一種絲狀真菌發(fā)酵專用淀粉衍生物的制備及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種絲狀真菌發(fā)酵專用淀粉衍生物的制備及應(yīng)用。具體而言，本發(fā)明涉及DE值為0.1-3，粘度為1-100cp的淀粉衍生物、其制備方法，以及使用這些淀粉衍生物來(lái)發(fā)酵絲狀真菌、控制絲狀真菌發(fā)酵時(shí)的形態(tài)，以及含有所述淀粉的絲狀真菌發(fā)酵用培養(yǎng)基。本發(fā)明的淀粉衍生物粘度低，即使高溫滅菌后粘度也不會(huì)明顯增加，在與發(fā)酵培養(yǎng)基混合滅菌后，形成細(xì)微的顆粒，有利于形成游離的菌絲體。
【專利說(shuō)明】一種絲狀真菌發(fā)酵專用淀粉衍生物的制備及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及絲狀真菌發(fā)酵專用淀粉衍生物的制備及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]絲狀真菌在液體深層發(fā)酵過(guò)程中，通常會(huì)形成三種形態(tài)，即:致密菌絲球，疏松菌絲團(tuán)及游離菌絲體，其中菌絲球及游離菌絲對(duì)目的產(chǎn)物的影響研究比較多，適宜的菌絲形態(tài)可大幅提高其目的產(chǎn)物量(Kaup et al., 2007 ；Petzoldt, 1971 ；Zhang et al., 2007 ；Znidarsic和Pavko, 2001)。例如，致密菌絲球有利于衣康酸(Metz, 1976)、梓檬酸發(fā)酵(Gomez et al.，1988),而游離菌絲體適宜于外源蛋白表達(dá)及分泌(Papagianni和Mattey, 2006)，如a_淀粉酶、植酸酶和β _呋喃果糖苷酶(Teng et al.，2009)，以及青霉素的發(fā)酵(Vecht-Lifshitz et al.，1990)。因此,發(fā)酵過(guò)程中控制菌絲的形態(tài)對(duì)目的產(chǎn)物的發(fā)酵非常關(guān)鍵。
[0003]目前，控制發(fā)酵過(guò)程中菌絲形態(tài)的方法主要有調(diào)節(jié)接種量，攪拌速率或?qū)H降為 2-3 (Booking et al., 1999 ；Mcintyre et al., 2001 ；Niel sen, 1996 ；Papagianni andMattey, 2006);或者加分散劑如滑石粉，氧化鋁等(Kaup et al.，2007);誘變育種改變菌絲形態(tài)(DeNicolas-Santiago et al., 2006 ；ffang et al.，2005)等方法。但實(shí)際上很多方法并不十分有效，比如，在極端pH(2-3)條件下，很多酶不穩(wěn)定，甚至失活，并且有的絲狀真菌本身在此PH條件下就生長(zhǎng)很差，甚至無(wú)法生長(zhǎng)，因此也無(wú)法表達(dá)蛋白；過(guò)高的攪拌轉(zhuǎn)數(shù)不僅增加能耗，且易打 斷菌絲，過(guò)多菌絲片段不僅影響產(chǎn)酶，且易造成發(fā)酵液粘度過(guò)高，造成溶氧不足。此外，添加滑石粉等方法也只適合個(gè)別絲狀真菌，至于誘變育種獲得游離菌絲體的方法更是工作量巨大，幾率極低。
[0004]其次，在以淀粉為碳源的微生物發(fā)酵過(guò)程中，因淀粉糊化后粘度較大，不論在初始培養(yǎng)基中的添加量還是在流加過(guò)程中，淀粉的添加濃度都很低(濃度2%普通淀粉糊化后粘度已較高)，粘度較高會(huì)造成流加體積很大或碳源過(guò)低，從而不利于發(fā)酵，目前通常的解決方法都是添加淀粉酶或先將淀粉液化，不僅增加工藝步驟，而且增加成本。
[0005]本發(fā)明基于制備可溶性淀粉的過(guò)程中，獲得一種粘度動(dòng)力學(xué)曲線變化甚微的淀粉衍生物，將其用于絲狀真菌發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶，發(fā)現(xiàn)以該淀粉衍生物配置的培養(yǎng)基(淀粉衍生物濃度為6-40%)流動(dòng)性很好，發(fā)酵液粘度相對(duì)比較低，且發(fā)酵過(guò)程中菌體形態(tài)始終保持游離狀的菌絲體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明人經(jīng)過(guò)深入地研究，首次發(fā)現(xiàn)具有一定DE值、粒徑中間值和粘度的淀粉衍生物特別適合用于絲狀真菌發(fā)酵。具體而言，本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)，DE值為0.1-3和粘度為1-1OOcp的淀粉衍生物(更優(yōu)選地，粒徑中間值為1-30 μ m)，在高溫滅菌后不會(huì)因淀粉糊化而形成很高的粘度，即使該淀粉衍生物濃度高達(dá)400g/L的溶液中，高溫滅菌冷卻后，也不會(huì)形成很強(qiáng)的凝膠，流動(dòng)性很好。這類淀粉衍生物不僅利于提高初始培養(yǎng)基中淀粉含量，且也可采用較高淀粉濃度流加發(fā)酵。將其與發(fā)酵培養(yǎng)基混合滅菌時(shí)，由于培養(yǎng)基中各種離子的存在，該混合物滅菌后，會(huì)形成細(xì)小的微粒，該微粒在絲狀真菌孢子萌發(fā)時(shí)起到分散作用，使絲狀真菌在發(fā)酵過(guò)程中始終以游離分散的菌絲體存在，有利于提高外源蛋白的表達(dá)量，由此而完成本發(fā)明。
[0007]因此，本發(fā)明提供一種使用絲狀真菌進(jìn)行發(fā)酵的方法，所述方法包括使用含有淀粉衍生物的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，其中，所述淀粉衍生物DE值為0.1-3，粘度為1-lOOcp。
[0008]本發(fā)明還提供一種控制絲狀真菌發(fā)酵時(shí)的形態(tài)的方法，所述方法包括使用含有淀粉衍生物的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，從而控制絲狀真菌在發(fā)酵時(shí)以游離菌絲體形態(tài)存在，其中，所述淀粉衍生物DE值為0.1-3，粘度為1-1OOcp。
[0009]本發(fā)明還提供DE值為0.1-3和粘度為1-1OOcp的淀粉衍生物在絲狀真菌發(fā)酵中的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明還提供DE值為0.1-3和粘度為1-1OOcp的淀粉衍生物在制備絲狀真菌發(fā)
酵用的培養(yǎng)基中的應(yīng)用。
[0011 ] 在上述方法和應(yīng)用的實(shí)施例中，所述淀粉衍生物的粒徑中間值為1-30 μ m。
[0012]在上述方法和應(yīng)用的實(shí)施例中，所述絲狀真菌選自:黑曲霉、米曲霉、米黑根毛霉、李氏木霉、雪白根霉、華根霉、少根根霉和唐德鏈霉菌。 [0013]在上述方法和應(yīng)用的實(shí)施例中，所述淀粉衍生物是玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、木薯淀粉、小麥淀粉、甘薯淀粉、高粱淀粉或豆類淀粉的淀粉衍生物，或是這些淀粉衍生物的混合物。
[0014]在上述方法和應(yīng)用的實(shí)施例中，所述培養(yǎng)基含有2~40wt %的所述淀粉衍生物。
[0015]在上述方法和應(yīng)用的實(shí)施例中，所述培養(yǎng)基含有5~25wt %的所述淀粉衍生物。
[0016]在上述方法和應(yīng)用的實(shí)施例中，所述培養(yǎng)基含有葡萄糖、磷酸二氫鈉、硫酸銨、檸檬酸鈉、NaNO3、MgSO4.7H20、CaCl2、胰蛋白胨和/或酵母提取物。
[0017]本發(fā)明還一種制備絲狀真菌發(fā)酵用淀粉衍生物的方法，其特征在于，所述方法包括:采用酸化法或酶解法處理選自玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、木薯淀粉、小麥淀粉、甘薯淀粉、高粱淀粉、豆類淀粉或其任意混合物的普通淀粉直至獲得DE值為0.1-3、粘度為1-1OOcp的淀粉衍生物，從而獲得所述絲狀真菌發(fā)酵用淀粉衍生物。
[0018]在一具體實(shí)施例中，所述酸化法包括:
[0019]( I)配制普通淀粉與水的重量比為1:0.8 — 1:3的混合液；
[0020](2)加入占該所述水的體積0.5%- 10%的稀酸；和
[0021](3)將步驟(2)所得混合液在110-130°C、0.05MPa-0.12MPa處理2 — 20分鐘后終止反應(yīng)，將PH調(diào)節(jié)至中性，洗滌，干燥，從而獲得所述淀粉衍生物。
[0022]在一具體實(shí)施例中，所述酸化法包括:
[0023](I)配制普通淀粉與水的重量比為3:1.5 — 3:0.8的混合液；
[0024](2)加入其體積與水的體積比為1:3到1:1的稀酸；
[0025](3)在40_50°C、常壓下反應(yīng)25_30小時(shí)后，終止反應(yīng)，將pH調(diào)節(jié)至中性，洗滌，干燥，從而獲得所述淀粉衍生物。
[0026]在一具體實(shí)施例中，酸化法中使用到的稀酸濃度通常為3.0-4.0%。[0027]在另一實(shí)施例中，酸化法中使用到的是稀鹽酸，其濃度為3.4-3.6%。
[0028]在一具體實(shí)施例中，采用上述酸化法或酶解法制備得到的淀粉衍生物，若其粒徑中間值不在1-30 μ m的范圍內(nèi)，可采用本領(lǐng)域常規(guī)的技術(shù)手段，例如研磨或粉碎，對(duì)其進(jìn)行處理，以獲得粒徑中間值在1-30 μ m范圍內(nèi)的淀粉衍生物。
[0029]本發(fā)明也包括采用本文所述的制備絲狀真菌發(fā)酵用淀粉衍生物的方法制備得到的淀粉衍生物。
[0030]本發(fā)明的淀粉衍生物的DE值為0.1-3，粘度為1-1OOcp。
[0031]在一優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明的淀粉衍生物的粒徑中間值為1-30 μ m。
[0032]在一優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明的淀粉衍生物的粘度為l_50cp。
[0033]在一優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明的淀粉衍生物的粘度為5_30cp。
[0034]在一具體實(shí)施例中，所述淀粉衍生物是玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、木薯淀粉、小麥淀粉、甘薯淀粉、高粱淀粉或豆類淀粉的淀粉衍生物，或是這些淀粉衍生物的混合物。
[0035]本發(fā)明還提供一種絲狀真菌發(fā)酵用培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基含有本發(fā)明的淀粉衍生物。
[0036]在一具體實(shí)施 例中，所述培養(yǎng)基含有占培養(yǎng)基總重2~40被％的所述淀粉衍生物。
[0037]在一具體實(shí)施例中，所述培養(yǎng)基含有占培養(yǎng)基總重5~25被％的所述淀粉衍生物。
[0038]在一具體實(shí)施例中，所述培養(yǎng)基還含有葡萄糖、磷酸二氫鈉、硫酸銨、檸檬酸鈉、NaN03、MgSO4.7H20、CaCl2、胰蛋白胨和酵母提取物等。
[0039]在一具體實(shí)施例中，含有本發(fā)明所述淀粉衍生物的培養(yǎng)基在滅菌后，形成細(xì)小的、肉眼可見(jiàn)的微粒。通常，微粒直徑在例如0.3cm以下。
[0040]本發(fā)明的淀粉衍生物具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0041]1.該淀粉衍生物粘度低，即使高溫滅菌后粘度也不會(huì)明顯增加，因此，有利于提高初始碳源濃度及過(guò)程中淀粉的流加濃度，提高發(fā)酵產(chǎn)量及減少成本；
[0042]2.該淀粉衍生物與發(fā)酵培養(yǎng)基混合滅菌后，形成細(xì)微的顆粒，有利于形成游離的菌絲體，有利于外源蛋白分泌，從而提供目的產(chǎn)物量。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0043]圖1顯示市售6%普通玉米淀粉水溶溫度及動(dòng)力粘度曲線。
[0044]圖2顯示市售6%普通馬鈴薯淀粉水溶溫度及動(dòng)力粘度曲線。
[0045]圖3顯示實(shí)施例1制備的淀粉衍生物(6%)水溶液的溫度及動(dòng)力粘度曲線。
[0046]圖4顯示實(shí)施例1制備的淀粉衍生物(20%)水溶液的溫度及動(dòng)力粘度曲線。
[0047]圖5顯示實(shí)施例1制備的淀粉衍生物(40%)水溶液的溫度及動(dòng)力粘度曲線。
[0048]圖6顯示實(shí)施例4制備的淀粉衍生物(20%)水溶液的溫度及動(dòng)力粘度曲線。
[0049]圖7顯示實(shí)施例5制備的淀粉衍生物(20%)水溶液的溫度及動(dòng)力粘度曲線。
[0050]圖8顯示實(shí)施例6制備的淀粉衍生物(20%)水溶液的溫度及動(dòng)力粘度曲線。
[0051]圖9顯示市售20%可溶性淀粉水溶液溫度及動(dòng)力粘度曲線。
[0052]圖10顯示市售玉米淀粉粒徑曲線圖。[0053]圖11顯示實(shí)施例2制備的DE值為0.92的玉米淀粉衍生物粒徑曲線圖。
[0054]圖12顯示實(shí)施例6制備的DE值為1.99的馬鈴薯淀粉衍生物粒徑曲線圖。
[0055]圖13顯示市售馬鈴薯淀粉粒徑曲線圖。
[0056]圖14顯示實(shí)施例5制備的DE值為0.23的馬鈴薯淀粉衍生物粒徑曲線圖。
[0057]圖15顯示發(fā)酵培養(yǎng)基中形成細(xì)微顆粒。
[0058]圖16顯示發(fā)酵過(guò)程中游離菌絲形態(tài)。
[0059]圖17顯示發(fā)酵過(guò)程中形成的菌絲球【具體實(shí)施方式】。
[0060]圖18顯示使用對(duì)照淀粉衍生物配制的培養(yǎng)基中存在大結(jié)塊。
【具體實(shí)施方式】
[0061]可采用酸化法和酶解法來(lái)制備本發(fā)明的淀粉衍生物。制備方法可基本上與本領(lǐng)域常規(guī)的酸化法和酶解法相同，但需要例如通過(guò)改變相應(yīng)的反應(yīng)條件(例如反應(yīng)時(shí)間)，以獲得具有本發(fā)明所限定DE值 的本發(fā)明淀粉衍生物。
[0062]本文所述酸化法，指用稀酸處理普通淀粉以制備本發(fā)明淀粉衍生物的方法。
[0063]例如，可參照段春紅等(“干法制備黃糊精工藝的研究”，《食品與發(fā)酵工業(yè)》，2005年第31卷第9期(總第213期)，第39-41頁(yè))，稱取一定量的普通淀粉加到蒸餾水中，加入稀的酸攪拌，然后高壓滅菌一段時(shí)間，直至所產(chǎn)生的淀粉衍生物的DE值滿足本發(fā)明的要求，然后用堿中和至中性后洗滌，烘干即可獲得用于本發(fā)明的淀粉衍生物。
[0064]具體而言，本發(fā)明酸化法的一個(gè)方案是，配制普通淀粉與水的重量比為1:0.8-1:3的混合液，攪拌均勻后加入占所述水體積0.5% -10% (例如0.5-5%)的稀酸(例如濃度為3.0-4.0 %的稀酸，例如可以是濃度為3.4-3.6%的稀鹽酸)，攪拌后在110_130°C、
0.05MPa-0.12MPa (例如0.105MPa)的壓力下處理2_20分鐘，測(cè)得溶液中還原糖含量為
0.1-3 %之后，終止反應(yīng)，將pH調(diào)節(jié)至中性(例如，可使飽和的堿溶液，如飽和的NaOH溶液)，洗滌(可用適量的無(wú)水乙醇洗滌)后烘干即可獲得本發(fā)明的淀粉衍生物。通常，反應(yīng)體系中的水含量占整個(gè)反應(yīng)體系的50-70wt%。
[0065]在一個(gè)具體實(shí)施例中，以每40g左右的普通淀粉為例，稱取40g左右的普通淀粉緩慢加入裝有49ml蒸餾水的敞口燒杯中，輕輕攪拌，同時(shí)加入0.5ml-2ml,3.4-3.6%的稀鹽酸溶液，攪拌4-6min。放入高壓滅菌鍋內(nèi)，在121°C 0.105MPa處理2_20min。測(cè)得采用菲林試劑法檢測(cè)溶液中還原糖含量為1_3%。反應(yīng)結(jié)束后用飽和NaOH溶液中和至中性。用50-100mL無(wú)水乙醇洗滌，混合后放入培養(yǎng)皿平鋪，60°C烘干過(guò)夜，粉碎，獲得本發(fā)明的絲狀真菌發(fā)酵專用淀粉衍生物。
[0066]或者，可參照謝麗娟等(“木薯淀粉酸水解制可溶性淀粉”，《廣西化工》，第24卷1995年第3期，第38-41頁(yè))，稱取一定量的普通淀粉加入蒸餾水中，加入稀的酸后在約40~50°C之間攪拌，直至所產(chǎn)生的淀粉衍生物的DE值滿足本發(fā)明的要求，然后用堿中和至中性后洗滌，烘干即可獲得用于本發(fā)明的淀粉衍生物。
[0067]具體而言，配制普通淀粉與水的重量比為3:1.5-3:0.8的混合液，加入其體積與水的體積比為1:3到1:1的稀酸(例如濃度為3.0-4.0%的稀酸，例如可以是濃度為
3.4-3.6%的稀鹽酸)，在40-50°C、常壓下反應(yīng)25-30小時(shí)后(中途可不斷補(bǔ)充水，以維持溶液總體積基本不變)，終止反應(yīng)，將PH調(diào)節(jié)至中性(例如，可使飽和的堿溶液，如飽和的NaOH溶液)，洗滌(可用適量的無(wú)水乙醇洗滌)后烘干即可獲得本發(fā)明的淀粉衍生物。通常，反應(yīng)體系中的水含量占整個(gè)反應(yīng)體系的60-80wt%。
[0068]在一具體實(shí)施例中，以每125g左右的普通淀粉為例，稱取125g左右的普通淀粉緩慢加入裝有49ml蒸餾水的敞口燒杯中，輕輕攪拌，同時(shí)加入20-50ml，3.4-3.6%的稀鹽酸溶液，加水補(bǔ)足500ml，45°C攪拌25_30h，中途不斷補(bǔ)充水，保持總體積為500mL，反應(yīng)結(jié)束后用飽和NaOH溶液中和至中性。采用菲林試劑法檢測(cè)溶液中還原糖含量為1-3%。用50-100mL無(wú)水乙醇洗滌，混合后放入培養(yǎng)皿平鋪，60°C烘干過(guò)夜，粉碎，獲得本發(fā)明的絲狀真菌發(fā)酵專用淀粉衍生物。
[0069]本文所述酶解法，指用相應(yīng)的酶來(lái)處理普通淀粉，直至所產(chǎn)生的淀粉衍生物具有本發(fā)明所述的DE值。
[0070]例如，酶解法制備淀粉衍生物的方法可包括稱取一定量的淀粉，加入到蒸餾水中，然后加入適量相應(yīng)的酶進(jìn)行酶解，直至所產(chǎn)生的淀粉衍生物具有本發(fā)明所述的DE值。反應(yīng)結(jié)束后加入堿中和至中性，洗滌后烘干，可獲得本發(fā)明絲狀真菌發(fā)酵專用淀粉衍生物。
[0071]可根據(jù)不同的淀粉使用不同酶，這在本領(lǐng)域技術(shù)人員所掌握的知識(shí)范圍之內(nèi)。作為例子，適用于本發(fā)明的酶包括但不限于α-淀粉酶，淀粉酶，淀粉葡萄糖苷酶，解枝酶，環(huán)狀麥芽糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶等。
[0072]適用于本發(fā)明的淀粉衍生物可由各種普通淀粉經(jīng)由前述酸化法或酶解法獲得，這些普通淀粉包括但不限于玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、木薯淀粉、小麥淀粉、甘薯淀粉、高粱淀粉、豆類淀粉等。
[0073]適用于本發(fā)明的 淀粉衍生物優(yōu)選DE值(還原糖％)在大于O到小于等于3的范圍之內(nèi)。優(yōu)選在0.1-3的范圍之內(nèi)，更優(yōu)選在0.1-2.5、0.2-2.0、0.5-2.0不等的范圍之內(nèi)?？刹捎帽绢I(lǐng)域常規(guī)的方法測(cè)試淀粉衍生物的DE值。
[0074]作為一示例性例子，可采用如下所述的還原糖測(cè)定方法來(lái)測(cè)定DE值，所述方法包括:依次往250ml三角瓶中加入Iml樣品+A液10ml+B液10ml+29ml蒸餾水；煮沸，沸騰2min后取出冷卻；加入C液10ml+D液10ml，搖勻；用E液滴定，至溶液呈淡黃色，加入1-2滴可溶性淀粉(F液)；繼續(xù)用E液滴定，至藍(lán)黑色消失，記錄E液消耗體積Vs。
[0075]計(jì)算方法:還原糖％ (DE) =(Vo-Vs)/ (Vo-Vfe) X 2%
[0076]Vo:空白樣消耗滴定液體積；Vs:樣品消耗滴定液體積
[0077]Vfe:2%葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液消耗滴定液體積
[0078]該方法所用的各種試劑組成及配制方法分別如下所示:
[0079]A 液，CuSO4.5H20692g — IOL
[0080]B 液，KNaC4H4O6.4H203460g+Na0H1032g — IOL
[0081]C液，KI3000g— IOL
[0082]D 液，H2SO41420ml — IOL
[0083]E 液，0.1M Na2S2O3.5H20252g+Na2C0310g — IOL
[0084]F液，2%淀粉液(指示劑)
[0085]適用于本發(fā)明的淀粉衍生物優(yōu)選具有1_30μπι的粒徑中間值?？刹捎贸Ｒ?guī)的方法來(lái)測(cè)定粒徑中間值，所述方法包括但不限于激光粒度法(參考文獻(xiàn)見(jiàn)李芬芬、張本山，淀粉顆粒粒徑不同測(cè)定方法的比較，食品與發(fā)酵工業(yè)，2010年第36卷4期(總第268期)，171 -17 4 )。優(yōu)選的粒徑中間值范圍包括IO - 3 O μ m，更優(yōu)選的粒徑中間值范圍包括15-25 μ m。應(yīng)理解，若采取上述方法制備得到的淀粉衍生物的粒徑中間值不在上述數(shù)值范圍內(nèi)，可采用本領(lǐng)域常規(guī)的技術(shù)手段，例如研磨或粉碎，處理所述淀粉衍生物，使其粒徑中間值落在上述范圍之內(nèi)。
[0086]普通淀粉的粘度通常在lOOOcp以上。例如，本申請(qǐng)實(shí)施例所測(cè)的6%的普通玉米淀粉粘度糊化后最高粘度為1708cp，而6%的普通馬鈴薯淀粉糊化后最高粘度高達(dá)6959cp。這類淀粉在用來(lái)配制絲狀真菌發(fā)酵用培養(yǎng)基后常常導(dǎo)致培養(yǎng)基粘度過(guò)高或結(jié)塊而無(wú)法用于發(fā)酵。
[0087]而適用于本發(fā)明的淀粉衍生物優(yōu)選具有1-1OOcp的粘度，優(yōu)選的粘度為l-80cp，例如可以是l-60cp、l-50cp、l-40cp、5-40cp、10-30cp不等?？刹捎帽旧暾?qǐng)“測(cè)定方法”中“淀粉衍生物動(dòng)力粘度測(cè)定”所述的方法測(cè)定所述粘度。具體而言，采用快速粘度分析儀檢測(cè)法(Rapid Visco Analyser,RVA)按制造商所述方法測(cè)定本發(fā)明淀粉衍生物的粘度,測(cè)得6-40wt%的本發(fā)明淀粉衍生物的水溶液經(jīng)如下測(cè)定程序處理后在50°C的粘度在I 一 IOOcp的范圍之內(nèi):攪拌轉(zhuǎn)數(shù)160rpm，3’ 42”內(nèi)由50°C升溫至95°C，95°C保持2’ 30”后3’ 48”內(nèi)冷卻至50°C，再在50°C保溫2min。
[0088]優(yōu)選地，適用于本發(fā)明的淀粉衍生物的粘度隨溫度升高而變化極小。
[0089]本發(fā)明的淀粉衍生物通常為白色或類白色粉末，無(wú)臭無(wú)味，不溶于冷水，能溶于熱水，pH(20g/L, 25 °C )為 2-3。
[0090]在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的淀粉衍生物包括酸化淀粉、酶解淀粉、氧化淀粉、白糊精、黃糊精和英國(guó)膠等。以此淀粉衍生物水溶液(6-40%淀粉溶液)高溫滅菌(121°C，20min)后，不形成強(qiáng)凝膠，無(wú)顆粒，粘度低，流動(dòng)性好；以該淀粉衍生物為初始碳源的培養(yǎng)基高溫滅菌后，該淀粉衍生物能與培養(yǎng)基中各種離子作用，形成部分微小顆粒，該顆粒在絲狀真菌孢子萌發(fā)初期可起到分散作用，致使真菌在發(fā)酵過(guò)程中始終處于游離菌絲狀態(tài)，該淀粉衍生物在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，不僅提供菌絲生產(chǎn)及產(chǎn)酶所需的碳源，而且在絲狀真菌孢子萌發(fā)初期可起分散作用，使菌絲體一直處于游離分散狀態(tài)，有利于產(chǎn)量提高。
[0091]本發(fā)明的淀粉衍生物適用于絲狀真菌的培養(yǎng)和/或發(fā)酵。適用于使用本發(fā)明淀粉衍生物進(jìn)行培養(yǎng)和/或發(fā)酵的絲狀真菌包括但不限于黑曲霉、米曲霉、米黑根毛霉、李氏木霉、雪白根霉、華根霉、少根根霉、唐德鏈霉菌等。最常用的絲狀真菌主要為黑曲霉和米曲霉。本發(fā)明適于使用本發(fā)明的淀粉衍生物來(lái)發(fā)酵各種絲狀真菌，用于生產(chǎn)各種生物學(xué)活性分子，包括但不限于脂肪酶、Y-亞麻酸(GLA)等。
[0092]可采用常規(guī)的方法來(lái)培養(yǎng)和/或發(fā)酵絲狀真菌，不同之處在于在培養(yǎng)基中使用本發(fā)明的淀粉衍生物。不同絲狀真菌的培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)基、發(fā)酵工藝不盡相同，但這都在本領(lǐng)域技術(shù)人員所掌握的知識(shí)范圍之內(nèi)。例如，一般而言，培養(yǎng)或發(fā)酵過(guò)程包括獲得絲狀真菌的孢子或其懸浮液，然后將所述孢子或其懸浮液接種到培養(yǎng)基中，在適當(dāng)發(fā)酵條件下進(jìn)行發(fā)酵。同樣地，不同絲狀真菌的發(fā)酵條件(例如攪拌轉(zhuǎn)數(shù)、通風(fēng)、溫度、pH值、罐壓等)不盡相同，但可由技術(shù)人員根據(jù)實(shí)際發(fā)酵情況做適當(dāng)調(diào)整。
[0093]通常，培養(yǎng)或發(fā)酵培養(yǎng)基中含有2%~40%的本發(fā)明淀粉衍生物，優(yōu)選5%~35%，更優(yōu)選5%~30%，更優(yōu)選5%~25%，更優(yōu)選10%~20%。
[0094]培養(yǎng)基中還可含有其它適于絲狀真菌培養(yǎng)或發(fā)酵的成分，包括但不限于葡萄糖、磷酸二氫鈉、硫酸銨、檸檬酸鈉、NaNO3、MgS04.7H20、CaCl2、胰蛋白胨和/或酵母提取物等。
[0095]例如，在一具體實(shí)施例中，本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基含有:淀粉衍生物200g/L，葡萄H 20g/L, TSB80g/L,磷酸二氫鈉0.2g/L，硫酸銨15g/L，檸檬酸鈉70g/L，硫酸鎂Ig/L, Tween800.7ml，微量元素 Iml，鐵鹽 IOml，其中，微量元素為 ΚΙ0.83g/L，Η3Β036.2g/L，MnSO4.4Η2022.3g/L, ZnSO4.7Η208.6g/L, Na2MoO4.2Η200.25g/L, CuSO4.5Η200.025g/L,CoCl2.6Η200.025g/L ;鐵鹽為 FeSO4.7Η202.78g/L, Na2.EDTA3.73g/L。所述培養(yǎng)基可用于黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶。
[0096]在另一實(shí)施例中，本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基含有NaN033g/L，KH2P047g/L,Na2HPO4.12H201.2g/L，MgSO4.7Η200.5g/L，CaCl20.3g/L，胰蛋白胨 3g/L，酵母提取物 lg/L，本發(fā)明淀粉衍生物100g/L，橄欖油15g/L，pH4.5。該培養(yǎng)基可用于野生米黑根毛霉發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶。[0097]在又一實(shí)施例中，本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基含有本發(fā)明的淀粉衍生物180g/L，磷酸二氫鉀7.0g/L,硫酸鎂0.lg/L,氯化鈉0.6g/L，酵母膏0.9g/L，蛋白胨0.7g/L，微量元素3ml，PH5.0。該培養(yǎng)基可用于野生深黃被孢霉發(fā)酵產(chǎn)Y-亞麻酸(GLA)。
[0098]因此，應(yīng)理解，可根據(jù)不同的絲狀真菌以及發(fā)酵產(chǎn)物等因素選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基成分及其含量，這些都在本領(lǐng)域技術(shù)人員所掌握的知識(shí)范圍之內(nèi)。
[0099]本發(fā)明也包括含有本發(fā)明所述淀粉衍生物的絲狀真菌發(fā)酵用培養(yǎng)基。在一具體實(shí)施例中，所述培養(yǎng)基中所含的淀粉衍生物采用本文所述的制備方法制備得到。在另一實(shí)施例中，所述淀粉衍生物的DE值為0.1-3，粘度為Ι-lOOcp。在一優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明的淀粉衍生物的粒徑中間值為1_30μπι。在一優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明的淀粉衍生物的粘度為l-50cp。在一優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明的淀粉衍生物的粘度為5-30cp。在一具體實(shí)施例中，所述淀粉衍生物是玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、木薯淀粉、小麥淀粉、甘薯淀粉、高粱淀粉或豆類淀粉的淀粉衍生物，或是這些淀粉衍生物的混合物。應(yīng)理解，本發(fā)明的絲狀真菌發(fā)酵用培養(yǎng)基除淀粉衍生物外的其它成分及含量與現(xiàn)有已知的絲狀真菌發(fā)酵用培養(yǎng)基相同或類似。技術(shù)人員可根據(jù)實(shí)際情況，例如所培養(yǎng)的真菌等，對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基中的成分及其含量做出適當(dāng)選擇。
[0100]下文將以具體實(shí)施例的方式描述本發(fā)明。實(shí)施例中所用的試劑、反應(yīng)條件等，除非另有說(shuō)明，否則均為本領(lǐng)域常規(guī)的試劑和反應(yīng)條件。
[0101]此外，為了本說(shuō)明書(shū)和所附權(quán)利要求的目的，除非另外指出，所有表達(dá)成分?jǐn)?shù)量、材料的百分比或比例、反應(yīng)條件的數(shù)字以及在說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中使用的其它數(shù)值，都應(yīng)當(dāng)被理解為在所有情況下被術(shù)語(yǔ)“約”修飾。因此，除非相反指示，在本說(shuō)明書(shū)和所附權(quán)利要求書(shū)中列舉的數(shù)值參數(shù)是近似值，其可以取決于本發(fā)明要求獲得的期望性質(zhì)而變。絲毫且并非試圖使等價(jià)原則的應(yīng)用限于權(quán)利要求書(shū)的范圍，每個(gè)數(shù)值參數(shù)至少應(yīng)當(dāng)根據(jù)所報(bào)告的有效數(shù)字的數(shù)目并且通過(guò)應(yīng)用常規(guī)舍去技術(shù)進(jìn)行解釋。
[0102]在本發(fā)明中，發(fā)明人首先使用玉米淀粉制備獲得了玉米淀粉衍生物，使用這些淀粉衍生物培養(yǎng)絲狀真菌時(shí)，發(fā)現(xiàn)使用其中部分玉米淀粉衍生物時(shí)，能獲得良好的效果；經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，這些玉米淀粉衍生物的DE值為0.1-3，粘度為Ι-lOOcp，特別地，當(dāng)粒徑中間值為1-30 μ m時(shí)，其效果更優(yōu)。隨后，發(fā)明人又使用馬鈴薯淀粉、木薯淀粉、小麥淀粉、甘薯淀粉制備相應(yīng)的淀粉衍生物，當(dāng)控制獲得的淀粉衍生物的DE值為0.1-3，粘度為1-1OOcp時(shí)，使用該淀粉衍生物培養(yǎng)絲狀真菌，也具有良好的效果，當(dāng)?shù)矸鄣牧街虚g值為1-30 μ m時(shí)，其效果更好。
[0103]實(shí)施例
[0104]測(cè)試方法:
[0105]1.淀粉衍生物動(dòng)力粘度測(cè)定
[0106]采用快速粘度分析儀檢測(cè)法(Rapid Visco Analyser, RVA ;快速粘度分析儀購(gòu)自波通瑞華科學(xué)儀器(北京)有限公司):稱取一定量淀粉及淀粉衍生物，加水配置成6-40%的溶液于鋁盒中。用攪拌槳混合均勻，放入樣品池中，開(kāi)始測(cè)定。測(cè)定程序?yàn)?攪拌轉(zhuǎn)數(shù)為160rpm，3’ 42” 內(nèi)由 50°C升溫至 95°C，95°C保持 2’ 30” 后 3，48” 內(nèi)冷卻至 50°C，再在 50°C保溫2min。記錄整個(gè)過(guò)程中粘度變化，根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)應(yīng)的粘度，即可制得相應(yīng)的粘度變化曲線。
[0107]2.脂肪酶酶活測(cè)定方法
[0108](I)樣品瓶及空白瓶各加4.0Oml底物溶液、3ml蒸餾水、2mlTris-HCl緩沖液；
[0109](2)放入400C恒溫水浴搖床振蕩預(yù)熱5分鐘；
[0110](3)樣品瓶加入發(fā)酵上清液1ml，樣品瓶和空白瓶繼續(xù)40°C水浴振蕩15分鐘；
[0111](4)向樣品瓶和空白瓶各加入95%乙醇10ml，終止反應(yīng)；
[0112](5)瓶加入Iml發(fā)酵上清液搖勻；
[0113](6)品瓶和空白瓶各加入2滴酚酞指示劑；
[0114](7)0.1M氫氧化鈉溶液滴定至酹酞變微紅為終點(diǎn),記錄消耗氫氧化鈉溶液體積。
【權(quán)利要求】
1.一種使用絲狀真菌進(jìn)行發(fā)酵的方法，其特征在于，所述方法包括使用含有淀粉衍生物的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，其中，所述淀粉衍生物DE值為0.1-3，粘度為1-lOOcp。
2.一種控制絲狀真菌發(fā)酵時(shí)的形態(tài)的方法，其特征在于，所述方法包括使用含有淀粉衍生物的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，從而控制絲狀真菌在發(fā)酵時(shí)以游離菌絲體形態(tài)存在，其中，所述淀粉衍生物DE值為0.1-3，粘度為1-1OOcp。
3.DE值為0.1-3和粘度為1-1OOcp的淀粉衍生物在絲狀真菌發(fā)酵中的應(yīng)用。
4.DE值為0.1-3和粘度為1-1OOcp的淀粉衍生物在制備絲狀真菌發(fā)酵用的培養(yǎng)基中的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求1或2所述的方法或權(quán)利要求3或4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述淀粉衍生物粒徑中間值為1-30 μ m。
6.如權(quán)利要求1或2所述的方法或權(quán)利要求3或4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述絲狀真菌選自:黑曲霉、米曲霉、米黑根毛霉、李氏木霉、雪白根霉、華根霉、少根根霉和唐德鏈霉菌。
7.如權(quán)利要求1或2所述的方法或權(quán)利要求3或4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述淀粉衍生物是玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、木薯淀粉、小麥淀粉、甘薯淀粉、高粱淀粉或豆類淀粉的淀粉衍生物，或是這些淀粉衍生物的混合物。
8.如權(quán)利要求1或2所述的方法或權(quán)利要求3或4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述培養(yǎng)基含有2%~40%的所述淀粉衍生物。
9.如權(quán)利要求8所述的方法或應(yīng)用，其特征在于，所述培養(yǎng)基含有5%~25 %的所述淀粉衍生物。
10.如權(quán)利要求1或2所述的方法或權(quán)利要求3或4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述培養(yǎng)基含有葡萄糖、磷酸二氫鈉、硫酸銨、檸檬酸鈉、NaN03、MgSO4.7H20、CaCl2、胰蛋白胨和/或酵母提取物。
11.一種制備絲狀真菌發(fā)酵用淀粉衍生物的方法，其特征在于，所述方法包括:采用酸化法或酶解法處理選自玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、木薯淀粉、小麥淀粉、甘薯淀粉、高粱淀粉、豆類淀粉或其任意混合物的普通淀粉，以獲得DE值為0.1-3、粘度為1-1OOcp的淀粉衍生物，從而獲得所述絲狀真菌發(fā)酵用淀粉衍生物； 優(yōu)選的，所述方法還包括，研磨或粉碎所獲得的淀粉衍生物，以獲得粒徑中間值為1-30 μ m的絲狀真菌發(fā)酵用淀粉衍生物。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述酸化法包括: (1)配制普通淀粉與水的重量比為1:0.8 — 1:3的混合液； (2)加入占該所述水的體積0.5%- 10%的稀酸；和 (3)將步驟(2)所得混合液在110-130°C、0.05MPa-0.12MPa處理2 — 20分鐘后終止反應(yīng)，將PH調(diào)節(jié)至中性，洗滌，干燥，從而獲得所述淀粉衍生物。
13.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述酸化法包括: (1)配制普通淀粉與水的重量比為3:1.5-3:0.8的混合液； (2)加入其體積與水的體積比為1:3-1:1的稀酸； (3)在40-50°C、常壓下反應(yīng)25-30小時(shí)后終止反應(yīng)，將pH調(diào)節(jié)至中性，洗滌，干燥，從而獲得所述淀粉衍生物。
14.一種淀粉衍生物，其特征在于，所述淀粉衍生物的DE值為0.1-3，粘度為1-lOOcp。
15.如權(quán)利要求14所述的淀粉衍生物，其特征在于，所述淀粉衍生物的粒徑中間值為1-30 μ m。
16.如權(quán)利要求14所述淀粉衍生物，其特征在于，所述淀粉衍生物是玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、木薯淀粉、小麥淀粉、甘薯淀粉、高粱淀粉或豆類淀粉的淀粉衍生物，或是這些淀粉衍生物的混合物。
17.—種絲狀真菌發(fā)酵用培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基含有權(quán)利要求14 - 16中任一項(xiàng)所述的淀粉衍生物。
【文檔編號(hào)】C08B31/00GK103834625SQ201210484085
【公開(kāi)日】2014年6月4日 申請(qǐng)日期:2012年11月23日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月23日
【發(fā)明者】包悅佚, 高霓思, 關(guān)惠琴, 滕健, 朱玲 申請(qǐng)人:豐益(上海)生物技術(shù)研發(fā)中心有限公司