劑作用下進行聚合反應10min，用乙醇洗滌聚合產物、冷凍干燥后得到生物活性玻璃微粉/聚N-異丙基丙烯酰胺復合材料，即膏狀可注射型骨填充用生物活性玻璃復合材料。
實施例2
步驟1，制備生物活性玻璃凝膠
以正硅酸四乙酯(TEOS)、磷酸三乙酯(TEP)、NaNO3、Ca(NO3)2·4H2O、Mg(NO3)2為前軀體，所述TEOS、TEP、NaNO3、Ca(NO3)2·4H2O、Mg(NO3)2的質量比為16︰1.5︰7︰11︰1，以硝酸為催化劑，硝酸水溶液(濃度為2M)與五種前驅體總的摩爾比為10︰1，聚乙烯醇(PVA)及聚二甲基硅氧烷(PDMS)作為造孔劑，所述PVA用量為32wt％(相對于前軀體)、PDMS用量為20wt％(相對于前軀體)，在35℃下通過溶膠-凝膠法制得生物活性玻璃凝膠；
步驟2，將得到的生物活性玻璃凝膠，經洗滌、梯度升溫干燥(60℃/12h→200℃/5h→700℃/2h)、研磨后得到高強度、高活性多孔生物活性玻璃微粉；
步驟3，制備生物活性玻璃微粉/聚N-異丙基丙烯酰胺復合材料
通過超聲振蕩后磁力攪拌，將所述多孔生物活性玻璃粉末均勻分散于水中，得玻璃微粉懸浮液，并向液面下通入N2；控制溫度為15℃，將N-異丙基丙烯酰胺(NIPAM)單體加入玻璃微粉懸浮液中，所述多孔生物活性玻璃粉末與N-異丙基丙烯酰胺的質量比為1︰9，總的固含量為10wt％，攪拌使NIPAM充分溶解，然后將N2改為從液面上通入，以降低溶液中氣體含量；
一次性加入過硫酸鉀(KPS)-四甲基乙二胺(TEMDA)氧化-還原引發(fā)體系，所述引發(fā)劑總摩爾量相對N-異丙基丙烯酰胺為1％，其中KPS與TEMDA的摩爾比為1:2，在引發(fā)劑作用下進行聚合反應15min，用乙醇洗滌聚合產物、冷凍干燥后得到生物活性玻璃微粉/聚N-異丙基丙烯酰胺復合材料，即膏狀可注射型骨填充用生物活性玻璃復合材料。
實施例3
步驟1，制備生物活性玻璃凝膠
以正硅酸四乙酯(TEOS)、磷酸三乙酯(TEP)、NaNO3、Ca(NO3)2·4H2O、Mg(NO3)2為前軀體，所述TEOS、TEP、NaNO3、Ca(NO3)2·4H2O、Mg(NO3)2的質量比為20︰3︰9︰14︰1，以檸檬酸為催化劑，檸檬酸水溶液(濃度為5mM)與五種前驅體總的摩爾比為10︰1，聚乙烯醇(PVA)及聚二甲基硅氧烷(PDMS)作為造孔劑，所述PVA用量為28wt％(相對于前軀體)、PDMS用量為24wt％(相對于前軀體)，在20℃下通過溶膠-凝膠法制得生物活性玻璃凝膠；
步驟2，將得到的生物活性玻璃凝膠，經洗滌、梯度升溫干燥(60℃/12h→200℃/5h→700℃/2h)、研磨后得到高強度、高活性多孔生物活性玻璃微粉；
步驟3，制備生物活性玻璃微粉/聚N-異丙基丙烯酰胺復合材料
通過超聲振蕩后磁力攪拌，將所述多孔生物活性玻璃粉末均勻分散于水中，得玻璃微粉懸浮液，并向液面下通入N2；控制溫度為15℃，將N-異丙基丙烯酰胺(NIPAM)單體加入玻璃微粉懸浮液中，所述多孔生物活性玻璃粉末與N-異丙基丙烯酰胺的質量比為1.5︰8.5，總的固含量為7.5wt％，攪拌使NIPAM充分溶解，然后將N2改為從液面上通入，以降低溶液中氣體含量；
一次性加入過硫酸鉀(KPS)-四甲基乙二胺(TEMDA)氧化-還原引發(fā)體系，所述引發(fā)劑總摩爾量相對N-異丙基丙烯酰胺為1.5％，其中KPS與TEMDA的摩爾比為1:2，在引發(fā)劑作用下進行聚合反應15min，用乙醇洗滌聚合產物、冷凍干燥后得到生物活性玻璃微粉/聚N-異丙基丙烯酰胺復合材料，即膏狀可注射型骨填充用生物活性玻璃復合材料。
實施例4
步驟1，制備生物活性玻璃凝膠
以正硅酸四乙酯(TEOS)、磷酸三乙酯(TEP)、NaNO3、Ca(NO3)2·4H2O、Mg(NO3)2為前軀體，所述TEOS、TEP、NaNO3、Ca(NO3)2·4H2O、Mg(NO3)2的質量比為17︰1︰7.5︰13︰1，以檸檬酸為催化劑，檸檬酸水溶液(濃度為5mM)與五種前驅體總的摩爾比為10︰1，聚乙烯醇(PVA)及聚二甲基硅氧烷(PDMS)作為造孔劑，所述PVA用量為20wt％(相對于前軀體)、PDMS用量為16wt％(相對于前軀體)，在20℃下通過溶膠-凝膠法制得生物活性玻璃凝膠；
步驟2，將得到的生物活性玻璃凝膠，經洗滌、梯度升溫干燥(60℃/12h→200℃/5h→700℃/2h)、研磨后得到高強度、高活性多孔生物活性玻璃微粉；
步驟3，制備生物活性玻璃微粉/聚N-異丙基丙烯酰胺復合材料
通過超聲振蕩后磁力攪拌，將所述多孔生物活性玻璃粉末均勻分散于水中，得玻璃微粉懸浮液，并向液面下通入N2；控制溫度為15℃，將N-異丙基丙烯酰胺(NIPAM)單體加入玻璃微粉懸浮液中，所述多孔生物活性玻璃粉末與N-異丙基丙烯酰胺的質量比為1.5︰8.5，總的固含量為10wt％，攪拌使NIPAM充分溶解，然后將N2改為從液面上通入，以降低溶液中氣體含量；
一次性加入過硫酸鉀(KPS)-四甲基乙二胺(TEMDA)氧化-還原引發(fā)體系，所述引發(fā)劑總摩爾量相對N-異丙基丙烯酰胺為2％，其中KPS與TEMDA的摩爾比為1:2，在引發(fā)劑作用下進行聚合反應12min，用乙醇洗滌聚合產物、冷凍干燥后得到生物活性玻璃微粉/聚N-異丙基丙烯酰胺復合材料，即膏狀可注射型骨填充用生物活性玻璃復合材料。
實施例5
步驟1，制備生物活性玻璃凝膠
以正硅酸四乙酯(TEOS)、磷酸三乙酯(TEP)、NaNO3、Ca(NO3)2·4H2O、Mg(NO3)2為前軀體，所述TEOS、TEP、NaNO3、Ca(NO3)2·4H2O、Mg(NO3)2的質量比為18.6︰1.8︰8.0︰12.3︰1，以硝酸為催化劑，硝酸水溶液(濃度為2M)與五種前驅體總的摩爾比為10︰1，聚乙烯醇(PVA)及聚二甲基硅氧烷(PDMS)作為造孔劑，所述PVA用量為32wt％(相對于前軀體)、PDMS用量為20wt％(相對于前軀體)，在35℃下通過溶膠-凝膠法制得生物活性玻璃凝膠；
步驟2，將得到的生物活性玻璃凝膠，經洗滌、梯度升溫干燥(60℃/12h→200℃/5h→700℃/2h)、研磨后得到高強度、高活性多孔生物活性玻璃微粉；
步驟3，制備生物活性玻璃微粉/聚N-異丙基丙烯酰胺復合材料
通過超聲振蕩后磁力攪拌，將所述多孔生物活性玻璃粉末均勻分散于水中，得玻璃微粉懸浮液，并向液面下通入N2；控制溫度為15℃，將N-異丙基丙烯酰胺(NIPAM)單體加入玻璃微粉懸浮液中，所述多孔生物活性玻璃粉末與N-異丙基丙烯酰胺的質量比為2︰8，總的固含量為7.5wt％，攪拌使NIPAM充分溶解，然后將N2改為從液面上通入，以降低溶液中氣體含量；
一次性加入過硫酸鉀(KPS)-四甲基乙二胺(TEMDA)氧化-還原引發(fā)體系，所述引發(fā)劑總摩爾量相對N-異丙基丙烯酰胺為1.5％，其中KPS與TEMDA的摩爾比為1:2，在引發(fā)劑作用下進行聚合反應10min，用乙醇洗滌聚合產物、冷凍干燥后得到生物活性玻璃微粉/聚N-異丙基丙烯酰胺復合材料，即膏狀可注射型骨填充用生物活性玻璃復合材料。
實施例6
步驟1，制備生物活性玻璃凝膠
以正硅酸四乙酯(TEOS)、磷酸三乙酯(TEP)、NaNO3、Ca(NO3)2·4H2O、Mg(NO3)2為前軀體，所述TEOS、TEP、NaNO3、Ca(NO3)2·4H2O、Mg(NO3)2的質量比為18.6︰1.8︰8.0︰12.3︰1，以檸檬酸為催化劑，檸檬酸水溶液(濃度為5mM)與五種前驅體總的摩爾比為10︰1，聚乙烯醇(PVA)及聚二甲基硅氧烷(PDMS)作為造孔劑，所述PVA用量為32wt％(相對于前軀體)、PDMS用量為28wt％(相對于前軀體)，在20℃下通過溶膠-凝膠法制得生物活性玻璃凝膠；
步驟2，將得到的生物活性玻璃凝膠，經洗滌、梯度升溫干燥(60℃/12h→200℃/5h→700℃/2h)、研磨后得到高強度、高活性多孔生物活性玻璃微粉；
步驟3，制備生物活性玻璃微粉/聚N-異丙基丙烯酰胺復合材料
通過超聲振蕩后磁力攪拌，將所述多孔生物活性玻璃粉末均勻分散于水中，得玻璃微粉懸浮液，并向液面下通入N2；控制溫度為15℃，將N-異丙基丙烯酰胺(NIPAM)單體加入玻璃微粉懸浮液中，所述多孔生物活性玻璃粉末與N-異丙基丙烯酰胺的質量比為2︰8，總的固含量為9wt％，攪拌使NIPAM充分溶解，然后將N2改為從液面上通入，以降低溶液中氣體含量；
一次性加入過硫酸鉀(KPS)-四甲基乙二胺(TEMDA)氧化-還原引發(fā)體系，所述引發(fā)劑總摩爾量相對N-異丙基丙烯酰胺為2％，其中KPS與TEMDA的摩爾比為1:2，在引發(fā)劑作用下進行聚合反應15min，用乙醇洗滌聚合產物、冷凍干燥后得到生物活性玻璃微粉/聚N-異丙基丙烯酰胺復合材料，即膏狀可注射型骨填充用生物活性玻璃復合材料。
本發(fā)明實施例所得復合材料的相轉變溫度為33～35℃，在人的生理溫度附近，其體積溶脹-收縮率為5～10％，注入人體骨缺損組織后體積變化較小，可以與基體組織緊密結合。高溫收縮后所得材料的抗壓強度為6.2～7.0MPa，優(yōu)于純的45S5多孔塊體材料的力學強度(3.9MPa)。
采用上述方法，通過生物活性玻璃微粉與PNIPAM的相對含量及含水量的選取，制得適于注射(有一定流動性)、有適宜相轉變溫度(適用于人體體溫)、有足夠強度并具有較小溶脹-收縮率的骨填充用生物活性玻璃復合材料。
如在說明書及權利要求當中使用了某些詞匯來指稱特定成分或方法。本領域技術人員應可理解，不同地區(qū)可能會用不同名詞來稱呼同一個成分。本說明書及權利要求并不以名稱的差異來作為區(qū)分成分的方式。如在通篇說明書及權利要求當中所提及的“包含”為一開放式用語，故應解釋成“包含但不限定于”?！按笾隆笔侵冈诳山邮盏恼`差范圍內，本領域技術人員能夠在一定誤差范圍內解決所述技術問題，基本達到所述技術效果。說明書后續(xù)描述為實施本發(fā)明的較佳實施方式，然所述描述乃以說明本發(fā)明的一般原則為目的，并非用以限定本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的保護范圍當視所附權利要求所界定者為準。
還需要說明的是，術語“包括”、“包含”或者其任何其他變體意在涵蓋非排他性的包含，從而使得包括一系列要素的商品或者系統不僅包括那些要素，而且還包括沒有明確列出的其他要素，或者是還包括為這種商品或者系統所固有的要素。在沒有更多限制的情況下，由語句“包括一個……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系統中還存在另外的相同要素。
上述說明示出并描述了發(fā)明的若干優(yōu)選實施例，但如前所述，應當理解發(fā)明并非局限于本文所披露的形式，不應看作是對其他實施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述發(fā)明構想范圍內，通過上述教導或相關領域的技術或知識進行改動。而本領域人員所進行的改動和變化不脫離發(fā)明的精神和范圍，則都應在發(fā)明所附權利要求的保護范圍內。