本發(fā)明涉及雜多糖、其通過微生物的生產(chǎn)及其在乳制品行業(yè)中用于制造發(fā)酵乳制品的應(yīng)用。
發(fā)明背景
來自植物、動(dòng)物和微生物來源的聚合物在食品配方中起著重要的作用。食品聚合物是長鏈的高分子質(zhì)量分子，其溶解或分散在水中從而提供質(zhì)地化(texturizing)特性。食品行業(yè)所使用的大多數(shù)生物聚合物是來自作物植物的多糖(例如，淀粉)或者來自海藻類的多糖(例如，卡拉膠)以及動(dòng)物蛋白如酪蛋白酸鹽和明膠。植物碳水化合物在食品中的功能性質(zhì)由相當(dāng)微妙的結(jié)構(gòu)特征決定。對(duì)于工業(yè)實(shí)踐，大部分被化學(xué)改性。
替代性的生物增稠劑是微生物表多糖。這些聚合物可被組裝成與細(xì)胞表面緊密相連的莢膜多糖(CPS)，或者它們可被釋放到生長介質(zhì)中(即，“絲狀(ropy)”多糖)。術(shù)語表多糖(EPS)可用來描述任一種類型的胞外多糖(Broadbent J.R.等人,2003,Journal Dairy Science,86,407-423,“Biochemistry,genetics and applications of exopolysaccharide production in Streptococcus thermophilus:a review”)。
EPS廣泛存在于細(xì)菌和微藻中并較少存在于酵母和真菌中。工業(yè)上重要的微生物EPS的實(shí)例是來自Leuconostoc mesenteroides的右旋糖酐、來自Xanthomonas campestris的黃原膠和來自Sphingomonas paucimobilis的結(jié)蘭膠家族的EPS。這些EPS僅代表目前生物聚合物市場(chǎng)的一小部分。限制微生物EPS的使用的因素是其經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)(這需要對(duì)其生物合成的充分了解和適應(yīng)性生物工藝技術(shù))、其高回收成本以及其中大多數(shù)是非食品細(xì)菌來源。對(duì)于EPS的食品用途，能夠足夠大量地產(chǎn)生EPS的公認(rèn)安全(GRAS)的食品級(jí)微生物、尤其是乳酸菌(LAB)的菌株是令人關(guān)注的替代物。此外，這些微生物可被用于在原位產(chǎn)生EPS，對(duì)于發(fā)酵乳制品尤其如此，以改善它們的流變性、質(zhì)地和主體，以及口感。
來自LAB的EPS可被細(xì)分成兩組，即同多糖(HoPS)和雜多糖(HePS)。HoPS由一種類型的組成單糖(d-吡喃葡萄糖或d-呋喃果糖)構(gòu)成(Monsan,P.等人,2001,International Dairy Journal,11,673–683,Homopolysaccharides from lactic acid bacteria.)。HePS由重復(fù)子單元的骨架構(gòu)成，所述重復(fù)子單元是支化的(在C2、C3、C4或C6位置)或未支化的并且由3-8個(gè)單糖、單糖衍生物或經(jīng)取代的單糖組成。最近的綜述請(qǐng)參見Vaningelgem等人(2004)applied and Environmental Microbiology 70(2),900-912“Biodiversity of Exopolysaccharides Produced by Streptococcus thermophilus Strains Is Reflected in Their Production and Their Molecular and Functional Characteristics”和De Vuyst等人(2001)International Dairy Journal,11,687-707.“Recent developments in the biosynthesis and applications of heteropolysaccharides from lactic acid bacteria”。
de Vuyst等人(2001)中的表1總結(jié)了34種不同乳酸菌的HePS。重復(fù)單元包含以下糖類：葡萄糖(Glc)、GlcNAc(N-乙酰葡糖胺)、半乳糖、(Gal)、GalNAc(N-乙酰半乳糖胺)、鼠李糖(Rha)和海藻糖(Fuc)。Vaningelgem等人中的表4總結(jié)了25種不同Streptococcus thermophilus菌株的HePS。而de Vuyst(2001)基于重復(fù)單元中單糖的數(shù)目對(duì)不同EPS進(jìn)行分類，從三-糖開始直至八-糖，Vaningelgem等人根據(jù)它們的定性單糖組成定義了組I-組VI。例如，組I由半乳糖和葡萄糖構(gòu)成，而組V由半乳糖、葡萄糖、鼠李糖和N-乙酰半乳糖胺構(gòu)成。Ruas-Madiedo等人,2002,International Dairy Journal,12,163-171,An overview of the functionality of exopolysaccharides produced by lactic acid bacteria的表2中總結(jié)了HePS的重復(fù)單元的額外結(jié)構(gòu)。
眾所周知，EPS的功能受分子的3D結(jié)構(gòu)(即，所謂的流體力學(xué)半徑-Rh)的影響。決定3D結(jié)構(gòu)的兩個(gè)主要參數(shù)是分子質(zhì)量(MW，以道爾頓計(jì))和EPS的重復(fù)單元，其中EPS的重復(fù)單元由聚合物中分支與連接的類型、單糖組成決定。
來自LAB的EPS在一些發(fā)酵乳制品的生產(chǎn)中具有技術(shù)重要性。使用含有形成EPS的S.thermophilus和Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus的“絲狀”起子(starter)是生產(chǎn)酸乳中的常用做法以改善酸乳的質(zhì)地、避免酸乳脫水收縮和提高酸乳的粘度。此外，產(chǎn)生EPS的細(xì)菌被用來改善奶酪、尤其是低脂奶酪的產(chǎn)率、質(zhì)地和功能(參見Broadbent J.R.等人,2003,Journal Dairy Science,86,407-423,“Biochemistry,genetics and applications of exopolysaccharide production in Streptococcus thermophilus:a review”)。
我們現(xiàn)在已經(jīng)出乎意料地發(fā)現(xiàn)了具有卓越質(zhì)地化特性的新型雜多糖。雜多糖的分子重量和糖組成的組合以前尚未被報(bào)道過。
發(fā)明詳述
在第一方面，本發(fā)明提供雜多糖，所述雜多糖基本上由單糖葡萄糖、半乳糖、鼠李糖和N-乙酰半乳糖胺構(gòu)成并且具有100kDa-10000kDa的分子重量?；旧显诒疚闹斜欢x為：基于雜多糖的干物質(zhì)，至少90％、優(yōu)選地至少95％、更優(yōu)選地至少98％的雜多糖由單糖葡萄糖、半乳糖、鼠李糖和N-乙酰半乳糖胺構(gòu)成。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，雜多糖由30-50摩爾％的葡萄糖、10-30摩爾％的半乳糖、10-30摩爾％的鼠李糖和10-30摩爾％的N-乙酰半乳糖胺構(gòu)成，且其中葡萄糖、半乳糖、鼠李糖和N-乙酰半乳糖胺的總摩爾％為100％。更優(yōu)選地，雜多糖由35-45摩爾％的葡萄糖、15-25摩爾％的半乳糖、15-25摩爾％的鼠李糖和15-25摩爾％的N-乙酰半乳糖胺構(gòu)成，優(yōu)選地其中葡萄糖、半乳糖、鼠李糖和N-乙酰半乳糖胺的總摩爾％為100％。在另一個(gè)實(shí)施方式中，雜多糖的特征在于：葡萄糖的摩爾％與半乳糖的摩爾％的比率在≥1.0和≤2.0之間。最優(yōu)選地，雜多糖由40摩爾％的葡萄糖、20摩爾％的半乳糖、20摩爾％的鼠李糖和20摩爾％的N-乙酰半乳糖胺構(gòu)成。
根據(jù)本發(fā)明的雜多糖的組成可以以幾種方式被表示。組成可以被表示成各單糖的重量百分比或者被表示成各單糖的摩爾百分比?；蛘撸柊俜直瓤梢员槐硎境筛鲉翁堑哪柋?整數(shù))。例如，上文所述的最優(yōu)選實(shí)施方式(其由40摩爾％的葡萄糖、20摩爾％的半乳糖、20摩爾％的鼠李糖和20摩爾％的N-乙酰半乳糖胺構(gòu)成)則被表示成：
葡萄糖：半乳糖：鼠李糖：N-乙酰半乳糖胺＝2:1:1:1。
本發(fā)明的雜多糖可以由基本重復(fù)單元構(gòu)成。重復(fù)單元可以具有與雜多糖的組成相同的組成。優(yōu)選地，本發(fā)明的雜多糖的重復(fù)單元是由葡萄糖、半乳糖、鼠李糖和N-乙酰半乳糖胺構(gòu)成的五糖。五糖在本文中被定義為由5個(gè)單糖構(gòu)成的糖。本發(fā)明的五糖優(yōu)選地具有以下組成：
葡萄糖：半乳糖：鼠李糖：N-乙酰半乳糖胺＝2:1:1:1。
本發(fā)明的雜多糖具有100kDa-10000kDa的分子重量。更優(yōu)選地200kDa-10000kDa的分子重量，優(yōu)選地300kDa-10000kDa的分子重量，優(yōu)選地400kDa-10000kDa的分子重量，優(yōu)選地450kDa-10000kDa的分子重量，優(yōu)選地500kDa-10000kDa的分子重量，更優(yōu)選地200kDa-8000kDa的分子重量，優(yōu)選地300kDa-6000kDa的分子重量，優(yōu)選地400kDa-4000kDa的分子重量，優(yōu)選地450kDa-2000kDa的分子重量，最優(yōu)選地500kDa-1500kDa的分子重量。本發(fā)明的雜多糖的分子重量在本文中被定義為平均分子重量。雜多糖的分子重量將具有在平均分子重量左右的分子重量分布。平均分子重量可以由技術(shù)人員通過本領(lǐng)域已知的方法(例如尺寸排阻色譜法)來測(cè)定。
本發(fā)明的雜多糖可以具有上文所述的任何糖組成與上述所述的任何分子重量范圍的組合。一個(gè)高度優(yōu)選的本發(fā)明的雜多糖由35-45摩爾％的葡萄糖、15-25摩爾％的半乳糖、15-25摩爾％的鼠李糖和15-25摩爾％的N-乙酰半乳糖胺構(gòu)成，其中葡萄糖、半乳糖、鼠李糖和N-乙酰半乳糖胺的總摩爾％為100％，并且具有500kDa-1500kDa的分子重量。另一高度優(yōu)選的本發(fā)明的雜多糖具有以下糖組成：
葡萄糖：半乳糖：鼠李糖：N-乙酰半乳糖胺＝2:1:1:1，并且具有500kDa-1500kDa的分子重量。
本發(fā)明的雜多糖的優(yōu)點(diǎn)為：相較于雖然由相同的單糖葡萄糖、半乳糖、鼠李糖和N-乙酰半乳糖胺構(gòu)成但具有比100kDa低得多的分子質(zhì)量的雜多糖，其在發(fā)酵乳產(chǎn)品中具有卓越的增稠性質(zhì)并且提供長紋理(long texture)(參見實(shí)施例)。
在第二方面，本發(fā)明提供能夠產(chǎn)生本發(fā)明的雜多糖的的細(xì)菌。優(yōu)選地，所述細(xì)菌屬于Streptococcus種。更優(yōu)選地，所述細(xì)菌選自由以下組成的組
·Streptococcus salivarius thermophilus NGB-22D，于2012年2月28日在烏特勒支的Centraalbureau voor Schimmelcultures(真菌生物多樣性中心)保藏為CBS132067
·Streptococcus salivarius thermophilus DS65008，于2013年6月18日在烏特勒支的Centraalbureau voor Schimmelcultures(真菌生物多樣性中心)保藏為CBS135685。
本發(fā)明的細(xì)菌優(yōu)選地產(chǎn)生上文所限定的雜多糖，即基本上由單糖葡萄糖、半乳糖、鼠李糖和N-乙酰半乳糖胺構(gòu)成的雜多糖。所述細(xì)菌能夠產(chǎn)生在本發(fā)明的第一方面中限定的具有優(yōu)選組成的雜多糖。本發(fā)明的細(xì)菌還能夠產(chǎn)生在本發(fā)明的第一方面中限定的由基本重復(fù)單元構(gòu)成的雜多糖。
在第三方面，本發(fā)明提供生產(chǎn)發(fā)酵乳制品的方法，所述方法包括：添加在本發(fā)明的第一方面中限定的本發(fā)明的雜多糖。添加本發(fā)明的雜多糖的效果是：相較于不添加雜多糖或者相較于添加具有不同組成的雜多糖，獲得了高度粘稠、可拉伸和光滑質(zhì)地的發(fā)酵乳制品。
在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供生產(chǎn)發(fā)酵乳制品的方法，所述方法包括：添加在本發(fā)明的第二方面中限定的能夠產(chǎn)生雜多糖的本發(fā)明的細(xì)菌。在該實(shí)施方式中，在用于生產(chǎn)發(fā)酵乳制品的方法中，所述細(xì)菌在原位產(chǎn)生雜多糖，相較于不添加本發(fā)明的細(xì)菌或者相較于添加能夠產(chǎn)生具有不同組成的多糖的細(xì)菌，這導(dǎo)致發(fā)酵乳制品的質(zhì)地和/或粘度得到改善。
發(fā)酵制品可以是期望質(zhì)地和/或粘度得到改善的任何發(fā)酵乳制品。發(fā)酵乳制品可以選自，但不限于，發(fā)酵制品例如酸乳、飲用酸乳、(低脂)奶酪、開菲爾(kefir)、酪乳、酸乳油或大豆酸乳等。這類食品還可包含用于制備甜點(diǎn)的常見成分，例如水果、巧克力片或谷物，以及甜化產(chǎn)品或液體巧克力。食品還可包含常見的食物成分例如乳化劑、膠凝劑、穩(wěn)定劑、甜味劑等。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何使用來自本發(fā)明的(發(fā)酵)食物來制備食品。
在第四方面，本發(fā)明提供生產(chǎn)在本發(fā)明的第一方面中限定的本發(fā)明的雜多糖的方法。優(yōu)選地，在生產(chǎn)本發(fā)明的雜多糖的方法中，在有益于產(chǎn)生本發(fā)明的雜多糖的條件下，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的第二方面中限定的本發(fā)明的細(xì)菌?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的技術(shù)從發(fā)酵液中收集本發(fā)明的雜多糖，所述發(fā)酵液包含細(xì)菌的生物質(zhì)、本發(fā)明的雜多糖和其它組分。
在第五方面，本發(fā)明提供在本發(fā)明的第一方面中限定的本發(fā)明的雜多糖用于改善發(fā)酵乳制品的質(zhì)地和/或粘度的用途。優(yōu)選地，發(fā)酵乳制品是酸乳或奶酪。
在第六方面，本發(fā)明提供在本發(fā)明的第二方面中限定的本發(fā)明的細(xì)菌用于改善發(fā)酵乳制品的質(zhì)地和/或粘度的用途。
材料和方法
菌株
*菌株STV88是商業(yè)菌株并可以以商品名-ADD 100-F獲自荷蘭代爾夫特的DSM Food Specialties B.V.
**Streptococcus thermophilus ST144獲自乳制品微生物保藏中心(Culture Collection of Dairy Microorganisms)(Milcom),Sobeslavska 841,39001Tabor,捷克共和國
***菌株于指定日期(保藏日期)被保藏在Centraalbureau voor Schimmelcultures(真菌生物多樣性中心),Uppsalalaan 8,3584CT烏特勒支,荷蘭，并收到的相應(yīng)的保藏號(hào)
制備發(fā)酵乳制品
向商業(yè)UHT半脫脂乳(Campina,荷蘭)補(bǔ)充2％(w/w)的脫脂乳粉末。如下對(duì)200ml乳的等分試樣進(jìn)行巴氏滅菌：在水浴中在90℃下加熱乳15分鐘，隨后在85℃下加熱30分鐘。巴氏滅菌之后，利用冰水將乳迅速冷卻至4℃。用106cfu/ml(菌落形成單位/ml)各種細(xì)菌培養(yǎng)物接種巴氏滅菌乳并在42℃孵育直至pH達(dá)到4.6。使用CINAC設(shè)備(Ysebaert,法國)連續(xù)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)物的pH。同時(shí)，為了測(cè)量Brookfield粘度，在杯子(體積為150ml，直徑為5.5cm)中以相同的方式發(fā)酵125ml乳。
在冰水中冷卻如此得到的發(fā)酵乳并貯存在4℃直至進(jìn)一步分析。
從發(fā)酵乳中分離EPS
在50mL管中在55℃下加熱40mL發(fā)酵乳1小時(shí)以釋放EPS。為了沉淀蛋白質(zhì)，加入2.67mL 60％(w/v)的TCA并在20-25℃之間的溫度下輕輕搖動(dòng)溶液1.5小時(shí)。在4℃的溫度下以6300g離心30分鐘之后，將上清液定量轉(zhuǎn)移到100mL瓶中并利用5N的氫氧化鈉(NaOH)將pH調(diào)節(jié)至4.0。將上清液定量轉(zhuǎn)移到30cm的透析管(4個(gè)MWCO 12 000-14 000的SpectraPor膜，Spectrum Laboratories Inc)中并相對(duì)于自來水透析約16小時(shí)(過夜)，隨后利用反滲透(RO)水透析2小時(shí)。使用前，在2％的碳酸鈉(Na2CO3)溶液中煮沸透析管15分鐘，利用RO水洗滌兩次，然后利用RO水再次煮沸15分鐘。將透析管貯存在RO水中直至使用。然后將透析液定量轉(zhuǎn)移到塑料杯中(利用5mL RO水洗滌透析管兩次)并在兩天期間凍干。
SEC-MALLS分析
尺寸排阻色譜(SEC)系統(tǒng)由串聯(lián)的TSK凝膠PWXL保護(hù)柱(6.0mm×4.0cm)、TSK凝膠G6000PWXL分析柱(7.8mm×30cm，13.0μm)和TSK凝膠G5000PWXL分析柱(7.8mm×30cm，10μm)(TosoHaas)組成并利用溫度控制模件(Waters)恒溫控制在35℃。
對(duì)洗脫液進(jìn)行在線真空脫氣(1200系列,Agilent Technologies)并以0.5mL/分鐘的流量泵送(1200系列,Agilent Technologies)。將樣品置于10℃的溫控樣品架中并在柱(模型231Bio,Gilson)上注射200μL。
于32°和144°之間的15個(gè)角度在632.8nm下測(cè)量光散射(DAWN DSP-F,Wyatt Technologies)。在280nm下測(cè)量UV吸收(CD-1595,Jasco)以檢測(cè)蛋白質(zhì)。
使用ASTRA V軟件(5.3.2.22版,Wyatt Technologies)進(jìn)行數(shù)據(jù)收集和處理。為了歸一化，使用參照物牛血清白蛋白(BSA)(M.W.＝67000Da)。洗脫液為100mM的NaNO3+0.02％NaN3。使用前，通過0.20μm的濾器并在線通過0.025μm的濾器過濾洗脫液，其中0.025μm的濾器位于泵和注射器之間。注射前，將凍干的EPS樣品以25mg/mL的濃度溶解在洗脫液中并通過0.20μm的濾器過濾。
酸水解EPS后分析單糖
酸水解多糖–在利用尺寸排阻色譜(SEC)分析期間，收集到了多糖峰(在29-31分鐘之間：2分鐘×0.5mL/分鐘＝1mL)。加入TFA儲(chǔ)液(1mL；4M)并在氮?dú)?N2)中利用2M三氟乙酸(TFA)在120℃下酸水解收集到的多糖溶液75分鐘。水解之后，于真空中在室溫下過夜干燥溶液，然后將其溶解在水(100μL)中并通過HPAEC-PAD分析。
HPAEC-PAD分析–在金電極上的高效陰離子交換色譜與脈沖安培檢測(cè)法(HPAEC-PAD)被用于單糖鼠李糖、半乳糖胺、阿拉伯糖、葡萄糖胺、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖、半乳糖醛酸和葡糖醛酸的定量分析。利用帶有氦脫氣單元的600E系統(tǒng)控制器泵(Waters)和模型400EC檢測(cè)器(EG&G)，使用VT-03流動(dòng)池(Antec Leyden)和Dionex的技術(shù)說明21中所述的關(guān)于波形B的設(shè)置進(jìn)行分析。利用717自動(dòng)進(jìn)樣器(Waters)，將20μL樣品注射在恒溫控制在30℃的250×4mm(10-32)的Carbopac PA-1柱(Dionex)上。以1.0mL/分鐘的流速洗脫單糖。利用16mM的氫氧化鈉等度洗脫單糖，隨后洗脫酸單糖：從20分鐘開始在20分鐘內(nèi)以線性梯度達(dá)到200mM氫氧化鈉+500mM乙酸鈉。
利用Chromeleon軟件6.80版(Dionex)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。利用經(jīng)受酸水解條件的單糖(Sigma-Aldrich)標(biāo)準(zhǔn)溶液(40-250mg/L之間)進(jìn)行定量分析。
質(zhì)地分析
通過用長塑料勺手動(dòng)攪動(dòng)杯子中的酸乳來定性評(píng)估酸乳的質(zhì)地。通過攪動(dòng)期間觀察到的阻力來評(píng)價(jià)樣品的稠度和膠黏性。通過使一勺酸乳從勺子流動(dòng)來評(píng)價(jià)長(long)質(zhì)地和短(short)質(zhì)地。短酸乳將從勺子落下成為一團(tuán)，而長酸乳將從勺子流動(dòng)并形成線(thread)。
實(shí)施例
實(shí)施例1
由S.thermophilus菌株產(chǎn)生的EPS的特征
如材料和方法中所述，利用不同的S.thermophilus菌株生產(chǎn)發(fā)酵乳并從其中分離EPS。表1總結(jié)了發(fā)酵乳的質(zhì)地和稠度以及EPS的糖組成及其分子重量。
菌株BLF5-1充當(dāng)對(duì)照，因?yàn)樗峁┮姿榈牧钯|(zhì)地(“短”)。菌株STV88是現(xiàn)有技術(shù)菌株，已知其相較于對(duì)照菌株BLF5-1提供平均質(zhì)地化的可拉伸的和光滑的(“長”)發(fā)酵品。菌株ST144充當(dāng)對(duì)照，因?yàn)樗哂信c本發(fā)明的菌株相同的糖組成但低得多的分子重量。該菌株也提供短質(zhì)地。
菌株NGB-22D和DS65008是代表本發(fā)明的菌株，其產(chǎn)生高度粘稠、可拉伸和光滑(“長”)質(zhì)地的發(fā)酵乳制品。
EPS的分析顯示：菌株NGB-22D和DS65008產(chǎn)生這樣的EPS，其相較于比較菌株的EPS具有獨(dú)特的糖組成和分子重量的組合
表1-S.thermophilus酸乳菌株經(jīng)分離的EPS的糖組成
Glc＝葡萄糖；Gal＝半乳糖；Rha＝鼠李糖；GalNAc＝N-乙酰半乳糖胺。其它單糖未被包括在內(nèi)，因?yàn)樗鼈兊闹档陀跈z測(cè)限。ND＝未檢出。
*摘自Vaningelgem(2004)–表3和表4