專利名稱：具有多種生物活性的螠蟶多糖的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其是一種操作簡(jiǎn)單、成本低廉，具有多種生物活性的 螆蟶多糖的制備方法。
背景技術(shù)：
螆蟶constricta Iamarck)俗名蟶子、青子、竹蚶、海蟶，隸屬于 軟體動(dòng)物門(mén)(Mollusca)、瓣鰓綱(LameUibranchia)、真瓣鰓目(Eulamellibranchia)、蟶科 (Wmrellidae)，是我國(guó)與日本特有的種類(lèi)，也是100多年來(lái)我國(guó)沿海養(yǎng)殖的重要貝類(lèi)之 一。螆蟶肉味鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量5.5%，脂肪0.8%，糖1.8%和無(wú)機(jī)鹽1. 1%。螆蟶 的軟體部還有補(bǔ)虛的作用，對(duì)陰虛、血虛效果最佳，產(chǎn)后、病后多用之。近年來(lái)，海洋貝類(lèi)的 研究已引起人們極大重視，海洋貝類(lèi)中所具有的多種生物活性肽、多糖、不飽和脂肪酸等已 成為海洋保健食品和功能食品的重要原材料，如Bordenave等將太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)用胃蛋白酶水解，得到具有抑制ACE能力的水解產(chǎn)物；文蛤(Meretrix meretrix (Linnaeus))多糖對(duì)不同劑量的環(huán)磷酰胺(CTX)引起的遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)有雙向調(diào)節(jié) 功能等。但是，目前關(guān)于螆蟶的研究多集中在干制品加工及營(yíng)養(yǎng)成分分析方面，對(duì)其生物活 性的研究甚少，產(chǎn)品品種單調(diào)，在一定程度上限制了螆蟶養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述技術(shù)問(wèn)題，提供一種操作簡(jiǎn)單、成本低 廉，具有多種生物活性的螆蟶多糖的制備方法。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種具有多種生物活性的螆蟶多糖的制備方法，其特 征在于依次按如下步驟進(jìn)行
a.將螆蟶肉用組織搗碎勻漿機(jī)勻漿搗碎裝入容器中再加入蒸餾水制成螆蟶肉勻漿 液，螆蟶肉與蒸餾水的比重為30 g :120ml ；
b.將螆蟶肉勻漿液置于70°C水浴中加熱6 h,3000 r/min離心15 min，收集上清液， 在上清液中按體積比為1 :2加入無(wú)水乙醇，4°C靜置過(guò)夜；
c.5000 r/min離心20 min，收集沉淀置于培養(yǎng)皿上，自然揮發(fā)干燥后收集；
d.用kvage法去除所收集固體中的蛋白，然后用丙酮脫色，將所得沉淀置于培養(yǎng)皿 中，自然揮發(fā)干燥過(guò)夜后收集。本發(fā)明是以來(lái)源豐富、價(jià)格便宜的螆蟶為原料，所提取的螆蟶多糖具有多種活性 抑菌活性、抗氧化活性效果顯著，具有一定的誘抗活性，可抑制蠶豆根尖細(xì)胞微核形成，并 且對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7有抑制活性。操作簡(jiǎn)單、成本低廉，適合于大規(guī)模生產(chǎn)，可制成海 鮮調(diào)味料、保健食品、營(yíng)養(yǎng)食品及天然藥物等。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明實(shí)施例依次按如下步驟進(jìn)行 a.將螆蟶肉用組織搗碎勻漿機(jī)勻漿搗碎裝入容器中再加入蒸餾水制成螆蟶肉勻漿液，螆蟶肉與蒸餾水的比重為30 g :120ml ；
b.將螆蟶肉勻漿液置于70°C水浴中加熱6 h,3000 r/min離心15 min，收集上清液， 在上清液中按體積比為1 :2加入無(wú)水乙醇，4°C靜置過(guò)夜；
c.5000 r/min離心20 min，收集沉淀置于培養(yǎng)皿上，自然揮發(fā)干燥后收集；
d.用kvage法去除所收集固體中的蛋白，然后用丙酮脫色，將所得沉淀置于培養(yǎng)皿 中，自然揮發(fā)干燥過(guò)夜后收集。用苯酚-濃硫酸法檢驗(yàn)所得固體，結(jié)果為多糖。本發(fā)明實(shí)施例所得固體(螆蟶多糖)的實(shí)驗(yàn)如下
1.濾紙片法檢測(cè)抑菌活性大腸桿菌hcherichia coli (EC)、變形桿菌ftOteus vulgaris (PV)、金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus (SA)、產(chǎn)氣桿菌 Enterobacter aerogenes (EA)和枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis (BS)用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；乳酸菌 Lactobacterium delbruckii (LD)用 MRS 培養(yǎng)基；酉良酒酵母菌 Saccharomyces cerevisiae (SC)用YPD培養(yǎng)基，上述菌種均可購(gòu)自上海坤肯生物化工有限公司。將上述各菌種分別接 種于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)M h作指示菌。分別用移液槍取指示菌液100 μ L于相應(yīng)的固體培養(yǎng)基，用無(wú)菌三角涂棒涂抹均 勻，然后將各固體培養(yǎng)基平板分成六個(gè)區(qū)，每個(gè)區(qū)分別放入一張濾紙片，再分別用移液槍移 取螆蟶多糖水溶液樣品10 μ L滴入濾紙片中央，置于37 ！培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每個(gè)處理做3 次重復(fù)，陽(yáng)性對(duì)照為75%酒精，陰性對(duì)照為無(wú)菌水。三天后觀察指示菌的生長(zhǎng)情況，測(cè)定抑 菌圈的直徑大小。結(jié)果表明螆蟶多糖對(duì)大腸桿菌、變形桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄 球菌作用較強(qiáng)，對(duì)產(chǎn)氣桿菌也有抑制活性，而金黃色葡萄球菌、變形桿菌、大腸桿菌和產(chǎn)氣 桿菌分別屬于革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性菌，因此可用螆蟶多糖開(kāi)發(fā)功能性食品或食品添加 劑，因其抑菌活性而延長(zhǎng)產(chǎn)品的保藏時(shí)間。2.超氧陰離子自由基(02_)清除作用的測(cè)定取鄰苯三酚0.1 mL于試管中，加入 PH 8. 2的1Tris-HCl緩沖溶液5 mL，加入螆蟶多糖水溶液0. 25 mL，迅速混勻，在25°C反應(yīng) 15 min。使用1 cm比色皿，以蒸餾水做空白對(duì)照，在320 nm處時(shí)測(cè)吸光度A 并測(cè)定樣 液本底的吸光度值~。酶解液對(duì)超氧陰離子自由基清除率的計(jì)算公式如下清除率S (%) =Ao - (Ai - Aj)/AoX 100%。式中，Ao為試劑空白的吸光度值 ’Ai為樣液的吸光度值；A」 為樣液本底的吸光度值。雖然超氧陰離子自由基(O2—)不能直接誘導(dǎo)生物和食品體系中的 脂類(lèi)氧化，但它會(huì)在金屬離子催化下發(fā)生i^enton反應(yīng)產(chǎn)生有高活性的· 0H，因此常用樣品 對(duì)超氧陰離子自由基(02_)的清除能力來(lái)反映其抗氧化活性。試劑空白時(shí)的吸光度值A(chǔ)o為 0.499，經(jīng)清除率公式S (%)= Ao- (Ai-Aj)AoXlOO計(jì)算超氧陰離子自由基清除率。結(jié) 果表明螆蟶多糖的超氧陰離子自由基清除率高達(dá)66. 53%。因此可用作抗氧化藥物的制備 或食品抗氧化添加劑。3.輕自由基(· 0H)清除作用的測(cè)定取9 mmol/L的!^eSO4 1 mL、9 mmol/L的水 楊酸-乙醇溶液1 mL、蟶多糖水溶液樣品1 mL，最后加入8. 8 mmol/L的H2R 1 mL啟動(dòng)反 應(yīng)，在37°C反應(yīng)30分鐘。以水為參比，用可見(jiàn)光分光光度計(jì)在510 nm下測(cè)各個(gè)提取液吸光 度值。對(duì)羥自由基的清除效果用清除率表示，按下式計(jì)算
Sa= [(Ac—As) / (Ac—Ao)] X 100% 式中Ac為對(duì)照組OD值；As為樣品組OD值；Atl為空白組OD值。
羥基自由基(· 0H)是一種能夠激發(fā)油脂過(guò)氧化反應(yīng)的較強(qiáng)的氧化劑，被認(rèn)為是體 內(nèi)最活躍的活性氧自由基，輻射損傷等物理、化學(xué)因子都會(huì)促進(jìn)其形成，是造成生物有機(jī)體 過(guò)氧化損傷的主要因素。羥自由基可介導(dǎo)許多病理變化，如引發(fā)不飽和脂肪酸的脂質(zhì)過(guò)氧 化反應(yīng)，并損傷生物膜的功能和結(jié)構(gòu)，因此羥自由基的清除對(duì)于生物體具有重要意義。H2A 和1 2+混合發(fā)生ronton反應(yīng)，生成具有很高反應(yīng)活性的·0Η，能被水楊酸有效的捕捉，并生 成有色物質(zhì)；但若加入具有清除作用的物質(zhì)，便會(huì)與水楊酸競(jìng)爭(zhēng)，從而使有色產(chǎn)物生成量減 少。經(jīng)公式Sa= [ (Ac—As) / (Ac-Ao) ] X 100%算出羥自由基清除率S%，結(jié)果表明螆 蟶多糖的羥基自由基(·0Η)清除率達(dá)61. 48%，因此可用作抗氧化藥物的制備或食品抗氧化 添加劑。4.誘抗活性的測(cè)定將發(fā)芽大豆放入洗凈的解剖盤(pán)中澆水浸沒(méi)，光照培養(yǎng)，每天澆 水培養(yǎng)，待大豆長(zhǎng)出兩片真葉后，在無(wú)菌條件下，將剛剛長(zhǎng)出真葉的大豆子葉剪下，用8%次 氯酸鈉溶液滅菌5 min，再用無(wú)菌水沖洗。用刀片削去子葉外表皮厚約1 mm，形成直徑約6 mm的傷口，用無(wú)菌水浸泡清洗，約30秒后取出，濾紙拭干后放入鋪有濕濾紙培養(yǎng)皿中，每皿 10片子葉作為一個(gè)處理。每個(gè)處理做一次重復(fù)，對(duì)照組用無(wú)菌水，使用微量移液器取螆蟶多 糖水溶液10 yL加在一個(gè)傷口上。處理后的子葉在黑暗的溫箱中培養(yǎng)M h后，將每 皿中的子葉轉(zhuǎn)移到一個(gè)盛有10 μ L雙蒸水的試管中，充分振蕩，用紫外分光光度計(jì)在觀6 nm處測(cè)定OD值。植物體內(nèi)存在潛在抗病性，受到外界損害和病原物侵染的植物可通過(guò)激發(fā)子和誘 導(dǎo)劑(inducer)激活植物抗病基因，使植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性，以免受到進(jìn)一步的傷害。豆科 植物在受到病原體侵染時(shí)，能通過(guò)莽草酸途徑、醋酸一丙二酸途徑或醋酸一甲羥戊酸途徑， 產(chǎn)生以異黃酮類(lèi)為主的植保素，直接殺死入侵的病原體，抑制病斑的擴(kuò)大。在外源激發(fā)子的 處理下豆科植物也能夠產(chǎn)生抗性反應(yīng)，合成植保素。大豆子葉法就是利用激發(fā)子處理大豆 子葉，然后通過(guò)測(cè)定子葉產(chǎn)生的植保素的量，來(lái)表示激發(fā)子誘導(dǎo)植物抗性活性的方法。結(jié)果 表明螆蟶多糖水溶液的0擬86值為0. M65，而對(duì)照僅為0. 2605，因此螆蟶多糖具有明顯的 誘抗活性，可用作植物誘抗劑用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域。5.抑制腫瘤細(xì)胞活性測(cè)定取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞接種于96孔 板中，接種細(xì)胞數(shù)為每孔1X105個(gè)，設(shè)空白對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組(加樣濃度分別為50、200 μ g/ mL)，設(shè)5個(gè)平行孔，置37 °C、5 % C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待穩(wěn)定后，空白對(duì)照組每孔加RPMI1640 培養(yǎng)液1 PL，試驗(yàn)組每孔加1 μ L螆蟶多糖多糖水溶液，培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入MTT溶液(5 mg/mL) 20 yL,5 h后加入150 μ L 二甲基亞砜溶液，振蕩5 min。在DG5031型酶聯(lián)免疫 檢測(cè)儀下，以RPMI1640培養(yǎng)液10 μ L加20 μ L MTT溶液調(diào)零，檢測(cè)各孔的OD57tl值。實(shí) 驗(yàn)重復(fù)一次。計(jì)算方法
取平均值，按公式計(jì)算抑制率％ = (1 — OD實(shí)/OD對(duì))X 100% 式中，OD對(duì)為對(duì)照組OD值(不加樣液)；OD實(shí)為樣品組OD值。使用MTT法測(cè)定螆蟶多糖抗癌活性，其檢測(cè)原理是活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫 酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚(Formazan)并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì) 胞無(wú)此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。根據(jù)測(cè)得的吸光度值， 來(lái)判斷活細(xì)胞數(shù)量，OD值越小，則說(shuō)明癌細(xì)胞被抑制率越好，樣品抑制能力越強(qiáng)。使用酶標(biāo) 儀在570 nm處測(cè)定吸光度值，結(jié)果表明，200 ？ g/mL樣品抑制率為27. 08%，因此可用作抗 腫瘤藥物或保健品的制備。6.抑制蠶豆根尖微核形成活性檢測(cè)首先將蠶豆在清水中浸泡M h，然后放入 墊有吸水脫脂棉的培養(yǎng)皿中，蓋上雙層濕紗布于25°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待根尖長(zhǎng)至1 1. 5cm時(shí)，將萌發(fā)蠶豆分成3組，每組8個(gè)，分別用濃度為200 μ g/mL螆蟶多糖水溶液和 1.6yg/ml的絲裂霉素混合物、1. 6 μ g/ml的絲裂霉素、雙蒸水浸根，同時(shí)設(shè)3個(gè)平行組 合，25°C培養(yǎng)8 h，自來(lái)水沖洗，吸干水后加Imol/mL HCl于60°C水解8 12min，再用水 沖洗2次；將根尖呈現(xiàn)乳白色處(即分生組織)切下，放于載玻片搗碎涂片。苯酚品紅染色 3 5min，蓋上載玻片，并用鑷子后背輕輕敲打使其分散成一層細(xì)胞顯微觀察。每個(gè)根尖觀 察1000個(gè)以上間期細(xì)胞，每個(gè)處理組觀察4個(gè)根尖，統(tǒng)計(jì)含微核的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算其微核率 (MCN)和抑制率(％)。
含微核的細(xì)胞數(shù)
觀察的細(xì)胞總數(shù) 陽(yáng)性對(duì)照組微核細(xì)胞數(shù)-試驗(yàn)組微核細(xì)胞數(shù) 抑制率(ι O0) =- 100° ο
陽(yáng)性對(duì)照組微核細(xì)胞數(shù)
目前，在人類(lèi)的生活環(huán)境中存在著許多可能損害遺傳物質(zhì)，并造成“致癌、致畸、致突 變”等遺傳毒性效應(yīng)的環(huán)境致突變物，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)健康和生存。人們廣泛應(yīng)用微核在組 織細(xì)胞中出現(xiàn)的頻率來(lái)反映該組織受損傷的程度，即微核的大量出現(xiàn)是一個(gè)危險(xiǎn)的訊號(hào)。 結(jié)果表明螆蟶多糖對(duì)微核的抑制率達(dá)49%，可制成保健品及臨床治療藥品等。
權(quán)利要求
1. 一種具有多種生物活性的螆蟶多糖的制備方法，其特征在于依次按如下步驟進(jìn)行a.將螆蟶肉用組織搗碎勻漿機(jī)勻漿搗碎裝入容器中再加入蒸餾水制成螆蟶肉勻漿 液，螆蟶肉與蒸餾水的比重為30 g :120ml ；b.將螆蟶肉勻漿液置于70°C水浴中加熱6 h,3000 r/min離心15 min，收集上清液， 在上清液中按體積比為1 :2加入無(wú)水乙醇，4°C靜置過(guò)夜；c.5000 r/min離心20 min，收集沉淀置于培養(yǎng)皿上，自然揮發(fā)干燥后收集；d.用kvage法去除所收集固體中的蛋白，然后用丙酮脫色，將所得沉淀置于培養(yǎng)皿 中，自然揮發(fā)干燥過(guò)夜后收集。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種具有多種生物活性的螠蟶多糖的制備方法，其特征在于依次按如下步驟進(jìn)行a.將螠蟶肉用組織搗碎勻漿機(jī)勻漿搗碎裝入容器中再加入蒸餾水制成螠蟶肉勻漿液，螠蟶肉與蒸餾水的比重為30g120ml；b.將螠蟶肉勻漿液置于70℃水浴中加熱6h，3000r/min離心15min，收集上清液，在上清液中按體積比為12加入無(wú)水乙醇，4℃靜置過(guò)夜；c.5000r/min離心20min，收集沉淀置于培養(yǎng)皿上，自然揮發(fā)干燥后收集；d.用Sevage法去除所收集固體中的蛋白，然后用丙酮脫色，將所得沉淀置于培養(yǎng)皿中，自然揮發(fā)干燥過(guò)夜后收集。
文檔編號(hào)C08B37/00GK102079793SQ201010592509
公開(kāi)日2011年6月1日 申請(qǐng)日期2010年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月16日
發(fā)明者張付云, 李云冰, 李妍, 王斌, 胡溯 申請(qǐng)人:大連海洋大學(xué)