專利名稱：：一種高取代度精氨酸-殼聚糖及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：甲殼素是自然界中產(chǎn)量?jī)H次于纖維素的第二大類生物材料，廣泛存在于節(jié)肢動(dòng)物蝦、蟹及昆蟲(chóng)的外殼以及低等植物菌類、藻類的細(xì)胞等細(xì)胞壁中。殼聚糖是甲殼素經(jīng)濃堿處理脫乙酰的產(chǎn)物，它是由氨基葡萄糖通過(guò)P-1,4糖苷鍵連接起來(lái)的一種天然高分子線型多糖，其化學(xué)名為p-(l，4)-2-氨基-脫氧-D-葡萄糖。作為一種天然聚合物，殼聚糖具有優(yōu)良的性質(zhì)，如良好的生物相容性、無(wú)毒性、生物可降解性、抗細(xì)菌、抗真菌及抗病毒等。近些年，其抗病原細(xì)菌的性質(zhì)得到了廣泛的研究。研究表明帶正電的殼聚糖通過(guò)吸附于帶負(fù)電的細(xì)菌表面，然后通過(guò)阻斷營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)或者進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)部從而干擾其代謝等方式來(lái)抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。為了通過(guò)增加殼聚糖所帶正電荷而更進(jìn)一步增強(qiáng)其的抗菌性能，于是研究人員合成了N，N，N-三甲基化殼聚糖(JiaZSetal.Carbohydrateresearch2001;333:1-6.)、N，N，N-二乙基甲基殼聚糖(AvadiMRet.al.EuropeanPolymerJournal2004:40;1355-1361.)、甜菜堿殼聚糖(HolappaJelal.CarbohydratePolymers2006;65:114-118.)等殼聚糖衍生物并做了抗菌性能的評(píng)價(jià)。根據(jù)化學(xué)規(guī)律，基團(tuán)所帶正電荷強(qiáng)弱的排序?yàn)殡一导句@根〉烷基胺〉芳香雜化胺〉酰胺。胍基作為目前已知的堿性最強(qiáng)的有機(jī)堿，已得到廣泛的應(yīng)用，如美國(guó)梅勒克和貝茨公司的產(chǎn)品多果定(Dogdine)的殺菌劑就是十二烷基醋酸胍；雙胍辛乙酸鹽是一種新的廣譜殺菌劑，對(duì)農(nóng)業(yè)和園藝的主要真菌有很高的生長(zhǎng)抑制活性。當(dāng)含胍基的物質(zhì)，如精氨酸、胍基乙酸、胍基丙酸，與殼聚糖結(jié)合后形成具有良好的生物活性。有研究人員通過(guò)NHS/EDC作為催化劑合成了精氨酸-殼聚糖衍生物(LiuWGetal.JournalofMaterialsScience:MaterialsinMedicine2004;15:1199-1203.)，僅能得到取代度低于20.1%的產(chǎn)物。本發(fā)明以一氯乙酸作為"分子臂"，通過(guò)三步反應(yīng)將精氨酸高效率結(jié)合到殼聚糖上，其取代度最高可達(dá)到了170%，可在皮膚組織工程支架領(lǐng)域獲得廣泛應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是解決上述問(wèn)題而提供一種高取代度精氨酸-殼聚糖及其制備方法和應(yīng)用，該高取代度精氨酸-殼聚糖結(jié)合了殼聚糖和胍的生物活性，表現(xiàn)出比殼聚糖更強(qiáng)的抗菌性能。本發(fā)明所釆用的技術(shù)方案是-.一種高取代度精氨酸-殼聚糖，所述高取代度精氨酸-殼聚糖以一氯乙酸作為"分子臂"，將精氨酸高效率共價(jià)結(jié)合到殼聚糖的自由氨基或自由羥基上，其結(jié)構(gòu)式為=—HR2=—CH2—C一NH一H—CH2CH2CH2—NH—C—NH2COOH當(dāng)R'=R2,R"-R2時(shí)，該高取代度精氨酸-殼聚糖為精氨酸-N，O-殼聚糖；當(dāng)R'=1^,R"=112時(shí)，該高取代度精氨酸-殼聚糖為精氨酸-O-殼聚糖；當(dāng)R，=R2,R"=1^時(shí)，該高取代度精氨酸-殼聚糖為精氨酸-N-殼聚糖。優(yōu)選地，所述高取代度精氨酸-殼聚糖以一氯乙酸作為"分子臂"，將精氨酸高效率共價(jià)結(jié)合到殼聚糖的自由氨基和自由羥基上。優(yōu)選地，所述殼聚糖的分子量在0.5~100萬(wàn)之間，其脫乙酰度為50~99%，所述精氨酸-N,O-殼聚糖的取代度為0~170%,所述精氨酸-O-殼聚糖的取代度為0~91%,所述精氨酸-N-殼聚糖的取代度為0~95%。該高取代度精氨酸-殼聚糖的制備方法，所述精氨酸-N，0-殼聚糖的制備方法為(1)殼聚糖經(jīng)異丙醇和氫氧化鈉溶液膨脹和堿化處理后，再與一氯乙酸于40~80'C反應(yīng)26小時(shí)，純化干燥后得N,0-羧甲基殼聚糖；(2)N,0-羧甲基殼聚糖在二甲基甲酰胺/水(DMF/H20)混合液作為反應(yīng)介質(zhì)下，與二氯亞砜(S0C12)于40~80r反應(yīng)4~8小時(shí)，純化干燥后得N，0-殼聚糖酰氯衍生物；(3)N，O-殼聚糖酰氯衍生物溶于二甲亞砜(DMS0)中，再與精氨酸反應(yīng)12~24小時(shí)，純化干燥后得高取代度精氨酸-N，O-殼聚糖；所述精氨酸-O-殼聚糖的制備方法(1)殼聚糖經(jīng)異丙醇和氫氧化鈉溶液膨脹和堿化處理后，再與一氯乙酸于0~15匸反應(yīng)2~6小時(shí)，純化干燥后得O-羧甲基殼聚糖；(2)0-羧甲基殼聚糖在二甲基甲酰胺/水(DMF/H20)混合液作為反應(yīng)介質(zhì)下，與二氯亞砜(S0C12)于40~80。C反應(yīng)2~6小時(shí)，純化干燥后得0-殼聚糖酰氯衍生物；(3)O-殼聚糖酰氯衍生物溶于適量的二甲亞砜(DMS0)中，再與精氨酸反應(yīng)12~24小時(shí)，純化干燥后得高取代度精氨酸-O-殼聚糖；所述精氨酸-N-殼聚糖的制備方法(1)將殼聚糖溶于酸液后，與乙醛酸反應(yīng)2~6小時(shí)后再加以硼氫化鈉還原，純化干燥后得N-羧甲基殼聚糖；(2)N-羧甲基殼聚糖在二甲基甲酰胺/水(DMF/H20)混合液作為反應(yīng)介質(zhì)下，與二氯亞砜(S0C12)于40~80'C反應(yīng)2~6小時(shí)，純化干燥后得N-殼聚糖酰氯衍生物；(3)N-殼聚糖酰氯衍生物溶于適量的二甲亞砜(DMS0)中，再與精氨酸反應(yīng)12~24小時(shí)，純化干燥后得高取代度精氨酸-N-殼聚糖。該高取代度精氨酸-殼聚糖的應(yīng)用，將所得高取代度精氨酸-殼聚糖粉末溶解在濃度為0.5~2%(v/v)的醋酸溶液，配成濃度為0.5~1%的溶液，然后通過(guò)微孔濾膜過(guò)濾除菌，得到高取代度精氨酸-殼聚糖抗菌溶液。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)發(fā)明利用了殼聚糖的自由氨基和自由羥基，經(jīng)三步反應(yīng)后得到高取代度精氨酸-殼聚糖。它結(jié)合了殼聚糖和胍類物質(zhì)的生物活性，表現(xiàn)出比殼聚糖更強(qiáng)的抗菌活性，而且原料來(lái)源便宜，制備方法簡(jiǎn)單，具有反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)品易于純化，容易實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，具有很好的產(chǎn)業(yè)化前景。所以可以作為新型抗菌劑、抗菌藥物等在醫(yī)藥、紡織、食品保鮮等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景。具體實(shí)施方式實(shí)施例1將6g殼聚糖放入250ml三口燒瓶中，再向瓶中加入50ml異丙醇，在室溫下用電動(dòng)攪拌器以400r/min的速度攪拌20min,使兩者充分混合。將37.5ml濃度為40%的氫氧化鈉溶液，分五次注入三口燒瓶中，每次間隔5分鐘。將所得的堿性溶液攪拌l小時(shí)后，再將總計(jì)6g的一氯乙酸也分五批投入瓶中，每批間隔5分鐘。隨后，將混合體系升溫至6(TC，并在此溫度下反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，待反應(yīng)體系冷卻至室溫后，向其中加入5ml去離子水，再加入冰醋酸調(diào)節(jié)pH到7.0，將混合溶液過(guò)濾。用70%至90%的乙醇溶液洗滌過(guò)濾得到固體。將收集到的固體產(chǎn)物置于烘箱中60'C干燥，所得產(chǎn)物為N，O-羧甲基殼聚糖。將5gN，0-羧甲基殼聚糖放入250ml三口燒瓶中，再向瓶中加入DMF/H20(90/10,v/v)，電動(dòng)攪拌30min。再加入40mlS0C12，于60。C反應(yīng)6小時(shí)。反應(yīng)結(jié)東后，待反應(yīng)體系冷卻至室溫后，再用95%的酒精洗滌6遍以去除雜質(zhì)。將收集到的固體產(chǎn)物置于烘箱中6(TC過(guò)夜干燥，所得產(chǎn)物為N，0-殼聚糖酰氯衍生物。將4.5gN,0-殼聚糖酰氯衍生物溶于適量的DMSO中，攪拌均句，此為溶液A;將3.35g精氨酸溶解于10mlH20中，此為溶液B，將溶液A和溶液B混合并通過(guò)iy。Na0H調(diào)節(jié)溶液pH至910，反應(yīng)15小時(shí)。通過(guò)95°/的酒精洗滌6遍以去除雜質(zhì)。將收集到的固體產(chǎn)物置于烘箱中6(TC干燥，所得產(chǎn)物即為高取代度精氨酸-N，O-殼聚糖。實(shí)施例2將6g殼聚糖放入250ml三口燒瓶中，再向瓶中加入50ml異丙醇，在室溫下用電動(dòng)攪拌器以400iVmin的速度攪拌20min，使兩者充分混合。將37.5ml濃度為40%的氫氧化鈉溶液，分五次注入三口燒瓶中，每次間隔5分鐘。將所得的堿性溶液攪拌l小時(shí)后，再將總計(jì)6g的一氯乙酸也分五批投入瓶中，每批間隔5分鐘。隨后，將混合體系升溫至60°C,并在此溫度下反應(yīng)4小時(shí)。反應(yīng)結(jié)東后，待反應(yīng)體系冷卻至室溫后，向其中加入5ml去離子水，再加入冰醋酸調(diào)節(jié)pH到7.0,將混合溶液過(guò)濾。用70%至90%的乙醇溶液洗滌過(guò)濾得到固體。將收集到的固體產(chǎn)物置于烘箱中6(TC干燥,所得產(chǎn)物為N,O-羧甲基殼聚糖。將5gN，O-羧甲基殼聚糖放入250ml三口燒瓶中，再向瓶中加入DMF/H20(90/10，v/v)，電動(dòng)攪拌30min。再加入40mlS0C12，于60。C反應(yīng)6小時(shí)。反應(yīng)結(jié)東后，待反應(yīng)體系冷卻至室溫后，再用95%的酒精洗滌6遍以去除雜質(zhì)。將收集到的固體產(chǎn)物置于烘箱中6(TC過(guò)夜干燥，所得產(chǎn)物為N，O-殼聚糖酰氯衍生物。將4.5gN，O-殼聚糖酰氯衍生物溶于適量的DMSO中，攪拌均勾，此為溶液A;將3.35g精氨酸溶解于10ml仏0中，此為溶液B，將溶液A和溶液B混合并通過(guò)1%NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至910，反應(yīng)15小時(shí)。通過(guò)95%的酒精洗滌6遍以去除雜質(zhì)。將收集到的固體產(chǎn)物置于烘箱中60。C干燥，所得產(chǎn)物即為高取代度精氨酸-N，O-殼聚糖。實(shí)施例3將6g殼聚糖放入250ml三口燒瓶中，再向瓶中加入50ml異丙醇，在室溫下用電動(dòng)攪拌器以400r/min的速度攪拌20min，使兩者充分混合。將37.5ml濃度為40%的氫氧化鈉溶液，分五次注入三口燒瓶中，每次間隔5分鐘。將所得的堿性溶液攪拌l小時(shí)后，再將總計(jì)6g的一氯乙酸也分五批投入瓶中，每批間隔5分鐘。隨后，將混合體系升溫至6(TC，并在此溫度下反應(yīng)6小時(shí)。反應(yīng)結(jié)東后，待反應(yīng)體系冷卻至室溫后，向其中加入5ml去離子水，再加入冰醋酸調(diào)節(jié)pH到7.0,將混合溶液過(guò)濾。用70%至90%的乙醇溶液洗滌過(guò)濾得到固體。將收集到的固體產(chǎn)物置于烘箱中6(TC干燥,所得產(chǎn)物為N，0-羧甲基殼聚糖。將5gN，0-羧甲基殼聚糖放入250ml三口燒瓶中，再向瓶中加入,/H20(90/10，v/v)，電動(dòng)攪拌30min。再加入40mlS0C12，于60。C反應(yīng)6小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，待反應(yīng)體系冷卻至室溫后，再用95%的酒精洗滌6遍以去除雜質(zhì)。將收集到的固體產(chǎn)物置于烘箱中6(TC過(guò)夜干燥，所得產(chǎn)物為N,O-殼聚糖酰氯衍生物。將4.5gN，O-殼聚糖酰氯衍生物溶于適量的DMSO中，攪拌均勻，此為溶液A;將3.35g精氨酸溶解于10mlH2O中，此為溶液B,將溶液A和溶液B混合并通過(guò)iy。NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至910，反應(yīng)15小時(shí)。通過(guò)95%的酒精洗滌6遍以去除雜質(zhì)。將收集到的固體產(chǎn)物置于烘箱中6(TC干燥，.所得產(chǎn)物即為高取代度精氨酸-N，0-殼聚糖。實(shí)施例4將6g殼聚糖放入250ml三口燒瓶中，再向瓶中加入50ml異丙醇，在室溫下用電動(dòng)攪拌器以400r/min的速度攪拌20min,使兩者充分混合。將37.5ml濃度為40%的氫氧化鈉溶液，分五次注入三口燒瓶中，每次間隔5分鐘。將所得的堿性溶液攪拌l小時(shí)后，再將總計(jì)6g的一氯乙酸也分五批投入瓶中，每批間隔5分鐘。隨后，將混合體系溫度控制在015'C，并在此溫度范圍下反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)結(jié)東后，待反應(yīng)體系冷卻至室溫后，向其中加入5ml去離子水，再加入冰醋酸調(diào)節(jié)pH到7.0，將混合溶液過(guò)濾。用70%至90%的乙醇溶液洗滌過(guò)濾得到固體。將收集到的固體產(chǎn)物置于烘箱中60t:干燥，所得產(chǎn)物為O-羧甲基殼聚糖。將5gN，0-羧甲基殼聚糖放入250ml三口燒瓶中，再向瓶中加入DMF/H20(90/10，v/v)，電動(dòng)攪拌30min。再加入40mlS0C1"于60。C反應(yīng)6小時(shí)。反應(yīng)結(jié)東后，待反應(yīng)體系冷卻至室溫后，再用95%的酒精洗滌6遍以去除雜質(zhì)。將收集到的固體產(chǎn)物置于烘箱中6(TC過(guò)夜干燥，所得產(chǎn)物為O-殼聚糖酰氯衍生物。將4.5gN,0-殼聚糖酰氯衍生物溶于適量的DMSO中，攪拌均勻，此為溶液A;將3.35g精氨酸溶解于10mlH2O中，此為溶液B，將溶液A和溶液B混合并通過(guò)iy。NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至910,反應(yīng)15小時(shí)。通過(guò)95%的酒精洗滌6遍以去除雜質(zhì)。將收集到的固體產(chǎn)物置于烘箱中6(TC干燥，所得產(chǎn)物即為高取代度精氨酸-o-殼聚糖。實(shí)施例5將6g殼聚糖放入250ml三口燒瓶中，再向瓶中加入50ml異丙醇，在室溫下用電動(dòng)攪拌器以400r/min的速度攪拌20min，使兩者充分混合。將37.5ml濃度為40%的氫氧化鈉溶液，分五次注入三口燒瓶中，每次間隔5分鐘。將所得的堿性溶液攪拌l小時(shí)后，再將總計(jì)6g的一氯乙酸也分五批投入瓶中，每批間隔5分鐘。隨后，將混合體系溫度控制在0~15匸，并在此溫度范圍下反應(yīng)4小時(shí)。反應(yīng)結(jié)東后，待反應(yīng)體系冷卻至室溫后，向其中加入5ml去離子水，再加入冰醋酸調(diào)節(jié)pH到7.0，將混合溶液過(guò)濾。用70%至90%的乙醇溶液洗滌過(guò)濾得到固體。將收集到的固體產(chǎn)物置于烘箱中6(TC干燥，所得產(chǎn)物為O-羧甲基殼聚糖。將5gN，O-羧甲基殼聚糖放入250ml三口燒瓶中，再向瓶中加入DMF/H20(90/10，v/v)，電動(dòng)攪拌30min。再加入40mlS0C12,于6(TC反應(yīng)6小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，待反應(yīng)體系冷卻至室溫后，再用95%的酒精洗滌6遍以去除雜質(zhì)。將收集到的固體產(chǎn)物置于烘箱中6(TC過(guò)夜干燥，所得產(chǎn)物為O-殼聚糖酰氯衍生物。將4.5gN，O-殼聚糖酰氯衍生物溶于適量的DMSO中，攪拌均勻，此為溶液A;將3.35g精氨酸溶解于10mlH2O中，此為溶液B,將溶液A和溶液B混合并通過(guò)lWaOH調(diào)節(jié)溶液pH至910，反應(yīng)15小時(shí)。通過(guò)95°/的酒精洗滌6遍以去除雜質(zhì)。將收集到的固體產(chǎn)物置于烘箱中6(TC干燥，所得產(chǎn)物即為高取代度精氨酸-o-殼聚糖。實(shí)施例6將6g殼聚糖放入250ml三口燒瓶中，再向瓶中加入50ml異丙醇，在室溫下用電動(dòng)攪拌器以400r/min的速度攪拌20min，使兩者充分混合。將37.5ml濃度為40%的氫氧化鈉溶液，分五次注入三口燒瓶中，每次間隔510分鐘。將所得的堿性溶液攪拌l小時(shí)后，再將總計(jì)6g的一氯乙酸也分五批投入瓶中，每批間隔5分鐘。隨后，將混合體系溫度控制在015'C,并在此溫度范圍下反應(yīng)6小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，待反應(yīng)體系冷卻至室溫后，向其中加入5ml去離子水，再加入冰醋酸調(diào)節(jié)pH到7.0，將混合溶液過(guò)濾。用70%至90%的乙醇溶液洗滌過(guò)濾得到固體。將收集到的固體產(chǎn)物置于烘箱中6(TC干燥，所得產(chǎn)物為O-羧甲基殼聚糖。將5gN,O-羧甲基殼聚糖放入250ml三口燒瓶中，再向瓶中加入DMF/H20(90/10,v/v)，電動(dòng)攪拌30min。再加入濕S0C12，于60。C反應(yīng)6小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，待反應(yīng)體系冷卻至室溫后，再用95%的酒精洗滌6遍以去除雜質(zhì)。將收集到的固體產(chǎn)物置于烘箱中6(TC過(guò)夜干燥，所得產(chǎn)物為o-殼聚糖酰氯衍生物。將4.5gN，0-殼聚糖酰氯衍生物溶于適量的DMSO中，攪拌均句，此為溶液A;將3.35g精氨酸溶解于10mlH2O中，此為溶液B，將溶液A和溶液B混合并通過(guò)l%NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至9~10,反應(yīng)15小時(shí)。通過(guò)95%的酒精洗滌6遍以去除雜質(zhì)。將收集到的固體產(chǎn)物置于烘箱中6(TC干燥，所得產(chǎn)物即為高取代度精氨酸-0-殼聚糖。實(shí)施例7將6g殼聚糖放入250ml三口燒瓶中，再向瓶中加入60mll(v/v)%醋酸溶液，在室溫下磁力攪拌1小時(shí)，讓殼聚糖充分溶解。加入等量的殼聚糖葡萄糖胺單體物質(zhì)的量的乙醛酸，反應(yīng)2小時(shí)后再加以硼氫化鈉還原。用70%至90%的乙醇溶液洗滌過(guò)濾得到固體。將收集到的固體產(chǎn)物置于烘箱中6(TC千燥，所得產(chǎn)物為N-羧甲基殼聚糖。將5gN，0-羧甲基殼聚糖放入250ml三口燒瓶中，再向瓶中加入DMF/H20(90/10，v/v),電動(dòng)攪拌30min。再加入40mlS0C12,于60。C反應(yīng)6小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，待反應(yīng)體系冷卻至室溫后，再用95%的酒精洗滌6遍以去除雜質(zhì)。將收集到的固體產(chǎn)物置于烘箱中6(TC過(guò)夜干燥，所得產(chǎn)物為N-殼聚糖酰氯衍生物。將4.5gN,0-殼聚糖酰氯衍生物溶于適量的DMSO中，攪拌均勻，此為溶液A;將3.35g精氨酸溶解于10mlH2O中，此為溶液B，將溶液A和溶液B混合并通過(guò)iy。Na0H調(diào)節(jié)溶液pH至910,反應(yīng)15小時(shí)。通過(guò)95%的酒精洗滌6遍以去除雜質(zhì)。將收集到的固體產(chǎn)物置于烘箱中6(TC干燥，所得產(chǎn)物即為高取代度精氨酸-N-殼聚糖。實(shí)施例8將6g殼聚糖放入250ml三口燒瓶中，再向瓶中加入60ml1(v/v)%醋酸溶液，在室溫下磁力攪拌1小時(shí)，讓殼聚糖充分溶解。加入二倍于殼聚糖葡萄糖胺單體物質(zhì)的量的乙醛酸，反應(yīng)4小時(shí)后再加以硼氫化鈉還原。用70%至90%的乙醇溶液洗滌過(guò)濾得到固體。將收集到的固體產(chǎn)物置于烘箱中6(TC干燥，所得產(chǎn)物為N-羧甲基殼聚糖。將5gN,O-羧甲基殼聚糖放入250ml三口燒瓶中，再向瓶中加入DMF/H20(90/10，v/v)，電動(dòng)攪拌30min。再加入40mlS0C12,于60。C反應(yīng)6h。反應(yīng)結(jié)東后，待反應(yīng)體系冷卻至室溫后，再用95%的酒精洗滌6遍以去除雜質(zhì)。將收集到的固體產(chǎn)物置于烘箱中6(TC過(guò)夜干燥，所得產(chǎn)物為N-殼聚糖酰氯衍生物。將4.5gN，0-殼聚糖酰氯衍生物溶于適量的DMSO中，攪拌均勻，此為溶液A;將3.35g精氨酸溶解于10mlH2O中，此為溶液B，將溶液A和溶液B混合并通過(guò)iy。NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至910，反應(yīng)15小時(shí)。通過(guò)95°/。的酒精洗滌6遍以去除雜質(zhì)。將收集到的固體產(chǎn)物置于烘箱中6(TC干燥，所得產(chǎn)物即為高取代度精氨酸-N-殼聚糖。實(shí)施例9將6g殼聚糖放入250ml三口燒瓶中，再向瓶中加入60ml1(v/v)%醋酸溶液，在室溫下磁力攪拌1小時(shí)，使殼聚糖充分溶解。加入三倍于殼聚糖葡萄糖胺單體物質(zhì)的量的乙醛酸，反應(yīng)6小時(shí)后再加以硼氫化鈉還原。用70%至90%的乙醇溶液洗滌過(guò)濾得到固體。將收集到的固體產(chǎn)物置于烘箱中6(TC干燥，所得產(chǎn)物為N-羧甲基殼聚糖。將5gN，O-羧甲基殼聚糖放入250ml三口燒瓶中，再向瓶中加入DMF/H20(90/10，v/v)，電動(dòng)攪拌30min。再加入40mlS0C12,于60。C反應(yīng)6小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，待反應(yīng)體系冷卻至室溫后，再用95%的酒精洗滌6遍以去除雜質(zhì)。將收集到的固體產(chǎn)物置于烘箱中6(TC過(guò)夜干燥，所得產(chǎn)物為N-殼聚糖酰氯衍生物。將4.5gN，O-殼聚糖酰氯衍生物溶于適量的DMSO中，撹拌均勻，此為溶液A;將3.35g精氨酸溶解于10mlH2O中，此為溶液B，將溶液A和溶液B混合并通過(guò)iy。NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至910,反應(yīng)15小時(shí)。通過(guò)95%的酒精洗滌6遍以去除雜質(zhì)。將收集到的固體產(chǎn)物置于烘箱中6(TC干燥，所得產(chǎn)物即為高取代度精氨酸-N-殼聚糖。實(shí)施例10將上述實(shí)施例制備得到的高取代度精氨酸-殼聚糖進(jìn)行抗菌性能試驗(yàn)配置牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，滅菌后冷卻到5(TC左右時(shí)，分別移取18.OOml、18.40ml、18.80ml、19.20ml至各培養(yǎng)皿，同時(shí)用移液管向培養(yǎng)皿中依次加入抑菌劑2.OOml、1.60ml、1.20ml、0.8ml，使各培養(yǎng)皿中抑菌劑濃度依次為0.5g/L、0.4g/L、0.3g/L、0.2g/L，每個(gè)濃度做四個(gè)平行實(shí)驗(yàn)和一個(gè)空白實(shí)驗(yàn)。待培養(yǎng)基冷凝后，向各個(gè)培養(yǎng)皿中加入稀釋好的菌液0.4ml(25QCFU/ml),然后釆用平板涂布法用涂布棒涂布均勻。最后將涂好菌的培養(yǎng)皿放入生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，37"€下，E.coli培養(yǎng)24小時(shí)，S.aureas培養(yǎng)36小時(shí)，計(jì)數(shù)。實(shí)施例1、2、3所得產(chǎn)物(物質(zhì)一)進(jìn)行抗菌性能評(píng)價(jià)，測(cè)試結(jié)果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>由表中可以看出，N，O-胍基取代的殼聚糖殼聚糖的抗菌性能均強(qiáng)于純殼聚糖的，并且隨著精氨酸取代度的增大而增強(qiáng)。實(shí)施例4、5、6所得產(chǎn)物(物質(zhì)二)進(jìn)行抗菌性能評(píng)價(jià)，測(cè)試結(jié)果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>由表中可以看出，o-胍基取代的殼聚糖殼聚糖的抗菌性能均強(qiáng)于純殼聚糖的，并且隨著精氨酸取代度的增大而增強(qiáng)。實(shí)施例7、8、9所得產(chǎn)物(物質(zhì)三)進(jìn)行抗菌性能評(píng)價(jià)，測(cè)試結(jié)果如下:實(shí)例取代度(％)對(duì)金葡菌的CFUratio0.5g/L0.4g/L0.3g/L0.2g/L由表中可以看出，N-胍基取代的殼聚糖殼聚糖的抗菌性能均強(qiáng)于純殼聚糖的，并且隨著精氨酸取代度的增大而增強(qiáng)。根據(jù)殼聚糖的抗菌機(jī)理，殼聚糖活性的強(qiáng)弱與殼聚糖上氨基有關(guān)。表現(xiàn)在脫乙酰度越高，正電性越強(qiáng)，抑菌活性也越強(qiáng)，殼聚糖胍鹽含胍基，且胍基質(zhì)子化后得到一個(gè)非常穩(wěn)定的胍鎗離子，能在較大PH值范圍內(nèi)保持正電性。因此在殼聚糖上接上胍基得到殼聚糖胍鹽，可以得到抑菌活性更高、抑菌范圍更廣的殼聚糖衍生物。實(shí)施例11將高取代度精氨酸-殼聚糖粉末溶解在濃度為1(v/v)%的醋酸溶液，配成濃度為0.5%的溶液，然后通過(guò)孔徑為0.22um微孔濾膜過(guò)濾除菌，可以得到高取代度精氨酸-殼聚糖抗菌溶液最后所應(yīng)說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。0001.4880001.0410000.61500002o537923聚例例例殼實(shí)實(shí)實(shí)1權(quán)利要求1.一種高取代度精氨酸-殼聚糖，其特征在于，所述高取代度精氨酸-殼聚糖以一氯乙酸作為“分子臂”，將精氨酸高效率共價(jià)結(jié)合到殼聚糖的自由氨基或自由羥基上，其結(jié)構(gòu)式為R1＝-H當(dāng)R’＝R2，R”＝R2時(shí)，該高取代度精氨酸-殼聚糖為精氨酸-N，O-殼聚糖；當(dāng)R’＝R1，R”＝R2時(shí)，該高取代度精氨酸-殼聚糖為精氨酸-O-殼聚糖；當(dāng)R’＝R2，R”＝R1時(shí)，該高取代度精氨酸-殼聚糖為精氨酸-N-殼聚糖。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的高取代度精氨酸-殼聚糖，其特征在于，所述高取代度精氨酸-殼聚糖以一氯乙酸作為"分子臂"，將精氨酸高效率共價(jià)結(jié)合到殼聚糖的自由氨基和自由羥基上。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2任意一項(xiàng)所述的高取代度精氨酸-殼聚糖，其特征在于，所述殼聚糖的分子量在0.5~100萬(wàn)之間，其脫乙酰度為50~99%，所述精氨酸-N，0-殼聚糖的取代度為0~170%，所述精氨酸-0-殼聚糖的取代度為0~91%,所述精氨酸-N-殼聚糖的取代度為0~95%。4.一種權(quán)利要求1所述的高取代度精氨酸-殼聚糖的制備方法，其特征在于，所述精氨酸-N，0-殼聚糖的制備方法為(1)殼聚糖經(jīng)異丙醇和氫氧化鈉溶液膨脹和堿化處理后，再與一氯乙酸于40~80。C反應(yīng)26小時(shí)，純化干燥后得N，0-羧甲基殼聚糖；(2)N，0-羧甲基殼聚糖在二甲基甲酰胺/水(DMF/H20)混合液R2=—CH2—C—NH—H—CH2CH2CH2_NH—C_NH2作為反應(yīng)介質(zhì)下，與二氯亞砜(S0C12)于40~80。C反應(yīng)4~8小時(shí)，純化干燥后得N，0-殼聚糖酰氯衍生物；(3)N,O-殼聚糖酰氯衍生物溶于二甲亞砜(DMS0)中，再與精氨酸反應(yīng)12~24小時(shí)，純化干燥后得高取代度精氨酸-N,O-殼聚糖；所述精氨酸-O-殼聚糖的制備方法(1)殼聚糖經(jīng)異丙醇和氫氧化鈉溶液膨脹和堿化處理后，再與一氯乙酸于0~15'C反應(yīng)26小時(shí)，純化干燥后得O-羧甲基殼聚糖；(2)0-羧甲基殼聚糖在二甲基甲酰胺/水(DMF/H20)混合液作為反應(yīng)介質(zhì)下，與二氯亞砜(S0Ch)于40~80'C反應(yīng)2~6小時(shí)，純化干燥后得0-殼聚糖酰氯衍生物；(3)O-殼聚糖酰氯衍生物溶于適量的二甲亞砜(DMS0)中，再與精氨酸反應(yīng)12~24小時(shí)，純化干燥后得高取代度精氨酸-O-殼聚糖；所述精氨酸-N-殼聚糖的制備方法(1)將殼聚糖溶于酸液后，與乙醛酸反應(yīng)2~6小時(shí)后再加以硼氫化鈉還原，純化干燥后得N-羧甲基殼聚糖；(2)N-羧甲基殼聚糖在二甲基甲酰胺/水(DMF/H20)混合液作為反應(yīng)介質(zhì)下，與二氯亞砜(S0C12)于40~80r反應(yīng)2~6小時(shí)，純化干燥后得N-殼聚糖酰氯衍生物；(3)N-殼聚糖酰氯衍生物溶于適量的二甲亞砜(DMS0)中，再與精氨酸反應(yīng)12~24小時(shí)，純化干燥后得高取代度精氨酸-N-殼聚糖。5.—種權(quán)利要求1所述的高取代度精氨酸-殼聚糖的應(yīng)用，其特征在于將所得高取代度精氨酸-殼聚糖粉末溶解在濃度為0.5~2(v/v)y。的醋酸溶液，配成濃度為0.5~1%的溶液，然后通過(guò)微孔濾膜過(guò)濾除菌，得到高取代度精氨酸-殼聚糖抗菌溶液。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種高取代度精氨酸-殼聚糖及其制備方法和應(yīng)用，屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域。所述高取代度精氨酸-殼聚糖以一氯乙酸作為“分子臂”，將精氨酸高效率共價(jià)結(jié)合至殼聚糖的自由氨基或自由羥基上，殼聚糖的正電性顯著增大，從而使抗菌性能得到增強(qiáng)。本發(fā)明材料來(lái)源于節(jié)肢動(dòng)物蝦、蟹、昆蟲(chóng)的外殼、貝類及軟體動(dòng)物的外殼和軟骨以及低等植物、菌類、藻類的細(xì)胞等細(xì)胞壁。本發(fā)明涉及的高取代度精氨酸-殼聚糖材料制備過(guò)程簡(jiǎn)單、原料來(lái)源豐富。高取代度精氨酸-殼聚糖的抗臨床燒傷燙傷易感菌金黃色葡萄球菌的性能強(qiáng)于未經(jīng)修飾的殼聚糖，并且隨精氨酸取代度的增大而增強(qiáng)。文檔編號(hào)C08B37/08GK101624427SQ20091006358公開(kāi)日2010年1月13日申請(qǐng)日期2009年8月12日優(yōu)先權(quán)日2009年8月12日發(fā)明者影萬(wàn),劉藝群,張勝民,波肖申請(qǐng)人:華中科技大學(xué)