專利名稱：：一種溫度敏感性生物可降解水凝膠及其制法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種溫度敏感性生物可降解水凝膠及其制備方法和用途。屬于高分子化學(xué)領(lǐng)域，也屬于生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：上世紀(jì)80年代，Tanaka報道了聚/V—異丙基丙烯酰胺水凝膠具有溫敏性特征(J.Chem.Phys.1987，81:1392)，在低溫下溶脹，在高溫下收縮，其特點是存在一個溫度轉(zhuǎn)變區(qū)域-低臨界相變溫度(LCST)，當(dāng)水凝膠在低于這一溫度時凝膠溶脹，超過該溫度則體積迅速收縮。這類水凝膠雖然具有良好的溫度敏感性，但不能在體內(nèi)完全降解。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種既具有溫度敏感性特征又具有生物降解特性的水凝膠，且制備方法簡單，所得到的水凝膠生物相容性好，適合于作為體外藥物控制釋放或組織工程支架材料。本發(fā)明提供的技術(shù)方案是一種溫度敏感性生物可降解水凝膠，由下法制得(1)將摩爾比為1:l一l:10的甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA)與e—己內(nèi)酯(CL)在氮氣氛圍中，以辛酸亞錫的催化，100—12(TC反應(yīng)3—12小時；反應(yīng)后的混合物溶于四氫呋喃，沉淀，沉淀物溶于乙酸乙酯，用硫酸鎂干燥，然后減壓濃縮得到甲基丙烯酸羥乙酯一聚己內(nèi)酯(PCL-服MA);將得到的甲基丙烯酸羥乙酯一聚己內(nèi)酯與羰基二咪唑(CDI)以摩爾比l:1一1:2溶于四氫呋喃，在氮氣氣氛中反應(yīng)16—24小時，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到甲基丙烯酸羥乙酯一聚己內(nèi)酯一咪唑(HEMA-PCL—CI);將上述產(chǎn)物甲基丙烯酸羥乙酯一聚己內(nèi)酯一咪唑與重均分子量為15000-25000的a-(1—6)-D-葡聚糖(Dextran)以20:l—30:1的摩爾比溶于二甲亞砜(DMSO)中，加入與甲基丙烯酸羥乙酯一聚己內(nèi)酯一咪唑等摩爾的對一二甲氨基吡啶(DMAP)，室溫下反應(yīng)3—4天，得到的混合物在異丙醇中沉淀，然后用異丙醇洗滌，真空干燥得到聚己內(nèi)酯-g-a-(1—6)-D-葡聚糖(Dex-PCL-服MA);(2)N-異丙基丙烯酰胺和甲基丙烯酸羥乙酯一聚己內(nèi)酯-g-a-(l—6)-D-葡聚糖溶解于pH=7.4的磷酸緩沖液中，然后加入過硫酸銨和催化量的N，N，N',N'-四甲基乙二胺，室溫下反應(yīng)12—24小時得到水凝膠；將得到的水凝膠在室溫下用磷酸緩沖液透析，得到溫度敏感性生物可降解水凝膠。上述N-異丙基丙烯酰胺、甲基丙烯酸羥乙酯一聚己內(nèi)酯-g-a-(1—6)-D-葡聚糖和過硫酸銨的用量質(zhì)量比為160—190:10—40:5—10。上述磷酸緩沖液為磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉按摩爾配比1:2的比例配制。本發(fā)明甲基丙烯酸羥乙酯一聚己內(nèi)酯-g-a-(1—6)-D-葡聚糖(其中，R為氫或甲基丙烯酸羥乙酯一聚己內(nèi)酯，m=93—123、n=3)合成路線<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>本發(fā)明的溫度敏感性生物可降解水凝膠既具有溫度敏感性特征又具有生物降解特性，且制備方法簡單，所得到的水凝膠生物相容性好，適合于作為體外藥物控制釋放或組織工程支架材料在組織工程或藥物控制釋放中的應(yīng)用；也可以用于包裹干細(xì)胞在心肌梗死治療中的應(yīng)用。圖1為本發(fā)明葡聚糖接枝聚己內(nèi)酯合成產(chǎn)物核磁圖；圖2為本發(fā)明水凝膠的凝膠化過程示意圖3為本發(fā)明水凝膠的流變學(xué)性質(zhì)圖4為本發(fā)明水凝膠的內(nèi)部形貌圖5為本發(fā)明水凝膠體內(nèi)及體外降解圖6為本發(fā)明水凝膠體外控制釋放BSA圖7為本發(fā)明水凝膠的細(xì)胞毒性實驗結(jié)果圖8為本發(fā)明水凝膠注射皮膚下的組織切片圖9為本發(fā)明水凝膠注射后的大鼠的血常規(guī)及肝腎功能指標(biāo)圖10為本發(fā)明水凝膠注射對左心室重塑以及心肌梗死后的功能影響。具體實施例方式實施例l:(1)甲基丙烯酸羥乙酯-聚己內(nèi)酯一g-a-(1~>6)-D-葡聚糖的制備a:將等摩爾比的甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA)與e—己內(nèi)酯(CL)在氮氣氛圍中，以辛酸亞錫為催化劑，110攝氏度反應(yīng)3小時，其中摩爾比為甲基丙烯酸羥乙酯e—己內(nèi)酉旨辛酸亞錫=1:1:0.01。反應(yīng)后的混合物溶于四氫呋喃，然后在冷水中沉淀，此沉淀物溶于乙酸乙酯，用硫酸鎂干燥過夜，然后減壓濃縮得到甲基丙烯酸羥乙酯一聚己內(nèi)酯(PCL-HEMA)。b:將得到的產(chǎn)物甲基丙烯酸羥乙酯一聚己內(nèi)酯與羰基二咪唑(CDI)以摩爾比l:l溶于四氫呋喃，在氮氣氣氛中反應(yīng)24小時，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的到甲基丙烯酸羥乙酯一聚己內(nèi)酯一咪唑(HEMA-PCL—CL)。C:將上述產(chǎn)物甲基丙烯酸羥乙酯一聚己內(nèi)酯一咪唑與a-(1—6)-D-葡聚糖(Dextran)以20:l的摩爾比溶于二甲亞砜(DMSO)中，加入與甲基丙烯酸羥乙酯一聚己內(nèi)酯一咪唑等摩爾的對一二甲氨基吡啶(DMAP)，室溫下反應(yīng)4天，得到的混合物在20倍量的異丙醇中沉淀，然后用異丙醇洗滌三次，真空干燥得到甲基丙烯酸羥乙酯一聚己內(nèi)酯-g_a-(1—6)-D-葡聚糖(Dex-PCL-HEMA)，其核磁圖如圖l所示，由圖1C可以看出，甲基丙烯酸羥乙酯雙鍵出現(xiàn)在a峰，說明本發(fā)明制得了甲基丙烯酸羥乙酯一聚己內(nèi)酯-g-a-(1—6)-D-葡聚糖。(2)將N-異丙基丙烯酰胺和甲基丙烯酸羥乙酯一聚己內(nèi)酯-g-a-(1—6)-D-葡聚糖溶解于磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉摩爾配比l:2磷酸緩沖液(pH7.4)磷酸緩沖液磷酸緩沖液中，然后加入過硫酸銨和催化量的N，N,N'，N'-四甲基乙二胺，室溫下反應(yīng)12一24小時得到水凝膠；將得到的水凝膠在室溫下用磷酸緩沖液透析，得到溫度敏感性生物可降解水凝膠；其中，a-(1~>6)-0-葡聚糖的重均分子量為15000-25000，甲基丙烯酸羥乙酯一聚己內(nèi)酯的重均分子量為500—3200，甲基丙烯酸羥乙酯一聚己內(nèi)酯-g-a-(l—6)-D-葡聚糖的接枝度為每百個葡聚糖單元有三個聚己內(nèi)酯分子取代a一d—6)—D-葡聚糖的羥基。實施例2:水凝膠體外控制釋放牛血清蛋白(BSA)將20毫克的牛血清蛋白(數(shù)均分子量為67000)溶于1000毫克的DN2水凝膠的磷酸緩沖溶液中，其中水凝膠的含量為8%。然后，把這種水凝膠的磷酸緩沖溶液與牛血清蛋白充分混合，置于50毫升的離心管中于37'C的水浴中過夜，使水凝膠的溶液變成粘性的水凝膠。20毫升預(yù)先升溫至37-C的磷酸緩沖溶液慢慢地加入到包裹了牛血清蛋白的DN2水凝膠中。在設(shè)定的時間點，每次從20毫升的釋藥體系中取出4毫升的磷酸緩沖溶液，同時加入新鮮的磷酸緩沖溶液使其體積不變。用紫外光譜儀檢測其中的BSA的濃度，紫外吸收波長為280納米，從而計算出從水凝膠中釋放出的BSA含量。BSA的累積釋放量X=#(/私)x100,其中M是時間為t時釋放的總的BSA質(zhì)量，私是開始投入的20毫克BSA的質(zhì)量與包裹時沒有包裹到水凝膠中的BSA的質(zhì)量。在此實驗中，BSA的包裹效率為98%。凝膠體外控制釋放BSA曲線如圖6所示，前5小時內(nèi)釋放最快，DN1、DN2、DN3、DN4累積釋放的BSA分別為39y。,30y。，23呢，17%。因為第一天交聯(lián)酯鍵的降解較快，親水性的BSA擴(kuò)散到緩沖溶液中的速率也較快，但在接下來的七天，釋放級數(shù)幾乎為零級。實施例3:水凝膠攜帶骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和心肌細(xì)胞注射入大鼠體內(nèi)，比較骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在不同環(huán)境下的分化和功能和心肌細(xì)胞分化的差別。大鼠購進(jìn)七天后，將其隨機(jī)分為四組1.心肌梗死組(8只)，2.注射水凝膠組(8只)，3.注射細(xì)胞組(8只)，4.注射細(xì)胞和水凝膠組(11只)。所有的注射都通過29號針頭注射至心肌內(nèi)層部分，并且每組注射的體積均為200微升。第一組注射200微升DMEM/F12培養(yǎng)基至心肌內(nèi)層；第二組注射200微升水凝膠；第三組注射200微升懸浮了1W(T個骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的DMEM/F12培養(yǎng)基；第四組注射懸浮了1*107個骨髓單核成肌細(xì)胞。根據(jù)檢測時間為30天，過量戊巴比妥鈉處死大鼠，然后取左心室包埋后冰凍切片進(jìn)行病理分析。超聲心動圖檢測注射了骨髓單核成肌細(xì)胞的左室射血分?jǐn)?shù)。組織學(xué)檢查服染色觀察梗死區(qū)新生組織，Masson'Trichrome染色測量梗死壁厚度，計算梗死面積(梗死區(qū)面積/總面積)。從表和圖中可知，注射水凝膠后，心肌的血液循環(huán)以及心肌梗死都得到了明顯改善。附表1.水凝膠注射對左心室重塑以及心肌梗死后的功能影響。GroupControl(n=8)HydrogelInjection(n=8)尸LVEF(%)37.65土4.8952.98±6.090.001LVEDD(cm)1.96±0.201.65±0.180.001LVESD(cm)1.71±0.161.28±0.16<0.001LVSP(,Hg)107.37±4.7994.96±6.290.002LVEDP(mmHg)35.12±2.3128.23±1.98<0.001dp/dt(mmHg/s)4215±5055416±436<0.001如圖10所示本發(fā)明水凝膠注射對左心室重塑以及心肌梗死后的功能影響其中，LVEF左心室射血分?jǐn)?shù)，LVEDD左心室末端舒張直徑，LVESD左心室末端收縮直徑，LVSP左心室末端收縮壓，LVEDP左心室末端舒張壓，dp/dt壓力的一階導(dǎo)數(shù)，infarctsize心肌梗死尺寸，p<0.005表示有統(tǒng)計學(xué)顯著差異。本發(fā)明溫度敏感性生物可降解水凝膠的性質(zhì)及實驗:<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>上表表示的是四種不同配比條件下制備的水凝膠，其中Dex-PCL-HEMA指的是甲基丙烯酸羥乙酯一聚己內(nèi)酯-g-a-(1—6)-D-葡聚糖，NIPAAm指的是N-異丙基丙烯酰胺，APS指的是過硫酸銨，TEMED指的是N，N，N'，N'-四甲基乙二胺。1.水凝膠溶膠與凝膠可逆性轉(zhuǎn)變水凝膠溶膠與凝膠可逆性如圖2所示，隨著溫度的升高，水凝膠溶液在lmin內(nèi)變成凝膠；降低溫度，凝膠也很快變成溶膠。由不同濃度的水凝膠溶液的凝膠化過程可知濃度越高，凝膠化越快。當(dāng)升到37。C，比其LCST(33.2。C)高時，PNIPAAm鏈的親水/憎水平衡改變，PNIPAAm鏈發(fā)生脫水，如圖2所示，水凝膠溶液變得不透明。但要注意的是，升溫到37t:時，水凝膠只失去少量的水，凝膠化后其仍含有大量的水分。圖2表明，溫度在LCST上，水凝膠形成一個比較穩(wěn)定的凝膠體系，這在藥物及蛋白質(zhì)包裹持續(xù)釋放方面有很好的應(yīng)用。圖3說明本發(fā)明的水凝膠在溫度為29—32攝氏度發(fā)生相轉(zhuǎn)變，也就是發(fā)生溶膠一凝膠轉(zhuǎn)變，并且水凝膠的強(qiáng)度在37攝氏度時達(dá)到最大值而且穩(wěn)定，適合于體內(nèi)注射而作為組織工程材料。凝膠l、凝膠2、凝膠3凝膠4分別就是DN1、DN2、DN3、DN4。2.內(nèi)部形貌如圖4所示水凝膠的平均孔徑隨著交聯(lián)劑的含量的增大而縮小，DN1平均孔徑為8微米，然后逐漸減小，DN2、DN3、DN4的平均孔徑分別為6、4、2微米，DN4孔直徑是DN1的1/4。交聯(lián)劑的含量與水凝膠孔直徑之間的關(guān)系交聯(lián)密度隨交聯(lián)劑的含量組份的增加而增加。這是山于交聯(lián)劑的交聯(lián)基團(tuán)是位于葡聚糖主鏈上重復(fù)的葡萄糖單元。3.體內(nèi)及體外降解從圖5A可以看出37。C時，水凝膠在前三天降解比較快，第一天降解率為2.8%一10.9%(DN1到DN4逐漸增大)，3天后降解速率明顯減緩，在第4一16天間，DN1、DN2、DN3、DN4四種水凝膠的降解率依次增大。前三天，葡聚糖鏈被緩沖溶液包圍，葡聚糖與PCL-服MA之間酯鍵發(fā)生水解。37。C時，葡聚糖鏈親水而PNIPAAm憎水，隨著越來越多糖苷鍵斷裂擴(kuò)散進(jìn)緩沖溶液，凝膠越來越憎水，因此，水很難擴(kuò)散到水凝膠網(wǎng)絡(luò)中。圖4顯示的DN1、DN2、DN3、DN4在16天后，其重量達(dá)到一個穩(wěn)定狀態(tài)，基本上不再降解。以皮下注射組的皮下水凝膠最大橫徑來大致推測水凝膠的降解，用橫徑一時間曲線表示(圖5B)，我們可以看出與體外降解相似，前5天降解較快，以后降解逐漸減慢，其最終降解率較體外高，可達(dá)87%左右。4.水凝膠體外控制釋放牛血清蛋白(BSA)凝膠體外控制釋放BSA曲線如圖6所示，前5小時內(nèi)釋放最快，DN1、DN2、DN3、DN4累積釋放的BSA分別為39%，30%,23%,17%。因為第一天交聯(lián)酯鍵的降解較快，親水性的BSA擴(kuò)散到緩沖溶液中的速率也較快，但在接下來的七天，釋放級數(shù)幾乎為零級。這是因為，隨著交聯(lián)酯鍵的降解，親水性的葡聚糖鏈開始擴(kuò)散到PBS中，水凝膠慢慢變?yōu)樵魉浴６?7°C，塌陷的PNIPAAm結(jié)構(gòu)可大量包裹著殘余的BSA，從而延遲BSA的釋放。只有DN降解速率趨于平緩時，BSA釋放量才和時間成線性關(guān)系。降解完畢，釋藥也結(jié)束。由此可知，BSA藥物的釋放行為主要是由DN水凝膠的交聯(lián)劑的降解來決定的，而不是擴(kuò)散機(jī)理。5.水凝膠的細(xì)胞毒性圖7可以看出，通過吸光值與對照組的比較，水凝膠對細(xì)胞生長無明顯影響。6.體內(nèi)生物相容性試驗過程中所有大鼠下肢活動能力無下降，皮下注射組有1只出現(xiàn)局部皮膚壞死，用紅霉素軟膏涂搽4天后好轉(zhuǎn)，其余大鼠局部未見紅腫、壞死，一周后冰凍切片(圖8，皮下注射與肌肉注射大鼠局部炎癥反應(yīng)輕微；水凝膠注射一周后各組血白細(xì)胞分析無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。試驗過程中大鼠飲食量無明顯變化，肝腎功能指標(biāo)丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、肌氨酸酐、尿素氮各組間在統(tǒng)計學(xué)上無明顯差異，我們觀察了三組間血糖濃度，血細(xì)胞個數(shù)均無顯著性差異。(見圖9)權(quán)利要求1.一種溫度敏感性生物可降解水凝膠，由下法制得(1)將摩爾比為11—110的甲基丙烯酸羥乙酯與ε—己內(nèi)酯在氮氣氛圍中，以辛酸亞錫為催化劑，100—120℃反應(yīng)3—12小時；反應(yīng)后的混合物溶于四氫呋喃中，沉淀，沉淀物溶于乙酸乙酯，用硫酸鎂干燥，然后減壓濃縮得到甲基丙烯酸羥乙酯—聚己內(nèi)酯；將得到的甲基丙烯酸羥乙酯—聚己內(nèi)酯與羰基二咪唑以摩爾比11—12溶于四氫呋喃，在氮氣氣氛中反應(yīng)16—24小時，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到甲基丙烯酸羥乙酯—聚己內(nèi)酯—咪唑；將上述產(chǎn)物甲基丙烯酸羥乙酯—聚己內(nèi)酯—咪唑與重均分子量為15000-25000的α-(1→6)-D-葡聚糖以201-30:1的摩爾比溶于二甲亞砜中，加入與甲基丙烯酸羥乙酯—聚己內(nèi)酯—咪唑等摩爾的對—二甲氨基吡啶，室溫下反應(yīng)3—4天，得到的混合物在異丙醇中沉淀，然后用異丙醇洗滌，真空干燥得到甲基丙烯酸羥乙酯—聚己內(nèi)酯-g-α-(1→6)-D-葡聚糖；(2)N-異丙基丙烯酰胺和甲基丙烯酸羥乙酯—聚己內(nèi)酯-g-α-(1→6)-D-葡聚糖溶解于pH＝7.4的磷酸緩沖液中，然后加入過硫酸銨和催化量的N，N，N’，N’-四甲基乙二胺，室溫下反應(yīng)12—24小時得到水凝膠；將得到的水凝膠在室溫下用磷酸緩沖液透析，得到溫度敏感性生物可降解水凝膠。2.內(nèi)酯；將得到的甲基丙烯酸羥乙酯一聚己內(nèi)酯與羰基二咪唑以摩爾比1:1一1:2溶于四氫呋喃，在氮氣氣氛中反應(yīng)16—24小時，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到甲基丙烯酸羥乙酯一聚己內(nèi)酯一咪唑；將上述產(chǎn)物甲基丙烯酸羥乙酯一聚己內(nèi)酯一咪唑與重均分子量為15000-25000的a-(1~>6)-D-葡聚糖以20:1-30:1的摩爾比溶于二甲亞砜中，加入與甲基丙烯酸羥乙酯一聚己內(nèi)酯一咪唑等摩爾的對一二甲氨基吡啶，室溫下反應(yīng)3—4天，得到的混合物在異丙醇中沉淀，然后用異丙醇洗滌，真空干燥得到甲基丙烯酸羥乙酯一聚己內(nèi)酯-g-a-(l—6)-D-葡聚糖；(2)N-異丙基丙烯酰胺和甲基丙烯酸羥乙酯一聚己內(nèi)酯-g-a-(1~>6)-D-葡聚糖溶解于pH=7.4的磷酸緩沖液中，然后加入過硫酸銨和催化量的N,N，N'，N'-四甲基乙二胺，室溫下反應(yīng)12—24小時得到水凝膠；將得到的水凝膠在室溫下用磷酸緩沖液透析，得到溫度敏感性生物可降解水凝膠。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于N-異丙基丙烯酰胺、甲基丙烯酸羥乙酯一聚己內(nèi)酯-g-a-(1—6)-D-葡聚糖和過硫酸鉸的用量質(zhì)量比為160—190:10一40:5—10。4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的制備方法，其特征在于磷酸緩沖液為磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉按摩爾配比l:2的比例配制。5.權(quán)利要求1所述的溫度敏感性生物可降解水凝膠作為體外藥物控制釋放或組織工程支架材料的應(yīng)用。6.權(quán)利要求1所述的溫度敏感性生物可降解水凝膠在制備治療心肌梗死的包裹干細(xì)胞中的應(yīng)用。全文摘要一種具有溫度敏感性同時可生物降解的水凝膠，由下法制得甲基丙烯酸羥乙酯與ε-己內(nèi)酯反應(yīng)得到甲基丙烯酸羥乙酯-聚己內(nèi)酯；將甲基丙烯酸羥乙酯-聚己內(nèi)酯與羰基二咪唑反應(yīng)，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到甲基丙烯酸羥乙酯-聚己內(nèi)酯-咪唑；將甲基丙烯酸羥乙酯-聚己內(nèi)酯-咪唑與α-(1→6)-D-葡聚糖溶于二甲亞砜中，加入對-二甲氨基吡啶，室溫下反應(yīng)得到的混合物在異丙醇中沉淀，真空干燥得到甲基丙烯酸羥乙酯-聚己內(nèi)酯-g-α-(1→6)-D-葡聚糖；N-異丙基丙烯酰胺和甲基丙烯酸羥乙酯-聚己內(nèi)酯-g-α-(1→6)-D-葡聚糖溶解于pH＝7.4的磷酸緩沖液中，然后加入過硫酸銨和N，N，N’，N’-四甲基乙二胺，室溫下反應(yīng)得到水凝膠；將得到的水凝膠用磷酸緩沖液透析，得到溫度敏感性生物可降解水凝膠。文檔編號C08G63/91GK101371933SQ20081004848公開日2009年2月25日申請日期2008年7月23日優(yōu)先權(quán)日2008年7月23日發(fā)明者卓仁禧,吳德群,張先正,濤王,蔣學(xué)俊申請人:武漢大學(xué)