本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種酪氨酸-O-磺酸鹽的制備方法。
背景技術(shù)：
在生物體內(nèi)，酪氨酸被磺酸化是一個(gè)較為普遍的現(xiàn)象。因此，酪氨酸-O-磺酸(分子式1)在多肽及蛋白質(zhì)合成上有著較廣泛的應(yīng)用，強(qiáng)酸性基團(tuán)磺酸的引入極大地改善了酪氨酸的親水性，在多肽合成中引入酪氨酸-O-磺酸能在一定程度上改善多肽的水溶性，有利于后續(xù)的合成以及純化工作。
Dodgson,K.S.等人在二十世紀(jì)五十年代就開始研究酪氨酸的磺酸化(Sulfatases.XXIII.The enzymicdesulfation of tyrosine Osulfate Biochemical Journal,71,10-15；1959)，他們采用硫酸為磺化試劑，將酪氨酸磺化得到酪氨酸-O-磺酸(分子式1)，反應(yīng)收率為14％。具體反應(yīng)如下所示：
由于反應(yīng)收率過低，后處理難度非常大，很難得到高純度的產(chǎn)品，這個(gè)方法很難應(yīng)用到生產(chǎn)中。
Toth,Gabor K.等人提出了另一種合成方案(Comparison and optimization of synthetic methods for preparing cholecystokinin peptidesInternational Journal of Peptide&Protein Research,26(6),630-8；1985)，他們使用氯磺酸為磺化試劑，以吡啶為縛酸劑，在氯仿中將酪氨酸磺化得到酪氨酸-O-磺酸，再將所得到的粗產(chǎn)物用氫氧化鈉制成酪氨酸 -O-磺酸鈉，經(jīng)過后處理得到純品。具體反應(yīng)如下所示：
該方法由于使用了氯仿為溶劑，安全方面有較大的問題。Penke,Botond and Nyerges,Levente對(duì)這個(gè)方法進(jìn)行了更深入的研究(Solid-phase synthesis of porcine cholecystokinin-33in a new resin via FMOC strategyPeptide Research,4(5),289-95；1991)，他們將反應(yīng)溶劑由氯仿改成三氟醋酸，極大地提高了反應(yīng)的安全性，反應(yīng)收率80％。
Ueki,M.等人(Synthesis and anti-HIV activity of nonatyrosine N-and O1-9-decasulfateBioorganic&Medicinal Chemistry,9(2),477-486；2001)用吡啶三氧化硫絡(luò)合物為磺化試劑，在DMF(N,N-二甲基甲酰胺)中磺化得到酪氨酸-O-磺酸，然后用堿調(diào)節(jié)pH，得到酪氨酸-O-磺酸二鈉鹽，反應(yīng)收率81％，但是由于得到其二鈉鹽所需用堿的量比較大，操作中反應(yīng)液的pH值也太大，酪氨酸-O-磺酸部分水解導(dǎo)致產(chǎn)品中酪氨酸含量較大，純化難度極大。
Futaki,Shiroh等人于1990年發(fā)表文章提出了另一種合成思路(Use of dimethylformamide-sulfur trioxide complex as a sulfating agent of tyrosineJournalofthe Chemical Society,PerkinTransactions 1:Organic and Bio-Organic Chemistry(1972-1999),(6),739-44；1990)，他們利用三氧化硫DMF絡(luò)合物為磺化試劑，在吡啶與DMF混合溶劑中進(jìn)行磺化，獲得酪氨酸-O-磺酸。具體反應(yīng)如下所示：
在上述方法的基礎(chǔ)上，Takeshi Yagami等人在1993年提出一個(gè)方案(Evalution of the Final Deprotection System for the Solid-Phase Synthesis of Tyr(SO3H)-Containing Peptide with9-Fluorenylmethyloxycarbonyl(Fmoc)-Strategy and Its Application to the Synthesis of Cholecystokinin(CCK)-12,Chem.Pharm,Bull.41(2)376-380(1993)),以DMF、吡啶及二氧六環(huán)混合液為溶劑，三氧化硫DMF絡(luò)合物為磺化試劑對(duì)Fmoc保護(hù)的酪氨酸進(jìn)行磺化(室溫條件下攪拌過夜)，反應(yīng)液濃縮后得到的粗品用碳酸鈉進(jìn)行堿化，經(jīng)過凍干、柱層析等步驟得到純品,文獻(xiàn)報(bào)道收率為87％。
然而，現(xiàn)有技術(shù)中，反應(yīng)產(chǎn)物的純化方法較為復(fù)雜，這極大地限制了產(chǎn)物的規(guī)模化生產(chǎn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺點(diǎn)，提供一種制備酪氨酸-O-磺酸鹽的方法，所述方法包括如下步驟：
(1)在稀釋劑和堿的存在下，將磺化試劑和Fmoc保護(hù)的酪氨酸反應(yīng)，得到反應(yīng)液；
(2)將步驟(1)的反應(yīng)液倒入不良溶劑中，然后靜置；
(3)傾去步驟(2)所得物的上清液，殘余物用水溶解，然后用堿調(diào)節(jié)pH至弱酸性；
(4)用良溶劑洗滌步驟(3)所得水溶液，然后濃縮；
(5)向步驟(4)的濃縮物中加入良溶劑并攪拌，過濾，濾液加入至不良溶劑中，攪拌，收集固體，干燥，得到固體；
其中，F(xiàn)moc為9-芴甲氧羰基，與氨基相連。
本發(fā)明的制備方法，避免了使用蒸餾、凍干等耗時(shí)長(zhǎng)、設(shè)備要求高的問題，后處理中通過增加萃取操作，極大地提高了純度，避免了使用難以放大的柱層析純化操作，其是一個(gè)適合放大生產(chǎn)、操作簡(jiǎn)單、產(chǎn)品純度高的方法。
附圖說明
圖1實(shí)施例2所得產(chǎn)物的HPLC圖
具體實(shí)施方式
本發(fā)明的制備酪氨酸-O-磺酸鹽的方法包括如下步驟：
(1)在稀釋劑和堿的存在下，將磺化試劑和Fmoc保護(hù)的酪氨酸反 應(yīng)，得到反應(yīng)液；
(2)將步驟(1)的反應(yīng)液倒入不良溶劑中，然后靜置；
(3)傾去步驟(2)所得物的上清液，殘余物用水溶解，然后用堿調(diào)節(jié)pH至弱酸性；
(4)用良溶劑洗滌步驟(3)所得水溶液，然后濃縮；
(5)向步驟(4)的濃縮物中加入良溶劑并攪拌，過濾，濾液加入至不良溶劑中，攪拌，收集固體，干燥，得到固體；
其中，F(xiàn)moc為9-芴甲氧羰基，與氨基相連。
在本說明書中，如無相反說明，則所述操作均在常溫常壓下進(jìn)行。
在本說明書中，在室溫常壓下，在100g溶劑中，能溶解不小于10g產(chǎn)物的溶劑稱為良溶劑；在室溫常壓下，在100g溶劑中，能溶解不大于1g產(chǎn)物的溶劑稱為不良溶劑。
在本說明書中，步驟(4)和步驟(5)的良溶劑可相同或不同，優(yōu)選不同。
在本說明書中，步驟(2)和步驟(5)的不良溶劑可相同或不同，優(yōu)選相同。
在步驟(1)中，所述稀釋劑可以是所有對(duì)參與該反應(yīng)的物質(zhì)呈惰性的有機(jī)溶劑，例如，但不限于：DMF、1,4-二氧六環(huán)等，或其任意組合，
所述堿可為堿性較弱的堿，例如，但不限于：有機(jī)堿，如吡啶、三乙胺等，
所述磺化試劑可為三氧化硫吡啶絡(luò)合物、硫酸、發(fā)煙硫酸或三氧化硫DMF絡(luò)合物，優(yōu)選三氧化硫DMF絡(luò)合物。
在步驟(2)中，所述反應(yīng)液可由步驟(1)中的反應(yīng)液直接得到，也可由步驟(1)中的反應(yīng)液經(jīng)處理后得到，如通過濃縮除去低沸點(diǎn)溶劑而僅剩產(chǎn)物和高沸點(diǎn)溶劑，
所述不良溶劑為與步驟(1)的反應(yīng)液互溶的溶劑，例如，但不限于：醚類，如乙醚、丙醚、甲基叔丁基醚，或它們的混合物，
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所用不良溶劑的溫度低于0℃，
所述靜置可在室溫下進(jìn)行也可在低溫下進(jìn)行，優(yōu)選低溫，靜置的時(shí)間可為5個(gè)小時(shí)、10個(gè)小時(shí)或更長(zhǎng)。
在步驟(3)中，所述水的溫度可為0-25℃，優(yōu)選0-10℃，更優(yōu)選0 ℃，
所述堿可為無機(jī)堿，例如，但不限于：氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉、碳酸鉀等，優(yōu)選氫氧化鈉，
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述堿為其水溶液的形式，例如10％的氫氧化鈉水溶液，
所述弱酸性水溶液的pH可為6-7，優(yōu)選6.5，
在調(diào)節(jié)pH過程中，優(yōu)選在攪拌下進(jìn)行。
在步驟(4)中，所述良溶劑為不與水互溶的溶劑，例如，但不限于：乙酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸異丙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、1,2-二氯乙烷、1,1,2,2-四氯乙烷，優(yōu)選乙酸乙酯、二氯甲烷，
所述洗滌至少進(jìn)行2次，優(yōu)選3次，
所述濃縮操作使用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行，如減壓蒸餾。
在步驟(5)中，所述良溶劑為與不良溶劑互溶的溶劑，例如，但不限于：醇類，如甲醇、乙醇、異丙醇、叔丁醇，優(yōu)選甲醇、乙醇，
加入良溶劑后進(jìn)行充分?jǐn)嚢?，攪拌時(shí)間不低于20分鐘，優(yōu)選30分鐘，
所述不良溶劑和良溶劑的體積比可為15-8：1，優(yōu)選10：1，
在加入不良溶劑后進(jìn)行充分?jǐn)嚢?，攪拌時(shí)間不低于5分鐘，
所述收集固體可采用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行，例如離心、過濾等方法，優(yōu)選離心方法。
所述干燥可采用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行，例如常壓干燥、真空干燥、紅外干燥、冷凍干燥，優(yōu)選真空干燥方法。
以下參照實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明，應(yīng)理解，下述實(shí)施例意在說明，不對(duì)本發(fā)明構(gòu)成限制。
實(shí)施例1：
反應(yīng)瓶中加入Fmoc-L-酪氨酸32.4克，然后將200毫升的N,N-二甲基甲酰胺、50毫升的吡啶和25毫升的1,4-二氧六環(huán)混合均勻后加入到反應(yīng)瓶中，攪拌溶解，稱取DMF三氧化硫復(fù)合物12.4g加入反應(yīng)瓶中，室溫下開始攪拌過夜。TLC跟蹤反應(yīng)，直至Fmoc-L-酪氨酸反應(yīng)完全。
反應(yīng)液倒入到1200毫升冰凍的乙醚中，所得混合溶液在-20℃條件下 放置過夜。傾去上清液，殘余油狀物用250毫升冰水溶解，然后用10％的氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)使pH為6.5，過程中保持體系溫度不超過0℃，所得溶液凍干。向所得凍干的固體中加入250毫升的甲醇攪拌30分鐘，過濾，濾液加入到2.5升的冰凍乙醚中，攪拌5分鐘，離心收集固體，真空干燥，得類白色固體32.6克，收率64.2％，HPLC檢測(cè)純度95.0％。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.50(s,1H),7.93(d,J＝7.4Hz,2H),7.65(d,J＝7.6Hz,2H),7.53(t,J＝6.9Hz,2H),7.28(t,J＝7.4Hz,2H),7.05(d,J＝6.9Hz,2H),6.81(d,J＝7.2Hz,2H),4.61(d,J＝5.4Hz,2H),4.56(t,J＝6.2Hz,1H),4.46(d,J＝6.2Hz,1H),3.16(m,1H),2.2(m,1H).
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實(shí)施例2：
反應(yīng)瓶中加入Fmoc-L-酪氨酸32.4克，然后將200毫升的N,N-二甲基甲酰胺、50毫升的吡啶和25毫升的1,4-二氧六環(huán)混合均勻后加入到反應(yīng)瓶中，攪拌溶解，稱取三氧化硫N,N-二甲基甲酰胺絡(luò)合物12.4克加入反應(yīng)瓶中，室溫下開始攪拌。TLC跟蹤反應(yīng)，直至Fmoc-L-酪氨酸反應(yīng)完全。
反應(yīng)液倒入到1200毫升冰凍的乙醚中，所得混合溶液在-20℃條件下放置過夜。傾去上清液，殘余油狀物用250毫升冰水溶解，用10％的NaOH水溶液調(diào)節(jié)使pH為6.5，過程中保持體系溫度不超過0℃。所得水溶液用乙酸乙酯洗滌(150毫升*3)后，在35攝氏度下旋蒸至干。加入250毫升甲醇攪拌30分鐘，過濾，濾液加入到2.5升的冰凍乙醚中，攪拌5分鐘，離心收集固體，真空干燥，得類白色固體34.4克，收率67.7％，HPLC檢測(cè)純度99.4％。
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實(shí)施例3：
反應(yīng)瓶中加入Fmoc-L-酪氨酸32.4克，然后將200毫升的N,N-二甲基甲酰胺、50毫升的吡啶和25毫升的1,4-二氧六環(huán)混合均勻后加入到反應(yīng)瓶中，攪拌溶解，稱取三氧化硫吡啶絡(luò)合物12.8克加入反應(yīng)瓶中，室 溫下開始攪拌。TLC跟蹤反應(yīng)，直至Fmoc-L-酪氨酸反應(yīng)完全。
反應(yīng)液倒入到1200毫升冰凍的乙醚中，所得混合溶液在-20℃條件下放置過夜。傾去上清液，殘余油狀物用250毫升冰水溶解，用10％的NaOH水溶液調(diào)節(jié)使pH為6.5，過程中保持體系溫度不超過0℃。所得水溶液用乙酸乙酯洗滌(150毫升*3)后，在35攝氏度下旋蒸至干。加入250毫升甲醇攪拌30分鐘，過濾，濾液加入到2.5升的冰凍乙醚中，攪拌5分鐘，離心收集固體，真空干燥，得類白色固體32.5克，收率64.0％HPLC檢測(cè)純度90.0％。
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實(shí)施例4：
反應(yīng)瓶中加入Fmoc-L-酪氨酸32.4克，然后將200毫升的N,N-二甲基甲酰胺、50毫升的吡啶和25毫升的1,4-二氧六環(huán)混合均勻后加入到反應(yīng)瓶中，攪拌溶解，量取發(fā)煙硫酸14.5毫升加入反應(yīng)瓶中，室溫下開始攪拌。TLC跟蹤反應(yīng)，直至Fmoc-L-酪氨酸反應(yīng)完全。
反應(yīng)液倒入到1200毫升冰凍的乙醚中，所得混合溶液在-20℃條件下放置過夜。傾去上清液，殘余油狀物用250毫升冰水溶解，用10％的NaOH水溶液調(diào)節(jié)使pH為6.5，過程中保持體系溫度不超過0℃。所得水溶液用二氯甲烷洗滌(150毫升*3)后，在35攝氏度下旋蒸至干。加入250毫升甲醇攪拌30分鐘，過濾，濾液加入到2.5升的冰凍乙醚中，攪拌5分鐘，離心收集固體，真空干燥，得類白色固體22.3克，收率43.9％，HPLC檢測(cè)純度85.0％。
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實(shí)施例5：
20升反應(yīng)釜中加入Fmoc-L-酪氨酸1500克，然后將9260毫升的N,N-二甲基甲酰胺、2315毫升的吡啶和1160毫升的1,4-二氧六環(huán)混合均勻后加入到反應(yīng)釜中，攪拌溶解，稱取三氧化硫N,N-二甲基甲酰胺絡(luò)合物575克加入反應(yīng)釜中，室溫下開始攪拌。TLC跟蹤反應(yīng)，直至Fmoc-L-酪氨酸反應(yīng)完全。
反應(yīng)液倒入到55升冰凍的甲基叔丁基醚中，所得混合溶液在-20℃條 件下放置過夜。傾去上清液，殘余油狀物用11.5升冰水溶解，用10％的NaOH水溶液調(diào)節(jié)使pH為6.0，過程中保持體系溫度不超過0℃。所得水溶液用乙酸異丙酯洗滌(6.9升*3)后，在35-40攝氏度下旋蒸至干。加入11.5升甲醇攪拌30分鐘，過濾，濾液加入到115升的冰凍乙醚中，攪拌5分鐘，離心收集固體，真空干燥，得類白色固體1587.7克，收率67.5％HPLC檢測(cè)純度97.2％。
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實(shí)施例6：
反應(yīng)瓶中加入Fmoc-L-酪氨酸32.4克，然后將200毫升的N,N-二甲基甲酰胺、50毫升的吡啶和25毫升的1,4-二氧六環(huán)混合均勻后加入到反應(yīng)瓶中，攪拌溶解，稱取DMF三氧化硫復(fù)合物12.4g加入反應(yīng)瓶中，室溫下開始攪拌過夜。TLC跟蹤反應(yīng)，直至Fmoc-L-酪氨酸反應(yīng)完全。
反應(yīng)液倒入到1200毫升冰凍的丙醚中，所得混合溶液在-20℃條件下放置過夜。傾去上清液，殘余油狀物用250毫升冰水溶解，然后用10％的氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)使pH為6.9，過程中保持體系溫度不超過5℃，所得溶液凍干。向所得凍干的固體中加入250毫升的甲醇攪拌30分鐘，過濾，濾液加入到2.5升的冰凍丙醚中，攪拌5分鐘，離心收集固體，真空干燥，得類白色固體22.1克，收率43.5％，HPLC檢測(cè)純度94.6％。
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