專利名稱：一種高效溶解初生血栓的聚氨酯材料及其制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)用功能高分子材料領(lǐng)域，具體涉及一種具有高效溶解初生血栓 功能的聚氨酯材料的制備方法。
背景技術(shù)：
心血管疾病已經(jīng)成為威脅人類健康的最大殺手之一，用于診斷和治療心血管疾病 的材料和器件都不可避免的要與血液相接觸。因此，與血液相接觸的生物醫(yī)用材料具有十 分廣闊的應(yīng)用前景和大量的市場需求，這些材料包括心血管系統(tǒng)的植入體(支架、瓣膜、血 管移植體、心臟輔助器件、導(dǎo)管)和體外血液處理設(shè)備(血液透析、體外循環(huán))等，然而材料 表面引起血栓問題一直制約著該類材料的發(fā)展。以生物惰性高分子鏈為間隔臂將具有結(jié)合 抗凝血因子的生物活性分子固定于材料表面是解決血栓問題的一條有效途徑?，F(xiàn)有技術(shù)中，通常選用親水性高分子鏈聚乙二醇(PEG)及其衍生物作為惰性間 隔臂從而有效排斥非特異性蛋白質(zhì)吸附，再通過活化其鏈末端來引入特定的生物活性分 子，進(jìn)而可以實現(xiàn)從血液中選擇性結(jié)合抗凝血物質(zhì)。如通過該方法，Kim等人制備了具 有抑制凝血功能的肝素化材料表面(參見=Biomaterials, 21,121-130, 2000)；專利號為 200610124540. 6的中國發(fā)明公開了一種具有抗凝血和溶解血栓功能的聚氨酯材料，其由修 飾層和基層組成，基層由普通商用聚氨酯材料或合成聚氨酯材料構(gòu)成，修飾層是在該基層 的表面通過化學(xué)修飾方法而形成，修飾層中含有與聚氨酯基底材料通過共價健鏈接的聚乙 二醇柔性間隔基，以及進(jìn)一步利用聚乙二醇分子上的活性基團通過共價健鏈接的生物活性 物質(zhì)賴氨酸；該材料的制備方法是通過化學(xué)修飾方法，先在基層表面接枝帶有活性基團 的聚乙二醇柔性間隔基，使其具有抗凝血的功能，然后利用聚乙二醇上的活性基團鏈接生 物活性物質(zhì)賴氨酸，使其具有溶解血栓的功能，從而構(gòu)成修飾層。雖然PEG具有很好的排斥非特異性蛋白質(zhì)吸附的能力，但是在氧和過度金屬離子 存在的環(huán)境中，PEG易被氧化而分解，因此長期應(yīng)用于生理環(huán)境時會導(dǎo)致生物膜的形成從而 限制了其在人體植入材料中的應(yīng)用。此外，在材料表面化學(xué)接枝PEG往往很難實現(xiàn)高密度 接枝，這從很大程度上限制了生物活性分子的接枝密度，從而無法達(dá)到高效率的抗凝血過程。因此，需要選用一種更具生物惰性，同時可以在聚氨酯表面高密度接枝的材料作 為惰性間隔臂來制備一種可以更高效溶解血栓的聚氨酯材料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種具有溶解初生血栓功能的聚氨酯材料及其制備方法，通過 在聚氨酯基層表面高密度接枝生物惰性的聚合物鏈來固定高密度的ε _賴氨酸分子，從而 高效溶解初生血栓。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種具有溶解初生血栓功能的聚氨 酯材料的制備方法，首先，以聚氨酯材料為基層，在聚氨酯基層表面修飾親水性高分子作為惰性間隔臂；然后，活化惰性間隔臂的側(cè)鏈末端，然后結(jié)合生物活性分子ε _賴氨酸，得到 所述具有溶解初生血栓功能的聚氨酯材料；其中，所述親水性高分子為聚甲基丙烯酸羥乙 酯(PHEMA)。具體地，上述技術(shù)方案包括以下步驟(1)丙烯酰氧異硫氰酸酯溶液和甲基丙烯酰氧異硫氰酸酯溶液的制備將甲基丙烯酰氯或丙烯酰氯緩慢滴入硫氰酸鉀溶液中，攪拌反應(yīng)，反應(yīng)溫度為 0 35°C，反應(yīng)時間為1 24小時，得到甲基丙烯酰氧異硫氰酸酯溶液或丙烯酰氧異硫氰 酸酯溶液；優(yōu)選地，其中，甲基丙烯酰氯或丙烯酰氯與硫氰酸鉀的摩爾比為1 1 1 1.2; 所述硫氰酸鉀溶液為硫氰酸鉀乙腈溶液；(2)聚氨酯材料表面接碳碳雙鍵將聚氨酯材料置于甲基丙烯酰氧異硫氰酸酯溶液或丙烯酰氧異硫氰酸酯溶液中， 在三乙胺存在下進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)溫度為45 80°C，反應(yīng)時間為2 12小時，得到表面接有 碳碳雙鍵的聚氨酯材料；其中，所述聚氨酯材料為普通醫(yī)用聚氨酯材料，其形狀為粒狀、薄膜、管狀、棒狀或 其它形狀的固態(tài)聚氨酯材料；優(yōu)選地，所述甲基丙烯酰氧異硫氰酸酯或丙烯酰氧異硫氰酸酯溶液中的溶劑乙腈 或甲苯；按W/ν計，三乙胺用量為所述溶液的1 3% ；(3)聚氨酯材料表面共聚合接枝PHEMA 將表面接有碳碳雙鍵的聚氨酯材料置于含有引發(fā)劑和甲基丙烯酸-2-羥基乙酯 (HEMA)的甲醇溶液中進(jìn)行進(jìn)行表面自由基聚合反應(yīng)，反應(yīng)溫度為60 80°C，反應(yīng)時間為 2 12小時，得到聚甲基丙烯酸羥乙酯(PHEMA)修飾的聚氨酯；其中，所述引發(fā)劑為偶氮二異丁腈、偶氮二異庚腈、過氧化二苯甲酰、過氧化二碳 酸二乙基己酯、異丙苯過氧化氫、過硫酸鉀_亞硫酸鹽體系或過氧化氫_亞鐵酸鹽體系；(4) PHEMA修飾的聚氨酯材料表面接枝ε -賴氨酸將PHEMA修飾的聚氨酯置于琥珀亞胺碳酸二酯(DSC)溶液中，在三乙胺存在下進(jìn) 行室溫反應(yīng)，反應(yīng)時間為4 12小時；將反應(yīng)后的聚氨酯清洗后置于ε -氨基被叔丁氧 羰基保護(hù)的賴氨酸(H-Lys (t-BOC)-0Η)溶液中，室溫反應(yīng)12 24小時；反應(yīng)結(jié)束后用水 清洗改性的聚氨酯，再置于三氟乙酸溶液中進(jìn)行保護(hù)基團的脫除，最后用水充分清洗，得到 ε“賴氨酸修飾的聚氨酯材料；優(yōu)選地，所述DSC溶液為乙腈溶液，并且按W/V計，DSC用量為1 2. 5% ；三乙胺 與DSC摩爾比比值為1 2. 5 ；所述H-Lys (t-BOC) -OH溶液中的溶劑為水或PBS緩沖液，溶 液濃度為1 10mg/mL，溶液pH為8 9 ；所述的三氟乙酸溶液為25 30%水溶液，脫保 護(hù)溫度為15 25°C，脫保護(hù)時間為1 2小時。本發(fā)明的原理為利用PHEMA間隔層的生物惰性功能，該間隔層可以有效排斥非 特異性蛋白質(zhì)吸附，這樣不但能夠在一定程度上抑制血栓在材料表面的形成，還盡可能的 排除了體系中其他蛋白質(zhì)對ε _賴氨酸和纖溶酶原之間結(jié)合的干擾，保證了材料表面對纖 溶酶的特異性結(jié)合；二是利用PHEMA分子鏈的梳狀結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)中包含豐富的側(cè)鏈，側(cè)鏈末 端的羥基經(jīng)化學(xué)活化后用于共價結(jié)合賴氨酸分子，這樣每一個表面聚合的PHEMA都能夠結(jié)合很多賴氨酸分子，極大的提高了表面賴氨酸的密度，進(jìn)而也提高了表面結(jié)合纖溶酶原的 效率?？傊ㄟ^利用PHEMA的生物惰性和梳狀結(jié)構(gòu)，一方面可以在排斥非特異性蛋白質(zhì)吸 附的同時提高對纖溶酶原的特異性結(jié)合，另一方面可以高密度接枝賴氨酸分子進(jìn)而提高結(jié) 合纖溶酶原的效率，最終達(dá)到高效溶解初生血栓的目的。本發(fā)明同時要求保護(hù)采用上述技術(shù)方案制備得到的具有高效溶解初生血栓功能 的聚氨酯材料，所述聚氨酯材料由基層和設(shè)置在基層表面的修飾層構(gòu)成，其中基層由聚氨 酯材料構(gòu)成，修飾層是在該基層表面通過化學(xué)修飾方法而形成，修飾層中含有通過表面自 由基共聚合接枝在基層表面的的PHEMA以及在PHEMA側(cè)鏈末端共價結(jié)合的ε -賴氨酸。由于上述技術(shù)方案運用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點由于本發(fā)明以普通醫(yī)用聚氨酯材料為基層，然后通過表面自由基共聚合接枝 ΡΗΕΜΑ，并且在PHEMA側(cè)鏈末端共價結(jié)合ε -賴氨酸；一方面，由于PHEMA具有良好的生物惰 性，因此能夠有效排斥非特異性蛋白質(zhì)吸附，在lmg/mL纖維蛋白原溶液中的蛋白質(zhì)吸附量 為0. 27μ g/cm2，在血漿中能夠在有效排斥非特異性蛋白質(zhì)吸附的同時大量結(jié)合纖溶酶原； 另一方面，由于PHEMA具有豐富的側(cè)鏈末端羥基，因此，可以實現(xiàn)賴氨酸分子在表面的高密 度接枝，本發(fā)明中，表面賴氨酸密度能夠達(dá)到2. 81nmol/cm2,同時因為ε -賴氨酸具有特異 性結(jié)合血纖溶酶原及其激活物t-PA并溶解表面引起的初生血栓的能力，所以本發(fā)明所得 具有溶解初生血栓功能的聚氨酯材料浸泡于血漿中并復(fù)鈣化后，能夠在20分鐘內(nèi)將表面 形成的血栓全部溶解。


圖1是實施例二中表面修飾前后的聚氨酯材料在lmg/mL纖維蛋白原溶液中的吸 附圖譜；圖2是實施例三中表面修飾前后的聚氨酯材料在血漿中吸附纖維蛋白原和纖溶 酶原的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果；圖3是實施例四中表面修飾前后的聚氨酯材料的溶解血栓性能測試圖譜。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述本發(fā)明提供的高效溶解初生血栓的聚氨酯表面的制備方法，是以在聚氨酯材料表 面通過化學(xué)方法引入可聚合的碳碳雙鍵為化學(xué)接枝開端，在引發(fā)劑和HEMA的存在下，進(jìn)行 HEMA在表面的自由基接枝共聚合。再利用雙官能度的化學(xué)活性小分子DSC使PHEMA側(cè)鏈末 端的羥基激活，然后將賴氨酸分子通過α-氨基共價結(jié)合在該活性點上，具體實施方式
如 下實施例一(1)聚氨酯材料表面接枝共聚合PHEMA將0. 98g硫氰酸鉀、40mL無水乙腈置于IOOmL反應(yīng)瓶中，攪拌溶解。將0. 82mL丙 烯酰氯緩慢滴入反應(yīng)瓶中，室溫下攪拌反應(yīng)12小時。過濾除去沉淀，濾液直接用于下一步 反應(yīng)。將60片直徑約為7mm聚氨酯膜片(厚度0. 5mm)置于含有30mL上述濾液的反應(yīng)瓶 中，在反應(yīng)瓶中加入0. 75g三乙胺，65°C下攪拌反應(yīng)2-12小時后，將聚氨酯膜片取出，經(jīng)乙腈洗滌、干燥得到表面接有碳碳雙鍵的聚氨酯膜片。將0.082g偶氮二異丁腈、6.5g HEMA、 40mL甲醇和60片表面接有碳碳雙鍵的聚氨酯膜片置于50mL反應(yīng)瓶中，在氮氣保護(hù)下，將 反應(yīng)混合液攪拌加熱至65°C并反應(yīng)6小時。反應(yīng)完成后，將聚氨酯膜片取出，經(jīng)甲醇、水洗 滌、干燥得到PHEMA接枝改性的聚氨酯膜片。(2) PHEMA修飾聚氨酯表面接枝ε -賴氨酸將0. 256gDSC和0. 14mL三乙胺溶于20mL無水乙腈中，然后將40片干燥的PHEMA 修飾的聚氨酯膜片加入到該溶液中，在氮氣保護(hù)下，室溫攪拌6小時，將膜片取出，用干燥 乙腈充分清洗并用氮氣吹干后，迅速放入到IOmL濃度為5mg/mL的H-Lys (t-BOC) -OH的PBS 緩沖溶液(pH = 8.3)中，反應(yīng)24小時后用蒸餾水洗滌。將洗好的膜片浸入25%的三氟乙 酸水溶液中攪拌1. 5小時，用水充分清洗以確保將殘余的酸洗掉。(3)本材料在人體植入材料方面具有應(yīng)用前景，例如血管植入物和血管支架涂層寸。實施例二 按照實施例一的方法所制備的賴氨酸表面，通過同位素標(biāo)記纖維蛋白原吸附測試 來反映其排斥非特異性蛋白質(zhì)吸附的能力。通過ICI法將同位素125I標(biāo)記在纖維蛋白原的 酪氨酸殘基上，將標(biāo)記與未標(biāo)記的纖維蛋白原溶液按照1 19的纖維蛋白原質(zhì)量比混合并 將改性與未改性的聚氨酯膜片靜置于該溶液中3h，以pH為7. 4的PBS或TBS緩沖液洗三 次，最后通過Y計數(shù)器讀取膜片上的放射量并換算為蛋白質(zhì)的質(zhì)量，最終得到圖1。實施例三按照實施例一的方法所制備的賴氨酸表面，通過蛋白質(zhì)印跡技術(shù)來測試其在血漿 中排斥非特異性蛋白質(zhì)吸附及選擇性結(jié)合纖溶酶原的能力。首先，將改性與未改性的聚氨 酯膜片在血漿中浸泡3h，pH為7. 4的PBS或TBS緩沖液清洗三次后用2% (w/v)的十二 烷基硫酸鈉(SDS)溶液將吸附于膜片表面的蛋白質(zhì)洗脫下來。然后，將該蛋白質(zhì)洗脫液在 12% SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行電泳，再將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，以5%的脫脂奶粉 對PVDF膜進(jìn)行封閉，再依次結(jié)合所研究的目標(biāo)蛋白質(zhì)的一抗和堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗(該 實施例中研究的是纖維蛋白原和纖溶酶原)，最終通過作用于底物5-溴-4-氯-3-吲哚磷 酸和氮蘭四唑而顯色，見圖2。顯示出條帶說明膜片表面吸附了相應(yīng)的蛋白質(zhì)。實施例四按照實施例一的方法所制備的賴氨酸表面，通過血漿復(fù)鈣化實驗檢測其溶解初生 血栓的性能。首先，將改性與未改性的聚氨酯膜片在血漿中浸泡3h，用pH為7. 4的PBS或 TBS緩沖液清洗三次，再浸泡于0. lmg/mL組織型纖溶酶原激活劑(t_PA)中30min并用pH 為7. 4的PBS或TBS緩沖液清洗三次。將洗后的聚氨酯膜片置于新的96孔板中，依次加入 0. ImL血漿和0. ImLCaCl2溶液中(0. 025M)。最后在酶標(biāo)儀上讀取405nm處的吸光值變化 并獲得圖3，曲線上升說明形成了血栓，上升后又下降說明形成的血栓被溶解。
權(quán)利要求
一種具有溶解初生血栓功能的聚氨酯材料的制備方法，首先，以聚氨酯材料為基層，在聚氨酯基層表面修飾親水性高分子作為惰性間隔臂；然后，活化惰性間隔臂的側(cè)鏈末端，然后結(jié)合生物活性分子ε 賴氨酸，得到所述具有溶解初生血栓功能的聚氨酯材料；其特征在于，其中，所述親水性高分子為聚甲基丙烯酸羥乙酯并且，在聚氨酯基層表面修飾親水性高分子的方法為(1)丙烯酰氧異硫氰酸酯溶液和甲基丙烯酰氧異硫氰酸酯溶液的制備將甲基丙烯酰氯或丙烯酰氯緩慢滴入硫氰酸鉀溶液中，攪拌反應(yīng)，反應(yīng)溫度為0～35℃，反應(yīng)時間為1～24小時，得到甲基丙烯酰氧異硫氰酸酯溶液或丙烯酰氧異硫氰酸酯溶液；(2)聚氨酯材料表面接碳碳雙鍵將聚氨酯材料置于甲基丙烯酰氧異硫氰酸酯溶液或丙烯酰氧異硫氰酸酯溶液中，在三乙胺存在下進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)溫度為45～80℃，反應(yīng)時間為2～12小時，得到表面接有碳碳雙鍵的聚氨酯材料；(3)聚氨酯材料表面共聚合接枝聚甲基丙烯酸羥乙酯將表面接有碳碳雙鍵的聚氨酯材料置于含有引發(fā)劑和甲基丙烯酸 2 羥基乙酯的甲醇溶液中進(jìn)行表面自由基聚合反應(yīng)，反應(yīng)溫度為60～80℃，反應(yīng)時間為2～12小時，得到聚甲基丙烯酸羥乙酯修飾的聚氨酯；其中，所述引發(fā)劑為偶氮二異丁腈、偶氮二異庚腈、過氧化二苯甲酰、過氧化二碳酸二乙基己酯、異丙苯過氧化氫、過硫酸鉀 亞硫酸鹽體系或過氧化氫 亞鐵酸鹽體系。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，活化惰性間隔臂的側(cè)鏈末端，然后 結(jié)合生物活性分子￡ _賴氨酸的方法具體包括以下步驟將聚甲基丙烯酸羥乙酯修飾的聚 氨酯置于琥珀亞胺碳酸二酯溶液中，在三乙胺存在下進(jìn)行室溫反應(yīng)，反應(yīng)時間為4 12小 時；將反應(yīng)后的聚氨酯清洗后置于￡ _氨基被叔丁氧羰基保護(hù)的賴氨酸溶液中，室溫反應(yīng) 12 24小時；反應(yīng)結(jié)束后用水清洗改性的聚氨酯，再置于三氟乙酸溶液中進(jìn)行保護(hù)基團的 脫除，最后用水充分清洗，得到￡ -賴氨酸修飾的聚氨酯材料；所述的三氟乙酸溶液為25 30%水溶液，脫保護(hù)溫度為15 25°C，脫保護(hù)時間為1 2小時。
3.采用權(quán)利要求1所述制備方法制得的具有溶解初生血栓功能的聚氨酯材料。
4.一種具有高效溶解初生血栓功能的聚氨酯材料，所述聚氨酯材料由基層和設(shè)置在基 層表面的修飾層構(gòu)成，其中基層由聚氨酯材料構(gòu)成，修飾層是在該基層表面通過化學(xué)修飾 方法而形成，其特征在于，修飾層中含有通過表面自由基共聚合接枝在基層表面的聚甲基 丙烯酸羥乙酯以及在聚甲基丙烯酸羥乙酯側(cè)鏈末端共價結(jié)合的￡ _賴氨酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)用功能高分子材料領(lǐng)域，具體涉及一種具有高效溶解初生血栓功能的聚氨酯材料的制備方法。首先，以聚氨酯材料為基層，在聚氨酯基層表面修飾親水性高分子作為惰性間隔臂；然后，活化惰性間隔臂的側(cè)鏈末端，然后結(jié)合生物活性分子ε-賴氨酸，得到所述具有溶解初生血栓功能的聚氨酯材料；其中，所述親水性高分子為聚甲基丙烯酸羥乙酯。通過利用PHEMA的生物惰性和梳狀結(jié)構(gòu)，一方面可以在排斥非特異性蛋白質(zhì)吸附的同時提高對纖溶酶原的特異性結(jié)合，另一方面可以高密度接枝賴氨酸分子進(jìn)而提高結(jié)合纖溶酶原的效率，最終達(dá)到高效溶解初生血栓的目的。
文檔編號C08J7/16GK101942105SQ201010270930
公開日2011年1月12日 申請日期2010年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月3日
發(fā)明者李丹, 王莎莎, 陳紅 申請人:蘇州大學(xué)