本申請要求2014年4月11日提交的美國臨時申請?zhí)?1/978,406的優(yōu)先權(quán)，其全部內(nèi)容通過引用并入本申請。序列表本申請包含已以ASCII格式的電子版提交的序列表并且其全部內(nèi)容通過引用并入本申請。2015年10月14日創(chuàng)建的所述ASCII副本的文件名為18605.0094PCT_SL.txt，文件大小為53,211字節(jié)。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及DNA聚合酶。背景聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)是一種用于快速和指數(shù)級擴增目標核酸序列的方法。已發(fā)現(xiàn)其在基因表征和分子克隆技術(shù)中具有多種用途，包括對PCR擴增DNA的直接測序、確定等位基因變體和檢測感染性和遺傳疾病。已將多種熱穩(wěn)定的DNA聚合酶用于PCR應(yīng)用；例如從水生棲熱菌(Thermusaquaticus，Taq)中分離的TaqDNA聚合酶、來源于激烈熱球菌(Pyrococcusfuriosus)的pfu聚合酶、從Thermococcuskodakaraensis中分離的KOD聚合酶以及從嗜熱高溫球菌(Thermococcuslitoralis，Tli)中分離的VentTMDNA聚合酶。參見例如美國專利號6,008025、美國專利號5,545,552和美國專利號5,489,523，其全部內(nèi)容均通過引用并入本申請。概述在一個方面，提供了一種用于擴增核酸的DNA聚合酶組合物，所述DNA聚合酶組合物包含分離的DNA聚合酶，所述分離的DNA聚合酶具有與SEQIDNO:1-4所示的序列具有至少80％同源性的氨基酸殘基?？梢詮柠u池嗜熱古細菌物種中分離該聚合酶。該聚合酶可以與從嗜熱高溫球菌中分離的DNA聚合酶具有約40％的序列同源性。在某些實施方式中，在存在濃度高達300mM的氯離子的條件下該聚合酶保持其最佳DNA聚合酶活性的至少100％。其活性隨著氯離子濃度的增加而增加，300mM是最佳濃度。在某些實施方式中，在存在濃度高達300mM的硫酸根離子的條件下該聚合酶保持其最佳DNA聚合酶活性的至少50％。其活性隨著硫酸根離子濃度的增加而增加，100mM是最佳濃度并且在硫酸鹽濃度為300mM時活性降至50％。在某些實施方式中，在存在濃度高達250mM的谷氨酸鉀的條件下該聚合酶保持其最佳DNA聚合酶活性的100％。其活性隨著谷氨酸鉀濃度的增加而增加，250mM是最佳濃度。在某些實施方式中，在存在濃度高達1mM的Zn2+離子的條件下該聚合酶保持其最佳DNA聚合酶活性的至少50％。在Zn2+離子濃度為0.5mM時其活性是最佳的并且在1mM時降至50％。在某些實施方式中，在存在濃度高達100mM的Mg2+離子的條件下該聚合酶保持其DNA聚合酶活性的100％。其活性隨著Mg2+離子濃度的增加而增加，100mM是最佳濃度。在某些實施方式中，該聚合酶的DNA延伸速率大于每秒450個堿基。在某些實施方式中，該聚合酶具有每個DNA結(jié)合事件循環(huán)平均2000個堿基的DNA延伸持續(xù)合成能力。在某些實施方式中，該聚合酶的DNA校正活性是pfu聚合酶活性的至少2倍。在某些實施方式中，在65℃下加熱15分鐘后，該聚合酶保持其穩(wěn)定性的100％。在某些實施方式中，該聚合酶在室溫下具有活性。在某些實施方式中，在7.5-9.0的pH條件下，該聚合酶保持其DNA聚合酶活性的100％。在另一個方面，提供了一種用于擴增核酸的方法，所述方法包括將作為模板的DNA、引物、dNTP和DNA聚合酶組合物反應(yīng)，并且延伸引物以合成DNA引物延伸產(chǎn)物。在另一個方面，提供了一種用于擴增核酸的方法，其中的聚合酶具有在鹽和金屬離子濃度較高以及存在不同類型金屬離子的條件下延伸DNA的能力，能夠利用其改進當前可用的分子生物學(xué)、生物化學(xué)和生物物理技術(shù)。在另一個方面，提供了一種用于擴增核酸的試劑盒，所述試劑盒含有DNA聚合酶組合物。在另一個方面，提供了一種載體，所述載體可以包含編碼DNA聚合酶的基因。在另一個方面，提供了一種質(zhì)粒，所述質(zhì)?？梢园幋a用于形成DNA聚合酶重組體的基因。其他方面、實施方式和特征從下文的說明書、附圖和權(quán)利要求中將是顯而易見的。附圖簡述圖1A是比較在不同鹽濃度下BR3聚合酶和pfu聚合酶活性的圖像。在這些實驗中使用的鹽是NaCl。BR3和pfu的濃度是50nM。圖1B是在不同鹽濃度下KOD聚合酶活性的圖像。在這項實驗中使用的鹽是KCl和KOD的濃度是50nM。圖2A-2C是比較在存在不同鹽的條件下BR3聚合酶和pfu聚合酶活性的圖像。在這些實驗中使用的鹽是：KCl(2A)、NH4(SO)4(B)和谷氨酸鉀(C)。BR3和pfu的濃度是50nM。圖3A-3C是比較在存在不同金屬離子的條件下BR3聚合酶和pfu聚合酶活性的圖像。在(A)和(B)中使用的金屬離子的濃度是MgCl2、MnCl2、CaCl2、ZnSO4、LiCl均為1mM。BR3和pfu的濃度是50nM。圖4A是比較在存在不同濃度Mg2+的條件下BR3聚合酶和pfu聚合酶活性的圖像。BR3和pfu的濃度是50nM。圖4B是在存在不同濃度Mg2+的條件下KOD聚合酶活性的圖像。圖5是比較BR3聚合酶和pfu聚合酶校正活性的圖像。圖5按照出現(xiàn)的先后順序分別公開了SEQIDNO7-11。圖6是顯示用于檢測BR3和pfu聚合酶速率和持續(xù)合成能力的單分子測定的圖像和曲線以及顯示BR3和pfu聚合酶合成DNA的速率和持續(xù)合成能力的柱狀圖。圖7是顯示BR3聚合酶熱穩(wěn)定性的圖像。圖8是顯示BR3聚合酶ddNTP摻入效率和對其活性位點進行工程改造以摻入ddNTP的策略的圖像。圖8按照出現(xiàn)的先后順序分別公開了SEQIDNO12和13。圖9表示BR1、BR2、BR3和BR6聚合酶的序列。圖10表示BR3聚合酶開放閱讀框架的序列(核苷酸序列如SEQIDNO:14，氨基酸序列如SEQIDNO:3所示)。圖11表示BR3(SEQIDNO:3)、KOD(SEQIDNO:15)、Pfu(SEQIDNO:16)和Tli(SEQIDNO:17)聚合酶的一級序列比對。根據(jù)在DNA聚合酶中的共同結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)對序列的顏色高亮顯示，在催化中的關(guān)鍵氨基酸以加粗的紅色和藍色表示以及與聚合酶結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定性相關(guān)的半胱氨酸殘基以加粗的黃色表示。詳細描述紅海的深海缺氧鹽水被認為是地球上最偏遠、最具挑戰(zhàn)性和最極端的環(huán)境之一，同時仍是研究最少的區(qū)域之一。目前已知約有25個這樣的填充有鹽水的池，其均是缺氧、高鹽度的深海水體，具有升高的溫度、重金屬濃度，其具有與覆蓋的海水形成特征性尖銳的梯度豐富的界面的不同類型的金屬離子。參見BackerH&SchoellM(1972)NewdeepswithbrinesandmetalliferoussedimentsinRedSea.Nature-PhysicalScience240(103):153，和HartmannM,ScholtenJC,StoffersP,&WehnerF(1998)Hydrographicstructureofbrine-filleddeepsintheRedSea-newresultsfromtheShaban,Kebrit,AtlantisII,andDiscoveryDeep.MarGeol144(4):311-330，其全部內(nèi)容均通過引用并入。與頻繁的地質(zhì)和地球化學(xué)研究相比，很少有研究關(guān)注紅海的深海鹽水微生物學(xué)，并且沒有研究關(guān)注其在生物技術(shù)方面的應(yīng)用。最初的不依賴于培養(yǎng)和基于培養(yǎng)的研究第一次見識到了此地微生物群落出人意料的巨大生物多樣性，研究鑒定了若干新群并分離了在這些環(huán)境中繁殖的新的極端微生物。參見AntunesA,EderW,FareleiraP,SantosH,&HuberR(2003)Salinisphaerashabanensisgen.nov.,spnov.,anovel,moderatelyhalophilicbacteriumfromthebrine-seawaterinterfaceoftheShabanDeep,RedSea.Extremophiles7(1):29-34，AntunesA等，(2008)Anewlineageofhalophilic,wall-less,contractilebacteriafromabrine-filleddeepoftheRedSea.JBacteriol190(10):3580-3587，AntunesA等，(2008)Halorhabdustiamateaspnov.,anon-pigmented,extremelyhalophilicarchaeonfromadeep-sea,hypersalineanoxicbasinoftheRedSea,andemendeddescriptionofthegenusHalorhabdus.IntJSystEvolMicr58:215-220，EderW,LudwigW,&HuberR(1999)Novel16SrRNAgenesequencesretrievedfromhighlysalinebrinesedimentsofKebritDeep,RedSea.ArchMicrobiol172(4):213-218，EderW,JahnkeLL,SchmidtM,&HuberR(2001)Microbialdiversityofthebrine-seawaterinterfaceoftheKebritDeep,RedSea,studiedvia16SrRNAgenesequencesandcultivationmethods.ApplEnvironMicrob67(7):3077-3085，和EderW,SchmidtM,KochM,Garbe-SchonbergD,&HuberR(2002)Prokaryoticphylogeneticdiversityandcorrespondinggeochemicaldataofthebrine-seawaterinterfaceoftheShabanDeep,RedSea.EnvironMicrobiol4(11):758-763，其全部內(nèi)容均通過引用并入。由于這種環(huán)境的條件極其嚴苛，因而駐留于此的微生物為了生存非常有可能產(chǎn)生新的代謝途徑、跨膜轉(zhuǎn)運系統(tǒng)、酶和化學(xué)物質(zhì)。這種環(huán)境為DNA復(fù)制機制以及DNA加工酶復(fù)制和保持基因組DNA提供了最嚴苛的條件，表明其利用了新的適應(yīng)機制和核酸結(jié)合蛋白?？梢允褂脕碜喳u池的古細菌和細菌物種篩選新的DNA測序聚合酶和其他關(guān)鍵的DNA修飾酶。用于DNA測序的經(jīng)典鏈終止方法Sanger法依賴于使用具有較高鏈終止子雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)摻入速率的DNA聚合酶。參見TaborS&RichardsonCC(1995)AsingleresidueinDNApolymerasesoftheEscherichiacoliDNApolymeraseIfamilyiscriticalfordistinguishingbetweendeoxy-anddideoxyribonucleotides.ProcNatlAcadSciUSA92(14):6339-6343，其全部內(nèi)容均通過引用并入。DNA聚合酶通常催化引物的3’-OH基團親核攻擊引入的dNTP的α-磷酸。在該反應(yīng)中需要兩個Mg2+離子以便將引物/模板鏈和引入的dNTP對齊并且介導(dǎo)取代親核攻擊反應(yīng)。參見JohnsonA&O'DonnellM(2005)CellularDNAreplicases:componentsanddynamicsatthereplicationfork.AnnuRevBiochem74:283-315,andHamdanSM&RichardsonCC(2009)Motors,switches,andcontactsinthereplisome，其全部內(nèi)容均通過引用并入。在ddNTP中缺乏3’-OH親核基團是其作為DNA聚合酶抑制劑發(fā)揮作用的原因。參見TaborS&RichardsonCC(1995)AsingleresidueinDNApolymerasesoftheEscherichiacoliDNApolymeraseIfamilyiscriticalfordistinguishingbetweendeoxy-anddideoxyribonucleotides.ProcNatlAcadSciUSA92(14):6339-6343，其全部內(nèi)容均通過引用并入。在測序過程中，DNA合成反應(yīng)從特定引物起始并在摻入ddNTP后終止。通過使用基于染料或放射性標記的ddNTP，可以展示這些產(chǎn)品的性質(zhì)。在通常情況下，DNA聚合酶以非常高的準確度聚合dNTP(每摻入103-105個核苷酸有1個錯誤)并且編碼校正核酸外切酶活性以除去錯誤摻入的核苷酸(使準確度增至每摻入105-107個核苷酸有1個錯誤)。因此，理想的DNA測序聚合酶將具有較高的DNA合成速率和持續(xù)合成能力、較高的dNTP摻入準確度、校正核酸外切酶活性、較高熱穩(wěn)定性和較高ddNTP摻入速率。實際上所有這些性質(zhì)已通過將四種DNA聚合酶引入市場實現(xiàn)，它們是分離自古細菌物種的激烈熱球菌(Pyrococcusfuriosus)DNA聚合酶(pfuDNAPol)、嗜熱高溫球菌(Thermococcuslitoralis)VentTMDNA聚合酶(VentDNAPol)、ThermococcusKodakarensis(KODPol)和水生棲熱菌(ThermusAquaticus)DNA聚合酶(TaqPol)(表1)。表1：DNA聚合酶的特征。該表來自TakagiM等，(1997)CharacterizationofDNApolymerasefromPyrococcussp.strainKOD1anditsapplicationtoPCR.AppliedandEnvironmentalMicrobilogy63(11):4504-4510本申請公開的是一種以產(chǎn)生市售聚合酶為目的利用來自鹵池的DNA聚合酶的方法，該聚合酶利用廣泛的鹽和金屬離子濃度以及金屬離子類型具有耐用的反應(yīng)性質(zhì)以及增強的速率持續(xù)合成能力和校正活性。還公開了一種用于擴增核酸的方法和組合物，其中在高鹽和高金屬離子濃度、在存在不同類型金屬離子條件下和在高溫條件下能夠利用聚合酶的能力以改進當前可用的分子生物學(xué)、生物化學(xué)和生物物理技術(shù)。沒有一種常規(guī)聚合酶在諸如高鹽濃度、高金屬濃度和高溫的嚴苛條件下是理想的，更不用說兩種或多種這些條件的組合。本申請公開的是一種不僅僅能耐受這些嚴苛條件之一，而其還能夠耐受多種這些條件的組合的聚合酶，例如高鹽和高金屬濃度、高金屬濃度和高溫、高鹽濃度和高溫或者高鹽和高金屬濃度和高溫。從鹵池中分離的耐用的DNA測序酶能夠支持PCR過程中較寬范圍的鹽和金屬離子濃度、不同類型的金屬離子和較寬范圍的pH。已從鹵池中鑒定得到四個DNA聚合酶克隆(圖9，表2)。這些來自鹵池微生物的聚合酶能夠用于在較寬范圍的緩沖條件以及金屬離子濃度和類型下進行PCR反應(yīng)。PCR的優(yōu)化仍是復(fù)雜的，因為其可能需要篩選獲得較高收率、較高持續(xù)合成能力和較高擴增DNA片段準確度的適宜的鹽和金屬離子濃度。來自鹵池的熱古細菌物種具有在較高鹽濃度下復(fù)制其基因組的能力表明其DNA聚合酶以相對較高的親和性與DNA結(jié)合，這或許能夠增強PCR的靈敏度，從而耐受寬泛的鹽濃度。而且，這些DNA聚合酶耐受較高金屬離子濃度的能力表明其能夠在較寬范圍的金屬離子濃度下工作。最后，這些DNA聚合酶耐受不同類型金屬離子的能力表明其能夠在較寬范圍的金屬離子類型下工作。對來自鹵池嗜熱古細菌物種的DNA聚合酶進行了克隆、表達、純化和鑒定。表2：對來自鹵池的DNA聚合酶的鑒定特別地，與嗜熱高溫球菌(Thermococcuslitoralis)的DNA依賴性聚合酶具有42％同源性的克隆3(稱為BR3，圖10)與在PCR和DNA測序中使用的任何已知的市售可用的DNA聚合酶相比具有高得多的耐用性質(zhì)。BR3耐受極為通用的緩沖條件。圖1A和1B顯示了在高達300mMNaCl下BR3聚合酶保持其最佳活性，而pfu和KOD僅在高達10mM下保持其最佳活性。BR3聚合酶還能夠耐受不同類型的鹽。圖2顯示了BR3能夠耐受高達300mM的KCl(圖2A)、高達100mM的(NH4)2SO4(圖2B)和高達250mM的谷氨酸鉀(圖2C)。其范圍是pfu聚合酶的至少15-30倍。圖3顯示了在存在MgCl2和MnCl2且鹽濃度較高的條件下與pfu聚合酶相比BR3聚合酶顯示出高得多的活性(圖3B)。而且，BR3聚合酶顯示出較高的金屬離子耐受性，例如0.1-100mMMgCl2(圖4A和4B)。該范圍是pfu聚合酶和KOD聚合酶的10倍。當鹽濃度較低時(圖3A)，在存在MgCl2和MnCl2下pfu聚合酶顯示出更高活性。當存在鈣或鋰離子時，這兩種聚合酶均未顯示出顯著活性。值得注意的是，在高鹽濃度下，在存在鋅離子下BR3保持其活性(圖3B和3C)。BR3聚合酶是首個已知使用鋅離子或Mg2+和Mn2+以外的任意金屬離子的聚合酶。BR3聚合酶的校正活性是pfu聚合酶的至少2倍(圖5)。圖5顯示了在引物鏈上存在高達3個錯配的條件下BR3僅需要pfu聚合酶濃度的一半就能夠產(chǎn)生相同活性水平。圖6顯示了用于檢測BR3的速率和持續(xù)合成能力的單一分子測定并將其與pfu聚合酶進行比較和表3顯示了這項檢測的結(jié)果，其中BR3聚合酶的速率和持續(xù)合成能力是pfu聚合酶的至少1.5倍。表3：對BR3聚合酶和pfu聚合酶的速率和持續(xù)合成能力的比較在pH范圍在7.5-9.0之間BR3聚合酶保持相同的聚合活性。其還顯示了高達65℃的較高的熱穩(wěn)定性(圖7)。還可能通過引入在極端嗜熱聚合酶的活性位點中形成高度保守的二硫鍵增加其熱穩(wěn)定性。BR3聚合酶對ddNTP的摻入也有很好的鑒別(圖8)。極有可能通過將BR3活性位點中的F殘基突變?yōu)閅增加ddNTP的摻入效率(圖8)。這些性質(zhì)使得這種聚合酶能夠理想地用于DNA測序和分子生物學(xué)技術(shù)，其需要最小的反應(yīng)優(yōu)化并且可以用于不同樣品類型和制備物?？梢允褂弥亟M技術(shù)生產(chǎn)BR3聚合酶。如在本申請中使用的，術(shù)語“多肽”和“蛋白”可以互換使用，指氨基酸殘基的聚合物。術(shù)語“重組多肽”指由重組技術(shù)生產(chǎn)的多肽，其中通常將編碼所表達蛋白的DNA或RNA插入適宜的表達載體中，再使用其轉(zhuǎn)化宿主細胞以產(chǎn)生多肽。如在本申請中使用的，術(shù)語“同源物”和“同源的”指包含與相應(yīng)的多核苷酸或多肽序列至少約50％一致的序列的多核苷酸或多肽。優(yōu)選地，同源的多核苷酸或多肽具有與相應(yīng)的氨基酸序列或多核苷酸序列具有至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％或至少約99％同源性的核苷酸序列或氨基酸序列。如在本申請中使用的，術(shù)語序列“同源性”和序列“一致性”可以互換使用。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟知確定兩個或多個序列之間同源性的方法，例如使用BLAST。突變體或變體多肽指具有至少一個氨基酸不同于相應(yīng)野生型多肽的氨基酸序列的多肽。在一些實施方式中，突變體多肽具有約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100個或多個氨基酸取代、增加、插入或缺失。例如，突變體可以包含一個或多個保守的氨基酸取代。如在本申請中使用的，“保守的氨基酸取代”是其中的氨基酸殘基被具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基取代的一個。在本領(lǐng)域中已定義了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β支鏈側(cè)鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香側(cè)鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。優(yōu)選的多肽的變體或多肽的片段保留了相應(yīng)野生型多肽的一些或全部生物功能(例如酶活性)。在一些實施方式中，變體或片段保留了相應(yīng)野生型多肽至少約75％(例如至少約80％、至少約90％或至少約95％)的生物功能。在其他實施方式中，變體或片段保留了相應(yīng)野生型多肽約100％的生物功能。在又一個實施方式中，變體或片段具有大于相應(yīng)野生型多肽100％的生物功能。應(yīng)理解本申請所述的多肽可以具有附加的保守或非保守氨基酸取代，其對多肽的功能不具有實質(zhì)性影響。實施例酶：使用引物(5’-CACCATGGCAAATCAGACAACAAATGG-3’(SEQIDNO:5)和5’-TTATTTGAATTTTCCGAGTTTTACTTGTCG-3’(SEQIDNO:6))通過PCR擴增與BR3對應(yīng)的cDNA片段(參見圖9，SEQIDNO:3)并克隆至pENTR-D/TOPO載體(LifeTechnology)。通過使用LRClonaseII酶混合物(LifeTechnology)將BR3的ORF轉(zhuǎn)移至pDEST17載體(LifeTechnology)。在使用質(zhì)粒pDEST17/BR3轉(zhuǎn)化后BR3在大腸桿菌Rozetta2(DE3)(Novagen)中過表達。通過加入異丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(終濃度1mM)誘導(dǎo)過表達，并且在孵育3h后收集細胞。將所收集的細胞溶解在裂解緩沖液(10mMTris-HClpH8.0、80mMKCl、5mM2-巰基乙醇、1mMEDTA)中并在冰上使用溶菌酶(終濃度1mM)孵育30m，然后通過超聲處理破壞。將粗提物離心以除去細胞碎片，收集上清液并使用80％的飽和度進行銨沉淀。將從銨沉淀中獲得的球團溶解在緩沖液A(10mMTris-HClpH8.0，1mMEDTA)中并上樣至SephacrylSepharose(GEHealthcare)柱。收集從SephacrylSepharose柱的流出組分并進行充分稀釋以降低EDTA的濃度，然后上樣至HisTrapHP5ml(GEHealthcare)并使用緩沖液B(10mMTris-HClpH8.0、50mMKCl、500mM咪唑)洗脫結(jié)合蛋白。收集峰組分并通過HiTrap肝素1ml(GEHealthcare)，并且通過制造針對緩沖液C(10mMTris-HClpH8.0、50mMKCl、1MKCl)的梯度洗脫含有純蛋白的組分。針對緩沖液D(50mMTris-HClpH7.5、50mMKCl、1mMDTT、0.1％吐溫20、50％甘油)透析純化的BR3蛋白。通過使用280nm處的吸光度和消光系數(shù)確定蛋白濃度并根據(jù)BR3蛋白的氨基酸序列計算分子量。引物延伸和校正活性測定：根據(jù)已發(fā)表的文獻(參見LundbergeK.S.等(1991)High-fidelityamplificationusingathermostableDNApolymeraseisolatedfromPyrococcusfuriosus(Polymerasechainreaction；mutationarchaebacteria)frequency；lack；proofreading；3’40-5exonuclease；recombinantDNA.Gene(108):1-6)使用下述針對校正測定的修飾對聚合酶和校正活性進行鑒定。將含有內(nèi)部EcoRI位點的35-mer模板退火為在3’末端具有0、1和3個錯配的15-merCy3-標記的引物。在45℃下在22μl中進行5min反應(yīng)并且其中含有堿性緩沖液(20mMTris-HClpH8.8、10mM(NH4)2SO4、50mMKCl、2mMMgSO4、0.1％TritonX-100)、200μMdNTP和1mMMgCl2。從各反應(yīng)物中移出10μl并通過加入4μl終止溶液(100mMEDTApH8.0)終止反應(yīng)，使用5uEcoRI將剩余的10μl各反應(yīng)物在37℃下消化30min。通過加入4μl終止溶液終止反應(yīng)。將合成產(chǎn)物上樣至15％的聚丙烯酰胺/7.5M尿素/1xTBE變性凝膠中。使用TyphoonTRIO(GEHealthcare)對凝膠進行目測檢測。通過常規(guī)PCR在作為模板的引物ssDNApUC19質(zhì)粒上檢測KOD的聚合活性。在單一分子水平進行引物延伸測定：如此前所述通過實時監(jiān)測個體DNA分子的長度對DNA合成情況進行檢測(參見Tanner,N.A.等(2008)Single-moleculestudiesofforkdynamicsinEscherichiacoliDNAreplication.Naturestructural&molecularbiology(15):170-176，Jergic,S.等(2013)Adirectproofreader-clampinteractionstabilizesthePolIIIreplicaseinthepolymerizationmode.TheEMBOjournal(32):1322-1333和Lee,J.B.等(2006)DNAprimaseactsasamolecularbrakeinDNAreplication.Nature(439):621-624，其全部內(nèi)容均通過引用并入)。簡言之，含有生物素化引物的ssDNA模板通過一個末端連接至玻璃蓋玻片的表面并通過另一個末端連接至微流體流動池中的磁珠(圖6)。利用層流在小珠上施加2.6皮牛(pN)的拖拽力以拉伸DNA分子。如圖6所示意的并且如圖6中的軌跡所示，引物延伸將表面上栓系的ssDNA(較短)轉(zhuǎn)化為dsDNA(較長)并增加DNA的長度。測定在25℃下在含有(20mMTris-HClpH8.8、10mM(NH4)2SO4、2mMMgSO4、0.1％TritonX-100)、200μMdNTP、1mMMgCl2以及在BR3聚合酶的情況下250mMKCl或在pfu的情況下50mMKCl的緩沖液中進行。BR3和pfu聚合酶使用50nM。其他實施方式在下述權(quán)利要求的范圍內(nèi)。當前第1頁1 2 3 當前第1頁1 2 3