相關(guān)申請的交叉引用

本申請要求在35u.s.c.§119下于2014年12月16日提交的美國臨時專利申請?zhí)?2/092,461的優(yōu)先權(quán)，其整體通過引用并入本文。

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明總體涉及分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、微生物學(xué)、遺傳學(xué)和蛋白質(zhì)生產(chǎn)領(lǐng)域。更具體地，在本文披露的各種實施例中，本發(fā)明涉及具有遺傳改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞，以及制造和使用此類細(xì)胞的方法，所述遺傳改變導(dǎo)致感興趣的蛋白質(zhì)的增加的表達(dá)。

序列表的引用

命名為nb40772-wo-pct_sequencelisting.txt的文本文件序列表的電子提交內(nèi)容創(chuàng)建于2015年10月29日并且大小為11kb，其通過引用并入本文。

本發(fā)明的背景

遺傳工程已經(jīng)允許改進(jìn)在食品發(fā)酵中用作工業(yè)生物反應(yīng)器和細(xì)胞工廠的微生物。包括多個芽孢桿菌物種的革蘭氏陽性生物體被用于產(chǎn)生大量有用的蛋白質(zhì)和代謝產(chǎn)物(參見，例如，zukowski,“productionofcommerciallyvaluableproducts,”in:doiandmcglouglin(eds.)biologyofbacilli:applicationstoindustry,butterworth-heinemann,stoneham.masspages311-337,1992[zukowski,“有商業(yè)價值的產(chǎn)品的生產(chǎn)”，在：doi和mcglouglin(編輯)桿菌生物學(xué)：工業(yè)應(yīng)用，巴特沃思-海涅曼出版公司(butterworth-heinemann)，斯通哈姆，馬薩諸塞州，第311-337頁，1992中])。工業(yè)中使用的常見芽孢桿菌屬物種包括地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌。由于其gras(通常被認(rèn)為是安全的)狀態(tài)，這些芽孢桿菌屬物種的菌株是用于生產(chǎn)用于食品和制藥工業(yè)的蛋白質(zhì)的天然候選物。在革蘭氏陽性生物體中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的實例包括酶如α-淀粉酶、中性蛋白酶、堿性(或絲氨酸)蛋白酶等。

盡管對細(xì)菌宿主細(xì)胞中蛋白質(zhì)的產(chǎn)生的理解有所進(jìn)展，但本領(lǐng)域仍然需要開發(fā)新的表達(dá)增加水平的感興趣的蛋白質(zhì)的重組細(xì)菌菌株。

發(fā)明概述

本發(fā)明的某些實施例涉及表達(dá)增加水平的感興趣的蛋白質(zhì)的重組革蘭氏陽性細(xì)胞以及其制備和使用方法。特別地，某些實施例涉及具有遺傳改變的細(xì)菌細(xì)胞，與不具有遺傳改變的細(xì)菌細(xì)胞相比這些遺傳改變導(dǎo)致感興趣的蛋白質(zhì)的表達(dá)增加。

因此，本文披露的某些實施例涉及增加革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞中感興趣的蛋白質(zhì)(下文稱為“poi”)的表達(dá)的方法。更具體地，某些實施例涉及用于增加革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞中poi表達(dá)的方法，這些方法包括：(a)獲得產(chǎn)生poi的經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞，其中該經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞包含降低sin操縱子中一個或多個基因的表達(dá)的至少一個遺傳改變，并且(b)在表達(dá)該poi的條件下培養(yǎng)該經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞，其中相對于未經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞中相同poi的表達(dá)，poi的量增加。

在其他實施例中，本發(fā)明涉及包含經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞的組合物。在某些實施例中，本發(fā)明提供了經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞，這些經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞相對于未經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌對照細(xì)胞中相同poi的表達(dá)，表達(dá)了增加的量的poi，其中該經(jīng)改變的細(xì)菌細(xì)胞包含降低sin操縱子中一個或多個基因的表達(dá)的至少一個遺傳改變。

本披露的經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞可以是芽孢桿菌屬的任何成員。在某些實施例中，該芽孢桿菌屬細(xì)胞選自下組，該組由以下各項組成：枯草芽孢桿菌(b.subtilis)、地衣芽孢桿菌(b.licheniformis)、遲緩芽孢桿菌(b.lentus)、短芽孢桿菌(b.brevis)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(b.stearothermophilus)、嗜堿芽孢桿菌(b.alkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌(b.amyloliquefaciens)、克勞氏芽孢桿菌(b.clausii)、索諾拉沙漠芽孢桿菌(b.sonorensis)、耐鹽芽孢桿菌(b.halodurans)、短小芽孢桿菌(b.pumilus)、燦爛芽孢桿菌(b.lautus)、飼料芽孢桿菌(b.pabuli)、蠟樣芽孢桿菌(b.cereus)、黏瓊脂芽孢桿菌(b.agaradhaerens)、秋葉氏芽孢桿菌(bakibai)、庫拉奇芽孢桿菌(b.clarkii)、假堅強(qiáng)芽孢桿菌(b.pseudofirmus)、列城芽孢桿菌(b.lehensis)、巨大芽孢桿菌(b.megaterium)、凝結(jié)芽孢桿菌(b.coagulans)、環(huán)狀芽孢桿菌(b.circulans)、吉氏芽孢桿菌(b.gibsonii)、和蘇云金芽孢桿菌(b.thuringiensis)。在某些其他實施例中，該芽孢桿菌屬細(xì)胞是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌。在某些其他實施例中，該芽孢桿菌屬細(xì)胞是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌。

在某些實施例中，poi由經(jīng)改變的細(xì)菌細(xì)胞的外源基因或經(jīng)改變的細(xì)菌細(xì)胞的內(nèi)源基因編碼。在某些實施例中，該poi是酶。在其他實施例中，該poi是選自下組的酶，該組由以下各項組成：乙酰酯酶、氨肽酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、凝乳酶、角質(zhì)酶、脫氧核糖核酸酶、差向異構(gòu)酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、內(nèi)切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、半纖維素酶、己糖氧化酶、水解酶、轉(zhuǎn)化酶、異構(gòu)酶、漆酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化還原酶、果膠酸裂解酶、果膠乙酰酯酶、果膠解聚酶、果膠甲酯酶、果膠分解酶、過水解酶、多元醇氧化酶、過氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)運蛋白、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶、及其組合。

在某些實施例中，該poi是蛋白酶。在某些實施例中，該蛋白酶是枯草桿菌蛋白酶。在某些其他實施例中，枯草桿菌蛋白酶選自下組，該組由以下各項組成：枯草桿菌蛋白酶168、枯草桿菌蛋白酶bpn’、枯草桿菌蛋白酶carlsberg、枯草桿菌蛋白酶dy、枯草桿菌蛋白酶147，枯草桿菌蛋白酶309、及其變體。

在其他實施例中，此類經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞及其方法進(jìn)一步包括回收poi。在具體實施例中，相對于該未經(jīng)改變的革蘭氏陽性對照細(xì)胞，所表達(dá)的poi的增加的量為至少10％。

在某些其他實施例中，經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞(及其方法)進(jìn)一步包含選自下組的基因中的突變，該組由以下各項組成：degu、degq、degs、scoc4、和oppa。在某些實施例中，突變?yōu)閐egu(hy)32。

某些其他實施例涉及來自野生型sinr基因的、與seqidno:1具有至少80％序列同一性的多核苷酸變體，其中該多核苷酸變體包含錯義突變、移碼突變、無義突變、插入和/或缺失。在某些實施例中，多核苷酸變體包含對應(yīng)于seqidno:1的核苷酸330的核苷酸位置處的沉默突變。在具體實施例中，沉默突變位于對應(yīng)于seqidno:1的核苷酸330的位置，其中該沉默突變是g到a的核苷酸取代。

某些其他實施例是包含本發(fā)明的一種或多種多核苷酸變體的定向載體。在其他實施例中，載體是通過同源重組替代該內(nèi)源染色體sinr基因的靶向載體。

某些其他實施例涉及用于增加革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞中感興趣的蛋白質(zhì)(poi)的表達(dá)的方法，這些方法包括(a)用包含多核苷酸變體的載體轉(zhuǎn)化親本革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞，其中該載體和親本sinr基因的相應(yīng)區(qū)域之間的同源重組產(chǎn)生了經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞，并且(b)在適于表達(dá)該poi的條件下培養(yǎng)該經(jīng)改變的細(xì)胞，其中該poi的增加的表達(dá)是相對于未經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞中相同poi的表達(dá)而言的。

在某些實施例中，經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞表達(dá)感興趣的蛋白質(zhì)，其中編碼poi的表達(dá)盒被引入親本革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞中。

在其他實施例中，這些方法(及其組合物)進(jìn)一步包括在使得該感興趣的蛋白質(zhì)由經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞表達(dá)的條件下培養(yǎng)該經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞。在具體實施例中，組合物及其方法進(jìn)一步包括回收該poi。

在某些實施例中，至少一種突變是沉默突變，其中突變位于對應(yīng)于seqidno:1的核苷酸729的核苷酸位置。在某些實施例中，突變是對應(yīng)于seqidno:1的核苷酸729的核苷酸位置處的c到t的突變。在某些實施例中，多核苷酸變體序列與seqidno:3的全部或部分是至少90％相同的。在某些實施例中，變體序列與seqidno:3的全部或部分相同。在某些實施例中，該變體序列長度為至少20個核苷酸。在某些實施例中，該變體序列長度為至少50個核苷酸。在某些實施例中，該變體序列長度為至少200個核苷酸。

附圖簡要說明

圖1示出了pksv7-sinr的質(zhì)粒圖譜的示意圖。

圖2示出了sinr缺失(δsinr)的遺傳圖譜的示意圖。圖3a示出了表達(dá)fna蛋白酶的枯草芽孢桿菌細(xì)胞的細(xì)胞密度圖。wt是“未經(jīng)改變的”(親本)枯草芽孢桿菌(對照)細(xì)胞，sinr*是包含對應(yīng)于sinr基因的核苷酸330的沉默突變的“經(jīng)改變的”(子代)枯草芽孢桿菌細(xì)胞，并且δsinr是包含缺失的sinr基因的“經(jīng)改變的”(子代)枯草芽孢桿菌細(xì)胞(例如，參見，圖2)。

圖3b示出了圖3a中呈現(xiàn)的wt和改變的枯草芽孢桿菌細(xì)胞中的fna蛋白酶表達(dá)圖。wt是“未經(jīng)改變的”(親本)枯草芽孢桿菌(對照)細(xì)胞，sinr*是包含對應(yīng)于sinr基因的核苷酸330的沉默突變的“經(jīng)改變的”(子代)枯草芽孢桿菌細(xì)胞，并且δsinr是包含缺失的sinr基因的“經(jīng)改變的”(子代)枯草芽孢桿菌細(xì)胞。

圖4a示出了wt和改變的枯草芽孢桿菌細(xì)胞中amye表達(dá)的細(xì)胞密度圖。wt是“未經(jīng)改變的”(親本)枯草芽孢桿菌(對照)細(xì)胞，sinr*是包含對應(yīng)于sinr基因的核苷酸330的沉默突變的“經(jīng)改變的”(子代)枯草芽孢桿菌細(xì)胞，并且δsinr是包含缺失的sinr基因的“經(jīng)改變的”(子代)枯草芽孢桿菌細(xì)胞。

圖4b示出了wt和改變的枯草芽孢桿菌細(xì)胞中amye淀粉酶表達(dá)圖。wt是“未經(jīng)改變的”(親本)枯草芽孢桿菌(對照)細(xì)胞，sinr*是包含對應(yīng)于sinr基因的核苷酸330的沉默突變的“經(jīng)改變的”(子代)枯草芽孢桿菌細(xì)胞，并且δsinr是包含缺失的sinr基因的“經(jīng)改變的”(子代)枯草芽孢桿菌細(xì)胞。

圖5a示出了wt和改變的枯草芽孢桿菌細(xì)胞的細(xì)胞密度圖。wt是“未經(jīng)改變的”(親本)枯草芽孢桿菌(對照)細(xì)胞，sinr*是包含對應(yīng)于sinr基因的核苷酸330的沉默突變的“經(jīng)改變的”(子代)枯草芽孢桿菌細(xì)胞，并且δsinr是包含缺失的sinr基因的“經(jīng)改變的”(子代)枯草芽孢桿菌細(xì)胞。

圖5b示出了wt和改變的枯草芽孢桿菌細(xì)胞中pelc表達(dá)的圖。wt是“未經(jīng)改變的”(親本)枯草芽孢桿菌(對照)細(xì)胞，sinr*是包含對應(yīng)于sinr基因的核苷酸330的沉默突變的“經(jīng)改變的”(子代)枯草芽孢桿菌細(xì)胞，并且δsinr是包含缺失的sinr基因的“經(jīng)改變的”(子代)枯草芽孢桿菌細(xì)胞。

發(fā)明詳細(xì)說明

本發(fā)明總體上涉及具有導(dǎo)致感興趣的蛋白質(zhì)(下文稱為“poi”)表達(dá)增加的一個或多個遺傳改變的細(xì)菌細(xì)胞，以及制造和使用此類細(xì)胞的方法。

在更詳細(xì)地描述本發(fā)明組合物和方法之前，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明組合物和方法不限于所描述的具體實施例，因此當(dāng)然可以變化。還應(yīng)當(dāng)理解，在此使用的術(shù)語僅是出于描述具體實施例的目的，并且不旨在進(jìn)行限制，因為本發(fā)明組合物和方法的范圍將僅由所附權(quán)利要求書限制。

在提供了一系列值的情況下，應(yīng)理解每個中間值為到下限的十分之一單位(除非上下文清晰地另外指示)，該范圍的上限與下限之間以及在該陳述范圍內(nèi)的任何其他陳述的或中間值均被涵蓋在本發(fā)明的組合物和方法之內(nèi)。這些較小范圍的上限和下限可以被獨立地包括在所述較小的范圍內(nèi)，并且也被涵蓋在本發(fā)明的組合物和方法之內(nèi)，服從所陳述范圍中任何特別排除的限值。在所陳述的范圍包括一個或者全部兩個限值的情況下，排除那些包括的限值的任一個或者全部兩個的范圍也包括在本發(fā)明的組合物和方法中。

本文提供了某些范圍，其中數(shù)值前面是術(shù)語“約”。術(shù)語“約”在本文中用于為其后面的確切數(shù)字以及與該術(shù)語后面的數(shù)字接近或近似的數(shù)字提供文字支持。在確定數(shù)字是否接近或近似于具體敘述的數(shù)字時，接近或近似的未列舉的數(shù)字可以是在呈現(xiàn)其的上下文中提供具體敘述的數(shù)字的實質(zhì)性等值的數(shù)字。例如，關(guān)于數(shù)值，術(shù)語“約”是指數(shù)值的-10％至+10％的范圍，除非術(shù)語在上下文中另有具體定義。在另一個實例中，短語“約6的ph值”是指ph值為從5.4至6.6，除非ph值另有具體定義。

本文提供的標(biāo)題并非對本發(fā)明的組合物和方法的各個方面或?qū)嵤├M(jìn)行限制，這些方面或?qū)嵤├赏ㄟ^將說明書作為一個整體來參考而得到。因此，將說明書作為一個整體參考時，下面即將定義的術(shù)語被定義得更全面。

將本文件分為若干部分以便于閱讀；然而，讀者將領(lǐng)會的是，在一個部分中進(jìn)行的陳述可能適用于其他部分。以這種方式，用于本披露的不同部分的標(biāo)題不應(yīng)被解釋為限制。

除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明組合物和方法所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。雖然類似于或等同于本文描述的那些的任何方法和材料也可以用于本發(fā)明組合物和方法的實踐或測試中，但現(xiàn)在將對代表性示例方法和材料進(jìn)行描述。

在本說明書中引用的所有公開物和專利都通過引用結(jié)合在此，就好像每個單獨的公開物或?qū)＠痪唧w地并單獨地指示為通過引用結(jié)合，并且通過引用結(jié)合在此從而結(jié)合引用的公開物來披露和描述這些方法和/或材料。任何公開物的引用內(nèi)容是針對其在申請日之前的披露，并且不能理解為承認(rèn)因為先前發(fā)明而本發(fā)明組合物和方法不能獲得比這些公開物更早的申請日。此外，所提供的公開日期可能與實際公開日期不同，實際公開日期可能需要獨立地證實。

根據(jù)此詳細(xì)描述，適用下列簡稱和定義。應(yīng)當(dāng)注意單數(shù)形式“一個/一種(a/an)”和“該(the)”包括復(fù)數(shù)個指示物，除非上下文中清楚地另外指出。因此，例如提及“酶”包括多個這樣的酶，并且提及“劑量”包括提及一個或多個劑量以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其等效物，等等。

進(jìn)一步注意的是，權(quán)利要求書可以被撰寫為排除任何可選擇的要素。因此，該陳述意在作為使用與權(quán)利要求要素的敘述有關(guān)的排他性術(shù)語例如“單獨”、“僅”等或利用“否定型”限定的前提基礎(chǔ)。

進(jìn)一步注意到，如本文所使用的術(shù)語“基本上由……組成”是指一種組合物，其中該術(shù)語之后的一種或多種組分在存在其他已知的一種或多種組分的情況下的情況下為總體組合物的以重量計小于30％的總量，并且不會有助于或干擾一種或多種組分的作用或活性。

進(jìn)一步注意到，如本文所使用的術(shù)語“包含”意指包含但不限于在術(shù)語“包含”之后的一種或多種組分。在術(shù)語“包含”之后的組分是必需的或強(qiáng)制性的，但是包含一種或多種組分的組合物可以進(jìn)一步包括其他非強(qiáng)制性或可選擇的一種或多種組分。

還要注意的是，如本文所使用的術(shù)語“由……組成”意指包括且限于術(shù)語“由……組成”之后的一種或多種組分。因此，術(shù)語“由……組成”之后的一種或多種組分是必需的或強(qiáng)制性的，且組合物中不存在一種或多種其他組分。

如將對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，在閱讀本披露時，本文描述和展示的單獨實施例中的每一個具有離散的組分和特征，這些組分和特征可以在不偏離本文所述的本發(fā)明組合物和方法的范圍或精神的情況下容易地與任何其他幾個實施例的任何一個的特征分離或組合?？梢园凑账鶖⑹龅氖录捻樞蚧虬凑者壿嬌峡尚械娜魏纹渌樞騺磉M(jìn)行任何敘述的方法。

定義

本發(fā)明總體上涉及革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞(以及其制備和使用方法)，這些革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞已經(jīng)被改變(或修飾)而具有增加的表達(dá)和/或生產(chǎn)一種或多種感興趣的蛋白質(zhì)的能力。

如本文定義的，“修飾的細(xì)胞”、“經(jīng)改變的細(xì)胞”、“修飾的細(xì)菌細(xì)胞”、“經(jīng)改變的細(xì)菌細(xì)胞”、“修飾的宿主細(xì)胞”、或“經(jīng)改變的宿主細(xì)胞”可以互換使用，并且是指重組革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞，這些重組革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞包含改變或變更sin操縱子的一個或多個基因的表達(dá)(即，表達(dá)的增加或表達(dá)的降低)的至少一個遺傳改變。例如，本披露的“經(jīng)改變的”革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞可以進(jìn)一步定義為“經(jīng)改變的細(xì)胞”，該“經(jīng)改變的細(xì)胞”來自親本細(xì)菌細(xì)胞，其中該經(jīng)改變的(子代)細(xì)胞包含降低sin操縱子中一個或多個基因表達(dá)的至少一個遺傳改變。

如本文定義的，“未修飾的細(xì)胞”、“未經(jīng)改變的細(xì)胞”、“未修飾的細(xì)菌細(xì)胞”、“未經(jīng)改變的細(xì)菌細(xì)胞”、“未修飾的宿主細(xì)胞”、或“未經(jīng)改變的宿主細(xì)胞”可以互換使用，并且是指“未經(jīng)改變的”‘親本’革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞，這些革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞不包含降低sin操縱子的一個或多個基因表達(dá)的至少一個遺傳改變。在某些實施例中，未經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞稱為“對照細(xì)胞”或“未經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌‘對照’細(xì)胞”。

例如，本披露的某些實施例涉及表達(dá)增加的量的poi的“經(jīng)改變的”革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞，其中該poi的增加的量是相對于“未經(jīng)改變的”革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞(即，未經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌“對照”細(xì)胞)中相同poi的表達(dá)而言的。

因此，如本文定義的，當(dāng)術(shù)語或短語“一個或多個未經(jīng)改變的細(xì)菌細(xì)胞”、“一個或多個未經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞”、“一個或多個未經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌‘對照’細(xì)胞”等用于與本披露的一個或多個“經(jīng)改變的細(xì)菌細(xì)胞”進(jìn)行比較的上下文中時，應(yīng)理解經(jīng)改變的(子代)細(xì)胞和未經(jīng)改變的親本(對照)細(xì)胞均在基本上相同的條件和培養(yǎng)基下生長/培養(yǎng)。

如本文定義的，sin(sporulationinhibition，孢子形成抑制)操縱子至少包含編碼sini(sinr的抑制劑)蛋白的多核苷酸和編碼sinr(抑制子)蛋白的多核苷酸，并且可以進(jìn)一步包含可操作地連接或散布有sinr和/或sini基因或其多核苷酸序列的5’和3’調(diào)節(jié)核苷酸序列(參見，gauretal.,jbacteriol168:860-869,1986[gaur等人，細(xì)菌學(xué)雜志168:860-869,1986])。在某些實施例中，sin操縱子的sinr基因(或來自sinr基因的sinr多核苷酸)與seqidno:1的sinr多核苷酸包含至少60％核酸序列同一性。

如本文所使用的，“操縱子”包含可以從共同啟動子轉(zhuǎn)錄成單個轉(zhuǎn)錄單元的一組連續(xù)基因，并且從而進(jìn)行共調(diào)節(jié)。在一些實施例中，操縱子可以包含驅(qū)動多個不同mrna的轉(zhuǎn)錄的多個啟動子(參見，例如，圖1中扼要表示的phd操縱子中的啟動子)。

如本文定義的，術(shù)語“增加的表達(dá)”、“poi的增加的表達(dá)”、“增加的產(chǎn)生”、“增加的poi的產(chǎn)生”等是指“改變的”(子代)細(xì)菌細(xì)胞，該細(xì)菌細(xì)胞包含降低sin操縱子的一個或多個基因的表達(dá)的至少一個遺傳改變，其中“增加”總是相對(相比)于表達(dá)相同poi的“未經(jīng)改變的”(親本)細(xì)菌(對照)細(xì)胞而言的。

如本文定義的，術(shù)語“引入”，如短語中所使用的，如“向細(xì)菌細(xì)胞中引入”至少一種多核苷酸開放閱讀框(orf)、或其基因、或其載體，包括本領(lǐng)域已知用于將多核苷酸引入細(xì)胞的方法，這些方法包括但不限于原生質(zhì)體融合、轉(zhuǎn)化(例如，氯化鈣、電穿孔)、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)染、綴合等(參見，例如，ferrarietal.,“genetics,”inhardwoodetal,(eds.),bacillus,plenumpublishingcorp.,pages57-72,1989[ferrari等人，在hardwood等人(編輯)的“遺傳學(xué)”中，芽孢桿菌屬，普萊南出版公司，第57-72頁，1989])。

如本文定義的，術(shù)語“開放閱讀框”(下文稱為“orf”)意指包含不間斷閱讀框的核酸或核酸序列(無論是天然存在的、非天然存在的、或合成的)，不間斷閱讀框由以下各項組成：(i)起始密碼子，(ii)一系列代表氨基酸的更多密碼子中的兩(2)個，和(iii)終止密碼子，該orf以5’至3’方向閱讀(或翻譯)。

應(yīng)理解本文所述的多核苷酸包括“基因”，并且本文所述的核酸分子包括“載體”或“質(zhì)粒”。因此，術(shù)語“基因”是指編碼氨基酸具體序列的多核苷酸，其包括所有或部分蛋白質(zhì)，并且可以包括調(diào)節(jié)(非轉(zhuǎn)錄的)dna序列，如啟動子序列，該啟動子序列決定例如基因在其下表達(dá)的條件?；虻霓D(zhuǎn)錄區(qū)域可以包括非翻譯區(qū)域(utr)(這些非翻譯區(qū)域包括內(nèi)含子、5’-非翻譯區(qū)(utr)、和3’-utr)，以及編碼序列。

如本文所使用的術(shù)語“啟動子”是指能夠控制編碼序列或功能性rna表達(dá)的核酸序列。通常，編碼序列位于啟動子序列3’(下游)。啟動子能以其整體來自天然基因，或者由來自自然界中發(fā)現(xiàn)的不同啟動子的不同元件構(gòu)成，或甚至包含合成的核酸區(qū)段。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，不同啟動子可以在不同細(xì)胞類型中、或在不同發(fā)育階段、或響應(yīng)于不同環(huán)境條件或生理條件來指導(dǎo)基因表達(dá)。引起基因在大多數(shù)細(xì)胞類型中表達(dá)的啟動子大多數(shù)時候通常被稱為“組成型啟動子”。進(jìn)一步認(rèn)識到，由于在大多數(shù)情況下還不能完全確定調(diào)節(jié)序列的確切邊界，不同長度的dna片段可具有相同的啟動子活性。

如本文所使用的術(shù)語“可操作地連接”是指核酸序列在單個核酸片段上的締合，這樣使得一個核酸片段的功能受到另一個影響。例如，當(dāng)能夠?qū)崿F(xiàn)該編碼序列的表達(dá)(即編碼序列在啟動子的轉(zhuǎn)錄控制下)時，啟動子與該編碼序列可操作地連接。編碼序列可以在正義或反義方向上可操作地連接到調(diào)節(jié)序列。

載體也可以是本質(zhì)上不是附加型的裸rna多核苷酸、裸dna多核苷酸、由同一鏈內(nèi)的dna和rna組成的多核苷酸、聚賴氨酸綴合的dna或rna、肽綴合的dna或rna、脂質(zhì)體綴合的dna等，或者它可以是包含一種或多種以上多核苷酸構(gòu)建體如農(nóng)桿菌或細(xì)菌的生物體。

如本文定義的，關(guān)于基因序列、orf序列或多核苷酸序列的術(shù)語“表達(dá)”或“表達(dá)的”是指基因、orf或多核苷酸的轉(zhuǎn)錄，并且在適當(dāng)情況下將所得mrna轉(zhuǎn)錄物翻譯成蛋白質(zhì)。因此，如將從上下文清楚看出的，蛋白質(zhì)的表達(dá)是由開放閱讀框序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)生的。所希望產(chǎn)物在宿主微生物中的表達(dá)水平可以基于存在于宿主中的相應(yīng)mrna的量或所選序列編碼的所需產(chǎn)物的量來確定。例如，可以通過pcr或rna雜交來定量從所選序列轉(zhuǎn)錄的mrna(參見sambrooketal.,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,1989[sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨裕淙蹖嶒炇页霭嫔?，1989])。由所選序列編碼的蛋白質(zhì)可以通過各種方法進(jìn)行定量(例如，通過elisa，通過測定蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性，或通過采用使用識別并結(jié)合蛋白質(zhì)的抗體的、獨立于此類活性的測定，如蛋白質(zhì)印跡或放射免疫測定)?；?或其多核苷酸)的上下文中的術(shù)語“表達(dá)”是基于該基因(或其多核苷酸)的核酸序列產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，并且因此包括轉(zhuǎn)錄和翻譯兩者。

如本文定義的，來自sin操縱子的信使rna(mrna)轉(zhuǎn)錄物至少包含編碼全部或部分sinr蛋白的mrna轉(zhuǎn)錄物。

如本文定義的，降低sin操縱子的一個或多個基因的表達(dá)的“遺傳改變”包括但不限于錯義突變、移碼突變、無義突變、插入突變、缺失突變等。

如本文所使用的術(shù)語“突變”表示導(dǎo)致改變的核酸或所編碼的多肽的核酸的任何修飾(即，相對于野生型核酸或多肽序列)。突變包括在基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)內(nèi)產(chǎn)生的改變，連同在蛋白質(zhì)編碼區(qū)序列之外的區(qū)域中的改變，如但不限于調(diào)節(jié)序列或啟動子序列。因此，遺傳改變可能是任何類型的突變。

在某些實施例中，遺傳改變的(修飾的)微生物的基因組的一部分可以被一個或多個異源(外源)多核苷酸替代。

如本文所使用的，“芽孢桿菌屬”或“芽孢桿菌屬成員”包括在“芽孢桿菌屬”內(nèi)的所有物種，如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，這些物種包括但不限于：枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、索諾拉沙漠芽孢桿菌、耐堿芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、飼料芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、黏瓊脂芽孢桿菌、秋葉氏芽孢桿菌、庫拉奇芽孢桿菌、假堅強(qiáng)芽孢桿菌、列城芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、吉氏芽孢桿菌、和蘇云金芽孢桿菌。

我們意識到芽孢桿菌屬在不斷進(jìn)行分類學(xué)重組。因此，該屬旨在包括已重新分類的物種，包括但不限于：如嗜熱脂肪芽孢桿菌(b.stearothermophilus)(現(xiàn)在稱為“嗜熱脂肪土芽孢桿菌(geobacillusstearothermophilus)”)的此類生物體。在氧氣存在下的抗性內(nèi)生孢子的產(chǎn)生被認(rèn)為是芽孢桿菌屬的定義性特性，盡管這個特征也適用于最近命名的脂環(huán)酸芽孢桿菌屬、雙芽孢桿菌屬(amphibacillus)、硫胺素芽孢桿菌屬(aneurinibacillus)、厭氧芽孢桿菌屬(anoxybacillus)、短芽孢桿菌屬、線性桿菌屬(filobacillus)、薄壁芽孢桿菌屬(gracilibacillus)、喜鹽芽孢桿菌屬(halobacillus)、類芽孢桿菌屬、需鹽芽孢桿菌屬(salibacillus)、耐熱芽孢桿菌屬(thermobacillus)、脲芽孢桿菌屬(ureibacillus)和枝芽孢桿菌屬(virgibacillus)。

如本文所使用的，“核酸”是指核苷酸或多核苷酸序列、及其片段或部分，以及可能是雙鏈或單鏈的基因組或合成來源的dna、cdna、和rna，無論其代表正義或反義鏈。應(yīng)當(dāng)理解，由于遺傳密碼的簡并性，許多核苷酸序列可以編碼給定的蛋白質(zhì)。

如本文所使用的，術(shù)語“載體”是核酸可以在生物體、細(xì)胞、或細(xì)胞組分之間傳播和/或轉(zhuǎn)移的任何手段。載體包括為“附加體”的病毒、噬菌體、前病毒、質(zhì)粒、噬菌粒、轉(zhuǎn)座子、和人造染色體如yac(酵母人工染色體)、bac(細(xì)菌人工染色體)、和plac(植物人工染色體)等，即，其自主復(fù)制或可以整合到宿主微生物的染色體中。“表達(dá)載體”是指具有在外來細(xì)胞中并入并表達(dá)異源dna的能力的載體。許多原核和真核表達(dá)載體是可商購的。“靶向載體”是包含與其轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的染色體中的區(qū)域同源的多核苷酸序列并且可以驅(qū)動該區(qū)域的同源重組的載體。靶向載體可用于通過同源重組將突變引入細(xì)胞染色體中。在一些實施例中，靶向載體包含其他非同源序列，例如添加到末端(即，填充序列或側(cè)翼序列)。末端可以閉合，這樣使得靶向載體形成閉環(huán)，例如像，插入載體中。適當(dāng)載體的選擇和/或構(gòu)建在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識內(nèi)。

如本文所使用的，術(shù)語“質(zhì)?！笔侵赣米骺寺≥d體的環(huán)狀雙鏈(ds)dna構(gòu)建體，并且其在許多細(xì)菌和一些真核生物中形成額外的染色體自復(fù)制遺傳元件。在一些實施例中，質(zhì)粒被合并入宿主細(xì)胞的基因組中。

“純化的”或“分離的”或“富集的”意指生物分子(例如，多肽或多核苷酸)通過將其與它在自然界中相關(guān)聯(lián)的天然存在的成分中的一些或所有分離而被從其天然狀態(tài)改變。這種分離或純化可以通過本領(lǐng)域公認(rèn)的分離技術(shù)如離子交換層析、親和層析、疏水分離、透析、蛋白酶處理、硫酸銨沉淀或其他蛋白質(zhì)鹽沉淀、離心、尺寸排阻層析、過濾、微量過濾、凝膠電泳或梯度分離進(jìn)行，以去除最終組合物中所不希望的全細(xì)胞、細(xì)胞碎片、雜質(zhì)、外來蛋白質(zhì)或酶。隨后可以進(jìn)一步向純化或分離的生物分子組合物中添加成分，該成分提供了額外的益處，例如是活化劑、抗抑制劑、期望的離子、控制ph的化合物或其他酶或化學(xué)品。

如本文所使用的，術(shù)語“可選擇的標(biāo)志物”或“選擇性標(biāo)志物”是指能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)的核酸(例如，基因)，其允許容易地選擇包含該核酸的那些宿主。這些可選擇的標(biāo)志物的實例包括但不限于抗微生物劑。因此，術(shù)語“可選擇的標(biāo)志物”是指提供宿主細(xì)胞已經(jīng)攝取了感興趣的輸入dna，或者已經(jīng)發(fā)生了一些其他反應(yīng)的指示。通常，可選擇的標(biāo)志物是賦予宿主細(xì)胞抗微生物抗性或代謝優(yōu)勢的基因，以允許在轉(zhuǎn)化期間將包含外源dna的細(xì)胞與未接受任何外源序列的細(xì)胞區(qū)分開來。根據(jù)本發(fā)明有用的其他標(biāo)志物包括但不限于營養(yǎng)缺陷型標(biāo)志物，如色氨酸；和檢測標(biāo)志物，如β-半乳糖苷酶。

基因的“失活”意味著基因的表達(dá)或其編碼的生物分子的活性被阻斷，或不能發(fā)揮其已知的功能。滅活可以通過任何合適的手段發(fā)生，例如通過如上所述的遺傳改變。在一個實施例中，滅活基因的表達(dá)產(chǎn)物是具有蛋白質(zhì)的生物活性相應(yīng)變化的截短蛋白質(zhì)。在一些實施例中，經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌菌株包含優(yōu)選導(dǎo)致穩(wěn)定和非還原失活的一個或多個基因的失活。

在一些實施例中，通過缺失實現(xiàn)失活。在一些實施例中，通過同源重組缺失靶向缺失的區(qū)域(例如，基因)。例如，使用包括具有選擇性標(biāo)志物的輸入序列的dna構(gòu)建體，該選擇性標(biāo)志物在每側(cè)側(cè)翼有與靶向缺失的區(qū)域同源的序列(其中該序列在本文中稱為“同源盒”)。dna構(gòu)建體與宿主染色體的同源序列對齊，并且在雙重交叉事件中，將靶向缺失的區(qū)域從宿主染色體上切除。

“插入”或“添加”是與天然存在的或親本的序列相比分別導(dǎo)致添加一個或多個核苷酸或氨基酸殘基的核苷酸或氨基酸序列的改變。

如本文所使用的，“取代”由一或多個多核苷酸或氨基酸分別被不同的多核苷酸或氨基酸替代產(chǎn)生。

使基因突變的方法是本領(lǐng)域熟知的，包括但不限于位點定向突變、隨機(jī)突變的產(chǎn)生、和缺口雙鏈體方法(參見，例如，美國專利4,760,025；moringetal.,biotech.2:646,1984；andkrameretal.,nucleicacidsres.,12:9441,1984[moring等人，生物技術(shù)2:646,1984；和kramer等人，核酸研究，12:9441,1984])。

如本文所使用的，“同源基因”是指來自不同的、但通常相關(guān)的物種的基因?qū)?，這些基因彼此對應(yīng)并且彼此相同或非常相似。該術(shù)語涵蓋通過物種形成(即，新物種的發(fā)育)(例如，直系同源基因)分離的基因、以及通過遺傳重復(fù)分離的基因(例如，旁系同源基因)。

如本文所使用的，“直向同源物”和“直向同源基因”是指通過物種形成從共同祖先基因(即，同源基因)演化的不同物種中的基因。通常，直系同源物在進(jìn)化過程中保持相同的功能。直系同源物的鑒定可用于新測序基因組中基因功能的可靠預(yù)測。

如本文所使用的，“旁系同源物”和“旁系同源基因”是指與基因組內(nèi)重復(fù)相關(guān)的基因。雖然直系同源物在進(jìn)化過程中保持相同的功能，但旁系同源物發(fā)展新功能，即使一些功能通常與原始功能相關(guān)。旁系同源基因的實例包括但不限于編碼胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶、和凝血酶的基因，上述酶都是絲氨酸蛋白酶并且在同一物種內(nèi)一起發(fā)生。

如本文所使用的，“同源性”是指序列相似性或同一性，同一性優(yōu)先。該同源性是使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來確定的(參見，例如，smithandwaterman,adv.appl.math.,2:482[1981]；needlemanandwunsch,j.mol.biol.,48:443[1970]；pearsonandlipman,proc.natl.acad.sci.usa85:2444[1988]；programssuchasgap,bestfit,fasta,andtfastainthewisconsingeneticssoftwarepackage(geneticscomputergroup,madison,wi)；anddevereuxetal.,nucl.acidres.,12:387-395[1984][smith和waterman，應(yīng)用數(shù)學(xué)進(jìn)展，2:482[1981]；needleman和wunsch，分子生物學(xué)雜志，48:443[1970]；pearson和lipman，美國科學(xué)院院刊85:2444[1988]；程序，如威斯康星遺傳軟件包中的gap、bestfit、fasta、和tfasta(遺傳學(xué)計算機(jī)組，麥迪遜，威斯康星州)；和devereux等人，核酸研究，12:387-395[1984]])。

如本文所使用的，“類似的序列”是其中基因的功能基本上與指定來自枯草芽孢桿菌菌株168的基因相同的序列。另外，類似的基因與枯草芽孢桿菌菌株168基因的序列包括至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性。可替代地，類似的序列具有在枯草芽孢桿菌168區(qū)域中發(fā)現(xiàn)的在70％至100％之間的基因的對齊和/或在與枯草芽孢桿菌168染色體中的基因?qū)R的區(qū)域中發(fā)現(xiàn)的至少在5-10個之間的基因。在另外的實施例中，多于一個上述性質(zhì)適用于該序列。類似的序列由已知的序列比對方法確定。通常使用的比對方法是blast，盡管如上下文所示，存在也可用于比對序列的其他方法。

有用的算法的一個實例是pileup。pileup使用漸進(jìn)的、兩兩比對創(chuàng)建了來自一組相關(guān)序列的多個序列比對。它還可以標(biāo)繪顯示用于創(chuàng)建該比對的聚類關(guān)系的一個樹。pileup使用feng和doolittle的漸進(jìn)比對方法的簡化(fenganddoolittle,j.mol.evol.,35:351-360[1987][feng和doolittle，分子進(jìn)化雜志，35:351-360[1987]])。該方法類似于higgins和sharp所述的方法(higginsandsharp,cabios5:151-153[1989][higgins和sharp，cabios5:151-153[1989]])。有用的pileup參數(shù)包括為3.00的默認(rèn)空位權(quán)重，為0.10的默認(rèn)空位長度權(quán)重，以及加權(quán)的末端空位。

有用的算法的另一個實例是由altschul等人描述的blast算法(altschuletal.,j.mol.biol.,215:403-410,[1990]；andkarlinetal.,proc.natl.acad.sci.usa90:5873-5787[1993][altschul等人，分子生物學(xué)雜志，215:403-410，[1990]；和karlin等人，美國科學(xué)院院刊90:5873-5787[1993]])。一個特別有用的blast程序是wu-blast-2程序(參見，altschuletal.,meth.enzymol.,266:460-480[1996][altschul等人，酶學(xué)方法，266:460-480[1996]])。wu-blast-2使用若干個搜索參數(shù)，其中大部分設(shè)置為默認(rèn)值。可調(diào)參數(shù)設(shè)置為以下值：重疊跨度＝1，重疊分?jǐn)?shù)＝0.125，字閾值(t)＝11。hsps和hsps2參數(shù)是動態(tài)值，并且由程序本身根據(jù)特定序列的組成以及具體數(shù)據(jù)庫的組成針對所搜索的感興趣的序列是哪個來建立。然而，可以調(diào)整這些值以增加靈敏度。氨基酸序列同一性值％由匹配的相同殘基數(shù)除以比對區(qū)域中“較長”序列的殘基總數(shù)來確定?！拜^長”序列是在比對區(qū)域中具有最多實際殘基的序列(通過wu-blast-2引入以最大化比對得分的空位被忽略)。

如本文所使用的，相對于本文鑒定的氨基酸或核苷酸序列，“序列同一性百分比(％)”被定義為在比對序列并引入空位(必要的話)以實現(xiàn)最大百分比序列同一性之后，并且不考慮作為序列同一性的一部分的任何保守取代，候選序列中與感興趣的序列中的氨基酸殘基或核苷酸相同的氨基酸殘基或核苷酸的百分比。

“同系物”(或“同源物”)是指與主題氨基酸序列和主題核苷酸序列具有特定程度的同一性的實體。使用常規(guī)序列比對工具(例如，clustal、blast等等)，同源序列可以包括與主題序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至99％同一性的氨基酸序列。通常，除非另有說明，同系物將包括與主題氨基酸序列相同的活性位點殘基。

進(jìn)行序列比對并且確定序列同一性的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，可以在不進(jìn)行過多實驗的情況下實施，并且可以明確地獲得同一性值的計算。參見，例如，ausubeletal.,eds.(1995)currentprotocolsinmolecularbiology,chapter19(greenepublishingandwiley-interscience,newyork)；andthealignprogram(dayhoff(1978)inatlasofproteinsequenceandstructure5:suppl.3(nationalbiomedicalresearchfoundation,washington,d.c.)[ausubel等人編輯(1995)分子生物學(xué)現(xiàn)代方法，第19章(格林出版與威利交叉科學(xué)出版社，紐約)；和align程序(dayhoff(1978)，在蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)圖集5：增刊3中(國家生物醫(yī)學(xué)研究基金會，華盛頓)]。許多算法可用于比對序列并確定序列同一性，并且包括，例如，needlemanetal.(1970)j.mol.biol.48:443[needleman等人(1970)分子生物學(xué)雜志48:443]的同源性比對算法；smithetal.(1981)adv.appl.math.2:482[smith等人(1981)應(yīng)用數(shù)學(xué)進(jìn)展2:482]的局部同源性算法；pearsonetal.(1988)proc.natl.acad.sci.85:2444[pearson等人(1988)美國科學(xué)院院刊85:2444]的相似性捜索方法；smith-waterman算法(meth.mol.biol.70:173-187(1997)[分子生物學(xué)方法70:173-187(1997)])；和blastp、blastn、和blastx算法(參見altschuletal.(1990)j.mol.biol.215:403-410[altschul等人(1990)分子生物學(xué)雜志215:403-410])。

使用這些算法的計算機(jī)化程序也是可用的，并且包括但不限于：align或megalign(dnastar)軟件，或wu-blast-2(altschuletal.,meth.enzym.,266:460-480(1996)[altschul等人，酶學(xué)方法，266:460-480(1996)])；或可在遺傳學(xué)計算機(jī)組(gcg)包，版本8，麥迪遜，威斯康星州，美國中獲得的gap、bestfit、blast、fasta、和tfasta；以及智能遺傳學(xué)(intelligenetics)，山景城，加利福尼亞州的pc/基因程序中的clustal。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以確定用于測量比對的適當(dāng)參數(shù)，包括在進(jìn)行比較的序列的整個長度上實現(xiàn)最大比對所需的算法。優(yōu)選地，使用由程序確定的默認(rèn)參數(shù)來確定序列同一性。具體來說，序列同一性可以通過使用具有默認(rèn)參數(shù)的clustalw(thompsonj.d.etal.(1994)nucleicacidsres.22:4673-4680[thompsonj.d.等人，(1994)核酸研究22:4673-4680])來確定，這些默認(rèn)參數(shù)即：

如本文所使用的，術(shù)語“雜交”是指通過堿基配對將核酸鏈與互補(bǔ)鏈連接的過程，如本領(lǐng)域已知的。

如果兩個序列在中至高嚴(yán)格雜交和洗滌條件下彼此特異性雜交，則認(rèn)為核酸序列可與參考核酸序列“選擇性雜交”。雜交條件是基于結(jié)合復(fù)合物或探針的核酸的解鏈溫度(tm)。例如，“最大嚴(yán)格”通常發(fā)生在約tm-5℃(低于探針的tm5°)；“高嚴(yán)格”發(fā)生在低于tm約5-10℃；“中等嚴(yán)格”發(fā)生在低于探針的tm約10-20℃；并且“高嚴(yán)格”發(fā)生在低于tm約20-25℃。在功能上，最大嚴(yán)格條件可以用于鑒定與雜交探針具有嚴(yán)格同一性或近乎嚴(yán)格同一性的序列；而中或低嚴(yán)格雜交可用于鑒定或檢測多核苷酸序列同源物。

中和高嚴(yán)格雜交條件是本領(lǐng)域熟知的。高嚴(yán)格條件的實例包括在約42℃下在50％甲酰胺，5xssc，5x登哈特溶液，0.5％sds和100μg/ml變性載體dna中進(jìn)行的雜交，隨后在室溫下在2xssc和0.5％sds中洗滌兩次，并在42℃下在0.1xssc和0.5％sds中再洗滌兩次。中嚴(yán)格雜交條件的實例包括在37℃下在包括20％甲酰胺，5×ssc(150mmnacl，15mm檸檬酸三鈉)，50mm磷酸鈉(ph7.6)，5×登哈特溶液，10％葡聚糖硫酸鹽和20mg/ml變性剪切的鮭魚精子dna的溶液中過夜孵育，然后在約37℃-50℃下以1xssc洗滌濾器來進(jìn)行。如果需要，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何調(diào)節(jié)溫度、離子強(qiáng)度等以適應(yīng)因素如探針長度等等。

當(dāng)用于提及生物組分或組合物(例如，細(xì)胞、核酸、多肽/酶、載體等)時，術(shù)語“重組體”表示該生物組分或組成物處于自然界中未發(fā)現(xiàn)的狀態(tài)。換句話說，生物組分或組合物已經(jīng)通過人類干預(yù)從其天然狀態(tài)進(jìn)行了修飾。例如，重組細(xì)胞涵蓋表達(dá)在其天然親本(即，非重組)細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)的一個或多個基因的細(xì)胞，表達(dá)與其天然親本細(xì)胞不同的量的一種或多種天然基因的細(xì)胞，和/或在不同于其天然親本細(xì)胞的條件下表達(dá)一種或多種天然基因的細(xì)胞。重組核酸可以與天然序列相差一個或多個核苷酸，可操作地連接到異源序列(例如，異源啟動子，編碼非天然或變體信號序列的序列等)，沒有內(nèi)含子序列，和/或處于分離形式。重組多肽/酶可以與天然序列相差一個或多個氨基酸，可以與異源序列融合，可能被截短或具有氨基酸的內(nèi)部缺失，能以在天然細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)的方式表達(dá)(例如，來自由于細(xì)胞中存在編碼多肽的表達(dá)載體而過表達(dá)該多肽的重組細(xì)胞)，和/或處于分離形式。需要強(qiáng)調(diào)的是，在一些實施例中，重組多核苷酸或多肽/酶具有與其野生型對應(yīng)物相同但處于非天然形式(例如，分離或富集形式)的序列。

如本文所使用的，術(shù)語“靶序列”是指宿主細(xì)胞中編碼如下序列的dna序列：其中希望將輸入序列插入宿主細(xì)胞基因組中。在一些實施例中，靶序列編碼功能性野生型基因或操縱子，而在其他實施例中，靶序列編碼功能性突變基因或操縱子、或非功能基因或操縱子。

如本文所使用的，“側(cè)翼序列”是指正在討論的序列的上游或下游的任何序列(例如，針對基因a-b-c，基因b以a和c基因序列為側(cè)翼)。在一個實施例中，輸入序列每側(cè)側(cè)翼有同源盒。在另一個實施例中，輸入序列和同源盒包括在每側(cè)側(cè)翼有填充序列的單元。在一些實施例中，側(cè)翼序列僅存在于單側(cè)(3’或5’)，但在實施例中，序列的每側(cè)均有側(cè)翼序列。每個同源盒的序列與芽孢桿菌屬染色體中的序列同源。這些序列指導(dǎo)在芽孢桿菌屬染色體中，新構(gòu)建體被整合，并且部分芽孢桿菌屬染色體將被輸入序列替代。在一個實施例中，選擇性標(biāo)志物的5’和3’端側(cè)翼有包含失活染色體區(qū)段的部分的多核苷酸序列。在一些實施例中，側(cè)翼序列僅存在于單側(cè)(3’或5’)，而在實施例中，其存在于所側(cè)翼序列的每側(cè)。

如本文所使用的，術(shù)語“可擴(kuò)增標(biāo)志物”、“可擴(kuò)增基因”、和“擴(kuò)增載體”是指基因或編碼基因的載體，其允許在適當(dāng)生長條件下擴(kuò)增該基因。

在大多數(shù)擴(kuò)增技術(shù)中通過酶的選擇實現(xiàn)“模板特異性”。擴(kuò)增酶是在使用它們的條件下僅在核酸的不均勻混合物中處理核酸的特定序列的酶。例如，在qβ復(fù)制酶的情況下，mdv-1rna是復(fù)制酶的特異性模板(參見，例如，kacianetal.,proc.natl.acad.sci.usa69:3038[1972][kacian等人，美國科學(xué)院院刊69:3038[1972]])。其他核酸不被該擴(kuò)增酶復(fù)制。類似地，在t7rna聚合酶的情況下，該擴(kuò)增酶對其本身的啟動子具有嚴(yán)格的特異性(參見，chamberlinetal.,nature228:227[1970][chamberlin等人，自然，228:227[1970]])。在t4dna連接酶的情況下，該酶將不連接兩個寡核苷酸或多核苷酸，其中寡核苷酸或多核苷酸底物與連接接合處的模板之間存在錯配(參見，wuandwallace,genomics4:560[1989][wu和wallace，基因組學(xué)，4:560[1989]])。最后，taq和pfu聚合酶由于其在高溫下的作用能力而被發(fā)現(xiàn)顯示出對由引物限制并由此限定的序列的高度特異性；高溫導(dǎo)致有利于引物與靶序列雜交而不與非靶序列雜交的熱力學(xué)條件。

如本文所使用的，術(shù)語“可擴(kuò)增核酸”是指可以通過任何擴(kuò)增方法擴(kuò)增的核酸。預(yù)期“可擴(kuò)增核酸”通常將包含“樣本模板”。

如本文所使用的，術(shù)語“樣品模板”是指源自樣品的核酸，將該樣品對“靶標(biāo)”的存在進(jìn)行分析(下文所定義)。相比之下，“背景模板”用于提及除樣品模板之外的核酸，其可以存在或不存在于樣品中。背景模板通常是無意的。它可能是遺留(carryover)的結(jié)果，或者它可能是因為試圖從樣品中純化掉的核酸污染物的存在導(dǎo)致的。例如，來自生物體的而非待檢測那些的核酸可作為背景存在于測試樣品中。

如本文所使用的，術(shù)語“引物”是指當(dāng)置于以下條件下能作為合成起始點的寡核苷酸，無論是純化的限制性消化物中天然存在的還是經(jīng)合成而產(chǎn)生的：其中誘導(dǎo)與核酸鏈互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物的合成(即，在核苷酸和誘導(dǎo)劑例如dna聚合酶存在下并在合適的溫度和ph下)。引物優(yōu)選是單鏈，用于最大效率的擴(kuò)增，但是可替代地可以是雙鏈。如果是雙鏈，引物首先經(jīng)過處理以分離其雙鏈，然后再用于制備延伸產(chǎn)物。優(yōu)選地，引物是寡脫氧核糖核苷酸。引物必須足夠長，以在誘導(dǎo)劑存在下引發(fā)延伸產(chǎn)物的合成。引物的準(zhǔn)確長度將取決于多個因素，包括溫度、引物來源和方法的使用。

如本文所使用的，術(shù)語“探針”是指能與另一感興趣的寡核苷酸雜交的寡核苷酸(即核苷酸序列)，無論是在純化的限制性消化中天然存在還是以合成，重組或通過pcr擴(kuò)增產(chǎn)生的。探針可以是單鏈或雙鏈的。探針可用于檢測、鑒定和分離特定基因序列。預(yù)期的是，本發(fā)明所用的任何探針都將用任何“報道分子”標(biāo)記，這樣使得在任何檢測系統(tǒng)中都可檢測，所述檢測系統(tǒng)包括但不限于酶(例如elisa、以及基于酶的組織化學(xué)測定)系統(tǒng)、熒光系統(tǒng)、放射性系統(tǒng)、和發(fā)光系統(tǒng)。本發(fā)明并不旨在限于任何具體的檢測系統(tǒng)或標(biāo)記。

如本文所使用的，術(shù)語“靶”當(dāng)用于提及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)時，是指由用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的引物所界定的核酸區(qū)域。因此，試圖從其他核酸序列分選“靶標(biāo)”?！皡^(qū)段”被定義為靶序列內(nèi)的核酸區(qū)域。

如本文所使用的，術(shù)語“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”(“pcr”)是指通過引用并入本文的美國專利號4,683,195、4,683,202和4,965,188的方法，其包括用于在不進(jìn)行克隆或純化的情況下增加基因組dna混合物中靶序列的區(qū)段濃度的方法。這種用于擴(kuò)增靶序列的方法由以下各項組成：將大量過量的兩個寡核苷酸引物引入到包含了所希望的靶序列的dna混合物中，隨后在dna聚合酶的存在下進(jìn)行一種精確順序的熱循環(huán)。這兩個引物與雙鏈靶序列的其對應(yīng)鏈互補(bǔ)。為了實現(xiàn)擴(kuò)增，使該混合物變性，并且然后使引物退火為靶分子內(nèi)的其互補(bǔ)序列。退火后，用一種聚合酶使這些引物延伸，以便形成一對新的互補(bǔ)鏈。變性、引物退火以及聚合酶延伸的步驟可以重復(fù)許多次(即，變性、退火以及延伸構(gòu)成一個“循環(huán)”；可以存在多個“循環(huán)”)以獲得高濃度的所希望的靶序列的擴(kuò)增區(qū)段。所希望的靶序列的擴(kuò)增區(qū)段的長度是由引物相對于彼此的相對位置決定的，并且因此，此長度是一個可控制的參數(shù)。由于該方法的重復(fù)方面，該方法被稱為“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”(以下稱為“pcr”)。因為靶序列的所希望的擴(kuò)增區(qū)段變?yōu)榛旌衔镏械闹饕蛄?就濃度來說)，所以它們被稱為“pcr擴(kuò)增的”。

如本文所使用的，術(shù)語“擴(kuò)增試劑”是指除引物、核酸模板和擴(kuò)增酶之外的擴(kuò)增所需的那些試劑(脫氧核糖核苷酸三磷酸、緩沖液等)。通常，將擴(kuò)增試劑以及其他反應(yīng)組分放置并包含在反應(yīng)容器中(試管，微孔等)中。

在pcr的情況下，可以將基因組dna中特異性靶序列的單拷貝擴(kuò)增至由若干種不同方法可檢測的水平(例如，與標(biāo)記的探針雜交；并入生物素標(biāo)記的引物，然后進(jìn)行抗生物素蛋白-酶偶聯(lián)物檢測；將³²p標(biāo)記的脫氧核苷酸三磷酸(如dctp或datp)并入擴(kuò)增片段)。除基因組dna外，任何寡核苷酸或多核苷酸序列可以用適當(dāng)?shù)囊锓肿咏M來擴(kuò)增。具體地講，經(jīng)pcr方法本身所產(chǎn)生的擴(kuò)增區(qū)段自身就是用于隨后的pcr擴(kuò)增的有效模板。

如本文所使用的，術(shù)語“pcr產(chǎn)物”、“pcr片段”、及“擴(kuò)增產(chǎn)物”是指在變性、退火及延伸的pcr步驟的兩個或更多個循環(huán)完成之后所得到的化合物的混合物。這些術(shù)語涵蓋一個或多個靶序列的一個或多個區(qū)段已經(jīng)擴(kuò)增的情況。

如本文所使用的，術(shù)語“rt-pcr”是指rna序列的復(fù)制和擴(kuò)增。在該方法中，將逆轉(zhuǎn)錄與pcr偶聯(lián)，最常使用其中采用熱穩(wěn)定聚合酶的一種酶程序，如美國專利5,322,770中所述，其通過引用并入本文。在rt-pcr中，由于聚合酶的逆轉(zhuǎn)錄酶活性，將rna模板轉(zhuǎn)化為cdna，并且然后使用聚合酶的聚合活性擴(kuò)增(即，如在其他pcr方法中)。

如本文所使用的，“遺傳改變的宿主菌株”(例如，遺傳改變的芽孢桿菌屬菌株)是指遺傳工程化的宿主細(xì)胞，也稱為重組宿主細(xì)胞。在一些實施例中，與在基本上相同的生長條件下生長的相應(yīng)未經(jīng)改變的宿主菌株中相同感興趣的蛋白質(zhì)的表達(dá)和/或產(chǎn)生相比，遺傳改變的宿主細(xì)胞具有增強(qiáng)的(增加的)感興趣的蛋白質(zhì)的表達(dá)。在一些實施例中，增強(qiáng)的表達(dá)水平是由來自于sin操縱子的一個或多個基因，例如，sinr基因的表達(dá)降低引起的。在一些實施例中，改變的菌株是經(jīng)遺傳工程化的具有一個或多個缺失的內(nèi)源性染色體區(qū)或其片段的芽孢桿菌屬物種，其中與在基本上相同的生長條件下生長的相應(yīng)的未經(jīng)改變的芽孢桿菌屬宿主菌株相比，感興趣的蛋白質(zhì)具有增強(qiáng)的表達(dá)或產(chǎn)生水平。

如本文所使用的，術(shù)語“染色體整合”是指將輸入序列引入宿主細(xì)胞(例如，芽孢桿菌屬)的染色體的過程。轉(zhuǎn)化dna的同源區(qū)域與染色體的同源區(qū)域?qū)R。隨后，在雙交換(即同源重組)中，同源盒之間的序列被輸入序列替代。在本發(fā)明的一些實施例中，dna構(gòu)建體的滅活染色體區(qū)段的同源段與芽孢桿菌屬染色體的固有染色體區(qū)域的側(cè)翼同源區(qū)域?qū)R。隨后，在雙交換(即同源重組)中，通過dna構(gòu)建體缺失固有染色體區(qū)域。

“同源重組”意指在相同或幾乎相同核苷酸序列位點處的兩個dna分子或配對染色體之間的dna片段的交換。在一個實施例中，染色體整合是同源重組。

如本文所使用的“同源序列”意指，當(dāng)最佳比對用于比較時，與另一個核酸或多肽序列具有100％、99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、88％、85％、80％、75％、或70％序列同一性的核酸或多肽序列。在一些實施例中，同源序列具有85％至100％之間的序列同一性，而在其他實施例中，存在在90％至100％之間的序列同一性，并且在更多實施例中，存在95％和100％的序列同一性。

如本文所使用的，“氨基酸”是指肽或蛋白質(zhì)序列或其部分。術(shù)語“蛋白質(zhì)”、“肽”和“多肽”可互換使用。

如本文所使用的，“感興趣的蛋白質(zhì)”和“感興趣的多肽”是指期望和/或被評估的蛋白質(zhì)/多肽。在一些實施例中，感興趣的蛋白質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)的，而在其他實施例中，其是分泌的多肽。具體地，多肽包括酶，這些酶包括但不限于選自以下各項的那些：淀粉分解酶、蛋白水解酶、纖維素分解酶、氧化還原酶和植物細(xì)胞壁降解酶。更具體地，這些酶包括但不限于：淀粉酶、蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、漆酶、酚氧化酶、氧化酶、角質(zhì)酶、纖維素酶、半纖維素酶、酯酶、過氧化物酶、過氧化氫酶、葡萄糖氧化酶、植酸酶、果膠酶、過水解酶、多元醇氧化酶、果膠酸裂解酶、葡糖苷酶、異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)移酶、半乳糖苷酶和幾丁質(zhì)酶。在本發(fā)明的具體實施例中，感興趣的多肽是蛋白酶。在一些實施例中，感興趣的蛋白質(zhì)是與信號肽融合的分泌多肽(即，待分泌的蛋白質(zhì)上的氨基末端延伸)。幾乎所有分泌的蛋白質(zhì)都使用氨基末端蛋白質(zhì)延伸，其在前體蛋白質(zhì)穿過膜的靶向和易位中起關(guān)鍵作用。在膜轉(zhuǎn)移期間或之后立即通過信號肽酶水解去除該延伸。

在本發(fā)明的一些實施例中，感興趣的多肽選自激素、抗體、生長因子、受體等。涵蓋本發(fā)明的激素包括但不限于：卵泡刺激素、黃體生成激素、促皮質(zhì)素釋放因子、生長激素抑制素、促性腺激素、加壓素、催產(chǎn)素、促紅細(xì)胞生成素、胰島素等。生長因子包括但不限于：血小板衍生生長因子、胰島素樣生長因子、表皮生長因子、神經(jīng)生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、細(xì)胞因子如白介素(例如，il-1至il-13)、干擾素、集落刺激因子等?？贵w包括但不限于：直接從需要產(chǎn)生抗體的任何物種獲得的免疫球蛋白。此外，本發(fā)明涵蓋修飾的抗體。多克隆和單克隆抗體也由本發(fā)明所涵蓋。在具體實施例中，抗體是人抗體。

如本文所使用的，多肽的“衍生物”或“變體”意指一種多肽，該多肽通過以下方式來自前體多肽(例如，天然多肽)：向c-和n-末端之一或二者添加一個或多個氨基酸，在氨基酸序列的不同位點的一個或多個處取代一個或多個氨基酸，在多肽的一端或兩端處或在氨基酸序列的一個或多個位點處缺失一個或多個氨基酸，在氨基酸序列的一個或多個位點處插入一個或多個氨基酸，以及其任何組合。多肽的衍生物或變體的制備能以任何方便的方式實現(xiàn)，例如通過修飾編碼天然多肽的dna序列，將該dna序列轉(zhuǎn)化到合適的宿主中，以及修飾的dna序列的表達(dá)以形成衍生物/變體多肽。衍生物或變體進(jìn)一步包括經(jīng)化學(xué)修飾的多肽。

如本文所使用的，術(shù)語“異源蛋白質(zhì)”是指在天然存在于宿主細(xì)胞中的蛋白質(zhì)或多肽。異源蛋白質(zhì)的實例包括酶如水解酶，包括蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶、糖酶、和脂肪酶；異構(gòu)酶如消旋酶、差向異構(gòu)酶、互變異構(gòu)酶、或變位酶；轉(zhuǎn)移酶、激酶和磷酸酶。在一些實施例中，蛋白質(zhì)是治療上重要的蛋白質(zhì)或肽，包括但不限于：生長因子、細(xì)胞因子、配體、受體和抑制劑，連同疫苗和抗體。在另外的實施例中，蛋白質(zhì)是商業(yè)上重要的工業(yè)蛋白質(zhì)/肽(例如，蛋白酶、糖酶如淀粉酶和葡糖淀粉酶、纖維素酶、氧化酶和脂肪酶)。在一些實施例中，編碼蛋白質(zhì)的基因是天然存在的基因，而在其他實施例中，使用突變的和/或合成的基因。

如本文所使用的，“同源蛋白質(zhì)”是指天然的或天然存在于細(xì)胞中的蛋白質(zhì)或多肽。在實施例中，細(xì)胞是革蘭氏陽性細(xì)胞，而在具體實施例中，細(xì)胞是芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞。在替代性實施例中，同源蛋白質(zhì)是由其他生物體產(chǎn)生的天然蛋白質(zhì)，包括但不限于大腸桿菌。本發(fā)明涵蓋通過重組dna技術(shù)產(chǎn)生同源蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞。

本發(fā)明總體上涉及具有導(dǎo)致感興趣的蛋白質(zhì)的表達(dá)增加的遺傳改變的細(xì)菌細(xì)胞，以及制造和使用此類細(xì)胞的方法。本發(fā)明的方面包括具有遺傳改變的革蘭氏陽性微生物，如芽孢桿菌屬物種，該遺傳改變可降低sin操縱子中基因的表達(dá)，并導(dǎo)致感興趣的蛋白質(zhì)的表達(dá)增強(qiáng)(例如，降低sinr基因的表達(dá))。

如上文概述的，本發(fā)明的方面包括用于從革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞中增加感興趣的蛋白質(zhì)的表達(dá)的方法，并且是基于以下觀察：與相應(yīng)的非遺傳改變的革蘭氏陽性細(xì)胞(例如野生型和/或親本細(xì)胞)中相同的感興趣的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平相比，在已經(jīng)被遺傳改變以降低sin操縱子中一個或多個基因的表達(dá)的革蘭氏陽性細(xì)胞中感興趣的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)增加。遺傳改變意指宿主細(xì)胞中改變宿主細(xì)胞的遺傳構(gòu)成的任何改變，例如通過附加體添加和/或染色體插入、缺失、倒位、堿基變換等。在這方面不意圖進(jìn)行限制。

在某些實施例中，該方法包括產(chǎn)生或獲得包括至少一個遺傳改變的經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞，該遺傳改變降低了sin操縱子中一個或多個基因的表達(dá)，并且能夠產(chǎn)生感興趣的蛋白質(zhì)并在使得經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞表達(dá)感興趣的蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞。因此，與在基本上相同的培養(yǎng)條件下生長的相應(yīng)未經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞中的感興趣蛋白質(zhì)的表達(dá)相比，在經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞中感興趣的蛋白的表達(dá)增加。

根據(jù)某些實施例，遺傳改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞(或產(chǎn)生遺傳改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞的親本細(xì)胞)可以是芽孢桿菌屬菌株。在一些實施例中，感興趣的芽孢桿菌菌株是嗜堿的。許多嗜堿芽孢桿菌菌株是已知的(參見，例如，美國專利5,217,878；和aunstrupetal.,procivifs:ferment.technol.today,299-305[1972][aunstrup等人，procivifs：今日發(fā)酵工藝，299-305[1972]])。在一些實施例中，感興趣的芽孢桿菌菌株是工業(yè)芽孢桿菌菌株。工業(yè)芽孢桿菌菌株的實例包括但不限于地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、和解淀粉芽解桿菌。在另外的實施例中，芽孢桿菌宿主菌株選自下組，該組由以下各項組成：遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、和巨大芽孢桿菌，以及芽孢桿菌屬內(nèi)的其他生物體，如上所討論的。在具體實施例中，使用枯草芽孢桿菌。例如，美國專利5,264,366和4,760,025(re34,606)描述了可用于本發(fā)明的各種芽孢桿菌屬宿主菌株，盡管還考慮其他合適的菌株用于本發(fā)明。

如本文所述的遺傳改變的細(xì)胞的親本菌株(例如，親本芽孢桿菌屬菌株)可以是工業(yè)菌株，其包括非重組菌株、天然存在菌株的突變菌株或重組菌株。在某些實施例中，親本菌株是重組宿主菌株，其中編碼感興趣的多肽的多核苷酸已經(jīng)被引入宿主中。盡管可以在親本菌株中進(jìn)行編碼感興趣的多肽的多核苷酸的引入，但是該步驟也可以在已經(jīng)被遺傳改變以增加本文所述的多肽產(chǎn)生的菌株中進(jìn)行。在一些實施例中，宿主菌株是枯草芽孢桿菌宿主菌株，例如，重組枯草芽孢桿菌宿主菌株。

已知許多枯草芽孢桿菌菌株可用于本發(fā)明的方面，包括但不限于例如1a6(atcc39085)、168(1a01)、sb19、w23、ts85、b637、pb1753至pb1758、pb3360、jh642、1a243(atcc39,087)、atcc21332、atcc6051、mi113、de100(atcc39,094)、gx4931、pbt110、和pep211菌株(參見例如，hochetal.,genetics,73:215-228[1973][hoch等人，遺傳學(xué)，73:215-228[1973]]；美國專利號4,450,235；美國專利號4,302,544；和ep0134048)。palva等人以及其他人進(jìn)一步描述了使用枯草芽孢桿菌作為表達(dá)宿主(參見，palvaetal.,gene19:81-87[1982][palva等人，基因，19:81-87[1982]]；還參見fahnestockandfischer,j.bacteriol.,165:796-804[1986][fahnestock和fischer，細(xì)菌學(xué)雜志，165:796-804[1986]]；以及wangetal.,gene69:39-47[1988][wang等人，基因，69:39-47[1988]])。

在某些實施例中，產(chǎn)生工業(yè)蛋白酶的芽孢桿菌屬菌株可用作親本表達(dá)宿主。在一些實施例中，本發(fā)明中這些菌株的使用進(jìn)一步提高了效率和蛋白酶生產(chǎn)。兩種一般類型的蛋白酶通常由芽孢桿菌屬物種分泌，即中性(或“金屬蛋白酶”)和堿性(或“絲氨酸”)蛋白酶。絲氨酸蛋白酶是催化肽鍵的水解的酶，其中在活性位點存在必需的絲氨酸殘基。絲氨酸蛋白酶具有在25,000至30,000范圍內(nèi)的分子量(參見，priest,bacteriol.rev.,41:711-753[1977][priest，細(xì)菌學(xué)評論，41:711-753[1977]])?？莶輻U菌蛋白酶是用于本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶。已經(jīng)鑒定并測序了多種枯草芽孢桿菌蛋白酶，例如枯草桿菌蛋白酶168，枯草桿菌蛋白酶bpn’，枯草桿菌蛋白酶carlsberg，枯草桿菌蛋白酶dy，枯草桿菌蛋白酶147和枯草桿菌蛋白酶309(參見，例如，ep414279b；wo89/06279；和stahletal.,j.bacteriol.,159:811-818[1984][stahl等人，細(xì)菌學(xué)雜志，159:811-818[1984]])。在本發(fā)明的一些實施例中，芽孢桿菌宿主菌株產(chǎn)生突變體(例如，變體)蛋白酶。許多參考文獻(xiàn)提供了變體蛋白酶和參考的實例(參見例如，wo99/20770；wo99/20726；wo99/20769；wo89/06279；re34,606；美國專利號4,914,031；美國專利號4,980,288；美國專利號5,208,158；美國專利號5,310,675；美國專利號5,336,611；美國專利號5,399,283；美國專利號5,441,882；美國專利號5,482,849；美國專利號5,631,217；美國專利號5,665,587；美國專利號5,700,676；美國專利號5,741,694；美國專利號5,858,757；美國專利號5,880,080；美國專利號6,197,567；和美國專利號6,218,165)。

這里注意到，本發(fā)明不限于作為感興趣的蛋白質(zhì)的蛋白酶。實際上，本披露涵蓋了多種感興趣的蛋白質(zhì)，針對它們而言在革蘭氏陽性細(xì)胞中的增加的表達(dá)是所希望的(詳述如下)。

在其他實施例中，用于本發(fā)明方面的菌株可能在提供有益表型的其他基因中具有額外的遺傳改變。例如，可以使用包括以下基因中的至少一個的突變或缺失的芽孢桿菌屬物種：degu、degs、degr和degq。在一些實施例中，突變?yōu)閐egu基因，例如degu(hy)32突變。(參見，msadeketal.,j.bacteriol.,172:824-834[1990][msadek等人，細(xì)菌學(xué)雜志，172:824-834[1990]]；和olmosetal.,mol.gen.genet.,253:562-567[1997][olmos等人，分子遺傳和基因組學(xué)，253:562-567[1997]])。因此，可用于本發(fā)明方面的親本/遺傳改變的革蘭氏陽性菌株的一個實例是攜帶degu32(hy)突變的枯草芽孢桿菌細(xì)胞。在另一個實施例中，芽孢桿菌屬宿主可以包括scoc4(參見，caldwelletal.,j.bacteriol.,183:7329-7340[2001][caldwell等人，細(xì)菌學(xué)雜志，183:7329-7340[2001]])；oppa或opp操縱子的其他基因(參見，peregoetal.,mol.microbiol.,5:173-185[1991][perego等人，分子微生物學(xué)，5:173-185[1991]])中的突變或缺失。實際上，預(yù)期引起與oppa基因突變相同的表型的opp操縱子中的任何突變將可用于本發(fā)明的經(jīng)改變的芽孢桿菌屬菌株的一些實施例中。在一些實施例中，這些突變單獨發(fā)生，而在其他實施例中，存在突變的組合。在一些實施例中，本發(fā)明的改變的芽孢桿菌獲得自已經(jīng)包括對一種或多種上述基因的突變的親本芽孢桿菌宿主菌株。在替代實施例中，將本發(fā)明的前述經(jīng)遺傳改變的芽孢桿菌進(jìn)一步工程化以包括上述基因中的一種或多種的突變。

如上所述，與野生型和/或親本細(xì)胞(在基本相同的條件下生長的)相比，在遺傳改變的革蘭氏陽性細(xì)胞中，至少一種sin操縱子的基因的表達(dá)降低了。表達(dá)的這種降低能以任何方便的方式實現(xiàn)，并且可以是在轉(zhuǎn)錄、mrna穩(wěn)定性、翻譯的水平上，或者可能是由于存在由降低其活性的sin操縱子產(chǎn)生的一種或多種多肽的變異導(dǎo)致的(即，它是基于多肽的活性的表達(dá)的“功能性”降低)。因此，不意圖限制遺傳改變的類型或者降低sin操縱子中至少一個基因的表達(dá)的方式。例如，在一些實施例中，革蘭氏陽性細(xì)胞中的遺傳改變是改變sin操縱子中的一個或多個啟動子，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄活性降低的改變。在某些實施例中，改變是導(dǎo)致mrna轉(zhuǎn)錄物水平降低的sin操縱子中(例如，在sinr基因中)的沉默突變(例如，如實例中所示)?？商娲?，革蘭氏陽性細(xì)胞中的遺傳改變可以是改變sin操縱子中的核苷酸的遺傳改變，該遺傳改變在細(xì)胞中導(dǎo)致穩(wěn)定性降低的轉(zhuǎn)錄物。在某些實施例中，可以在遺傳改變的革蘭氏陽性細(xì)胞中存在降低sin操縱子中一個或多個基因的表達(dá)的多于一個遺傳改變。

在某些實施例中，在遺傳改變的革蘭氏陽性細(xì)胞中，該sin操縱子中的一個或多個基因的表達(dá)降低至在基本相同的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的野生型和/或親本細(xì)胞中的表達(dá)水平的約3％，包括約4％、約5％、約6％、約7％、約8％、約9％、約10％、約11％、約12％、約13％、約14％、約15％、約16％、約17％、約18％、約19％、約20％、約21％、約22％、約23％、約24％、約25％、約26％、約27％、約28％、約29％、約30％、約35％、約40％、約45％、約50％、約55％、約60％、約65％、約70％、約75％、或約80％。因此，sin操縱子中一個或多個基因的表達(dá)降低的范圍可以為從約3％至約80％、從約4％至約75％、從約5％至約70％、從約6％至約65％、從約7％至約60％、從約8％至約50％、從約9％至約45％、從約10％至約40％、從約11％至約35％、從約12％至約30％、從約13％至約25％、從約14％至約20％等。預(yù)期了在上述范圍內(nèi)的表達(dá)的任何子范圍。

在某些實施例中，與基本上相同培養(yǎng)條件下生長的相應(yīng)未經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞中這些基因的表達(dá)相比，經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞已經(jīng)降低了sinr基因的表達(dá)。在具體的實施例中，與在基本相同的培養(yǎng)條件下生長的相應(yīng)未經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞相比，遺傳改變導(dǎo)致來自經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞中的sinr基因的mrna轉(zhuǎn)錄物水平的降低。

在某些實施例中，遺傳改變(或突變)是降低sin操縱子中sinr基因表達(dá)的遺傳改變(或突變)。在這些實施例中的一些中，遺傳改變在sin操縱子的sinr基因中發(fā)生。親本革蘭氏陽性細(xì)胞中的sinr基因(即，在如本文所述的遺傳改變之前)是與seqidno:1具有至少60％同一性的基因，包括與seqidno:1具有至少約65％、至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％、至少約99％、或100％同一性的基因。在某些實施例中，遺傳改變是全部或部分的sinr基因的缺失。在某些實施例中，遺傳改變是沉默突變，其中沉默突變意指在翻譯時不導(dǎo)致所編碼的多肽的氨基酸變化的基因的編碼區(qū)的核酸序列中的突變(本領(lǐng)域中很好理解的術(shù)語)。在某些實施例中，變體序列中的沉默突變在對應(yīng)于seqidno:1的核苷酸330的核苷酸位置處。在某些實施例中，sinr沉默突變是野生型sinr基因的編碼序列的有義鏈的核苷酸位置330處的從鳥嘌呤(g)至腺嘌呤(a)的單核苷酸變化(seqidno:1顯示了sinr野生型核苷酸序列；seqidno:2顯示了sinr氨基酸序列；并且seqidno:3顯示了具有g(shù)330a沉默突變的變體sinr核苷酸序列)。

如上所述，許多不同的蛋白質(zhì)可用作革蘭氏陽性細(xì)胞中感興趣的蛋白質(zhì)(即，在遺傳改變的細(xì)胞中其表達(dá)增加的蛋白質(zhì))。感興趣的蛋白質(zhì)可以是同源蛋白質(zhì)或異源蛋白質(zhì)，并且可以是野生型蛋白質(zhì)或天然或重組變體。在某些實施例中，感興趣的蛋白質(zhì)是酶，其中在某些情況下，酶選自蛋白酶、纖維素酶、支鏈淀粉酶、淀粉酶、糖酶、脂肪酶、異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)移酶、激酶和磷酸酶。在某些實施例中，感興趣的蛋白質(zhì)是蛋白酶，其中該蛋白酶可以是枯草桿菌蛋白酶，例如，選自以下各項的枯草桿菌蛋白酶：枯草桿菌蛋白酶168、枯草桿菌蛋白酶bpn’、枯草桿菌蛋白酶carlsberg、枯草桿菌蛋白酶dy、枯草桿菌蛋白酶147、枯草桿菌蛋白酶309、及其變體。在某些實施例中，感興趣的蛋白質(zhì)是熒光蛋白，例如綠色熒光蛋白(gfp)。

在某些實施例中，該方法進(jìn)一步包括回收感興趣的蛋白質(zhì)。因為在遺傳改變的革蘭氏陽性細(xì)胞中(與q野生型或親本細(xì)胞相比)感興趣的蛋白質(zhì)的表達(dá)/產(chǎn)生水平增加，所以所回收的感興趣的蛋白質(zhì)的量與在相同培養(yǎng)條件(同樣規(guī)模)下培養(yǎng)的相應(yīng)的野生型和/或親本細(xì)胞相比是增加的。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知有用于檢測和測量細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外所表達(dá)的多肽的表達(dá)水平/產(chǎn)生的各種測定。這樣的測定將由本發(fā)明的用戶確定，并且可以取決于感興趣的蛋白質(zhì)的同一性和/或活性(例如，酶活性)而變化。例如，對于蛋白酶，存在基于從酪蛋白或血紅蛋白釋放酸可溶性肽的測定，該釋放以280nm下的吸光度或使用folin方法進(jìn)行比色進(jìn)行測量(參見，例如，bergmeyeretal.,“methodsofenzymaticanalysis”vol.5,peptidases,proteinasesandtheirinhibitors,verlagchemie,weinheim[1984][bergmeyer等人，“酶法分析的方法”第5卷，肽酶、蛋白酶及其抑制劑，化學(xué)出版社，魏因海姆(weinheim)[1984]]。其他測定涉及顯色底物的溶解(參見例如，ward,“proteinases,”infogarty(ed.).,microbialenzymesandbiotechnology,appliedscience,london,[1983],pp251-317[ward，“蛋白酶”，在：fogarty(編輯)，微生物酶與生物技術(shù)，應(yīng)用科學(xué)出版社，倫敦[1983]，第251-317頁]中)。測定的其他實例包括但不限于琥珀酰-ala-ala-pro-phe-對硝基苯胺測定(saapfpna)和2,4,6-三硝基苯磺酸鈉鹽測定(tnbs測定)。許多本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的附加參考文獻(xiàn)提供了合適的方法(參見，例如，wellsetal.,nucleicacidsres.11:7911-7925[1983]；christiansonetal.,anal.biochem.,223:119-129[1994]；andhsiaetal.,analbiochem.,242:221-227[1999][wells等人，核酸研究，11:7911-7925[1983]；christianson等人，分析生物化學(xué)，223:119-129[1994]；以及hsia等人，分析生物化學(xué)，242:221-227[1999]])。

同樣如上所述，用于確定宿主細(xì)胞中感興趣的蛋白質(zhì)的分泌水平并且檢測所表達(dá)的蛋白質(zhì)的手段包括使用對感興趣的蛋白質(zhì)具有特異性的多克隆或單克隆抗體的免疫測定。實例包括酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)、放射免疫測定(ria)、熒光免疫測定(fia)以及熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(facs)。然而，其他方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且可用于評估感興趣的蛋白質(zhì)(參見，例如，hamptonetal.,serologicalmethods,alaboratorymanual,apspress,st.paul,mn[1990]；andmaddoxetal.,j.exp.med.,158:1211[1983][hampton等人，血清學(xué)方法，實驗室手冊，aps出版社，圣保羅，明尼蘇達(dá)州[1990]；以及maddox等人，實驗醫(yī)學(xué)雜志，158:1211[1983]])。如本領(lǐng)域已知的，將使用本發(fā)明產(chǎn)生的改變的芽孢桿菌細(xì)胞在適于從細(xì)胞培養(yǎng)物表達(dá)和回收感興趣的多肽的條件下保持和生長(參見，例如，hardwoodandcutting(eds.)molecularbiologicalmethodsforbacillus,johnwiley&sons[1990][hardwood和cutting(編輯)芽孢桿菌的分子生物學(xué)方法，約翰威利父子公司[1990]])。進(jìn)一步注意到，本文所述的遺傳改變的細(xì)胞可以表達(dá)多于一種感興趣的蛋白質(zhì)，包括兩種或更多種、三種或更多種、四種或更多種、五種或更多種、六種或更多種、七種或更多種、八種或更多種、九種或更多種、十種或更多種等。在一些實施例中，需要在細(xì)菌分泌物中增加蛋白質(zhì)的表達(dá)，其包括從細(xì)胞分泌的許多不同的蛋白質(zhì)。

本發(fā)明的方面包括用于獲得具有改進(jìn)的蛋白質(zhì)生產(chǎn)能力的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞的方法。通常，該方法包括遺傳改變親本革蘭氏陽性細(xì)胞以產(chǎn)生遺傳改變的菌株，其中sin操縱子中的一個或多個基因的表達(dá)被降低(如上所定義)。

在某些實施例中，該方法包括將多核苷酸序列引入親本革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞，當(dāng)整合到染色體中或作為附加型遺傳元件維持時，導(dǎo)致遺傳改變的革蘭氏陽性細(xì)胞，其中sin操縱子中的一個或多個基因的表達(dá)水平降低。

已知使用多核苷酸載體(例如，質(zhì)粒構(gòu)建體)轉(zhuǎn)化芽孢桿菌屬物種以改變芽孢桿菌屬的染色體或維持芽孢桿菌中的附加型遺傳元件的各種方法是熟知的。將多核苷酸序列引入芽孢桿菌屬細(xì)胞的合適方法在如下中發(fā)現(xiàn)：ferrarietal.,“genetics,”inharwoodetal.(ed.),bacillus,plenumpublishingcorp.[1989],pages57-72[ferrari等人，“遺傳學(xué)”在：harwood等人(編輯)，芽孢桿菌，plenum出版公司[1989]，第57-72頁中]。還參見，saundersetal.,j.bacteriol.,157:718-726[1984]；hochetal.,j.bacteriol.,93:1925-1937[1967]；mannetal.,currentmicrobiol.,13:131-135[1986]；andholubova,foliamicrobiol.,30:97[1985][saunders等人，細(xì)菌學(xué)雜志，157:718-726[1984]；hoch等人，細(xì)菌學(xué)雜志，93:1925-1937[1967]；mann等人，當(dāng)代微生物學(xué)，13:131-135[1986]；和holubova，微生物學(xué)大觀，30:97[1985]]；針對解淀粉芽孢桿菌，changetal.,mol.gen.genet.,168:11-115[1979][chang等人，分子遺傳學(xué)與基因組學(xué)，168:11-115[1979]]；針對巨大芽孢桿菌，vorobjevaetal.,femsmicrobiol.lett.,7:261-263[1980][vorobjeva等人，fems微生物學(xué)快報，7:261-263[1980]]；針對解淀粉芽孢桿菌，smithetal.,appl.env.microbiol.,51:634(1986)[smith等人，應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)，51:634(1986)]；針對蘇云金芽孢桿菌，fisheretal.,arch.microbiol.,139:213-217[1981][fisher等人，微生物學(xué)文獻(xiàn)集，139:213-217[1981]]；以及針對球形芽孢桿菌，mcdonald,j.gen.microbiol.,130:203[1984][mcdonald，普通微生物學(xué)雜志，130:203[1984]]。實際上，包括原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和中板集合、轉(zhuǎn)導(dǎo)、和原生質(zhì)體融合在內(nèi)的轉(zhuǎn)化方法是已知的并且適合用于本發(fā)明。轉(zhuǎn)化方法具體是將本發(fā)明提供的dna構(gòu)建體引入宿主細(xì)胞。

此外，將dna構(gòu)建體引入宿主細(xì)胞包含本領(lǐng)域已知的將dna插入宿主細(xì)胞而不將靶向dna構(gòu)建體插入質(zhì)粒或載體中的物理和化學(xué)方法。此類方法包括但不限于氯化鈣沉淀、電穿孔、裸dna、脂質(zhì)體等。在另外的實施例中，dna構(gòu)建體可以與質(zhì)粒一起共轉(zhuǎn)化而不插入該質(zhì)粒中。

在可選擇的標(biāo)志物基因用于選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的實施例中，可能需要使用任何方便的方法從遺傳改變的革蘭氏陽性菌株中刪除可選擇的標(biāo)志物，其中許多方法是本領(lǐng)域已知的(參見，stahletal.,j.bacteriol.,158:411-418[1984]；andpalmerosetal.,gene247:255-264[2000][stahl等人，細(xì)菌學(xué)期刊，158:411-418[1984]；和palmeros等人，基因，247:255-264[2000]])。

在一些實施例中，將兩個或更多個dna構(gòu)建體(即，各自被設(shè)計用于遺傳改變宿主細(xì)胞的dna構(gòu)建體)引入親本革蘭氏陽性細(xì)胞中，導(dǎo)致在細(xì)胞中引入兩種或更多種遺傳改變，例如，在兩個或更多個染色體區(qū)域的改變。在一些實施例中，這些區(qū)域是連續(xù)的(例如，在sin操縱子內(nèi)的兩個區(qū)域或在sin操縱子內(nèi)，以及相鄰的基因或操縱子)，而在其他實施例中，這些區(qū)域是分離的。在一些實施例中，一種或多種遺傳改變是通過添加附加型遺傳元件實現(xiàn)的。

在一些實施例中，用根據(jù)本發(fā)明的一種或多種dna構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞以產(chǎn)生改變的芽孢桿菌菌株，其中兩個或更多個基因已經(jīng)在宿主細(xì)胞中失活。在一些實施例中，從宿主細(xì)胞染色體中缺失兩個或更多個基因。在替代實施例中，通過插入dna構(gòu)建體使兩個或更多個基因失活。在一些實施例中，滅活的基因是連續(xù)的(無論通過缺失和/或插入失活)，而在其他實施例中，它們不是連續(xù)的基因。

一旦產(chǎn)生遺傳改變的宿主細(xì)胞，就可以將它在使得感興趣的蛋白質(zhì)被表達(dá)的條件下培養(yǎng)，其中在某些實施例中，回收感興趣的蛋白質(zhì)。

本發(fā)明的方面包括經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞，其中與在基本相同的培養(yǎng)條件下生長的相應(yīng)的未經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞相比，該經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞包含降低sin操縱子中一個或多個基因的表達(dá)的至少一個遺傳改變。在一些實施例中，如上所述產(chǎn)生遺傳改變的革蘭氏陽性細(xì)胞。如以上進(jìn)一步指出，經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞可以是芽孢桿菌屬菌株，例如，地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、或蘇云金芽孢桿菌菌株。在某些實施例中，芽孢桿菌屬物種菌株是枯草芽孢桿菌菌株。在一些方面，經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)一步包含改進(jìn)細(xì)胞表型的另外的突變，例如選自下組的基因的突變，該組由以下各項組成：degu、degq、degs、scoc4、和oppa。在某些實施例中，突變?yōu)閐egu(hy)32。

在某些實施例中，與野生型和/或親本細(xì)胞(在基本相同的條件下生長的)相比，在遺傳改變的革蘭氏陽性細(xì)胞中，至少一種sin操縱子的基因的表達(dá)降低了。表達(dá)的這種降低能以任何方便的方式實現(xiàn)，并且可以是在轉(zhuǎn)錄、mrna穩(wěn)定性、翻譯的水平上，或者可能是由于存在由降低其活性的sin操縱子產(chǎn)生的一種或多種多肽的變異導(dǎo)致的(即，它是基于多肽的活性的表達(dá)的“功能性”降低)。因此，不意圖限制遺傳改變的類型或者降低sin操縱子中至少一個基因的表達(dá)的方式。例如，在一些實施例中，革蘭氏陽性細(xì)胞中的遺傳改變是改變sin操縱子中的一個或多個啟動子，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄活性降低的改變。在某些實施例中，改變是導(dǎo)致mrna轉(zhuǎn)錄物水平降低的、sin操縱子中的沉默突變(例如，如實例中所示)。可替代地，革蘭氏陽性細(xì)胞中的遺傳改變可以是改變sin操縱子中的核苷酸的遺傳改變，該遺傳改變在細(xì)胞中導(dǎo)致穩(wěn)定性降低的轉(zhuǎn)錄物。在某些實施例中，可以在遺傳改變的革蘭氏陽性細(xì)胞中存在降低sin操縱子中一個或多個基因的表達(dá)的多于一個遺傳改變。在某些實施例中，與在基本相同的培養(yǎng)條件下生長的相應(yīng)未經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞相比，遺傳改變導(dǎo)致來自經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞中的sin操縱子的mrna轉(zhuǎn)錄物水平的降低。

在一些實施例中，本發(fā)明包括dna構(gòu)建體，該dna構(gòu)建體包含輸入序列，當(dāng)穩(wěn)定并入宿主細(xì)胞時，該輸入序列在遺傳上改變細(xì)胞，這樣使得sin操縱子中的一個或多個基因的表達(dá)降低(如上面詳細(xì)描述的)。在一些實施例中，將dna構(gòu)建體在體外組裝，然后將構(gòu)建體直接克隆到感受態(tài)革蘭氏陽性(例如芽孢桿菌屬)宿主中，這樣使得dna構(gòu)建體整合入宿主細(xì)胞染色體中。例如，可以采用pcr融合和/或連接以在體外組裝dna構(gòu)建體。在一些實施例中，dna構(gòu)建體是非質(zhì)粒構(gòu)建體，而在其他實施例中，其被并入載體(例如，質(zhì)粒)中。在一些實施例中，使用環(huán)狀質(zhì)粒。在實施例中，環(huán)狀質(zhì)粒被設(shè)計為使用適當(dāng)?shù)南拗泼?即，不破壞dna構(gòu)建體的限制酶)。因此，線性質(zhì)?？捎糜诒景l(fā)明。然而，如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，其他方法適用于本發(fā)明(參見，例如，perego,“integrationalvectorsforgeneticmanipulationinbacillussubtilis,”in(sonensheinetal.(eds.),bacillussubtilisandothergram-positivebacteria,americansocietyformicrobiology,washington,dc[1993][perego，“枯草芽孢桿菌遺傳操作的整合載體”，在：(sonenshein等人(編輯)，枯草芽孢桿菌和其他革蘭氏陽性菌，美國微生物學(xué)會，華盛頓，哥倫比亞特區(qū)[1993]中])。

在某些實施例中，dna靶向載體被設(shè)計為缺失(或允許缺失)全部或部分的sinr基因。例如，dna靶向載體可以包括允許去除全部或部分sinr基因的元件(例如，使用如本領(lǐng)域已知的cre-lox系統(tǒng))。在某些實施例中，dna靶向載體的輸入序列包括多核苷酸，該多核苷酸包含來自sinr基因的變體序列。在這些實施例的一些中，變體序列長度為至少約15個核苷酸，與seqidno：1的全部或部分至少60％相同，并且在sinr基因的核苷酸位置處具有至少一個突變，當(dāng)革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞的內(nèi)源性sinr基因中存在該突變時，該突變導(dǎo)致sin操縱子中基因表達(dá)的降低。變體序列可以是至少約20個核苷酸、約30個核苷酸、約40個核苷酸、約50個核苷酸、約60個核苷酸、約80個核苷酸、約90個核苷酸、約100個核苷酸、約200個核苷酸、約300個核苷酸、約400個核苷酸、約500個核苷酸、約500個核苷酸、約700個核苷酸、約800個核苷酸、約900個核苷酸、約1000個核苷酸、約1100個核苷酸、約1200個核苷酸、約1300個核苷酸、約1400個或更多個核苷酸。如以上進(jìn)一步指出，變體序列可以與seqidno:1具有至少60％同一性，包括與seqidno:1具有至少約65％、至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％、或至少約99％同一性。在某些實施例中，變體序列中的遺傳改變是沉默突變，其中沉默突變意指在翻譯時不導(dǎo)致所編碼的sinr多肽的氨基酸變化的sinr基因的編碼區(qū)的變體序列中的突變(本領(lǐng)域中很好理解的術(shù)語)。在某些實施例中，變體序列中的沉默突變在對應(yīng)于seqidno:1的核苷酸330的核苷酸位置處。在某些實施例中，sinr沉默突變是野生型sinr基因的編碼序列的有義鏈的核苷酸位置330處的從鳥嘌呤(g)至腺嘌呤(a)的單核苷酸變化(seqidno:1顯示了sinr野生型核苷酸序列；seqidno:2顯示了sinr氨基酸序列；并且seqidno:3顯示了具有g(shù)330a沉默突變的變體sinr核苷酸序列)。

本發(fā)明的方面包括一種載體，該載體包含上述多核苷酸序列。在某些實施例中，載體是一種靶向載體，該靶向載體被設(shè)計用于在轉(zhuǎn)化到革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞中時通過同源重組將多核苷酸序列中的至少一個突變引入革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞的sin操縱子中的相應(yīng)位置。在一些實施例中，輸入序列/載體包括選擇性標(biāo)志物。在一些實施例中，擇性標(biāo)志物位于兩個loxp位點之間(參見，kuhnandtorres,meth.mol.biol.,180:175-204[2002][kuhn和torres，分子生物學(xué)方法，180:175-204[2002]])并且后然通過cre蛋白的作用缺失抗微生物基因。

本發(fā)明的方面包括用于增強(qiáng)革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞中感興趣的蛋白質(zhì)的表達(dá)的方法，該方法包括用上述dna構(gòu)建體或載體轉(zhuǎn)化親本革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞(即，包括輸入序列的dna構(gòu)建體或載體，當(dāng)穩(wěn)定地并入宿主細(xì)胞時，遺傳地改變細(xì)胞，這樣使得sin操縱子中一個或多個基因的表達(dá)降低，例如包括如上所述的sinr基因中的突變的dna構(gòu)建體或載體)，允許載體和親本革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞的sin操縱子中的相應(yīng)區(qū)域的同源重組以產(chǎn)生經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞；并在適合于表達(dá)感興趣的蛋白的條件下生長經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞，其中與同步轉(zhuǎn)化前革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞相比，感興趣的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)在經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞中增加。上面詳細(xì)描述了可用于本發(fā)明的這個方面的革蘭氏陽性菌株、突變和其他特征的實例。

無論dna構(gòu)建體是否并入到載體中或者在質(zhì)粒dna的不存在下使用，將其用于轉(zhuǎn)化微生物。預(yù)期，任何合適的轉(zhuǎn)化方法將用于本發(fā)明。在實施例中，將dna構(gòu)建體的至少一個拷貝整合到宿主芽孢桿菌染色體中。在一些實施例中，使用本發(fā)明的一種或多種dna構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。

通過參考以下實例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以更充分地理解實施本發(fā)明的方式和方法，這些實例不旨在以任何方式限制本發(fā)明或涉及其的權(quán)利要求的范圍。

實驗

提供以下實例以便證實和進(jìn)一步說明本發(fā)明的某些實施例和方面，而不應(yīng)被解釋為限制其范圍。

在下面的實驗披露物中，適用以下某些縮寫：℃(攝氏度)；rpm(每分鐘轉(zhuǎn)數(shù))；μg(微克)；mg(毫克)；μl(微升)；ml(毫升)；mm(毫摩爾)；μm(微摩爾)；sec(秒)；min(s)(分鐘)；hr(s)(小時)；od280(280nm下的光密度)；od600(600nm下的光密度)；pcr(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))；rt-pcr(反轉(zhuǎn)錄pcr)；sds(十二烷基硫酸鈉)；abs(吸光度)。

實例1

通過sinr基因突變芽孢桿菌屬中的增加的蛋白質(zhì)表達(dá)

a.枯草芽孢桿菌中sinr基因中的突變

使用janes和stibitz描述的無標(biāo)志物基因替代方法將沉默突變引入sinr基因中的親本枯草芽孢桿菌菌株(oppa::tetr、δapre、δnpre、deguhy32，本文稱為“親本菌株”)中(infectionandimmunity,74(3):1949,2006[感染和免疫，74(3):1949,2006])。sinr沉默突變是野生型sinr的編碼序列的正義鏈的核苷酸位置330處的從鳥嘌呤(g)至腺嘌呤(a)的單核苷酸變化(seqidno:1顯示了野生型序列；seqidno:2顯示了sinr氨基酸序列并且seqidno:3顯示了g330a沉默突變)(沉默突變是改變基因編碼區(qū)域中的位點的核酸序列但不改變所編碼多肽的氨基酸序列的突變)。

使用以下引物從菌株fcm102擴(kuò)增包含sinr基因的位置330處的sinrg>a同義突變的基因組區(qū)域：

ecorisinrfw:5’-caggaattcctgacgtctcaaatatgtgactattg-3’seqidno:4

bamhisinrrv:5’-ctcggatccgagaaattgaaagaaagacaaaagc-3’seqidno:5

將擴(kuò)增的片段克隆到pksv7-i-sce-km載體中(圖1)；該質(zhì)粒來自pksv7(smithk.andyoungmanp.biochimie(1992)74,705-711[smithk.和youngmanp.，生物化學(xué)，(1992)74,705-711])，用卡那霉素抗性標(biāo)志物代替氯霉素抗性標(biāo)志物，并且將i-sce限制酶切位點添加到質(zhì)粒的多接頭。使用janes和stibitz的方法將單核苷酸多態(tài)性引入sinr基因中。所得菌株cb15-14sinr有時在本文中稱為“sinr突變菌株”、“sinr*”、“突變菌株”、或其等效物。非突變菌株(cb15-14)有時在本文中稱為“親本菌株”或其等效物。

b.在枯草芽孢桿菌菌株中sinr基因的缺失

來自枯草芽孢桿菌168(bke24610)的sinr缺失菌株獲自芽孢桿菌屬遺傳庫存中心(http://www.bgsc.org/)。提取bke24610染色體dna，并在枯草芽孢桿菌“親本菌株”中轉(zhuǎn)化。通過pcr和sinr基因座的測序確認(rèn)缺失。所得菌株用枯草芽孢桿菌δsinr或sinr::ermr表示。圖2示出了sinr缺失的遺傳圖譜。將sinr基因的orf缺失，并用側(cè)翼有l(wèi)oxp位點(lox71和lox66)的紅霉素抗性盒替代，以便使用質(zhì)粒編碼的cre重組酶去除紅霉素抗性標(biāo)志物。側(cè)翼sini和tasa基因的orf與sinr基因的敲除保持不變。

c.sinr突變或sinr缺失的芽孢桿菌菌株中的蛋白酶表達(dá)

為了測試sinr突變和缺失對fna蛋白酶(包含y217l取代的枯草桿菌蛋白酶bpn’；seqidno：6)的表達(dá)的影響，將構(gòu)建體npre::prrne2/3-fna-catr(表達(dá)來自枯草芽孢桿菌的rrne2/3核糖體啟動子的fna，并且包括氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶抗性(catr)標(biāo)志物基因)引入親本菌株以及sinr*和δsinr菌株的npre基因座。在包含5ppm氯霉素的luria瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化體。野生型/親本菌株和突變菌株(sinr*和sinr::ermr)在30℃在lb培養(yǎng)基中生長過夜。將十微升預(yù)培養(yǎng)物用于接種165微升腦心浸液(bhi)培養(yǎng)基。菌株在37℃下生長并且從3小時生長取樣。使用spectramax分光光度計在600nm下以每小時間隔測量稀釋20倍的全肉湯的細(xì)胞密度(分子器件公司(moleculardevices)，唐寧鎮(zhèn)，賓夕法尼亞州，美國)。將600nm處的吸光度作為時間的函數(shù)來作圖，并且結(jié)果示于圖3a中。圖3a顯示，在生長7小時時，表達(dá)fna的親本菌株(wt)和sinr*和δsinr菌株的細(xì)胞生長相當(dāng)。

使用如wo2010/144283中所述的n-suc-aapf-pna底物(來自西格瑪化學(xué)有限公司(sigmachemicalco.))監(jiān)測蛋白酶表達(dá)。簡言之，在測定緩沖液(100mmtris，0.005％tween80，ph8.6)中將全發(fā)酵液稀釋40倍，并且將10μl稀釋的樣品排列在微量滴定板中。將aapf原液稀釋，并且將測定緩沖液(dmso中的100mg/mlaapf原液，稀釋100倍)和190μl該溶液添加到微量滴定板中，并且使用spectramax分光光度計(分子器件公司，唐寧鎮(zhèn)，賓夕法尼亞州，美國)在405nm下測量溶液的吸光度。將405nm下的吸光度作為時間的函數(shù)來作圖，并且將結(jié)果示于圖3b中。如圖3b中所示，與野生型菌株(wt)相比，突變菌株(sinr*和δsinr)中的fna產(chǎn)量增加。

d.sinr突變或sinr缺失的芽孢桿菌菌株中的淀粉酶表達(dá)

為了確定sinr突變和缺失對淀粉酶表達(dá)(seqidno:7)的影響，將構(gòu)建體papre-amyecatr引入sinr基因缺失或包含sinr突變的枯草芽孢桿菌親本菌株中。在包含5ppm氯霉素的la板上選擇轉(zhuǎn)化體。將wt菌株(cb15-14)和突變菌株(sinr*和sinr::ermr)在lb培養(yǎng)基中生長過夜。使用十微升預(yù)培養(yǎng)物接種165微升胰酶大豆培養(yǎng)液(細(xì)菌用胰蛋白胨17g/l、細(xì)菌用大豆蛋白胨3g/l、葡萄糖2.5g/l、氯化鈉5g/l、磷酸氫二鉀2.5g/l(ph7.3))，并且將菌株在30℃下生長以測試amye淀粉酶的表達(dá)。使用spectramax分光光度計在600nm下以每小時間隔測量細(xì)胞密度(分子器件公司，唐寧鎮(zhèn)，賓夕法尼亞州，美國)。將600nm下的吸光度作為時間的函數(shù)來作圖，并且將結(jié)果示于圖4a中。圖4a顯示了，表達(dá)amye的親本菌株和表達(dá)amye的sinr*和δsinr菌株的細(xì)胞生長是相等的，表明枯草芽孢桿菌菌株中sinr基因的突變或缺失不影響細(xì)胞生長。

使用ceralpha試劑(梅格澤姆公司(megazyme)，威克洛，愛爾蘭)測量全肉湯的amye淀粉酶活性。首先將來自ceralphahr試劑盒的ceralpha試劑混合物溶解在10ml的milliq水中，隨后添加30ml的50mm蘋果酸鹽緩沖液(ph5.6)。將培養(yǎng)物上清液在milliq水中稀釋40倍，并將5μl的稀釋的樣品添加到55μl稀釋的工作底物溶液中。在震蕩后，將mtp板于室溫下孵育4分鐘。通過添加70μl的200mm硼酸鹽緩沖液(ph10.2)(終止溶液)來淬滅反應(yīng)。使用spectramax分光光度計(分子器件公司，唐寧鎮(zhèn)，賓夕法尼亞州，美國)在400nm下測量溶液的吸光度。將400nm下的吸光度作為時間的函數(shù)來作圖，并且將結(jié)果示于圖4b中。圖4b中的圖顯示與野生型(wt)菌株相比，sinr*和δsinr菌株中的增加的amye表達(dá)。

e.sinr突變或sinr缺失的芽孢桿菌菌株中的內(nèi)源基因表達(dá)

為了測試sinr突變或sinr缺失對內(nèi)源基因表達(dá)的影響，將sinr突變或sinr缺失引入親本菌株，如前所述。在搖瓶中的bhi培養(yǎng)基中評估果膠酸裂解酶(seqidno:8)蛋白的活性。wt親本菌株和突變菌株(sinr*和sinr::ermr)在30℃在lb培養(yǎng)基中生長過夜。使用1毫升預(yù)培養(yǎng)物接種搖瓶中的20mlbhi培養(yǎng)基。將菌株在37℃下生長以測試果膠酸裂解酶的表達(dá)。使用spectramax分光光度計在600nm下以每小時間隔測量細(xì)胞密度(分子器件公司，唐寧鎮(zhèn)，賓夕法尼亞州，美國)。將600nm下的吸光度作為時間的函數(shù)來作圖，并且將結(jié)果示于圖5a中。圖5a顯示了，親本菌株以及sinr*和δsinr菌株的細(xì)胞生長是相等的，表明菌株中sinr基因的突變或缺失不影響細(xì)胞生長。

使用聚半乳糖醛酸鉀鹽(西格瑪p0853)底物監(jiān)測果膠酸裂解酶活性。通過將0.6％w/v聚半乳糖醛酸鉀鹽溶解在tris測定緩沖液(0.1mtris，1mmcacl2，1％peg-8000ph7.73)中來制備底物溶液。將一百微升底物溶液添加到20微升的樣品上清液中。將反應(yīng)物在37℃下孵育10分鐘。孵育后，向樣品中添加200微升終止液(0.05m磷酸)，并且使用石英96孔微量滴定板在235nm下測定溶液的吸光度。將235nm下的吸光度作為時間的函數(shù)來作圖，并且將結(jié)果示于圖5b中。圖5b中的圖顯示與野生型(wt)菌株相比，sinr*和δsinr菌株中的增加的果膠酸裂解酶表達(dá)。

雖然前述組合物和方法已經(jīng)通過說明和實例的方式出于清楚理解的目的在一些細(xì)節(jié)方面進(jìn)行了描述，但是對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言根據(jù)本文的傳授內(nèi)容顯而易見的是可以對其進(jìn)行某些改變和修改而不偏離所附權(quán)利要求的精神或范圍。

因此，前面僅僅舉例說明了本發(fā)明組合物和方法的原理。將了解的是本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠設(shè)計不同的安排，這些不同的安排雖然沒有在此明確地描述或顯示，但體現(xiàn)本發(fā)明組合物和方法的原理并且被包括在其精神和范圍之內(nèi)。此外，本文敘述的所有實例和條件性語言主要旨在幫助讀者理解諸位發(fā)明人所貢獻(xiàn)的本發(fā)明的組合物和方法的原理和概念以推動本領(lǐng)域發(fā)展，并且將被視為而不限于這些具體敘述的實例和條件。此外，本文中敘述本發(fā)明組合物和方法的原理、方面、以及實施例的所有陳述連同其具體實例旨在涵蓋其結(jié)構(gòu)和功能等效物兩者。另外，預(yù)期此類等效物包括當(dāng)前已知的等效物以及將來開發(fā)的等效物兩者，即不論結(jié)構(gòu)如何而執(zhí)行相同功能的任何開發(fā)的要素。因此，本發(fā)明的組合物和方法的范圍不是旨在受限于本文顯示和描述的示例性實施例。

序列

seqidno:1-sinr野生型編碼序列，正義鏈(具有終止密碼子)

ttgattggccagcgtattaaacaataccgtaaagaaaaaggctactcactatcagaactagctgaaaaagctggggtagcgaagtcttatttaagctcaatagaacgaaatctacaaacgaacccctccattcaatttctcgaaaaagtctccgctgttctggacgtctcggttcatactttgctcgatgagaaacatgaaaccgaatacgatggtcaattagatagtgaatgggagaaattggttcgcgatgcgatgacatccggggtatcgaaaaaacaatttcgtgaatttttagattatcaaaaatggagaaaatcccaaaaagaggagtag

seqidno:2-sinr蛋白質(zhì)序列

migqrikqyrkekgyslselaekagvaksylssiernlqtnpsiqflekvsavldvsvhtlldekheteydgqldseweklvrdamtsgvskkqfrefldyqkwrksqkee

seqidno:3-sinr突變體編碼序列，正義鏈(具有粗體下劃線表示的g330a沉默突變；具有終止密碼子)

ttgattggccagcgtattaaacaataccgtaaagaaaaaggctactcactatcagaactagctgaaaaagctggggtagcgaagtcttatttaagctcaatagaacgaaatctacaaacgaacccctccattcaatttctcgaaaaagtctccgctgttctggacgtctcggttcatactttgctcgatgagaaacatgaaaccgaatacgatggtcaattagatagtgaatgggagaaattggttcgcgatgcgatgacatccggggtatcgaaaaaacaatttcgtgaatttttagattatcaaaaatggagaaaatcccaaaaagagagtag

seqidno:4用于擴(kuò)增sinr基因的正向引物

5’-caggaattcctgacgtctcaaatatgtgactattg-3’

seqidno:5用于擴(kuò)增sinr基因的反向引物

5’-ctcggatccgagaaattgaaagaaagacaaaagc-3’

seqidno:6fna蛋白質(zhì)序列(具有前肽結(jié)構(gòu)域)

aqsvpygvsqikapalhsqgytgsnvkvavidsgidsshpdlkvaggasmvpsetnpfqdnnshgthvagtvaalnnsigvlgvapsaslyavkvlgadgsgqyswiingiewaiannmdvinmslggpsgsaalkaavdkavasgvvvvaaagnegtsgssstvgypgkypsviavgavdssnqrasfssvgpeldvmapgvsiqstlpgnkygalngtsmasphvagaaalilskhpnwtntqvrsslentttklgdsfyygkglinvqaaaq

seqidno:7amye蛋白質(zhì)序列

ltapsiksgtilhawnwsfntlkhnmkdihdagytaiqtspinqvkegnqgdksmsnwywlyqptsyqignrylgteqefkemcaaaeeygikvivdavinhttsdyaaisnevksipnwthgntqiknwsdrwdvtqnsllglydwntqntqvqsylkrfldralndgadgfrfdaakhielpddgsygsqfwpnitntsaefqygeilqdsasrdaayanymdvtasnyghsirsalknrnlgvsnishyasdvsadklvtwveshdtyanddeestwmsdddirlgwaviasrsgstplffsrpegggngvrfpgksqigdrgsalfedqaitavnrfhnvmagqpeelsnpngnnqifmnqrgshgvvlanagsssvsintatklpdgrydnkagagsfqvndgkltgtinarsvavlypd

seqidno:8果膠酸裂解酶c蛋白質(zhì)序列

mkkivsilfmfglvmgfsqfqpstvfaadkvvhetiivpknttydgkgqrfvagkelgdgsqsenqdpvfrvedgatlknvvlgapaadgvhtygnvniqnvkwedvgedaltvkkegkvtidggsaqkasdkifqinkastftvknftadnggkfirqlggstfhvdviidkctitnmkeaifrtdsktstvrmtntrysnvgqkwigvqhiyennntqf