一種高效提取深層液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)烏靈參菌絲體多糖的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高效提取深層液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)烏靈參菌絲體多糖的方法，該方法是將烏靈參發(fā)酵液分離的菌絲體通過超聲波和復(fù)合酶解進(jìn)行處理、分離得到烏靈參多糖。本發(fā)明改變了傳統(tǒng)的多糖“水提醇沉”的提取方式，提高了烏靈參多糖的提取收率和產(chǎn)品品質(zhì)，減少了生產(chǎn)中純化水用量和能源消耗，增加了經(jīng)濟(jì)效益。
【專利說明】一種高效提取深層液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)烏靈參菌絲體多糖的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體是一種高效提取深層液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)烏靈參菌絲 體多糖的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 烏靈參屬子囊菌綱、炭角菌科的黑柄炭角菌，是一傳統(tǒng)的藥用真菌，學(xué)名黑柄炭角 菌，別名烏靈參、雞縱（叢）蛋，又名震雷子，生長(zhǎng)在地下深處黑翅土棲白蟻廢棄的蟻巢上， 被世界藥用真菌研究、應(yīng)用領(lǐng)域均視為珍稀、名貴藥材，具有廣泛的藥用價(jià)值。
[0003] 野生烏靈參主要產(chǎn)于四川、云南、廣東等地，浙江、江西、江蘇也有生長(zhǎng)，烏靈參產(chǎn) 地以四川的灌縣、綦扛等地為上品。由于烏靈參生長(zhǎng)于地下2米一 20米的土棲白蟻廢棄的 蟻巢上，采掘非常困難，故自然資源極為稀少。烏靈參既是藥用真菌又是食用菌，有較高營(yíng) 養(yǎng)和藥用價(jià)值，是較理想的保健食（藥）品。
[0004] 烏靈參，性溫、味甘，具有補(bǔ)氣固腎、健脾除濕、鎮(zhèn)靜安神之功效，主治脾虛少食、產(chǎn) 后及術(shù)后失血過多、產(chǎn)后乳少、胃下垂、疝氣、心悸失眠、小兒驚風(fēng)及跌打損傷等。實(shí)驗(yàn)研究 表明，烏靈參的主要功效成分為多糖，其粗多糖不僅具有提高機(jī)體免疫功能和抗衰老作用， 而且經(jīng)中國(guó)醫(yī)科院藥物研究所對(duì)小鼠斷頭缺血喘息時(shí)間延長(zhǎng)影響測(cè)試表明，烏靈參粗多糖 有明顯的腦保護(hù)作用，并對(duì)電休克引起的記憶障礙也有保護(hù)作用。中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ) 所試驗(yàn)表明，烏靈參粗多糖可明顯抑制小鼠腦內(nèi)單胺氧化酶活性，從而提高中樞神經(jīng)遞質(zhì) 功能。
[0005] 由于烏靈參生長(zhǎng)于地下2米一 20米的土棲白蟻廢棄的蟻巢上，采掘非常困難，故 自然資源極為稀少。目前國(guó)內(nèi)只有少數(shù)院校展開深層液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)烏靈參的研究，都是以 獲得烏靈參的菌絲體為主要目標(biāo)展開研究的，而目前國(guó)內(nèi)關(guān)于液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)烏靈參的功效 成分多糖的相關(guān)報(bào)道很少。目前關(guān)于真菌類原料多糖的提取工藝多為傳統(tǒng)的水提醇沉法， 即向干燥后的菌絲體加入8-20倍重量的水，控制溫度80-100°C浸泡2-4h,靜止l-2h,然 后反復(fù)浸提2-3次，然后合并上清液進(jìn)行濃縮，再用50-85%的酒精進(jìn)行醇沉，最終烘干即 可得到粗多糖。此工藝的缺點(diǎn)是需加入大量水長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行浸提，并且為提高收率需反復(fù)浸 提2-3次，操作周期較長(zhǎng)、勞動(dòng)強(qiáng)度偏大，并且多糖的提取收率多在2-3%，產(chǎn)品成本比較昂 貴。并且分離的上清液作為廢液直接棄液排掉，增加了治污成本。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是為了解決傳統(tǒng)多糖的水提醇沉的技術(shù)瓶頸，采用此發(fā)明能夠快 速、高效生產(chǎn)出烏靈參多糖。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明主要按照下述步驟進(jìn)行：
[0008] -種烏靈參菌絲體多糖的提取方法，該方法包括下述步驟：
[0009] 1)分離：將烏靈參發(fā)酵液經(jīng)分離，得到烏靈參上清液和濕菌絲體；
[0010] 2)超聲處理：向步驟1)所得的濕菌絲體中加入步驟1)所得2-5倍的烏靈參上清 液進(jìn)行稀釋，攪拌均勻后進(jìn)行超聲處理10_40min，得到超聲處理液；上清液的添加主要是 作為水溶性溶液來進(jìn)行提取菌絲體中的多糖，添加量偏少，提取不完全，收率偏低，并且在 超聲過程中容易溫度偏高，影響設(shè)備使用；若添加過多，后期處理需消耗大量的能源，成本 偏1? ;
[0011] 3)復(fù)合酶解：將步驟2)所得超聲處理液調(diào)節(jié)pH值為4-7,控制溫度30-70°C，然 后向其加入干菌絲體重量〇. 2-3 %的纖維素酶、及干菌絲體重量0. 2-3 %的蛋白酶，酶解 l_3h，得到酶解液；
[0012] 4)分離、濃縮：將步驟3)所得的酶解液進(jìn)行分離，將分離所得到的上清液經(jīng)低溫 濃縮得到濃縮比重為1. 25?1. 40 (50°C熱測(cè)）的濃縮漿；
[0013] 5)醇沉、烘干：加入濃縮漿重量3-5倍量的95%酒精，用酒精計(jì)檢測(cè)混合液酒精度 為65-80% (v/v)，靜置2-8h，將沉淀物進(jìn)行真空烘干；烘干至干燥物水分含量為3?8%， 即得菌絲體多糖提取物。
[0014] 其中，步驟1)、4)所述的分離為離心分離，采用三足離心機(jī)或高速離心機(jī)等離心 設(shè)備進(jìn)行，轉(zhuǎn)速控制在1500_5000rpm。
[0015] 步驟2)超聲所用的設(shè)備為超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，其他同等超聲設(shè)備均可；超聲的功 率為 0. 5-2. 5kw。
[0016] 步驟3)所述的纖維素酶酶活為15000 μ /g?25000 μ /g，所述的蛋白酶的單位酶 活為 47000 μ /g ?53000 μ /g。
[0017] 步驟4)所述的低溫濃縮過程均要求控制溫度不高于75°C，真空度不低于 0.085Mpa〇
[0018] 步驟5)所述的真空烘干的溫度控制在50-75 °C，真空度不低于0. 085Mpa。
[0019] 本發(fā)明中醇沉次數(shù)越多，多糖的含量越高。真空烘干采用的真空干燥箱，本發(fā)明提 取的多糖含量在30-60%。
[0020] 本發(fā)明具有以下幾個(gè)突出的優(yōu)點(diǎn)：
[0021] 傳統(tǒng)的工藝是至少用菌絲體干重的20倍的純化水進(jìn)行稀釋，而本工藝采用上清 液進(jìn)行稀釋，并且添加量只為菌絲體干重的2-5倍；具有以下優(yōu)點(diǎn)：1、本發(fā)明利用上清液替 代純化水進(jìn)行稀釋，減少了廢液排放，減少了治污成本；2、因上清液中含部分胞外多糖，作 為溶液稀釋時(shí)，其中所含的多糖也可被回收利用。3、用上清液替代純化水，節(jié)約了純化水， 降低生產(chǎn)成本。
[0022] 本發(fā)明提取路線簡(jiǎn)潔，節(jié)約了大量的能源消耗：因減少了純化水的加入量，相應(yīng)的 在后期的分離、濃縮等工序減少了大量的電、蒸汽能源的消耗；
[0023] 縮短了操作周期，減少了勞動(dòng)強(qiáng)度：本發(fā)明改變了傳統(tǒng)的多次浸提，采用一次短時(shí) 間處理，是傳統(tǒng)處理時(shí)間的1/3-1/6,減輕了工人的勞動(dòng)強(qiáng)度。
[0024] 提高了提取收率：傳統(tǒng)的水提多糖的提取收率在2-3%，此發(fā)明用超聲和酶解加 劇了菌絲體胞內(nèi)產(chǎn)物的溶出度，本發(fā)明提取多糖收率在5-7%，比傳統(tǒng)工藝提升了 1倍多；
[0025] 提升了產(chǎn)品品質(zhì)：因本發(fā)明采用超聲和復(fù)合酶解處理菌絲體，將部分菌絲體的蛋 白降解成可溶性的小分子物質(zhì)，減少了在醇沉過程中雜質(zhì)蛋白的含量，提升了多糖的產(chǎn)品 品種，采用本發(fā)明提取多糖含量多在40%以上，比傳統(tǒng)工藝提升了 30%以上；
[0026] 采用本發(fā)明可根據(jù)市場(chǎng)需求和產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)，制得不同含量的高品質(zhì)的多糖，多糖含 量可在30-60%。

【具體實(shí)施方式】
[0027] 以下通過具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。但實(shí)施例的具體細(xì)節(jié)僅用于解釋本發(fā) 明，不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明總的技術(shù)方案的限定。本發(fā)明使用于普遍的烏靈參菌，其來源不受 實(shí)施例的限制，實(shí)施例中使用的菌種編碼CGMCC N0. 1038烏靈參菌僅是為了舉例說明本發(fā) 明的技術(shù)方案。
[0028] 實(shí)施例1
[0029] 本發(fā)明高效提取深層液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)烏靈參菌絲體多糖的方法按下述步驟進(jìn)行：
[0030] 1、烏靈參發(fā)酵液的制備：烏靈參菌種購(gòu)買于中科院微生物研究所（菌種編碼 CGMCCN0. 1038)。將活化好的烏靈參搖瓶菌株按接種量10% (v/v)接種于種子培養(yǎng)基 (10L)，其中種子培養(yǎng)基組成為葡萄糖2 %、蛋白胨0. 2 %、黃豆餅粉1 %、磷酸二氫鉀0. 3 %、 七水硫酸鎂0. 15%、硫酸鋅0. 10%、豆油0. 02%，調(diào)節(jié)pH值5. 5,通風(fēng)比為1 :0. 3vvm，罐壓 0.03Mpa，26?28°C振蕩培養(yǎng)4天即得烏靈參種子液；將種子液按接種量15% (v/v)接入 發(fā)酵培養(yǎng)基（50L)，其中發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖3 %、蛋白胨0. 3 %、黃豆餅粉1. 5 %、磷酸 二氫鉀0.2%、七水硫酸鎂0.2%、硫酸鋅0. 10%、豆油0.03%，調(diào)節(jié)pH值5.5 ;通風(fēng)比為1 : 0. 5vvm，罐壓0. 03Mpa，26?28°C培養(yǎng)4天，發(fā)酵至發(fā)酵液有特殊香味、菌球大量增加，濾液 渾濁；還原糖降至最低0. 3并略有波動(dòng)；鏡檢菌絲細(xì)碎，無雜菌污染，即得烏靈參發(fā)酵液。其 中上述培養(yǎng)基組成中的" ％ "均表示g/l〇〇ml。
[0031] 2、烏靈參發(fā)酵液分離：取上述烏靈參發(fā)酵液10Kg通過高速離心機(jī)3000rpm進(jìn)行分 離，得到烏靈參上清液液9. 25Kg和0. 75Kg的濕菌絲體（含水量為80% );
[0032] 3、超聲處理：向步驟2所得的0. 75Kg濕菌絲體中加入2. 25Kg的烏靈參上清液進(jìn) 行稀釋，攪拌均勻后進(jìn)行1. 5kw超聲處理20min，得到超聲處理液3Kg ;
[0033] 4、復(fù)合酶解：將步驟3所得超聲處理液調(diào)節(jié)pH值為5,在水浴控制溫度50°C，然 后向其緩慢加入纖維素酶2. 25g (購(gòu)自棗莊杰諾生物酶有限公司，單位酶活20000 μ /g，下 同）、蛋白酶2. 25g (購(gòu)自棗莊杰諾生物酶有限公司，單位酶活50000 μ /g，下同）并不斷攪 拌，攪拌均勻后計(jì)時(shí)進(jìn)行酶解2h，得到酶解液；
[0034] 5、分離、濃縮：將步驟4所得的酶解液用高速離心機(jī)5000rpm進(jìn)行分離，將分離所 得到的上清液2. 35Kg用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀低溫濃縮，濃縮過程均要求控制溫度不高于75°C，真空 度不低于〇. 〇85MPa，得到濃縮比重為1. 3(50°C熱測(cè)）的濃縮漿75g ;
[0035] 6、醇沉、烘干：向75g濃縮漿的中加入300ml的95%酒精，用酒精計(jì)檢測(cè)混合液酒 精度70% (v/v)，緩慢攪拌均勻后靜置2. 5h，將底部沉淀物分離用真空干燥箱進(jìn)行烘干，溫 度60°C，真空度0. 09MPa ;烘干lh得烏靈參菌絲體多糖提取物26g。檢測(cè)水分含量為3. 5%， 多糖含量為41%，折合純多糖提取收率為6. 83%。
[0036] 本發(fā)明中的多糖提取收率是按干菌粉計(jì)算的。即多糖提取收率=菌絲體多糖提取 物質(zhì)量*多糖含量/ [濕菌絲體質(zhì)量* (1-濕菌絲體含水量）]*100 %
[0037] 實(shí)施例2
[0038] 本發(fā)明高效提取深層液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)烏靈參菌絲體多糖的方法按下述步驟進(jìn)行：
[0039] 1、烏靈參發(fā)酵液的制備：烏靈參菌種購(gòu)買于中科院微生物研究所（菌種編碼
【權(quán)利要求】
1. 一種烏靈參菌絲體多糖的提取方法，其特征在于該方法包括下述步驟： 1) 分離：將烏靈參發(fā)酵液經(jīng)分離，得到烏靈參上清液和濕菌絲體； 2) 超聲處理：向步驟1)所得的濕菌絲體中加入步驟1)所得2-5倍的烏靈參上清液進(jìn) 行稀釋，攪拌均勻后進(jìn)行超聲處理10_40min，得到超聲處理液； 3) 復(fù)合酶解：將步驟2)所得超聲處理液調(diào)節(jié)pH值為4-7,控制溫度30-70°C，然后向 其加入干菌絲體重量〇. 2-3 %的纖維素酶、及干菌絲體重量0. 2-3 %的蛋白酶，酶解l-3h， 得到酶解液； 4) 分離、濃縮：將步驟3)所得的酶解液進(jìn)行分離，將分離所得到的上清液經(jīng)低溫濃縮 得到濃縮比重為1. 25?1. 40的濃縮漿； 5) 醇沉、烘干：加入濃縮漿重量3-5倍量的95%酒精，用酒精計(jì)檢測(cè)混合液酒精度為 65-80% (v/v)，靜置2-8h，將沉淀物進(jìn)行真空烘干；烘干至干燥物水分含量為3?8%，即 得菌絲體多糖提取物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的烏靈參菌絲體多糖的提取方法，其特征在于所述的分離為離 心分離，轉(zhuǎn)速控制在1500-5000rpm。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的烏靈參菌絲體多糖的提取方法，其特征在于所述的纖維素酶 酶活為15000 μ /g?25000 μ /g，所述的蛋白酶的單位酶活為47000 μ /g?53000 μ /g。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的烏靈參菌絲體多糖的提取方法，其特征在于步驟4)所述的低 溫濃縮過程均要求控制溫度不高于75°C，真空度不低于0. 085Mpa。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的烏靈參菌絲體多糖的提取方法，其特征在于步驟5)所述的真 空烘干的溫度控制在50-75°C，真空度不低于0. 085Mpa。
【文檔編號(hào)】C08B37/00GK104098712SQ201410337722
【公開日】2014年10月15日 申請(qǐng)日期:2014年7月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月15日
【發(fā)明者】王文風(fēng), 龔勁松, 徐國(guó)華, 徐玲, 王英燕, 楊亞威, 高巖, 張芙蓉 申請(qǐng)人:江蘇神華藥業(yè)有限公司