本發(fā)明涉及微生物及其微生物應(yīng)用領(lǐng)域。具體涉及一種絞股藍(lán)內(nèi)生真菌及其發(fā)酵液中含有多種天然活性物質(zhì)，可用于制取防治疾病藥物的用途。

背景技術(shù)：
絞股藍(lán)（Gynostemma）為葫蘆科多年生草質(zhì)藤本植物，主要含有皂苷元、多糖、黃酮類、有機(jī)酸、生物堿、萜類等多種生物活性物質(zhì)。其中皂甙的含量最高，其功能與西洋參相近，故又被稱為“南方人參”。研究表明，絞股藍(lán)具有抑制腫瘤、抗氧化、降血脂、降血壓、降血糖、增強(qiáng)免疫、保護(hù)心臟和肝臟、鎮(zhèn)靜止痛及抗炎、抗?jié)兊榷喾N藥理作用。內(nèi)生真菌（Endophyticfungi）是指生活在健康植株組織內(nèi)部的微生物。內(nèi)生菌在其與宿主植物長期協(xié)同進(jìn)化的過程中，形成了典型的互惠共生關(guān)系，不僅能促進(jìn)宿主植物生長，而且能誘導(dǎo)宿主植物細(xì)胞活性物質(zhì)的代謝，提高藥用植物的藥效和抗逆的能力。絞股藍(lán)作為常用多功效藥用植物，許多學(xué)者對(duì)其內(nèi)生真菌進(jìn)行研究。周生亮等（周生亮,等,2007）自絞股藍(lán)中分離出16株內(nèi)生真菌，具有抗菌性的內(nèi)生真菌占10%；魏希穎研究小組（尚菲,等,2011；ZhangQingmiao,etal.,2012）從絞股藍(lán)中分離出產(chǎn)皂苷的內(nèi)生真菌G4、G10株，具有強(qiáng)的抗氧化活性，經(jīng)形態(tài)和分子學(xué)初步鑒定為柔膜菌目(Helotiales)。因而，絞股藍(lán)中含有大量產(chǎn)生多種天然藥性物質(zhì)的內(nèi)生真菌。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種絞股藍(lán)內(nèi)生真菌（Chaetomiumsp.），除了能夠產(chǎn)生類似絞股藍(lán)植物的多種生物活性物質(zhì)多糖和黃酮外，還產(chǎn)生皂苷、有機(jī)酸、醌類等物質(zhì)，具有抗氧化、降低血糖、抗癌、抗菌等作用。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于對(duì)上述絞股藍(lán)內(nèi)生真菌發(fā)酵液中多種天然活性物質(zhì)的分離提取，以制備具有抗腫瘤、抗氧化、抗糖尿病、抗衰老、減肥、抗慢性炎癥、增強(qiáng)免疫力等功效藥物的應(yīng)用。本發(fā)明的絞股藍(lán)內(nèi)生真菌命名為毛殼菌（Chaetomiumsp.），保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院中國科學(xué)院微生物研究所，保藏日期：2012年11月26日，保藏登記號(hào)為CGMCCNO：6882。本發(fā)明所述的絞股藍(lán)內(nèi)生真菌命名為JY25，為子囊菌亞門[Ascomycotina]，核菌綱[Pyrenomycetes]，球殼目[Sphaeriales]，黑孢殼科[Melanosporaceae]，毛殼菌屬[Chaetomiumsp]。該菌株在PDA和察氏固體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)5~7d，菌落直徑分別為2.5mm、4.3mm，早期菌落呈白色平鋪，氣生菌絲少；隨著時(shí)間的延長，氣生菌絲增長旺盛呈絮狀，逐漸呈現(xiàn)出黃褐色，7d后表面形成大量沙狀孢子，菌落邊緣不整齊（附圖1A），背面呈棕褐色（附圖1B）。顯微鏡下觀察，菌絲有隔膜、透明、交織（附圖2A），子囊殼球形、卵形，頂端有一孔口，子囊殼初期半透明，后期呈暗色（附圖2B）。本發(fā)明所述的絞股藍(lán)內(nèi)生真菌PDA液體培養(yǎng)的特征為。1、培養(yǎng)條件：在液體PDA中添加1%的絞股藍(lán)汁提取液，以28℃160rpm搖床培養(yǎng)9d，其中，發(fā)酵初始pH5，種子液接種量為3%，裝液量為100mL/250mL搖瓶，產(chǎn)生的抗菌特性最佳。2、發(fā)酵液特性：培養(yǎng)1-3d，培養(yǎng)液較清亮，顏色淡黃，有零星菌絲白點(diǎn)；培養(yǎng)4-6d，培養(yǎng)液逐漸變稠，呈深黃色，菌絲球逐漸增多；培養(yǎng)7-9d，培養(yǎng)液呈深棕色、粘稠，不能分辨出菌絲。采用分子生物學(xué)方法，對(duì)真核生物核糖體RNA(rRNA)的ITS序列分析得出絞股藍(lán)內(nèi)生真菌JY25的ITS序列長度為599bp，在GenBank中登錄號(hào)為：JN180937.1（附圖3）。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的絞股藍(lán)內(nèi)生真菌發(fā)酵液含有多糖、黃酮、有機(jī)酸、醌類、皂苷元等天然活性物質(zhì)。其中，發(fā)酵液多糖提取液對(duì)肺癌細(xì)胞A549的半數(shù)致死濃度IC50為0.088mg/mL，總抗氧化能力為14.101±1.166U/mL，高于VC對(duì)照組（12.991±1.172U/mL）。絞股藍(lán)內(nèi)生真菌中的抗菌成分對(duì)G+和G-致病菌都有抑菌作用，主要通過破壞菌體完整性、損傷細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)（附圖4絞股藍(lán)內(nèi)生真菌抗致病菌的電鏡圖片），圖4-1為發(fā)酵液MIC濃度作用下金黃色葡萄球菌表面形態(tài)變化(10000倍)，其中A為作用2h的細(xì)菌形態(tài)；B為作用4h的細(xì)菌形態(tài)；C為作用8h的細(xì)菌形態(tài)。圖4-2為發(fā)酵液MIC濃度作用下大腸桿菌表面形態(tài)變化(10000倍)，其中A為作用4h的細(xì)菌形態(tài)；B為作用6h的細(xì)菌形態(tài)；C為作用8h的細(xì)菌形態(tài)。細(xì)胞膜的破裂造成菌體內(nèi)物質(zhì)流失，并影響菌體蛋白的合成和結(jié)構(gòu)，從而在對(duì)數(shù)生長期抑制細(xì)菌增殖。以絞股藍(lán)內(nèi)生真菌發(fā)酵液為糖尿病治療藥物，灌服糖尿病模型小鼠，明顯降低了小鼠空腹和餐后血糖。附圖說明圖1絞股藍(lán)內(nèi)生真菌的菌落形態(tài)注：A為正面，B為背面。氣生菌絲增長旺盛呈絮狀，菌落表面呈現(xiàn)黃褐色，表面有大量沙狀孢子，菌落邊緣不整齊，背面呈棕褐色。圖2絞股藍(lán)內(nèi)生真菌菌絲和孢子形態(tài)（400倍）注：菌絲有隔膜、透明、交織，子囊殼球形、卵形，頂端有一孔口，子囊殼初期半透明，后期呈暗色。圖3絞股藍(lán)內(nèi)生真菌rRNA的ITS序列（GenBank登錄號(hào)：JN180937.1）注：GenBank登錄號(hào)：JN180937.1ITS片段長599bp。圖4絞股藍(lán)內(nèi)生真菌抗致病菌的電鏡圖片(10000倍)圖4-1發(fā)酵液MIC濃度作用下金黃色葡萄球菌表面形態(tài)變化(10000倍)注：A.作用2h的形態(tài)；B.作用4h的形態(tài)；C.作用8h的形態(tài)。圖4-2發(fā)酵液MIC濃度作用下大腸桿菌表面形態(tài)變化(10000倍)注：A：作用4h的形態(tài)；B：作用6h的形態(tài)；C.作用8h的形態(tài)。圖5絞股藍(lán)內(nèi)生真菌多糖及絞股藍(lán)浸提液對(duì)肺癌A549細(xì)胞生長的影響（400倍）注：A：濃度為5mg/mL的絞股藍(lán)內(nèi)生真菌發(fā)酵液多糖，B：濃度為5mg/mL的絞股藍(lán)浸提液多糖；a：濃度為1mg/mL的絞股藍(lán)內(nèi)生真菌發(fā)酵液多糖，b：濃度為1mg/mL的絞股藍(lán)浸提液多糖。實(shí)施例1絞股藍(lán)內(nèi)生真菌的分離培養(yǎng)75%的酒精溶液：取純酒精75mL加入25mL的蒸餾水配制而成。4.5%的次氯酸鈉溶液：取含有效氯13%的次氯酸鈉溶液34.6mL加65.4mL蒸餾水制成。PDA雙抗固體培養(yǎng)基：200g新鮮馬鈴薯去皮，切成1cm3小塊，加水（少于1000mL）煮沸30min后，四層紗布過濾，收集濾液，加入20g葡萄糖、20g瓊脂，補(bǔ)充水至1000mL，自然pH，121℃滅菌30min，待其冷卻到60℃左右時(shí)，加入硫酸鏈霉素150μg/mL和青霉素鈉120μg/mL，倒入培養(yǎng)皿中制成。自河南省信陽農(nóng)科所采集野生的絞股藍(lán)新鮮植株。將根、莖、葉分別用水沖洗干凈，在超凈工作臺(tái)里，將根、莖剪成0.5cm小段，葉剪成0.5×0.5cm的碎片，以75%酒精消毒60~90s，再以4.5%次氯酸鈉消毒5min，無菌水沖洗，用濾紙吸干水分，置于馬鈴薯雙抗固體培養(yǎng)基中，28℃恒溫培養(yǎng)約5~7d，同時(shí)檢測(cè)表面消毒效果。待平板上長出菌絲后，挑取其尖端部分移至新的PDA培養(yǎng)基上，進(jìn)行三點(diǎn)接種純化培養(yǎng)，經(jīng)反復(fù)幾次純化后，得到絞股藍(lán)內(nèi)生真菌。實(shí)施例2最佳抗菌特性發(fā)酵液的制備0.25g/mL絞股藍(lán)汁浸提液：取10g絞股藍(lán)粉末加入40mL的蒸餾水，調(diào)pH8.0～9.0，85～95℃，攪拌浸提5～10min，1000rpm離心10min，取上清液即得。孢子懸液的制備：取絞股藍(lán)內(nèi)生真菌編號(hào)為JY25的菌株，接種于PDA固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)7d，用微量移液器移取1mL無菌水沖洗真菌孢子，裝入有玻璃珠的無菌水三角瓶中，充分振蕩制成孢子懸液，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并調(diào)整孢子懸液濃度約為1×107CFU/mL。PDA液體培養(yǎng)基：為不加瓊脂的PDA雙抗培養(yǎng)基。將絞股藍(lán)內(nèi)生真菌的孢子懸液以3%的接種量加入含有1%的絞股藍(lán)汁浸提液的PDA液體培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)培養(yǎng)液初始pH為5.0，裝液量為100mL/250mL搖瓶，28℃160rpm搖床培養(yǎng)9d，獲得的發(fā)酵液抗菌特性最佳。實(shí)施例3絞股藍(lán)內(nèi)生真菌粗多糖抗癌活性的測(cè)定10%血清的RPMI1640培養(yǎng)液：在RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入終濃度為10%的胎牛血清，用0.22μm濾膜過濾后分裝，4℃保存待用。5mg/mLMTT：避光取MTT100mg加入20mLPBS中，用0.22μm濾膜過濾后分裝，-20℃保存待用。取對(duì)數(shù)生長期的肺癌細(xì)胞A549，用10%血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至5.0×104個(gè)/mL，將其接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100μL，于37℃CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。用不含血清的RPMI1640培養(yǎng)液稀釋絞股藍(lán)內(nèi)生真菌發(fā)酵液粗多糖至1.0、0.5、0.25、0.125、0.063mg/mL，棄去96孔板中培養(yǎng)液，加100μL不同多糖濃度的RPMI1640培養(yǎng)液，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)重復(fù)，設(shè)絞股藍(lán)浸提液多糖為對(duì)照，培養(yǎng)48h，。取20μL的5mg/mLMTT溶液加入到各孔中，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，小心吸棄培養(yǎng)液，加入100μL的DMSO震蕩10min，用酶標(biāo)儀測(cè)定490nm下各孔的吸光值（OD490），取平均吸光值按公式計(jì)算不同濃度的粗多糖對(duì)肺癌A549腫瘤細(xì)胞生長的半數(shù)致死濃度IC50（mg/mL）。其中：Xm：lg最大劑量；I：lg(最大劑量/相臨劑量)；P：陽性反應(yīng)率之和；Pm：最大陽性反應(yīng)率；Pn：最小陽性反應(yīng)率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，JY25發(fā)酵液多糖提取液在0.1mg/mL的濃度下對(duì)肺癌細(xì)胞A549有50%以上的抑制率（見附圖5絞股藍(lán)內(nèi)生真菌多糖及絞股藍(lán)浸提液多糖對(duì)肺癌A549細(xì)胞生長的影響。其中A為絞股藍(lán)內(nèi)生真菌發(fā)酵液多糖，濃度為5mg/mL，a為絞股藍(lán)內(nèi)生真菌發(fā)酵液多糖，濃度為1mg/mL；B為絞股藍(lán)浸提液多糖，濃度為5mg/mL；b為絞股藍(lán)浸提液多糖，濃度為1mg/mL），其半數(shù)致死濃度IC50為0.088mg/mL，而絞股藍(lán)浸提液多糖在0.5mg/mL濃度下對(duì)肺癌細(xì)胞A549有50%以上的抑制率，由此可見絞股藍(lán)內(nèi)生真菌發(fā)酵液多糖的抗癌效果要遠(yuǎn)高于其宿主植物絞股藍(lán)。實(shí)施例4抗糖尿病活性的測(cè)定自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購買6~8周齡的SPF雄性昆白小鼠15只，飼養(yǎng)3天適應(yīng)環(huán)境后，隨機(jī)分成3組：對(duì)照組----正常小鼠；病模組----糖尿病模型組；治療組----以絞股藍(lán)內(nèi)生真菌發(fā)酵液作為藥物治療糖尿病。新鮮配制0.2%鏈脲菌素（STZ）溶液：稱取0.5gSTZ，溶于新鮮配制的25mL0.1mol/L檸檬酸緩沖液（pH4.4）中，放置冰上，盡快使用。糖尿病模型的制備：小鼠在制模前禁食12h以上，測(cè)定空腹血糖。以100mg/kg（體重）劑量腹腔注射0.2%STZ溶液，對(duì)照組腹腔注射同樣劑量的檸檬酸鹽緩沖液。注射4天后，每天早上固定時(shí)間測(cè)定小鼠的空腹血糖，當(dāng)連續(xù)3天的血糖高于16.7mmol/L時(shí)，判定為糖尿病模型成立。病模成立后，每隔1天，給對(duì)照組正常小鼠和治療組糖尿病小鼠灌服0.3mL的絞股藍(lán)內(nèi)生真菌發(fā)酵液，病模組灌服生理鹽水，灌服發(fā)酵液15次后，開始測(cè)定各組的空腹血糖和餐后血糖，以連續(xù)3天的血糖值計(jì)算平均值，觀察防治效果。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，經(jīng)過15次的治療，正常組小鼠的空腹血糖仍然在正常范圍內(nèi)（6.8±0.2mmol/L），治療組小鼠的空腹血糖（18.4±0.5mmol/L）比糖尿病模型小鼠的血糖（30.1±0.7mmol/L）降低38.9%。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是發(fā)明的一些具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多其他的變形和用途。本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容中直接引出或啟發(fā)所產(chǎn)生的所有用途，均認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。