本發(fā)明涉及PBMC白膜層提取技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及PBMC白膜層快速提取法。
背景技術(shù)：
當(dāng)前PBMC實(shí)驗(yàn)方法主要采用以手動(dòng)操作配合定時(shí)定速離心為主，或輔助一些新開發(fā)的特制篩網(wǎng)和離心管進(jìn)行操作。而PBMC試驗(yàn)方法的單核淋巴細(xì)胞(俗稱白膜層)提取尤為關(guān)鍵，然而目前常用的實(shí)驗(yàn)方法普遍存在離心時(shí)間長(zhǎng)，輔助的特制耗材又增加了額外的實(shí)驗(yàn)成本，使得PBMC實(shí)驗(yàn)方法的實(shí)驗(yàn)操作難上加難。
目前現(xiàn)有的方法中，申請(qǐng)?zhí)朇N201510768205.9《一種分離PBMC的方法》公開了白膜層提取采用15～18℃，500～1000g，離心力升降速為0的條件下離心20～30min的方法。在申請(qǐng)?zhí)朇N201510664306《帶篩板分離提取PBMC的細(xì)胞分離管》和申請(qǐng)?zhí)朇N201420466315.0《一種用于分離提取PBMC的細(xì)胞分離管》的申請(qǐng)專利中，均采用了實(shí)驗(yàn)特制耗材，包括特制帶篩板的離心管和特制離心管，增加了額外的實(shí)驗(yàn)成本。
另外PBMC白膜層提取方法也有采用手動(dòng)操作輔助定時(shí)定速離心的形式進(jìn)行，如在溫度20℃，離心力800g，離心時(shí)間25min，加減速為0；室溫，離心速度2000rpm，離心時(shí)間25min，降速設(shè)置no break，或只有1-2成的制動(dòng)；室溫，離心速度1500rpm，離心時(shí)間30min，加減速均為0等的條件下提取薄膜層。
縱觀以上方法可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)前PBMC白膜層提取方法均存在實(shí)驗(yàn)耗時(shí)長(zhǎng)，白膜層提取困難等諸多缺點(diǎn)，并且白膜層質(zhì)量很難保證，然而若采用特制篩板或特制離心管以簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)操作，縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，則又增加了額外的實(shí)驗(yàn)成本。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明提出了PBMC白膜層快速提取法，制品白膜層質(zhì)量好，提取效率高，且方法簡(jiǎn)單，耗時(shí)短，耗材少，成本低。
本發(fā)明提出的PBMC白膜層快速提取法，包括如下步驟：
S1、從全血中提取灰黃層；
S2、將灰黃層加入到淋巴分離液中離心處理，離心轉(zhuǎn)速為1500-2000rpm，離心力升速設(shè)置成5-8成制動(dòng)，離心力降速設(shè)置成5-8成制動(dòng)；
S3、離心15-20min后提取白膜層。
優(yōu)選地，所述的PBMC白膜層快速提取法，包括如下步驟：
S1、將全血離心提取灰黃層；
S2、將灰黃層加入到淋巴分離液中離心處理，離心轉(zhuǎn)速為1600-1800rpm，升速、降速均設(shè)置為5-7成制動(dòng)；
S3、離心18-20min后提取白膜層。
優(yōu)選地，所述的PBMC白膜層快速提取法，包括如下步驟：
S1、將全血離心提取灰黃層；
S2、將灰黃層加入到淋巴分離液中離心處理，其離心轉(zhuǎn)速為1600rpm，升速、降速均設(shè)置為6成制動(dòng)；
S3、室溫下離心20min后提取白膜層。
優(yōu)選地，在S2中，離心處理所采用離心機(jī)為Thermo ST40R離心機(jī)。
在現(xiàn)有技術(shù)中，在升速、降速采用1-2成制動(dòng)的前提下，不僅時(shí)間長(zhǎng)，分離不徹底，而且本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為，超過(guò)1-2成制動(dòng)的速度下，會(huì)發(fā)生細(xì)胞破碎，而發(fā)明人驚奇的發(fā)現(xiàn)采用5-8成制動(dòng)，不僅細(xì)胞不易破碎，且分離更徹底，同時(shí)減少了白膜層提取的時(shí)間。
本發(fā)明通過(guò)合理控制離心轉(zhuǎn)速、離心力升降速、離心時(shí)間，可有效縮短了PBMC白膜層獲取的離心時(shí)間，離心時(shí)間可縮短至20min以下，獲得的白膜層與下層淋巴分離液分層明顯，且質(zhì)量穩(wěn)定，淋巴細(xì)胞獲得率大幅提升，本申請(qǐng)方法的獲得率均可達(dá)到80％以上，而一般方法的獲得率僅在40％～66％。
具體實(shí)施方式
下面，通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
實(shí)施例1
PBMC白膜層快速提取法，包括如下步驟：
S1、從全血中提取灰黃層；
S2、將灰黃層加入到淋巴分離液中離心處理，離心轉(zhuǎn)速為1500rpm，離心力升速設(shè)置成8成制動(dòng)，離心力降速設(shè)置成5成制動(dòng)；
S3、離心20min后提取白膜層。
實(shí)施例2
PBMC白膜層快速提取法，包括如下步驟：
S1、從全血中提取灰黃層；
S2、將灰黃層加入到淋巴分離液中離心處理，離心轉(zhuǎn)速為2000rpm，離心力升速設(shè)置成5成制動(dòng)，離心力降速設(shè)置成8成制動(dòng)；
S3、離心15min后提取白膜層。
實(shí)施例3
PBMC白膜層快速提取法，包括如下步驟：
S1、將全血離心提取灰黃層；
S2、將灰黃層加入到淋巴分離液中離心處理，離心轉(zhuǎn)速為1600rpm，升速、降速均設(shè)置為7成制動(dòng)，離心處理所采用離心機(jī)為Thermo ST40R離心機(jī)；
S3、離心18min后提取白膜層。
實(shí)施例4
PBMC白膜層快速提取法，包括如下步驟：
S1、將全血離心提取灰黃層；
S2、將灰黃層加入到淋巴分離液中離心處理，離心轉(zhuǎn)速為1800rpm，升速、降速均設(shè)置為5成制動(dòng)，離心處理所采用離心機(jī)為Thermo ST40R離心機(jī)；
S3、離心20min后提取白膜層。
實(shí)施例5
PBMC白膜層快速提取法，包括如下步驟：
S1、將全血離心提取灰黃層；
S2、將灰黃層加入到淋巴分離液中離心處理，其離心轉(zhuǎn)速為1600rpm，升速、降速均設(shè)置為6成制動(dòng)，離心處理所采用離心機(jī)為Thermo ST40R離心機(jī)；
S3、室溫下離心20min后提取白膜層。
將采用實(shí)施例5的方法與普通方法1、2、3的淋巴細(xì)胞獲得率進(jìn)行對(duì)比，其中：
普通方法1：20℃，離心力為800g，離心時(shí)間25min，加減速制動(dòng)均為0；
普通方法2：室溫，離心速度2000rpm，離心時(shí)間25min，加速與降速均為2成制動(dòng)；
普通方法3：室溫，離心速度1500rpm，離心時(shí)間30min，加減速制動(dòng)均為0；
測(cè)試結(jié)果如下表1所示；
表1不同方法間淋巴細(xì)胞獲得率的比較
其中，離心淋巴細(xì)胞數(shù)理論值為相關(guān)體檢指標(biāo)乘以PBMC實(shí)驗(yàn)中所用血量后的結(jié)果。
上述結(jié)果表明，本申請(qǐng)可有效縮短PBMC白膜層獲取的離心時(shí)間，提高實(shí)驗(yàn)效率，且獲得的白膜層與下層淋巴分離液分層明顯，且質(zhì)量穩(wěn)定，淋巴細(xì)胞獲得率大幅提升。
以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。