專利名稱：一種特異性純化高分子尿激酶層析介質(zhì)及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高分子尿激酶層析介質(zhì)及制備方法，尤其涉及一種特異性純化高
分子尿激酶層析介質(zhì)及制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
根據(jù)市場(chǎng)調(diào)研機(jī)構(gòu)Datamonitor公司預(yù)測(cè)，到2015年，全球新穎抗血栓藥物創(chuàng) 造的市場(chǎng)總價(jià)值將達(dá)到100億美元左右。其中血栓溶解劑纖溶酶原激活劑(PAs)類的 藥物就達(dá)15億美元。而主要的纖溶酶原激活劑包括鏈激酶(Str印tokinase)、尿激酶 (Urokinase)、組織型纖維蛋白溶酶原激活劑(tPA)等。隨著世界人口老齡化的進(jìn)程，對(duì)這 類藥物的需求必然進(jìn)一步增加。作為溶栓類藥物中的一種，尿激酶是可直接促使無活性的 纖溶酶原變?yōu)橛谢钚缘睦w溶酶，使組成血栓的纖維蛋白水解。臨床上用于腦血栓形成、腦栓 塞、周圍動(dòng)脈或靜脈血栓癥、肺栓塞、急性心肌梗死等。也可用于眼科溶解眼前房的血纖維、 血塊。因此在臨床上用途廣泛。 尿激酶是人體腎細(xì)胞產(chǎn)生的一種堿性蛋白酶，會(huì)因人體代謝而隨尿液排出，因此 人尿是生產(chǎn)尿激酶的最主要來源之一。尿激酶在體內(nèi)合成時(shí)為一分子量為55kD的單鏈多 肽酶原，稱為單鏈尿激酶(sc-uPA)。在人體尿液中，尿胃蛋白酶可把尿激酶原切割為雙鏈形 式具有高生物活性的天然尿激酶分子，其分子量為54700D。天然尿激酶分子雙鏈通過二硫 鍵連接，稱為雙鏈尿激酶(tc-uPA)，也稱為高分子尿激酶(HUK)。受到各種酶的切割作用， 高分子尿激酶會(huì)進(jìn)一步降解為分子量為31300D的低分子尿激酶(LUK)。在溶栓藥物的應(yīng)用 中，雖然L區(qū)具有一定的體外溶栓生物活性，但由于缺少N-端的兩個(gè)重要模塊(生長因子 樣模塊G和Kringle模塊K)，在體內(nèi)的溶栓作用機(jī)制不明確，可能會(huì)引起溶血等嚴(yán)重副反 應(yīng)，而且高分子尿激酶在體內(nèi)的半衰期較長，因此藥用的尿激酶制劑產(chǎn)品對(duì)高分子尿激酶 含量有明確規(guī)定。其中美國FDA及歐州藥典EP明確規(guī)定在尿激酶制劑中，高分子尿激酶的 含量必須大于90% 。我國藥典2005版規(guī)定，高分子尿激酶含量不低于90% ，而實(shí)際上國際 原料藥市場(chǎng)對(duì)高分子尿激酶含量的要求更高。因此，從生產(chǎn)工藝的角度來說，高分子尿激酶 的收率和純度是評(píng)價(jià)工藝優(yōu)異的重要指標(biāo)。 我國是一個(gè)人口大國，生產(chǎn)尿激酶的原材料豐富，但由于缺乏較有效的分離純化 方法，國內(nèi)對(duì)于尿激酶的生產(chǎn)大多局限于粗品，難以精制到高純度的高分子尿激酶制劑。因 此研究特異性強(qiáng)，純化效果好，酶活性回收率高的尿激酶純化方法具有顯著的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。國 內(nèi)外有不少學(xué)者在親和配位體和純化介質(zhì)方面進(jìn)行了嘗試，如研究單克隆抗體親和層析 (李秀珍等，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，1988， 12 (3) :195-198)，篩選和開發(fā)對(duì)尿激酶催化活性 域具有高親和性的系列新穎配位體(李榮秀等，專利號(hào)ZL 99124231. 9)，開發(fā)聯(lián)苯胺-瓊 脂糖親和層析(鄭光會(huì)等，專利號(hào)91100702. 4)，開發(fā)對(duì)氨基苯甲脒-s印harose 6B親和 層析(司世麟等，河北科學(xué)院學(xué)報(bào)，1991，4 :41-46 ;陳祥勝等，湖北中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008， 10(4) :30-31)，研究頭孢唑啉-S印harose 4B親和層析介質(zhì)(曹學(xué)君等，生物化學(xué)與生物物 理學(xué)報(bào)，1998，30(6) :635-637)，以及開發(fā)基于胍基和氨基苯甲脒的磁性親和層析介質(zhì)(董聿生等，高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)，2002，23(6) :1013-1017 ;董聿生等，色譜，2001， 19 (1) :20-24)
等。上述對(duì)尿激酶純化介質(zhì)及工藝的改進(jìn)和探索只注重了尿激酶生物活性的最終回收率和純化倍數(shù)，卻難以有效分離高分子尿激酶和低分子尿激酶，因此實(shí)際效果有限。其主要原因是傳統(tǒng)親和層析都是基于尿激酶分子的P鏈c-端絲氨酸蛋白酶催化活性域活性位點(diǎn)(His204，Asp255和Ser356)組成的"口袋"高級(jí)結(jié)構(gòu)，而高分子尿激酶和低分子尿激酶都具有此天然高級(jí)結(jié)構(gòu)，因此單純用親和層析往往難以達(dá)到分離高分子尿激酶和低分子尿激酶的要求，還需要借助于凝膠過濾層析等步驟進(jìn)行進(jìn)一步分離，費(fèi)時(shí)費(fèi)力并且尿激酶活力損失。而且人尿蛋白中含有許多具有相似"口袋"結(jié)構(gòu)的蛋白或酶類，如胰蛋白酶和尿胰激肽釋放酶等， 一般親和層析對(duì)這些生化分子也缺少分辨力。因此，本發(fā)明的目的是獲得一種適用于高效分離高分子尿激酶和低分子尿激酶的介質(zhì)并用于高純度高分子尿激酶的大規(guī)模生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種特異性純化高分子尿激酶層析介質(zhì)及制備方法和應(yīng)用，該介質(zhì)能用于從尿激酶溶液中一步純化獲得高純度高分子尿激酶。 本發(fā)明是這樣來實(shí)現(xiàn)的，其特征是一種特異性純化高分子尿激酶層析介質(zhì)其結(jié)構(gòu)為HOOC-(CH2)4(NH)C-O-R-O-C(NH)NH(CH2)4-C0-X，
X = NHC6H5C (NH) NH2 ， R代表交聯(lián)瓊脂糖基質(zhì)。 本發(fā)明所述的一種特異性純化高分子尿激酶層析介質(zhì)其制備方法為 (1)交聯(lián)瓊脂糖基質(zhì)的活化取瓊脂糖作為基質(zhì)，將基質(zhì)與0. 5g/mL溴化氰在
pH > 11堿性條件下冰水浴中活化，得到活化的瓊脂糖基質(zhì)； (2)5-氨基戊酸-瓊脂糖復(fù)合物的制備活化的瓊脂糖基質(zhì)與5-氨基戊酸摩爾比大于1 : 2偶聯(lián)，得到5-氨基戊酸_瓊脂糖膠復(fù)合物； (3) 5-氨基戊酸_瓊脂糖膠_對(duì)氨基苯甲脒復(fù)合物的的制備5-氨基戊酸_瓊脂糖膠復(fù)合物與對(duì)氨基苯甲脒縮合，其中控制5-氨基戊酸與對(duì)氨基苯甲脒的摩爾分子比控
制為io : i-io : 5，縮合反應(yīng)得到目的層析介質(zhì)。
本發(fā)明的應(yīng)用為尿激酶特異性純化介質(zhì)裝層析柱，用預(yù)處理后尿激酶粗提液
進(jìn)行上樣，然后經(jīng)過洗滌和兩階段洗脫步驟，獲得目的高分子尿激酶產(chǎn)品，其中上樣和
洗滌步驟中緩沖液為pH6. 0-8. 0的0. 2-0. 5mol/L醋酸鹽緩沖液，第一階段洗脫緩沖液為pH4. 0-6. 0的1. 0-1. 5mol/L磷酸鹽緩沖液；第二階段洗脫緩沖液為pH4. 0-6. 0的0. 2-0. 5mol/L磷酸鹽緩沖液。 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是制備過程簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和，適用于高效分離高分子尿激酶和低分子尿激酶的介質(zhì)，能夠?qū)嵤└呒兌雀叻肿幽蚣っ傅墓I(yè)生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式(1) 1L高分子尿激酶特異性層析介質(zhì)的合成 將購買的S印arose-CL4B濕膠(裸膠)1L抽去保護(hù)劑，用水洗滌一次，再抽干，加水至2000mL，預(yù)先用冰水浴((TC )保溫，磁力攪拌重懸。用100mL的0. 5g/mL溴化氰溶液活化，邊滴加溴化氰溶液邊用Na0H溶液調(diào)pH值至10. 0-11. 0。加完溴化氰溶液后用Na0H溶液維持pHll. 0至15min左右。反應(yīng)完后用預(yù)冷沙濾漏斗抽濾至干，抽濾瓶中放置過量的固體硫酸亞鐵粉末以去除未反應(yīng)的溴化氰。用預(yù)冷的稀HC1溶液(3mmol/L HC1)進(jìn)行洗滌10L體積。將抽干的活化瓊脂糖膠S印arose-CL4B約1000ml加入到pH9. 3， lmol/L的5-氨基戊酸溶液2000ml中，25t:攪拌遮光反應(yīng)12小時(shí)，砂芯漏斗濾干，然后用0. 5mol/L NaCl洗滌IOL后再用純水洗滌IOL后，將1000ml 5-氨基戊酸-瓊脂糖膠懸浮于適量水中、攪拌。將1000mL對(duì)氨基苯甲脒溶液(pH4. 5，0. 5mol/L)和50mL 0. 5mol/L縮合劑(EDC. HC1)同時(shí)加入到懸浮的膠中，將pH調(diào)至5. 0，25"室溫下反應(yīng)5小時(shí)，砂芯漏斗濾干，O. 5mol/L NaCl洗滌IOL，純水洗滌IOL，然后抽干并常溫保存于0. lmol/L NaAC-20X乙醇(pH7. 0)溶液中備用。 (2)高分子尿激酶特異性純化介質(zhì)用于尿激酶的純化 取成年男性尿1000L，過濾，調(diào)節(jié)pH至8.0后用0. 8mol/L硫酸氨沉淀，沉淀用0. lmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7. 0)溶解，然后用離子交換層析對(duì)尿激酶活性組分進(jìn)行純化分離。洗脫液上(1)中合成純化介質(zhì)填裝的層析柱(預(yù)先用P朋.0-8. 0的0. 2-0. 5mo1/L醋酸鹽緩沖液平衡)，然后依次用含1.0-1. 5mol/L磷酸鹽緩沖液(pH4. 0-6.0)和含0. 2-0. 5mol/L磷酸鹽緩沖液(pH4. 0_6. 0)洗脫，收集第二次洗脫液，進(jìn)行超濾脫鹽，并且冷凍干燥獲得高分子尿激酶產(chǎn)品。整個(gè)工藝中高分子尿激酶回收率達(dá)98%以上，產(chǎn)品用SDS-PAGE法檢測(cè)為單一條帶，HPLC檢測(cè)高分子尿激酶含量為99. 5%以上，生物活性達(dá)到20萬單位/mg p。
權(quán)利要求
一種特異性純化高分子尿激酶層析介質(zhì)，其特征是結(jié)構(gòu)為HOOC-(CH2)4(NH)C-O-R-O-C(NH)NH(CH2)4-CO-X，X＝NHC6H5C(NH)NH2，R代表交聯(lián)瓊脂糖基質(zhì)。
2. —種權(quán)利要求1所述的一種特異性純化高分子尿激酶層析介質(zhì)的制備方法，其特征 是制備方法為(1) 交聯(lián)瓊脂糖基質(zhì)的活化取瓊脂糖作為基質(zhì)，將基質(zhì)與0. 5g/mL溴化氰在pH > 11 堿性條件下冰水浴中活化，得到活化的瓊脂糖基質(zhì)；(2) 5-氨基戊酸-瓊脂糖復(fù)合物的制備活化的瓊脂糖基質(zhì)與5-氨基戊酸摩爾比大于 1 : 2偶聯(lián)，得到5-氨基戊酸-瓊脂糖膠復(fù)合物；(3) 5-氨基戊酸-瓊脂糖膠_對(duì)氨基苯甲脒復(fù)合物的的制備5-氨基戊酸-瓊脂糖膠 復(fù)合物與對(duì)氨基苯甲脒縮合，其中控制5-氨基戊酸與對(duì)氨基苯甲脒的摩爾分子比控制為 10 : 1-10 : 5，縮合反應(yīng)得到目的層析介質(zhì)。
3. —種權(quán)利要求1所述的一種特異性純化高分子尿激酶層析介質(zhì)的應(yīng)用，其特征是尿 激酶特異性純化介質(zhì)裝層析柱，用預(yù)處理后尿激酶粗提液進(jìn)行上樣，然后經(jīng)過洗滌和兩階 段洗脫步驟，獲得目的高分子尿激酶產(chǎn)品，其中上樣和洗滌步驟中緩沖液為P朋.0-8. 0的 0. 2-0. 5mol/L醋酸鹽緩沖液，第一階段洗脫緩沖液為pH4. 0-6. 0的1. 0-1. 5mol/L磷酸鹽緩 沖液；第二階段洗脫緩沖液為PH4. 0-6. 0的0. 2-0. 5mol/L磷酸鹽緩沖液。
全文摘要
一種特異性純化高分子尿激酶層析介質(zhì)，其特征是結(jié)構(gòu)為HOOC-(CH2)4(NH)C-O-R-O-C(NH)NH(CH2)4-CO-X，X＝NHC6H5C(NH)NH2，R代表交聯(lián)瓊脂糖基質(zhì)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是制備過程簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和，適用于高效分離高分子尿激酶和低分子尿激酶的介質(zhì)，能夠?qū)嵤└呒兌雀叻肿幽蚣っ傅墓I(yè)生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C08B37/00GK101693748SQ20091018624
公開日2010年4月14日 申請(qǐng)日期2009年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月15日
發(fā)明者萬偲, 劉志勇, 楊華英, 王啟要, 胡小光 申請(qǐng)人:南昌市浩然生物醫(yī)藥有限公司;