專利名稱：血管生成因子－血管內(nèi)皮細胞生長因子vegf的突變體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及新型血管內(nèi)皮細胞生長因子基因以及這些基因所編碼的蛋白。更具體地說，本發(fā)明涉及新型人VEGF-A。VEGF-A的這些新形式包括VEGF-A138、VEGF-A162和VEGF-A182。這些新蛋白可通過影響解剖結(jié)構(gòu)、導管功能和通透性來用于心血管系統(tǒng)疾病的治療，更具體地說，是用一種生長因子刺激血管細胞增殖，從而刺激內(nèi)皮細胞的生長和血管的通透性，來治療心血管疾病。
本發(fā)明也涉及到編碼該新VEGF蛋白的核酸，以及包含該核酸的細胞、組織和動物；應用此類核酸的治療方法；和上述所有相關的方法。
不幸的是，身體在自然情況下的血管發(fā)生應答非常有限，常常不足。因為此種原因，發(fā)現(xiàn)新的血管生成生長因子就提供了一種替代的治療策略，其期望通過提供外源性血管發(fā)生物質(zhì)來補充自然血管發(fā)生應答。
曾經(jīng)嘗試用各種生長因子來刺激血管發(fā)生。Cid等在美國專利號為5318957的專利中公開了用結(jié)合珠蛋白(兩條多肽鏈通過二硫鍵相連的糖蛋白)刺激血管發(fā)生的方法。在模型動物冠狀動脈內(nèi)，注射表達人成纖維生長因子-5(FGF-5)的表達載體(即體內(nèi)基因治療)，可成功地消除心肌血流和功能的異常。(Giordano,F.J.,等，Nature Med 2，534-539，1996)。重組的腺病毒也被用于在體內(nèi)表達血管生成因子。這些包括酸性成纖維生長因子(Muhlhauser,J.,等，Hum.Gene Ther.61457-1465，1995)和VEGF之一的VEGF-A165(Muhlhauser,J.,等，Circ.Res.771077-1086，1995)。
心臟肌肉細胞對血液供應損害的應答之一是，激活編碼血管內(nèi)皮生長因子(“VEGF”)的基因，此因子也稱為VEGF-A(Banai,S.,等，Cardiovasc.Res.281176-1179，1994)。VEGF-A實際上是一個能誘導新的旁側(cè)血管生長的血管生成因子家族。這些生長因子為特異的血管生成生長因子，具有血管透過活性，幾乎專一的以內(nèi)皮(血管系)細胞為靶細胞。(參照Ferrara等，Endocr.Rev.1318-32(1992)；Dvorak等，Am.J.Pathol.1461029-39(1995)；Thomas,J.Biol.Chem.271603-06(1996)的綜述)。VEGF-A基因的表達在空間和時間上同血管發(fā)生的生理狀況相聯(lián)系，通過破壞小鼠目標基因的方式刪除VEGF-A基因?qū)е屡咛ニ劳?，因為血管不能形成。因此，它是目前已知的可能作為血管發(fā)生特異性生理調(diào)控因子的唯一血管生成生長因子。
當將VEGF-A和可能的VEGF-B用于細胞培養(yǎng)時，由于其結(jié)構(gòu)，它具有強的有絲分裂(Gospodarowicz等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 867311-15，1989)和趨化活性(Favard等，Biol.Cell 731-6，1991)。此外，VEGFs可誘導纖維蛋白溶解原激活因子、纖維蛋白溶解原激活因子抑制因子、纖維蛋白溶解原激活因子受體(Mandriota等，J.Biol.Chem.2709709-16，1995；Pepper等，181902-06，1991)和膠原酶-能夠調(diào)控生長中的毛細血管進入組織的酶系統(tǒng)(Unemori等，J.Cell.Physiol.153557-62，1992)。VEGFs也可通過內(nèi)皮細胞刺激類管狀結(jié)構(gòu)的形成，這是血管體外發(fā)生的一個實例(Nicosia等，Am.J.Pathol.,1451023-29，1994)。
在體內(nèi)，VEGFs可誘導血管發(fā)生(Leung等，Science 2461306-09，1989)和增加血管透過性(Senger等，Science 219983-85，1983)。VEGFs現(xiàn)在被認為是毛細血管形成的重要生理調(diào)控因子。它們在器官生長，包括胎兒生長(Peterso等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 908915-19，1991)、組織修復(Brown等，J.Exp.Med.1761375-79，1992)、月經(jīng)周期和懷孕等過程中新的毛細血管的正常形成中起作用(Jackson等，Placenta 15341-53，1994；Cullinan&Koos,Endocrinology 133829-37，1993；Kamat等，Am.J.Pathol.146157-65，1995)。在胎兒發(fā)育中，VEGFs可能在血管從血島(Risau&Flamme,Ann.Rev.Cell.Dev.Biol.1l73-92，1995)上重新形成過程中起重要作用，缺乏單一的VEGF等位基因可導致血管發(fā)育的異常和胚胎致死(Carmeliet等，Nature 380435-38，1986)。此外，VEGFs可能還同許多疾病的病理性血管生長特征有關，這些疾病包括實性腫瘤(Potgens等，Biol.Chem．Hoppe-Seyler 37657-70，1995)、視網(wǎng)膜病(Miller等，Am.J.Pathol574-84，1994；Aiello等，N.Engl.J.Med.33l1480-87，1994；Adamis等，Am.J.Ophthalmol.118445-50，1994)、牛皮癬(Detmar等，J.Exp.Med.1801141-46，1994)和風濕性關節(jié)炎(Fava等，J.Exp.Med.180141-46，1994)。
VEGF的表達受激素(Schweiki等，J.Clin.Invest.912235-43，1993)、生長因子(Thomas,J.Biol.Chem.271603-06，1996)和低氧血(Schweiki等，Nature 359843-45，1992；Levy等，J.Biol.Chem.2712746-53，1996)調(diào)控。在低氧情況下，VEGFs升高的調(diào)控作為一代償機制具有特別的重要性，此機制通過誘導額外的毛細血管形成進而增加血流，使組織的氧和作用增加。該機制在腫瘤和視網(wǎng)膜病中可能導致病理性的血管發(fā)生。但是，在低氧血后，VEGF表達減少的調(diào)控對組織的修復也很重要，例如，在皮膚創(chuàng)傷愈合(Frank等，J.Biol.Chem.27012607-613，1995)、在冠狀動脈局部缺血(Banai等，Cardiovasc.Res.281176-79，1994；Hashimoto等，Am.J.Physiol.267H1948-H1949，1994)。
利用兔慢性肢體局部缺血模型，通過測定缺血性后肢的血流，已表明重復的肌肉內(nèi)注射VEGF-A或單一的動脈內(nèi)VEGF-A彈丸可增加旁系血管的形成(Pu等，Circulation 88808.15，1993；Bauters等，Am.J.Physiol．267HI263-71，1994；Takeshita等，Circulation 90[part 2]，Ⅱ-228-34，1994；Bauters等，J.Vasc.Surg.2l314-25，1995；Bauters等，Circulaion 912802-09，1995；Takeshita等，J.Clin.Invest.93662-70，1994)。在此模型中，發(fā)現(xiàn)VEGF可同堿性FGF協(xié)同作用來消除局部缺血(Asahara等，Circulation 92[suppl 2]，Ⅱ-365-71，1995)。也有報道VEGF可加速由氣囊損傷的大鼠頸動脈內(nèi)皮的修復，同時抑制位于其下層平滑肌層的病理性增厚，從而維持血管腔的直徑和血流(Asahara等，Circulation 912793-2801，1995)。也發(fā)現(xiàn)VEGF可誘導犬冠狀動脈EDFR(Endothelin衍生的弛緩素因子(一氧化氮))依賴的松弛，從而通過一種和血管發(fā)生無關的繼發(fā)機制來潛在的增加血流(Ku等，Am.J.Physiol 265H586-H592，1993)。
編碼VEGF-A蛋白的基因激活可通過選擇性拼接機制產(chǎn)生幾種不同的VEGF-A突變體或異構(gòu)體，相同的染色體DNA產(chǎn)生了包含有不同外顯子的mRNA轉(zhuǎn)錄本，因此產(chǎn)生不同的蛋白。這樣的突變體已經(jīng)被公開，例如，在美國專利號為5194596的專利中，Tischer等鑒定出人血管內(nèi)皮細胞生長因子含有長度為121和165個氨基酸的肽序列(即VEGF-A121和VEGF-A165)。此外，也有VEGF-A189和VEGF-A206及其特征的報道(Neufeld,G等，Cancer Metastasis Rev.15153-158，1996)。
各種VEGF-A異構(gòu)體的促有絲分裂活性依不同的異構(gòu)體而異。例如，VEGF-A121和VEGF-A165對內(nèi)皮細胞具有相似的促有絲分裂活性。但是VEGF-A189和VEGF-A206僅具有很弱的促有絲分裂活性(Ferrara等，Endocr.Rev.1318-32，1992)。這些異構(gòu)體活性的減弱是因為它們同細胞及基質(zhì)強的結(jié)合能力，VEGF-A206突突變體同VEGF-A189和VEGF-A206(殘基115-139在圖2)具有相同序列，但缺乏24位“基質(zhì)定位”殘基，具有正常的促有絲分裂活性可以說明這一點(Ferrara等，Endocr.Rev.1318-32，1992)。
四個已知的VEGF-A形式源于VEGF-A基因8個外顯子的選擇性拼接(VEGF-A121，外顯子1-5，8；VEGF-A165，外顯子1-5，7，8；VEGF-A189，外顯子1-5，6a，7，8；VEGF-A121，外顯子1-5，6a，6b，7，8(外顯子6a和6b是指相同外顯子的2個不同拼接形式))(Houck等，Mol.Endocr.,51806-14(1991))。所有的VEGF-A基因都編碼指導蛋白進入分泌途徑的信號肽。例如，VEGF-A165cDNA編碼191個殘基的氨基酸序列，其中包含26個殘基的信號肽分泌序列，在蛋白從細胞分泌時被切割掉，成熟的蛋白單元含165個氨基酸殘基。但是，在培養(yǎng)的細胞中，僅發(fā)現(xiàn)VEGF-A121和VEGF-A165從細胞很容易分泌，而VEGF-A189和VEGF-A206仍然同產(chǎn)生的細胞相結(jié)合。這些VEGF-A形式額外含有一由第6外顯子編碼的高堿性序列，相當于VEGF-A189的115-139殘基和VEGF-A206的115-156殘基。這些額外序列賦予其同肝素的高親和力和同細胞外基質(zhì)(基質(zhì)靶向序列)結(jié)合的能力(Houck,K.A.等，J.Biol.Chem.26726031-37(1992)和Thomas,J.Biol.Chem.,271603-06(1996))。根據(jù)幾個不同研究組的結(jié)果(Neufeld,G.等，Cancer Metastasis Rev.15153-158(1996)，VEGF-A121和VEGF-A165具有相似的促有絲分裂活性，盡管一個研究組的證據(jù)表明VEGF-A121的活性顯著的較低(Keyt,B.A.等，J.Biol.Chem.2717798-7795(1996)。尚不清楚兩個長的VEGF-A，即VEGF-A189和VEGF-A206的活性是低于還是相當于兩個短的VEGF-A，因為還不能獲得適于定量測定的蛋白純品。這種情況部分上是因為，它們同所產(chǎn)生細胞和基質(zhì)強的結(jié)合，因為外顯子6來源的序列可明顯的同外顯子7來源的序列基團協(xié)同作用，破壞它們同細胞和基質(zhì)的作用。
如

圖1所述，外顯子1-5所編碼的結(jié)構(gòu)域含有能夠識別VEGF受體flt-1(R1和R2)和KDR/flk-1(Keyt,B.A.等，J.Biol.Chem.2715638-5646，1996)所需的信息，并且該外顯子出現(xiàn)在所有已知的VEGF異構(gòu)體中。外顯子8所編碼的氨基酸也出現(xiàn)在所有已知的異構(gòu)體中。異構(gòu)體的區(qū)分可通過是否含有VEGF-A基因外顯子6和7所編碼的肽來進行，這些外顯子所編碼肽的是否出現(xiàn)可導致VEGF-A異構(gòu)體間結(jié)構(gòu)的差異，因而被翻譯成功能不同的異構(gòu)體(Keyt,B.A.等，J.Biol.Chem.2717798-7795，1996的綜述)。
第6外顯子可以在拼接供點后的72bp處終止，形成VEGF的24個氨基酸殘基，例如VEGF-A189。此類形式的第6外顯子稱為外顯子6a。但是，VEGF-A RNA也可在第6外顯子的3’末端進行選擇性拼接，拼接位點位于上述第一個位點的下游51bp處，從而得到含41個氨基酸殘基的較大的第6外顯子產(chǎn)物。由于此種選擇性拼接而得到的額外添加的17個氨基酸在此處稱為6b。VEGF-A206含有由6a和6b組成的延長的第6外顯子，但此種形式的VEGF較VEGF-A189稀少。(Tischer,E.等，J.Biol.Chem.266，11947-11954；Houck,K.A.等，Mol.Endocrinol.,1806-1814，1991)。
利用PCR方法，已經(jīng)在人子宮內(nèi)膜注意到VEGF-A的第5種可能形式--VEGF-A145。作者證明，VEGF-A145剪接變異體的cDNA序列分析表明，它含有第1-5、6和8外顯子。但是，尚不確定作者是否發(fā)現(xiàn)該剪接突突變體含有如VEGF-A206中的外顯子6a和6b、VEGF-A189中的外顯子6a或外顯子6b。作者說明，既然該剪接突突變體保留了第6外顯子，很可能該家族中其它含有第6外顯子的成員所在的細胞也含有此種剪接體。(Charnock-Jones等，Biology og Reproduction 48，1120-1128(1993)；也請參照Bacic M.等，Growth Factors 12，11-15，1995)。在此報道中尚沒有確定該異構(gòu)體的生物活性(Cheung,C.Y等，Am.J.Obstet.Gynecol.,173，751-759)；Antony,F.M.等，Placenta，15，557-561，1994)。各種異構(gòu)體以及編碼這些異構(gòu)體的外顯子如圖1所描述。
最近，鑒定出一含145個氨基酸殘基的VEGF-A蛋白以及編碼此蛋白的核酸，它在心血管疾病治療中的應用也已得到鑒定(USSN 08/784551，1997年1月21日存檔，于1998年3月12日公開為WO 98/10071)。
已知VEGF-A可同三種不同的內(nèi)皮細胞受體中的兩種結(jié)合，每種受體為一單一的跨膜蛋白，較大的細胞外部分由7個免疫球蛋白型的結(jié)構(gòu)域組成，細胞質(zhì)部分起到酪氨酸激酶的功能。這些受體為R1(flt-1)(De Vries等，Science 255989-91，1992)、R2(KDR/flk-1)(Terman等，Biochem.Biophys.Res.Commun.1871579-86，1992)和R3(flk-4)(Pajusola等，Cancer Res.525738-43，1992)。這些受體同各種VEGF-A和VEGF相關蛋白配體之間有不同的選擇性，目前尚不完全明了。但是，已知VEGF-A同R1和R2結(jié)合(Terman等，Growth Factors 11187-95，1994)，但不和R3結(jié)合(Joukov等，EMBO J.15290-98，1996)。R2被認為在內(nèi)皮細胞對類VEGF生長因子的血管生成應答中起主要作用(Gitay-Goren等，J.Biol.Chem.2715519-23(1996))。
因此，需要一些新型的VEGF-A蛋白，具有已經(jīng)改變了的基質(zhì)親和力以及低親和力的受體。這種改變了的親和力在以后給藥時可改變其生物利用度。
這些新的VEGF蛋白具有獨特的生物特性的組合，以區(qū)別于其它形式的VEGF。這些VEGF蛋白生物特性的組合使得它們在某些情況下成為優(yōu)選的治療心血管疾病和其它以血管細胞增生為特征的疾病的治療劑。特別地，編碼這些VEGF蛋白的cDNA可用于心血管疾病的基因治療。
新的VEGF-A蛋白包含的氨基酸序列由，例如VEGF-A外顯子1-5、6b和8或1-5、6b和7或由此衍生而來的序列來編碼。優(yōu)選這些蛋白不包含外顯子6a的全部氨基酸序列，優(yōu)選那些不具有同含外顯子6a的VEGF-A蛋白具有相同特性、活性和功能的蛋白。另外一些新的VEGF-A蛋白所包含的氨基酸序列由，例如VEGF-A的外顯子1-5、6a、6b和8編碼。這些蛋白優(yōu)選不具有同不包含外顯子6b的VEGF-A蛋白具有相同特性、活性和功能的蛋白。
因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，需提供一純化的多肽，包含的氨基酸序列由，例如VEGF-A外顯子1-5、6b和8或由此衍生而來的序列編碼。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，需提供一純化的多肽，包含的氨基酸序列由VEGF-A外顯子1-5、6b、7和8或由此衍生而來的序列編碼。
在本發(fā)明的另一些實施方案中，需提供一純化的多肽，包含的氨基酸序列由VEGF-A外顯子1-5、6a、6b和8或由此衍生而來的序列編碼。優(yōu)選的，本發(fā)明的VEGF-A多肽是人的VEGF-A。在優(yōu)選方面，純化的多肽包含圖3、圖4或圖5的氨基酸序列。
本發(fā)明還提供了編碼所純化多肽的經(jīng)過純化和分離的核酸分子。優(yōu)選的，核酸分子具有圖3或圖4或圖5的核苷酸序列。
本發(fā)明還提供了編碼6b經(jīng)過修飾并且具有生物活性VEGF蛋白片段的經(jīng)過純化和分離的核酸分子，修飾的蛋白優(yōu)選VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或這些蛋白的衍生物。這些片段最優(yōu)選活性接近全長的修飾6b的100％，至少10％，更優(yōu)選至少40％，更優(yōu)選至少具有全長VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182多肽活性的80％。
本發(fā)明還提供了表達本發(fā)明核酸分子的表達載體。優(yōu)選的，這些載體包含腺病毒序列；優(yōu)選的表達載體為腺病毒載體。更優(yōu)選的，核酸連接在一種在血管內(nèi)皮細胞中具有活性的啟動子序列上。表達載體進一步優(yōu)選包含部分腺病毒序列，其中E1A/E1B基因已被刪除。
在本發(fā)明的另一實施方案中，提供了用于冠狀動脈內(nèi)注射的、表達6b的、經(jīng)修飾蛋白的重組表達載體試劑盒，蛋白優(yōu)選VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182，試劑盒包括編碼6b、經(jīng)修飾蛋白的核酸分子，優(yōu)選VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182，克隆到一適于體內(nèi)表達上述多核苷酸的載體中，上述載體的合適包裝物，和將上述載體注射到患者體內(nèi)的使用說明。優(yōu)選的，在試劑盒中，多核苷酸克隆到一種腺病毒表達載體中。
在本發(fā)明的另一方面，提供了治療哺乳動物心血管疾病的方法，包括將6b經(jīng)過修飾的VEGF-A蛋白以有效治療劑量給上述哺乳動物給藥的步驟，從而刺激血管細胞增殖，優(yōu)選的蛋白為VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182或其它6b經(jīng)過修飾的VEGF-A蛋白。
在本發(fā)明的另一方面，提供了促進疾病血管內(nèi)皮愈合的方法，包括將6b經(jīng)過修飾的VEGF-A蛋白以有效治療劑量給哺乳動物給藥的步驟，優(yōu)選的蛋白為VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182。優(yōu)選的，內(nèi)皮愈合為血管成型術后的內(nèi)皮重新愈合。更優(yōu)選的，內(nèi)皮重新愈合可減輕和預防再狹窄。
在本發(fā)明進一步的方面，患者使用斯滕特固定膜或無斯滕特固定膜進行治療。優(yōu)選的，本發(fā)明所用的哺乳動物為人，但是，可以考慮所有的哺乳動物作為這些方法的候選。在本發(fā)明的方法中，給藥方法包括基因治療。在優(yōu)選的方法中，用于基因治療的基因給藥是用一種可膨脹的氣囊導管，外面覆以編碼6b被修飾的VEGF蛋白的多核苷酸，蛋白優(yōu)選VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182。
在本發(fā)明的另一實施方案中，本發(fā)明的方法、組分、和載體可用以加強藥物在腫瘤中的滲透，其中包括將6b經(jīng)過修飾的VEGF-A蛋白或編碼它的核酸分子對患者給藥，蛋白優(yōu)選VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182。6b經(jīng)過修飾的VEGF-A蛋白可直接對腫瘤細胞給藥，也可通過血管系統(tǒng)給藥，優(yōu)選離腫瘤較近的位點給藥。因此，用6b經(jīng)過修飾的VEGF-A蛋白給藥結(jié)合化學治療去除或減小腫瘤的大小，可通過增加腫瘤對藥物的吸收來加強化學治療的有效性。在此種方法中6b經(jīng)過修飾的VEGF-A蛋白的給藥要么直接進行多核苷酸或蛋白給藥，要么通過基因治療來進行。
因此，本發(fā)明提供了加強藥物在腫瘤滲透的方法，其中包括將編碼6b經(jīng)過修飾的VEGF-A蛋白的核酸分子對患者給藥，蛋白優(yōu)選VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182。優(yōu)選的，6b經(jīng)過修飾的VEGF-A蛋白可直接給藥到腫瘤細胞。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種治療組分，包括一藥物學上可接受的載體和6b經(jīng)過修飾的VEGF蛋白以有效的治療劑量來刺激血管細胞的增殖，蛋白優(yōu)選VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182。本發(fā)明在另一方面也提供了一過濾的可注射腺病毒載體的制備，包括重組的腺病毒載體、不含野生型病毒的上述載體，其中包括刪除了E1A/E1B基因的部分腺病毒序列、編碼6b經(jīng)過修飾的VEGF蛋白的轉(zhuǎn)基因，該基因受一旁側(cè)序列為部分腺病毒序列的啟動子驅(qū)動，蛋白優(yōu)選VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182、和藥物學上可接受的載體。
在本發(fā)明的進一步實施方案中，提供了治療哺乳動物心血管疾病的下述方法，包括將編碼VEGF-A外顯子1-5、6b和8氨基酸序列對應的核酸分子轉(zhuǎn)染給上述動物細胞的步驟。本發(fā)明也提供了治療哺乳動物心血管疾病的下述方法，包括將編碼VEGF-A外顯子1-5、6b、7和8氨基酸序列對應的核酸分子轉(zhuǎn)染給上述動物細胞的步驟。本發(fā)明也提供了治療哺乳動物心血管疾病的下述方法，包括將編碼VEGF-A外顯子1-5、6a、6b和8氨基酸序列對應的核酸分子轉(zhuǎn)染給上述動物細胞的步驟。
優(yōu)選的，本發(fā)明方法中所用的核酸分子編碼VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182。在優(yōu)選的實施方案中，核酸分子克隆入一載體。優(yōu)選的，載體包含腺病毒顆粒。優(yōu)選的，腺病毒顆粒通過注射給上述哺乳動物。優(yōu)選的，上述腺病毒顆粒的數(shù)目在大約108和1014之間，更優(yōu)選大約1010到1014。
在進一步的優(yōu)選方面，編碼6b經(jīng)過修飾VEGF蛋白的多核苷酸給藥到哺乳動物的心臟，蛋白優(yōu)選VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182。優(yōu)選多核苷酸的冠狀動脈內(nèi)給藥，優(yōu)選根據(jù)PCT/US96/02631提出的方法，此方法在1996年9月6日公布，號碼為WO96/26742，在此引入作為參考。優(yōu)選的，冠狀動脈內(nèi)注射以深入左或右冠狀動脈管腔內(nèi)1cm進行。
因此，在優(yōu)選的實施方案中，轉(zhuǎn)染的細胞為肌肉細胞，包括但不局限于成肌細胞、肌細胞、心肌細胞、成心細胞和平滑肌細胞。優(yōu)選的，細胞為心肌細胞。更優(yōu)選的，轉(zhuǎn)染的細胞為冠狀動脈細胞，上述注射為冠狀動脈內(nèi)注射。更優(yōu)選的，腺病毒顆粒的注射以深入左或右冠狀動脈內(nèi)1cm進行。
優(yōu)選的，這些方法進一步包括給一種增強劑，可加強6b經(jīng)過修飾的VEGF-A多肽的血管發(fā)生效果。優(yōu)選的，增強劑為一種血管生成FGF。更優(yōu)選的，該增強劑選自FGF-1、FGF-2、FGF-4、FGF-5和FGF-6。
在本發(fā)明的一優(yōu)選方面，細胞轉(zhuǎn)染在體內(nèi)進行。在另一些優(yōu)選方面，上述細胞轉(zhuǎn)染離體進行。
內(nèi)皮細胞的增殖，例如在血管發(fā)生中所發(fā)生的那樣，在預防氣囊血管成型術后的再狹窄中也很有用。氣囊血管成型術程序常損傷到排列在血管內(nèi)壁的內(nèi)皮細胞。平滑肌細胞常浸潤到開放的血管中導致繼發(fā)性堵塞，此過程稱為再狹窄。為了以一層新的內(nèi)皮細胞覆蓋血管的腔面，位于氣囊所導致?lián)p傷區(qū)域表面內(nèi)皮細胞的增殖可恢復血管起始的結(jié)構(gòu)。
因此，本發(fā)明提供了治療哺乳動物心血管疾病的下述方法，包括將編碼6b經(jīng)過修飾的VEGF-A蛋白的多核苷酸分子轉(zhuǎn)染給上述動物細胞的步驟，蛋白優(yōu)選VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182。在優(yōu)選的方面，多核苷酸分子克隆入一種載體。在進一步的優(yōu)選優(yōu)選方面，載體為腺病毒載體。優(yōu)選的，腺病毒載體通過注射給上述哺乳動物；優(yōu)選的，注射腺病毒載體顆粒的數(shù)目在大約108和1014之間，更優(yōu)選的注射腺病毒載體顆粒在大約1011到1013。更優(yōu)選的，注射大約1012腺病毒載體顆粒。
因此在進一步的優(yōu)選方案中，核酸分子通過一種插入到上述動脈中的導管導入冠狀動脈內(nèi)。優(yōu)選的，導管含一可膨脹氣囊，后者的外表面可適應上述動脈的內(nèi)壁，由此將上述核酸分子覆蓋在氣囊的外表面上。
在本發(fā)明方法的另一些優(yōu)選方面，核酸分子包括圖3、圖4或圖5中的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一些方面，提供了轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染的宿主細胞，其中包括本發(fā)明的表達載體。這些宿主細胞可用于，例如產(chǎn)生VEGF-A多肽的方法，在合適的條件下，用本發(fā)明重組表達載體以一定方式轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細胞，可表達上述多肽，并從宿主細胞中分離該多肽。
本發(fā)明也提供了治療患局部缺血患者的方法，包括將治療劑量的含有6b經(jīng)過修飾的VEGF-A蛋白的藥物學組分在一合適的載體中給藥，優(yōu)選的蛋白為VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182。優(yōu)選的，該方法進一步包括給一增強劑，可加強6b經(jīng)過修飾的VEGF-A多肽的血管發(fā)生效果。優(yōu)選的，該增強劑選自FGF-1、FGF-2、FGF-4、FGF-5和FGF-6。此外，所述缺血疾病優(yōu)選選自心肌梗塞、慢性冠狀動脈缺血、慢性下肢缺血、中風和外周性血管疾病。
對于治療外周性情況，例如外周性血管疾病，本發(fā)明的藥物學組分的給藥優(yōu)選將修飾的VEGF-A多肽或多核苷酸(或含此多核苷酸的載體)在體內(nèi)給藥到外周組織。優(yōu)選的，可通過直接注射到外周組織來達到此目的，也可通過導入血管提供給外周組織。
本發(fā)明也提供了增加血管透過性的方法，包括將治療劑量的含有6b經(jīng)過修飾的VEGF-A蛋白的藥物學組分在合適的載體中給藥，優(yōu)選的蛋白為VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182。
本發(fā)明也提供治療創(chuàng)傷患者的方法，包括將治療劑量的含有6b經(jīng)過修飾的VEGF-A蛋白的藥物學組分在一合適的載體中給藥，優(yōu)選的蛋白為VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182。
由于本發(fā)明上述及其他目的、優(yōu)點和特征在本發(fā)明下文中將被闡明，所以在參照下列本發(fā)明的詳述部分、附圖及所附權利要求情況下，可對本發(fā)明的實質(zhì)得到更清晰的理解。
圖2描述了VEGF-206的核苷酸和氨基酸序列，外顯子以下畫線表示[SEQ ID NOs 1 and 2]。成熟VEGF-206轉(zhuǎn)錄物的核苷酸以大寫字母表示。5’端側(cè)翼區(qū)和內(nèi)含子核苷酸序列以小寫字母表示。在氨基端分泌序列被切割掉后，相應于成熟蛋白氨基末端的丙氨酸以星號表示。
圖3描述了VEGF-138編碼區(qū)的核苷酸和氨基酸序列[SEQ ID NOS 3and 4]。在氨基端分泌序列被切割掉后，相應于成熟蛋白氨基末端的丙氨酸以星號表示。
圖4描述了VEGF-182編碼區(qū)的核苷酸和氨基酸序列[SEQ ID NOs 5 and6]。在氨基端分泌序列被切割掉后，相應于成熟蛋白氨基末端的丙氨酸以星號表示。
圖5描述了VEGF-162編碼區(qū)的核苷酸和氨基酸序列[SEQ ID NOS 7and 8。在氨基端分泌序列被切割掉后，相應于成熟蛋白氨基末端的丙氨酸以星號表示。發(fā)明詳述下面是此處所用的縮寫。
BCE 牛角膜內(nèi)皮細胞BFGF堿性成纖維生長因子ECM 細胞外基質(zhì)HUVEC 人臍靜脈內(nèi)皮細胞VEGF血管內(nèi)皮生長因子VEGF-A 血管內(nèi)皮生長因子-AVEGF-Axxx含有標示數(shù)目(xxx)氨基酸的血管內(nèi)皮生長因子-A6b-modified VEGF-A 含有外顯子6b的血管內(nèi)皮生長因子蛋白，不包括VEGF-A206。
本發(fā)明涉及新的VEGF-A蛋白產(chǎn)物和編碼新蛋白產(chǎn)物的核酸，例如VEGF-A蛋白的外顯子1-5、6b、8；1-5、6b、7、8；或1-5、6a、6b、8，以及它們在治療心血管疾病中的應用。此處所用的“心血管疾病”是指由于心血管不足而來的疾病，包括但不局限于，冠狀動脈疾病、充血性心力衰竭和外周性血管病。本發(fā)明的方法涉及治療哺乳動物患者，優(yōu)選人。
“VEGF-A138”指含有138個氨基酸的一種VEGF-A形式，含有被VEGF-A基因外顯子1-5、6b和8編碼的肽?！癡EGF-A138”也指天然VEGF-A138核酸或氨基酸序列的衍生物和功能等同物。成熟的VEGF-A138單體包含圖3所示的氨基酸序列。但是，此處所用的VEGF-A138指成熟形式和包含信號序列的前體形式，以及它們的衍生物和功能等同物。
“VEGF-A182”指含有182個氨基酸的一種VEGF-A形式，含有被VEGF-A基因外顯子1-5、6b、7和8編碼的肽?！癡EGF-A182”也指天然VEGF-A182核酸或氨基酸序列的衍生物和功能等同物。成熟的VEGF-A182單體包含圖4所示的氨基酸序列。但是，此處所用的VEGF-A182指成熟形式和包含信號序列的前體形式，以及它們的衍生物和功能等同物。
“VEGF-A162”指含有162個氨基酸的一種VEGF-A形式，含有被VEGF-A基因外顯子1-5、6a、6b和8編碼的肽?！癡EGF-A162”也指天然VEGF-A162核酸或氨基酸序列的衍生物和功能等同物。成熟的VEGF-A162單體包含圖5所示的氨基酸序列。但是，此處所用的VEGF-A162指成熟形式和包含信號序列的前體形式，以及它們的衍生物和功能等同物。
VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b經(jīng)過修飾的VEGF蛋白的“衍生物”是指其功能上的等同物，并且具有同VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b經(jīng)過修飾的VEGF蛋白相似的氨基酸序列，在某種程度上保留了這些蛋白的活性。“功能等同物”指衍生物具有能夠替代VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b經(jīng)過修飾的VEGF蛋白活性的某種活性。在用本領域技術人員熟知的方法或此處所描述方法進行活性測定時，優(yōu)選的功能等同物保留了VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b經(jīng)過修飾的VEGF蛋白全部的活性。優(yōu)選的功能等同物具有VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b經(jīng)過修飾的VEGF蛋白1％-10000％之間的活性，更優(yōu)選10％-1000％，更優(yōu)選50％-200％。衍生物具有同VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b經(jīng)過修飾的VEGF蛋白至少50％的序列相似性，優(yōu)選70％，更優(yōu)選90％，更優(yōu)選95％?！靶蛄邢嗨菩浴敝覆还芏嚯牡膩碓矗^察到的兩個不同多肽氨基酸序列的“同源性”。
衍生物所保留的一些活性能力的測定可用此處所描述的技術或本領域技術人員熟知的技術，這些技術是為了測定其它VEGF-A異構(gòu)體的活性。衍生物包括翻譯過程中及翻譯后所發(fā)生的修飾，例如，磷酸化、糖基化、交聯(lián)、乙?；?、水解切割、連接到一抗體分子、膜分子或其它配體上(參照Ferguson等，1988，Annu.Rev.Biochem.57285-320)。
特定類型的衍生物也包括氨基酸的改變，例如缺失、替代、添加和氨基酸修飾?！叭笔А笔侵赶嚓P多肽中一個或多個氨基酸殘基的丟失?！疤砑印笔侵赶嚓P多肽中一個或多個氨基酸殘基的加入。在一多肽中的添加和缺失可以在氨基端、羧基端或內(nèi)部。氨基酸“修飾”指因自然發(fā)生的氨基酸改變而生成了自然情況下不存在的氨基酸。“替代”是指多肽中一個或多個氨基酸殘基被另外一個或一些氨基酸殘基所取代。衍生物可包括這些改變的不同組合，包括多于一個或不同類型的改變。
盡管氨基酸改變造成的影響依賴于不同的因素，例如磷酸化、糖基化、鏈內(nèi)交聯(lián)、三級結(jié)構(gòu)和氨基酸在活性位點或可能變構(gòu)位點的作用，一般優(yōu)選替代的殘基同被替代殘基為相同類別。在某種程度上含有下述氨基酸的組別內(nèi)可互換堿性氨基酸賴氨酸、精氨酸和組氨酸；酸性氨基酸天冬氨酸和谷氨酸；中性極性氨基酸絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺和，在某種更小程度上，甲硫氨酸；非極性脂肪性氨基酸甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸(因為大小的緣故，甘氨酸和丙氨酸更接近，異亮氨酸和亮氨酸更接近)；和芳香氨基酸苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。此外，盡管被分為不同組別，丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸在某種程度上可互換，半胱氨酸也可添加到組別，或被分為極性中性氨基酸。
盡管脯氨酸為中性非極性的氨基酸，由于對構(gòu)象的影響，它的置換非常困難。因此，不優(yōu)選用脯氨酸替代其它氨基酸或用其它氨基酸替代脯氨酸，除非可以獲得相同或相似的構(gòu)象。具有脯氨酸殘基特性構(gòu)象的置換可用羥脯氨酸(Hyp)替代一個或多個脯氨酸來獲得。
被修飾氨基酸的實例包括下面一些被改變的中性非極性氨基酸如公式H2N(CH2)，nCOOH，其中n為2-6，中的氨基酸、肌氨酸(Sar)、t-丁基丙氨酸(t-BuAla)、t-丁基甘氨酸(t-BuGly)、N-甲基-異亮氨酸(N-MeIle)和正亮氨酸苯基甘氨酸(Nleu)；被改變的中性芳香氨基酸如苯基甘氨酸；被改變的極性中性氨基酸如瓜氨酸(Cit)和硫氧化甲硫氨酸(MSO)；被改變的中性非極性氨基酸如環(huán)己基丙氨酸(Cha)；被改變的酸性氨基酸如磺基丙氨酸(Cya)；被改變的堿性氨基酸如鳥氨酸(Om)。
優(yōu)選的衍生物有一個或多個氨基酸改變，但不顯著改變6b經(jīng)過修飾VEGF蛋白的受體結(jié)合活性或其它活性。在6b經(jīng)過修飾VEGF蛋白活性非必須的多肽序列區(qū)域，氨基酸的刪除、添加和替代一般對活性影響較小。在其蛋白活性所必須的區(qū)域，因為對活性影響的可能性很大，因此不優(yōu)選此類氨基酸的改變。這一類改變應該為保守性改變。例如，序列中的一個或多個氨基酸用相似極性的氨基酸替代，作為功能上的等同物。
保守的區(qū)域相對于非保守區(qū)而言對蛋白的活性更重要?？梢杂帽景l(fā)明公開所描述的體外突變技術和缺失分析等標準程序來測定對受體活性重要的保守和非保守區(qū)，并測定受體活性。
可以用標準的化學技術和重組核酸分子技術得到衍生物。對一特定多肽的修飾可以是有意識的，如通過通過定點突變和固相合成中的氨基酸替代，也可是隨意的，如通過在產(chǎn)生多肽的宿主中產(chǎn)生突變。可以用標準技術，如Sambrook等在分子克隆，冷泉港實驗室出版社(1989)，中所描述的技術來獲得多肽，包括衍生物。例如Sambrook在第15章描述了所克隆DNA的定點突變。
在本發(fā)明的一方面，描述了核酸分子或編碼6b經(jīng)過修飾VEGF蛋白的多核苷酸的特征。在某些情況下，期望這些核酸分子已經(jīng)被分離、富集和純化。核酸分子、多肽或蛋白的“富集”是指，相比較在正常細胞、疾病細胞或這些序列所來的細胞，特定的DNA或RNA序列、多肽或蛋白在目的細胞或溶液中占總的DNA或RNA序列、多肽或蛋白的比例要顯著地高(2-5倍)。這可通過人為方法優(yōu)先減少其它DNA或RNA、也可通過增加特定DNA或RNA序列的數(shù)量或是二者的結(jié)合來實現(xiàn)。但是，應該指出，富集并不意味著沒有其它的DNA或RNA出現(xiàn)，只是目的序列的量有顯著的增加。此處的顯著用于表明增加的水平對要達到增加目的的人有用，一般指相對于其它核酸有至少2倍的增加，更優(yōu)選至少5-10倍的增加或更多。此術語也不意味著沒有其它來源的DNA或RNA。其它來源的DNA可能包括，例如從酵母或細菌基因組或克隆載體如pUCI9中而來的DNA。該術語區(qū)別于自然發(fā)生的事件，如病毒感染或腫瘤型生長，其中一種mRNA的水平相對于其它種類mRNA已經(jīng)自然增加。也就是說，此術語僅包括人為升高了目的核酸的情況。
使用術語“分離”是指已經(jīng)將DNA、RNA或蛋白從其自然發(fā)生的環(huán)境中提取出來。因此，序列處在一無細胞溶液或在一不同的細胞環(huán)境中。該術語并不意味著該序列為唯一的核苷酸鏈或多肽，但已經(jīng)幾乎沒有(大約至少90-95％的純度)了在自然情況下同其結(jié)合的非核苷酸或非肽類物質(zhì)。
核苷酸序列或多肽以純化的形式對某些目的很有利，例如以克隆或重組的純化形式。術語“純化的”并不需要絕對純度(例如一均勻的制備)；相反，它表明序列比自然環(huán)境中相對較純(同自然水平比，至少高2-5倍，例如以mg/ml計。
使用，例如寡核苷酸介導的定點突變、用限制酶刪除序列、用亞克隆或PCR添加序列或使用此處所描述的方法，可以對已存在VEGF-A核苷酸序列進行修飾，構(gòu)建核酸分子。標準的突變重組技術例如體外定點突變(Hutchinson等，J.Biol.Chem.2536551，(1978)，Sambrook等，Chapter15，supra)、使用TAB接頭(Pharmacia)和PCR介導的突變可用于產(chǎn)生此類突變。核酸分子也可通過三酯法或自動DNA合成儀合成。
本發(fā)明也描述了重組DNA載體的特征，優(yōu)選在一細胞或有機體內(nèi)。重組DNA載體可包括在一載體中含能有效啟動在宿主細胞轉(zhuǎn)錄起始的啟動子和編碼VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b經(jīng)過修飾的VEGF蛋白或其功能等同物的核酸序列。重組DNA載體中也可包含一在細胞中起作用的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。如果DNA載體含有足夠的控制序列，例如起始和終止區(qū)，則被插入的核酸分子可以在宿主細胞表達，載體也可稱為“表達載體”。
本發(fā)明也涉及到包含上述核酸分子和重組DNA載體的細胞或有機體，因而能夠表達VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b經(jīng)過修飾的VEGF蛋白?？梢詮囊呀?jīng)經(jīng)過改變能夠表達多肽的細胞中純化多肽。當細胞通過基因操作，可以產(chǎn)生在正常情況下不產(chǎn)生或產(chǎn)生量非常低的蛋白時，該細胞被稱為“被改變表達一預期多肽”。本領域技術人員可很容易改變此程序?qū)⒒蚪M、cDNA或合成序列導入真核或原核細胞中表達。
如果一個核酸分子含有一核苷酸序列，其中包含轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控信息，并且這些序列可操作的連接到編碼多肽的核苷酸序列上，該核酸分子，例如DNA，可以說“能表達”多肽?；蛐蛄斜磉_所需調(diào)控區(qū)的精確特征依有機體不同而不同，但一般包括一啟動子區(qū)，在原核生物，包含啟動子(指導RNA轉(zhuǎn)錄起始)和在轉(zhuǎn)錄成RNA時能指導起始合成的DNA序列。這樣的區(qū)域一般包括同轉(zhuǎn)錄和翻譯起始相關的5’端非編碼區(qū)，例如TATA框、帽子序列、CAAT序列和類似序列。
例如，VEGF-A138的完整編碼序列在一合適表達載體中可以同下述的一個或多個序列結(jié)合從而允許表達(1)一種外源啟動子序列(2)一種核糖體結(jié)合位點(3)一種多聚A加尾信號(4)一種分泌信號(5)一種不加選擇的或組織特異的增強子。在5’和3’非翻譯序列可以進行修飾來改進在原核和真核細胞的表達，或改變密碼子，使得該密碼子盡管編碼相同的氨基酸，但在選定的表達系統(tǒng)內(nèi)是優(yōu)先的密碼。使用此類優(yōu)選密碼在，例如，Grantham等，Nuc.Acids Res.,943-74(1994)和Lathe,J.Mol.Biol.1831-12(1985)中有描述，在此完整引入作為參考。這些發(fā)表的文章以及所引用的其它文章在此完整引入作為參考。
如果期望，VEGF-A蛋白的基因組序列可以可操作的連接在編碼，例如VEGF-A138的核酸分子上。該區(qū)域在重組DNA載體中可用作轉(zhuǎn)錄終止調(diào)控序列，例如終止和加尾信號。因此，保留同編碼VEGF-A的DNA序列自然連接的3’區(qū)，可提供終止信號或保持信使RNA穩(wěn)定性的序列?？蛇x擇的，在宿主細胞中有功能的3’區(qū)可以被替代。
可操作的連接是指調(diào)控序列、DNA序列和要被表達的DNA序列以一種允許基因表達的一種連接方式。兩個DNA序列(例如一種啟動子區(qū)序列和一VEGF-A138蛋白序列)被稱為可操作連接，如果兩個序列的連接在本質(zhì)上不(1)導致在編碼區(qū)引入移框突變，(2)干擾啟動子區(qū)序列指導VEGF-A138蛋白的基因序列轉(zhuǎn)錄的能力，或(3)干擾VEGF-A138蛋白基因序列被啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄的能力。因此，如果啟動子能夠影響DNA序列的轉(zhuǎn)錄，則啟動子區(qū)就可操作的連接到DNA序列上。因此，為了表達VEGF-A138，被合適宿主識別的轉(zhuǎn)錄和翻譯信號是必需的。
本領域技術人員可認識到，本發(fā)明的新VEGF蛋白的表達可以在各種細胞系統(tǒng)中，包括原核和真核細胞，所有這些均在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
盡管本發(fā)明的新VEGF-A蛋白可以在原核細胞表達，而原核細胞在產(chǎn)生重組蛋白方面也非常有效和便利，但此類細胞產(chǎn)生的VEGF-A蛋白沒有糖基化，因此在體內(nèi)的半衰期比較短。經(jīng)常使用的原核細胞代表是各種E.coli菌株。但是，也可使用其它微生物，包括其它細菌菌株。已經(jīng)認識到的原核宿主細胞包括細菌如E.coli、芽孢桿菌、鏈霉菌屬、假單胞菌屬、沙門氏菌、沙雷氏菌屬和類似的菌株。所用的原核宿主必須同表達質(zhì)粒中的復制子和控制序列兼容。
在原核系統(tǒng)中，可以使用含有和宿主細胞能夠兼容的物種的復制位點和控制序列。合適的質(zhì)粒載體的實例包括pBR322、PUC118、pUC119和類似的質(zhì)粒；合適的噬菌體和細菌噬菌體包括λgt10、λgt11和類似的載體；合適的病毒載體包括pMAM-neo、pKRC和類似的載體。優(yōu)選的，本發(fā)明選擇的載體具有在所選擇使用的細胞中復制的能力。
為了在原核細胞表達VEGF多肽或其亞單元(或其功能性衍生物)，必須將6b經(jīng)過修飾的VEGF核酸序列可操作的連接在一功能啟動子上。這些啟動子可以是組成性，也可以并且優(yōu)選為可調(diào)控的(即可誘導的或可阻遏的)。組成性啟動子的例子包括細菌噬菌體λ的int啟動子、pBR322中β-內(nèi)酰胺酶基因序列的bla啟動子、和pPR325中氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因序列的CAT啟動子。可誘導的原核啟動子的實例包括細菌噬菌體λ的主要右和左啟動子(PL和PR)、E.coli的trp、recA、lacZ、lacI和gal啟動子、B.subtilis(Gilman等，Gene sequence 3211-20(1984))的α-淀粉酶(Ulmanen等，J.Bacteriol.162176-182(1985))和-28特異啟動子、細菌噬菌體芽孢桿菌(Gryczan，在Bacilli的分子生物學，Academic出版社，Inc.,NY(1982))的啟動子和鏈霉菌屬啟動子(Ward等，Mol.Gen.Genet.203468-478(1986))。原核啟動子的綜述參照Glick(J.Ind.Microbiot.1277-282(1987))；Cenatiempo(Biochimie 68505-516(1986))；和Gottesman(Ann.Rev.Genet.18415-442(1984))。
在原核細胞中合適的表達需要在基因編碼區(qū)序列的上游含有核糖體結(jié)合位點。這種核糖體結(jié)合位點已被公開，例如Gold等(Ann.Rev.Microbiol.35365-404(1981)。核糖體結(jié)合位點和其它翻譯起始所需的序列可操作的同編碼VEGF-A145的核酸分子相連，例如，連接在含有此類控制序列的合成寡核苷酸上。對于在原核細胞表達，無需要信號肽序列?？刂菩蛄小⒈磉_載體、轉(zhuǎn)化方法的及類似條件的選擇依賴于表達基因所用的宿主細胞。
此處所用的“細胞”、“細胞系”和“細胞培養(yǎng)”可互換使用，并且所有此類的稱謂都包括子代。因此，術語“轉(zhuǎn)化子”或“轉(zhuǎn)化細胞”均包括起始轉(zhuǎn)化細胞和由此培養(yǎng)得到的細胞，而不管轉(zhuǎn)化的次數(shù)。例如，在原核細胞表達的VEGF-A138預期包含一蛋白混合物，其中包括根據(jù)載體序列能夠預測的具有N末端正常起始的VEGF-A138肽以及具有N端甲硫氨酸的VEGF-A138肽，后者是因在細菌表達但不足以切割甲硫氨酸而得到的。這兩種類型的VEGF-A138肽均在本發(fā)明范圍之中，因為N端甲硫氨酸并不影響生物學活性。也需要明白，因為有意或偶然突變，所有的子代并不一定含有非常精確一致的DNA內(nèi)容物。但是，如所述那樣，突變的子代具有同起初轉(zhuǎn)化細胞相同的功能。
優(yōu)選的原核載體包括那些例如在E.coli(例如pBR322、ColE1、pSC101、pACYC 184、πVX)能夠復制的質(zhì)粒。這些質(zhì)粒被公開在，例如Sambrook(cf.“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”，第二版，Sambrook編輯，F(xiàn)ritsch,&Maniatis，冷泉港實驗室，(1989))。芽孢桿菌質(zhì)粒包括pC194、pC221、pT127和類似的質(zhì)粒。這樣的質(zhì)粒已公開Gryczan(在Bacilli的分子生物學，Academic出版社，Inc.,NY(1982)，pp.307-329)。適合的鏈霉菌屬質(zhì)粒包括plJ101(Kendall等，J.Bacteriol.1694177-4183(1987))，和鏈霉菌屬細菌噬菌體例如φC31(Chater等，在；關于Actinomycetales Biology第6次國際研討會，Akademiai Kaido,Budapest,Hungary(1986))，假單孢菌屬的質(zhì)粒由John等(Rev.Infect.Dis.8693-704(1986)和Izaki(Jpn.J.Bacteriol.33729-742(1978))綜述。
用于本發(fā)明的真核細胞表達體系沒有嚴格限制，如果它們適用于表達本發(fā)明的6b經(jīng)過修飾的VEGF蛋白。優(yōu)選的真核宿主包括，例如體內(nèi)或組織培養(yǎng)的酵母、真菌、昆蟲細胞、哺乳動物細胞。用作宿主的哺乳動物細胞包括Hela細胞、成纖維來源的細胞例如Vero或CHO-K1，或淋巴來源細胞和其衍生物。
本發(fā)明中6b經(jīng)過修飾的VEGF-A蛋白也可表達在人細胞，例如人胚胎腎293EBNA細胞，該細胞表達Epstein-Barr病毒核抗原1，例如在Olofsson，B等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 932576-2581(1996)中所描述。表達載體轉(zhuǎn)染細胞使用，例如磷酸鈣沉淀或脂轉(zhuǎn)染法，然后細胞孵育至少48小時。然后用實施例Ⅱ中所述的方法從上清中純化VEGF肽。
此外，植物細胞也可用作宿主細胞，可以使用和植物細胞兼容的控制序列，例如菜花花葉病毒35S和19S，和胭脂堿合成酶啟動子和多聚A信號序列。另一優(yōu)選的宿主為昆蟲細胞，例如果蠅幼蟲。使用昆蟲細胞做宿主時，可使用果蠅酒精脫氫酶啟動子。Rubin,Science 2401453-1459(1988)。
可使用一系列的酵母基因序列表達系統(tǒng)的任何一種，其中含有來自于編碼糖酵解酶活性表達基因的啟動子和終止元件，當酵母在富含葡萄糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時可大量產(chǎn)生此類酶。已知的糖酵解酶基因序列也可以提供非常有效的轉(zhuǎn)錄控制信號。酵母的巨大優(yōu)勢在于，它在肽翻譯后可以對其進行加工。已存在很多使用強啟動子序列和高拷貝質(zhì)粒的重組DNA策略，用于在酵母中產(chǎn)生預期的蛋白。酵母可識別所克隆哺乳動物基因產(chǎn)物上的引導序列，并分泌含有導肽序列的肽(即前肽)。對于哺乳動物宿主，幾個有用的可能載體系統(tǒng)可用于表達本發(fā)明中6b經(jīng)過修飾的VEGF肽。
依賴于所用宿主的性質(zhì)，可使用很多轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列。轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控信號可以是病毒來源，例如腺病毒、牛乳頭瘤病毒、細胞巨化病毒、猿的病毒或類似病毒，其中調(diào)控序列同高水平的表達的特定基因序列相結(jié)合?？蛇x擇的，來自哺乳動物表達產(chǎn)物的啟動子，例如肌動蛋白、膠原、肌凝蛋白和類似的啟動子也可以使用?？梢赃x擇允許抑制和激活的轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控信號，來調(diào)節(jié)基因序列的表達。另人感興趣的調(diào)控信號為溫度敏感，隨溫度的變化，基因表達可受到抑制或激活，或受化學(如代謝物)調(diào)控。
在真核宿主中表達本發(fā)明6b經(jīng)過修飾的VEGF蛋白需要使用真核調(diào)控區(qū)。這樣的區(qū)域一般包括一足以指導RNA合成起始的啟動子區(qū)。優(yōu)選的真核啟動子包括，例如，小鼠金屬硫蛋白Ⅰ基因序列的啟動子(Hamer等，J.Mol.Appl.Gen.1273-288(1982))；皰疹病毒的TK啟動子(McKnight,Cell 31355-365(1982))；SV40早期啟動子(Benoist等，Nature(London)290304-310(1981))；酵母ga14基因序列啟動子(Johnson等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)796971-6975(1982)；Silver等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)815951-5955(1984))。
真核mRNA的翻譯起始在編碼第一個甲硫氨酸的密碼子。因此，優(yōu)選能夠保證在真核啟動子和編碼VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b經(jīng)過修飾的VEGF蛋白及功能衍生物DNA序列之間的連接不包含能編碼甲硫氨酸的干擾密碼(即AUG)。這種密碼的出現(xiàn)可導致形成融合蛋白(如果AUG密碼同，例如VEGF-A138蛋白編碼序列，在同一讀框)或移框突變(如果AUG密碼同，例如VEGF-A138蛋白編碼序列，不在同一讀框)。
6b經(jīng)過修飾的VEGF-A核酸分子和一可操作的啟動子連接后可導入到一原核或真核受體細胞，作為一不能復制的DNA(或RNA)分子，該分子要麼以線性分子導入，但更優(yōu)選一閉環(huán)共價分子。因為這樣的分子不能自主復制，基因表達的發(fā)生僅僅為“被導入序列”的短暫表達?？蛇x擇的，可通過將導入DNA序列整和到染色體來使其永久表達。
可以使用的載體是能夠?qū)㈩A期的基因序列整和到宿主細胞的染色體。導入DNA已穩(wěn)定整和到染色體上的細胞的篩選可通過這樣的方式，即導入能夠篩選含有表達載體的宿主細胞的一個或多個標記。標記可對一營養(yǎng)缺陷宿主提供原營養(yǎng)、殺生物劑抗性，即抗生素或重金屬如銅，或類似方法?？蛇x擇的標記基因序列可直接連接在要表達基因的DNA序列上，或通過共轉(zhuǎn)染導入相同的細胞。單鏈結(jié)合蛋白RNA的最優(yōu)合成還需要其它元件。這些元件可能包括剪接信號和轉(zhuǎn)錄啟動子、增強子和終止信號。包含這些元件的cDNA表達載體包括Okayama,Molec.Cell.Biol.3280(1983)所描述的載體。
導入的核酸分子可以連接到一能夠在宿主細胞自主復制的質(zhì)?；虿《据d體上。任何這些種類的載體都可用于此目的。選擇特定質(zhì)?；虿《据d體的重要因素包括含有載體的受體細胞能夠被識別以及從不包含載體細胞中篩選的容易程度；在一特定宿主中預期載體的拷貝數(shù)，以及是否期望載體在不同種類的宿主細胞間“穿梭”。
優(yōu)選的真核質(zhì)粒包括例如，BPV、痘苗病毒、SV40、2-微米環(huán)和類似的載體及這些載體的衍生物。這樣的質(zhì)粒在本領域眾所周知(Botstein等，Miami Wntr.Symp.19265-274(1982)；Broach，在“酵母菌屬的分子生物學生命周期和遺傳”，冷泉港實驗室，NY，p.445-470(1981)；Broach，Cell 28203-204(1982)；Ballon等，J.Clin.Hematol.Oncol.1039-48(1980)；Maniatis，在細胞生物學A Comprehensive Treatise,vol.3，基因序列表達，Academic出版社，NY，pp.563-608(1980)。
“載體”(有時指基因給藥或基因轉(zhuǎn)移的“工具”)指一大分子或分子復合物，其中包含一要在體外或體內(nèi)導入到宿主細胞的多核苷酸。要被導入的多核苷酸包括一用于基因治療目的的編碼序列。載體包括，例如病毒載體(例如腺病毒(‘Ad’)、腺聯(lián)病毒(AAV)、和反轉(zhuǎn)錄病毒)、脂質(zhì)體及其它含脂復合物、和其它能介導多核苷酸導入宿主細胞的大分子復合物。載體也可包括其它一些成分或功能，可進一步調(diào)節(jié)基因?qū)牖蚧虮磉_，或能夠給靶細胞提供有益的性質(zhì)。如下面詳述，這些成分包括，例如影響細胞結(jié)合和細胞導向的成分(包括介導細胞類型和組織特異的結(jié)合)；影響細胞攝入載體核酸的成分；影響多核苷酸攝入后在細胞內(nèi)定位的因素(例如介導核定位的因子)；以及影響多核苷酸表達的成分。這樣的成分也包括一些標記，這些可檢測或篩選的標記可用于檢測或篩選這樣的細胞，即已經(jīng)攝入并表達了載體所導入核酸的細胞。這樣的成分也可作為載體的一自然特征(例如使用某些具有介導結(jié)合和攝入功能的某些病毒載體)，或?qū)⑤d體修飾后含有此類功能。在本領域有大量這樣的載體，一般可以獲得(參照，例如此處所引用的各種文獻)。
根據(jù)前面的一個實施方案，在優(yōu)選加強心功能的方法中，載體是病毒載體或基于脂類的載體，優(yōu)選病毒載體。載體可以是一靶向載體，尤其是優(yōu)先結(jié)合心室肌細胞的靶向載體。目前優(yōu)選的病毒載體是腺病毒(Ad)或腺聯(lián)病毒(AVV)來源的載體。可以使用人或非人的病毒載體，但優(yōu)選的病毒載體在人為復制缺陷型。當載體是腺病毒時，優(yōu)選含有一可操作啟動子并連接在編碼血管生成蛋白或肽上的多核苷酸，并且在人為復制缺陷。
當前優(yōu)選的復制缺陷腺病毒載體是去除了E1A和E1B基因或去除了E1A、E1B和E4基因的缺失載體。優(yōu)選用大約1010-1014的病毒載體顆粒，更優(yōu)選1011-1013的病毒載體顆粒，最優(yōu)選1012的病毒載體顆粒，導入血管，優(yōu)選供應心肌的血管。
對于AVV載體，優(yōu)選的載體包括一多核苷酸，其中包括連接在編碼血管生成蛋白或肽基因序列上的可操作啟動子，優(yōu)選編碼血管生成蛋白或肽基因序列的側(cè)翼序列為AAV反轉(zhuǎn)末端重復(ITRs)。優(yōu)選的，AAV載體在人為復制缺陷。當前優(yōu)選的AAV復制缺陷載體含有一個或多個能夠影響AAV復制或衣殼裝配序列的缺失?？蛇x擇的，載體可以是基于脂類的載體，其中包含一編碼此處所述的血管生成蛋白或肽的基因。
當含有構(gòu)建體的載體或核酸分子用于表達時，可以使用任何一種合適的方式將DNA構(gòu)建體導入到一合適的宿主細胞，即轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、接合、原生質(zhì)體融合、電穿孔、顆粒槍技術、脂轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀、直接顯微注射、DEAE葡聚糖轉(zhuǎn)染和類似的方法。最有效的用質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染真核細胞系的方法依據(jù)所用細胞類型的不同而變化。在導入載體后，受體細胞要在一選擇性培養(yǎng)基中生長，篩選含有載體的細胞。克隆基因的表達可產(chǎn)生6b經(jīng)過修飾的VEGF。這可直接發(fā)生在轉(zhuǎn)化的細胞或在誘導這些細胞分化后(例如，將bromodeoxyuracil加入到成神經(jīng)瘤細胞或類似情況)。各種孵育條件可用于形成本發(fā)明的肽。最優(yōu)選的條件是那些模仿生理狀況下的條件。
穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子的產(chǎn)生可通過用一真核表達載體例如pCEP4轉(zhuǎn)染合適的細胞系，其中編碼6b經(jīng)過修飾VEGF蛋白的編碼序列已克隆到多克隆位點。這些表達載體含一啟動子區(qū)，例如細胞巨化病毒啟動子(CMV)，啟動預期的DNA分子在很多種類哺乳動物細胞中高水平轉(zhuǎn)錄。此外，這些載體含有某些基因，用于篩選能夠穩(wěn)定表達目的DNA分子的細胞。在pCEP4載體中可選擇的標記編碼一種酶，賦予了對潮霉素的抗性，后者為一代謝抑制因子，加入到培養(yǎng)基中可殺死非轉(zhuǎn)染細胞。
穩(wěn)定整和了轉(zhuǎn)染DNA的細胞的鑒定可用上述對選擇培養(yǎng)基的抗性來進行，通過擴增抗性克隆來得到克隆細胞系。這些細胞系中6b經(jīng)過修飾VEGF蛋白的表達可通過本領域已知的方法來進行評估，例如用RNAse保護分析、Northern雜交或western分析。藥物學組成和治療用途本發(fā)明的一個目標是提供一含有VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b經(jīng)過修飾的VEGF蛋白的藥物組成，用于治療。因此，本發(fā)明在一方面提供了包含VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或6b經(jīng)過修飾的VEGF蛋白的藥物學組成，以有效治療劑量給患者用藥，可刺激血管細胞增殖。
“有效治療劑量”是指在患者能產(chǎn)生預期治療效果的化合物量。例如，對某一疾病或病癥，可以在某種程度上減輕疾病或病癥的一個或多個癥狀、部分或全部恢復正常、同疾病或病癥相關或?qū)е录膊〉纳砘蛏瘏?shù)減輕的劑量。當用于治療患者時，預期用0.1mg/kg蛋白到100mg/kg，優(yōu)選少于50mg/kg，更優(yōu)選少于10mg/kg，更優(yōu)選少于1mg/kg?；衔镉昧恳蕾囉谀挲g、大小和同患者相關的疾病，可以用標準的程序進行測定。因此，對于基因治療，有效治療劑量是足以指導在患者表達和分泌該劑量蛋白所需的載體劑量。
優(yōu)選的將本發(fā)明化合物給患者的方式依賴于本領域所知的因素如，特定的疾病或病癥、預期的效果和患者的類型。當化合物可典型的用于人患者時，它們也可用于治療其它哺乳動物的類似或相同疾病，例如其它靈長類、家養(yǎng)動物如豬、牛和家禽、娛樂動物或?qū)櫸锶珩R、狗和貓。
優(yōu)選的，有效的治療劑量做為藥物學組成的一部分。一藥物學制劑或組成是指，一制劑或組成以合適的形式給藥到多細胞有機體，例如人。合適的給藥形式在部分上依賴于導入用途和途徑，例如口服、經(jīng)皮或注射。不管靶細胞是在多細胞有機體或培養(yǎng)物中，這些形式允許制劑或組成到達靶細胞。例如，注射到血流中的藥物學制劑或組分應該可溶。其它一些因素，包括毒性和阻止制劑或組成發(fā)揮作用的形式已為本領域所知。
要求權利保護的組分也可制成藥物學上可接受的鹽(例如酸性附加鹽)和/或由此得到的復合物。藥物學上可接受的鹽是指在用藥濃度時無毒性的鹽。這種鹽的制備可改變組分的理化特性，而不影響其發(fā)揮功能，因此有利于藥物學上的應用。有用的物理特性改變的實例包括降低熔點，有利于跨黏膜給藥，增加可溶性從而有利于高濃度給藥。
藥物學上可接受的鹽包括酸性附加鹽例如硫酸鹽、氫氯化物、磷酸鹽、磺酸鹽、氨基磺酸鹽、硫酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、p-甲苯磺酸鹽、cyclohexylsulfonate、cyclohexylsulfamate和奎尼酸鹽。藥物學上可接受的鹽也可從酸獲得，例如鹽酸、硫酸、磷酸、磺酸、sulfamic acid、乙酸、檸檬酸、乳酸、酒石酸、馬來酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、p-甲苯磺酸、cyclohexylsulfonate acid、cyclohexylsulfamate acid和奎尼酸。這樣的鹽也可以用下述方法獲得例如將游離形式的酸或堿同一個或多個合適的等同堿或酸在一溶劑或培養(yǎng)基中反應，其中鹽是不可溶的，或在一溶劑例如水中，水最后在真空中去除、或凍干去除、或通過合適的離子交換樹脂用另一種離子交換現(xiàn)存的鹽。
也可使用載體或賦形劑來利于化合物的給藥。載體或賦形劑的實例包括碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖如乳糖、葡萄糖、或蔗糖、或各種淀粉、纖維素衍生物、明膠、蔬菜油、聚乙二醇和在生理上配伍的溶劑。組分或藥物學組分可通過不同途徑給藥，包括靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下和肌肉內(nèi)、口服、局部或經(jīng)皮。
可用氯化鈉或其它藥物學上可接受的試劑如葡聚糖、硼酸、酒石酸鈉、丙二醇、多元醇(例如甘露醇和山梨醇)，或無機或有機溶質(zhì)來調(diào)整到預期的滲透壓。對于含有鈉離子的緩沖液，特別優(yōu)選氯化鈉。
本發(fā)明的化合物可制成不同形式的服用制劑，包括全身、局部或定位給藥。所用的技術和制法可在Remington的《藥物學科學》，第18版，Mack出版公司，Easton，PA，1990中找到。也可參照Wang,Y.J.和Hanson,M.A.“蛋白和肽的不經(jīng)腸道的制劑穩(wěn)定性和穩(wěn)定劑”，Journal of ParenteralSciences and Technology,Technical Report No.10，Supp.422S(1998)。合適的給藥程序最好通過醫(yī)療醫(yī)師對每一個患者進行測定。
對于全身給藥，優(yōu)選注射，例如，皮內(nèi)、皮下、膜內(nèi)、或顱腔內(nèi)。對于注射，本發(fā)明的化合物要制成液體，優(yōu)選生理配伍的Hank’s溶液或Ringer’s溶液?？蛇x擇的，本發(fā)明的化合物可使用USP標準認定的一個或多個的安全賦形劑(例如丙二醇)?？梢詫⑵鋺腋≡诙栊杂椭校线m的蔬菜油如芝麻油、花生油、橄欖油或別的可接受的載體。優(yōu)選的，將它們懸浮在一水相載體，例如在一pH值在5.6-7.4的等滲溶液中。這些組成可用常規(guī)滅菌技術進行滅菌，也可過濾除菌。組成中可含有藥物學上可接受的輔助物質(zhì)，使其更接近生理條件，例如pH緩沖試劑。有用的緩沖液包括例如，Goodman乙酸鹽/乙酸緩沖液。可以使用貯存或“儲留”形式的緩慢釋放制劑，使得有效治療劑量的制劑在給藥到血流中許多小時后，或經(jīng)皮注射或給藥幾天后仍能發(fā)揮作用。此外，可以將制劑制成固體形式，在臨用前重新溶解或懸浮。也包括凍干形式。也可將VEGF-A145蛋白覆蓋在氣囊上通過可膨脹的的氣囊導管將物質(zhì)給藥到靶動脈。
可選擇的，化合物可用口服。對于口服給藥，化合物可制成常規(guī)的口服劑量形式，例如膠囊、片劑或補品。
全身給藥也可用經(jīng)黏膜或經(jīng)皮途徑，也可口服給藥。對于經(jīng)黏膜和經(jīng)皮給藥，需在制劑中使用適于穿透障礙的浸透劑。這樣的浸透劑一般對本領域所知，包括例如，用于經(jīng)黏膜給藥的膽汁鹽和夫西地酸衍生物。此外，可以使用除垢劑加速滲透。經(jīng)黏膜給藥可通過，例如，鼻噴入法或使用栓劑。對于口服給藥，可將分子制成常規(guī)口服劑量形式，例如膠囊、片劑和液體制劑。
對于局部給藥，本發(fā)明的化合物可制成軟膏、敷藥膏、凝膠劑或膏狀物，這些形式對本領域一般所知。
如果期望上述組分粘稠，可以使用粘稠劑例如甲基纖維素來實現(xiàn)。可以制成乳濁液形式，油包水或水包油。任何在藥物學上可接受的乳濁液制劑都可使用包括，例如，阿拉伯膠粉、非離子表面活性劑(例如Tween)或一離子表面活性劑(例如堿性polyether alcohol sulfates或sulfonates，例如Triton)。
本發(fā)明有用的組成制備可以使用一般可接受的程序?qū)⒊煞只旌掀饋?。例如，可用混料機或其它標準的裝置將被選成分簡單的混和，產(chǎn)生一定濃度的混合物，通過加入水或粘稠劑調(diào)整到終濃度和黏度，或可能需加入緩沖液控制pH或一額外溶質(zhì)控制緊張度。
本發(fā)明各種化合物的給藥量可以用標準的程序進行測定。
對于給醫(yī)生所用，組成應該以單位劑量的形式，其中包含一定量的VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b經(jīng)過修飾的VEGF蛋白?；蛑委熅幋aVEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b經(jīng)過修飾的VEGF蛋白的核酸也可用于基因治療(在Miller,Nature 357455-460(1992)中綜述)。Miller表明，已有的進展使實用于人的基因治療有了初步的陽性結(jié)果。關于基因治療的基礎科學描述在Mulligan,Science 260926-931(1993)?；蛑委煹囊粋€實例在實施例Ⅳ中給出，其中描述了腺病毒介導的基因治療。
作為另一實例，含有VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b經(jīng)過修飾的VEGF蛋白編碼序列的表達載體可插入到細胞，在體外培養(yǎng)細胞，然后注入患者。在另一實例中，含有選擇性啟動子(例如一強啟動子)的DNA節(jié)段轉(zhuǎn)移到含有內(nèi)源性VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b經(jīng)過修飾的VEGF蛋白的細胞，如果在細胞中存在內(nèi)源性的形式，在此種方式下，啟動子可加強內(nèi)源性基因的表達(例如，將啟動子節(jié)段轉(zhuǎn)移到細胞使得直接同內(nèi)源VEGF基因相連)。
基因治療需要使用包含編碼VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b經(jīng)過修飾的VEGF蛋白核苷酸序列的腺病毒載體或其它載體，或使用編碼這些蛋白的裸露核酸分子?？蛇x擇的，包含有編碼這些修飾蛋白核酸分子的工程細胞可用于注射。實施例Ⅳ說明了用腺病毒載體提供血管發(fā)生治療的基因治療方法。
來源于病毒，例如反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺聯(lián)病毒、皰疹病毒、一些RNA病毒或牛乳頭瘤病毒，的表達載體可用于將編碼重組VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b經(jīng)過修飾的VEGF蛋白的核苷酸序列(例如cDNA)導入到目的細胞群。參照，例如，Nabel,E.G.等，Circulation，91，541-548(1995)，描述在Maniatis等，《分子克隆實驗室手冊》，冷泉港實驗室，N.Y.(1989)，在Ausubel等，《當前分子生物學手冊》，Greene出版協(xié)會和Wiley Interscience,N.Y.(1989)中的技術?？蛇x擇的，編碼蛋白序列的重組核酸分子可以使用裸露分子或重建的系統(tǒng)，例如脂質(zhì)體或其他導入靶細胞的脂系統(tǒng)(參照例如，F(xiàn)elgner等，Nature 337397-8，1989)。一些其它直接將質(zhì)粒DNA導入細胞的方法可用于人基因治療，通過將質(zhì)粒DNA和蛋白復合，將DNA導向到細胞受體。參照，Miller,Nature 357455-60，1992。
基因轉(zhuǎn)移的的最簡單形式是，通過顯微注射的方法，僅僅將少量的DNA注射到核內(nèi)就可完成。Capecchi,M.R.,Cell 22479-88(1980)。一旦重組基因?qū)氲郊毎?，它們可以被細胞正常的轉(zhuǎn)錄和翻譯機制識別，表達基因產(chǎn)物。另外的一些將DNA導入大量細胞的方法也已經(jīng)被嘗試。這些方法包括轉(zhuǎn)染，其中DNA用CaPO4沉淀，通過胞飲作用攝入細胞(Chen,C.和Okayama,H.Mol.Cell Biol.72745-52(1987))；電穿孔，其中細胞暴露于高電壓脈沖下，導致細胞膜形成小孔(Chu,G.等，Nucleic Acids Res.,151311-26(1987))；脂轉(zhuǎn)染/脂質(zhì)體融合，其中DNA包裝到嗜脂性顆粒，與靶細胞融合(Felgner,P.L.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.847413-7(1987))；和使用結(jié)合在小projectiles上的DNA微粒轟擊(Yang,N.S.等，Proc.Natl.Acid.Sci.879568-72(1990)。另一種將DNA導入細胞的方法是將DNA偶合到經(jīng)過化學修飾的蛋白上。
已經(jīng)表明腺病毒蛋白可以使核內(nèi)體不穩(wěn)定，從而加強DNA被攝入到細胞。腺病毒同含有DNA復合物的溶液的混合物、或使用蛋白交聯(lián)劑將DNA通過多聚賴氨酸共價連接到腺病毒上，可極大的改善重組基因的攝入和表達。Curiel,D.T.,等，Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.6247-52(1992)。
可以使用氣囊導管，例如在血管成型術中所使用的，其中氣囊覆蓋有含VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b經(jīng)過修飾的VEGF蛋白、編碼這些蛋白的DNA以及載體，如Riessen,R.,Human Gene Therapy,4，749-758(1993)中所描述，在此引入作為參考。
此處所用的“基因轉(zhuǎn)移”指將外源核酸分子導入細胞的過程?；蜣D(zhuǎn)移通常為了表達基因編碼的特定產(chǎn)物。這些產(chǎn)物包括一蛋白、多肽、反義DNA或RNA、或具有酶活性的RNA。基因轉(zhuǎn)移可在培養(yǎng)的細胞或直接在動物體上進行。一般基因轉(zhuǎn)移的過程包括核酸分子同靶細胞非特異接觸或受體介導的接觸、核酸分子通過細胞膜或內(nèi)吞進入細胞、核酸分子從漿膜或核內(nèi)體釋放到細胞質(zhì)?；虮磉_可能還需要核酸分子移位到細胞核并同合適的轉(zhuǎn)錄相關的核因子結(jié)合。
此處所用的“基因治療”為一種形式的基因轉(zhuǎn)移，包括在此處基因轉(zhuǎn)移的定義范圍之內(nèi)，特定的指在體內(nèi)或體外細胞表達一治療產(chǎn)物的基因轉(zhuǎn)移?；蜣D(zhuǎn)移可在離體細胞進行，然后將細胞移植到患者，或直接將核酸分子或核酸-蛋白復合物給患者。
在另一優(yōu)選實施方案中，提供了含有編碼VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b經(jīng)過修飾的VEGF蛋白核酸序列的載體，其中核酸序列只在特定的組織表達。達到組織特異基因表達的方法參照InternationalPublication No.WO 93/09236，存檔于1992年11月3日，公開于1993年5月13日。
本發(fā)明的另一方面是，在所有上述提到的載體中，載體中包含的核酸序列可包括上述所限定的部分或全部核酸序列的添加、刪除和修飾。
在另一優(yōu)選方案中，提出了基因置換的一種方法。此處所用的“基因置換”指，提供了一種能夠在動物體內(nèi)表達的核酸序列，因此而提供或增強了因動物內(nèi)源基因丟失或缺陷所缺失的功能。用于體內(nèi)基因給藥的載體一般的，目的基因在體內(nèi)被轉(zhuǎn)移到靶器官，優(yōu)選心臟，包括心肌細胞、或骨骼肌，包括骨骼肌細胞，可指導產(chǎn)生編碼蛋白。這種蛋白的產(chǎn)生相對來說是組成性的。許多不同的基因轉(zhuǎn)移載體，包括病毒和非病毒系統(tǒng)，可用于本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因給藥。
優(yōu)選用于本發(fā)明的載體包括病毒載體、基于脂類的載體和其它在體內(nèi)能夠?qū)NA攜帶到非分裂細胞的載體。當前優(yōu)選的載體是病毒載體，特別優(yōu)選復制缺陷型病毒載體(包括，例如復制缺陷腺病毒載體和腺聯(lián)病毒(AAV)載體)。為了有利于本發(fā)明的生產(chǎn)和使用，當前最優(yōu)選的為復制缺陷腺病毒載體。
本領域已有很多描述其它給藥載體系統(tǒng)的文獻，其中部分已在此引用。這樣的載體包括，例如，其它病毒載體(例如腺聯(lián)病毒(AAV))、脂質(zhì)體和其它含脂復合物、和其它能夠介導將一多核苷酸導入宿主細胞的大分子復合物。如上所述及引用文獻所描述，載體也可包含其它能夠調(diào)節(jié)基因給藥或基因表達的成分或功能，或者能提供對靶細胞有益的特性。這些成分包括，例如影響細胞結(jié)合和細胞導向的成分(包括介導細胞類型或組織特異結(jié)合)；影響細胞攝入載體核酸的成分；影響多核苷酸攝入后在細胞內(nèi)定位的因素(例如介導核定位的因子)；以及影響多核苷酸表達的成分。這樣的成分也包括一些標記，這些可檢測或篩選的標記可用于檢測或篩選已攝入并表達了通過載體所導入核酸的細胞。這樣的成分也可作為載體的一自然特征(例如使用某些具有介導結(jié)合和攝入功能成分的某些病毒載體)，或?qū)⑤d體修飾含有此類功能。可選擇的標記可以是陽性、陰性或雙功能。陽性篩選標記允許篩選攜帶有標記的細胞，而陰性篩選標記則允許攜帶有標記的細胞被選擇性的消除。這樣的標記已有許多描述，包括雙功能(即陽性/陰性)標記(參照，例如，Lupton,S.,WO 92/08796，公開于1992年5月29日；和Lupton,S.,WO 94/28143，公開于1994年12月8日)。這樣的標記基因在基因治療中還具有作為一額外對照標準的優(yōu)點。關于這樣的載體有大量為本領域人所知，并且一般情況下可以得到。(參照，例如，上述的各參考文獻)。
另外的可用于本發(fā)明方法的描述腺病毒載體和其它病毒載體的文獻包括以下Horwitz,M.S.,Adenoviridae and Their Replication,in Fields,B.,等，(eds)Virology,Vol.2.Raven Press New York,pp.1679-1721，1990)；Graham,F.,等，pp.109128 Methods in Molecular Biology,Vol.7GenetTransfer and Expression Protocols,Murray,E,(ed.),Human出版社，Clifton,N.J.(1991)Miller,N.,等，F(xiàn)ASER Journal 9190-199，1995；Schreier,H.Pharmaceutica Acta Helvetiae 68145-159，1994；Schnieder and French,Circulation Therapy 3147-154，1992；Graham,F.L.,等，WO 95/00655(1995年1月5日)；Falck-Pedersen,E.S.,WO 95/16772(1995年6月22日)；Denefle,P.等，WO 95/23867(1995年9月8日)；Haddada,H.等，WO94/26914(1994年11月24日)；Perricaudet,M.等，WO 95/02697(1995年1月26日)；Zhang,W.,等，WO 95/25071(1995年10月12日)。很多種類的腺病毒質(zhì)粒也可購買得到，包括，例如Microbix Biosystems ofToronto,Ontario(參照，例如，Microbix產(chǎn)品信息單用于腺病毒載體構(gòu)建的質(zhì)粒，1996)。
另外的可用于本發(fā)明方法的描述AAV載體的文獻包括以下Carter,B.,Handbook of Parvoviruses,vol.1，pp.169-228，1990；Berns,Virology,pp.1743-1764(Raven出版社1990)；Carter,B.,Curr.Opin.Biotechnol.,3533-539，1992；Muzyczka,N.,Current Topics in Microbiology andImmunology,15892-129，1992；Flotte,T.R.,等，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.7349-356，1992；Chatterjee等，Ann.NY Acad.Sci.,77079-90，1995；Flotte,T.R.,等，WO 95/13365(1995年5月18日)；Trempe,J.P.,等，WO 95/13392(1995年5月18日)；Kotin,R.,Human Gene Therapy,5793-801，1994；Flotte，T.R.,等，Gene Therapy 2357-362，1995；Allen,J.M.,WO 96/17947(1996年6月13日)；和Du等，Gene Therapy 3254261，1996。
另外的可用于本發(fā)明方法的描述非病毒載體的文獻包括以下Ledley,FD,Human Gene Therapy 61129-1144，1995；Miller,N.,等，F(xiàn)ASEB Journal9190-199，1995；Chonn,A.等，Curr.Opin.In Biotech.6698-708，1995；Schofield,JP，等，British Med.Bull.5156-71，1995；Brigham,K.L.,等，J.Liposome Res.331-49，1993；Brigham,K.L.,WO 9I/06309(1991年5月16日)；Felgner,P.L.,等，WO 91/17424(1991年11月14日)；Solodin等，Biochemistry 3413537-13544，1955；WO 93/19768(1993年10月14日)；Debs等，WO 93125673；Felgner,P.L.,等，U.S.專利5264618(1993年11月23日)；Epand,R.M.,等，U.S.專利5283185(1994年2月1日)；Gebeyehu等，U.S.專利5334761(1994年8月2日)；Felgner,P.L.,等，U.S.專利5425197(1995年10月17日)；Overell,R.W.,等，WO 95/28494(1995年10月26日)；Jessee,WO 95/17373(1995年6月29日)；Lin等，WO96/01840(1996年1月25日)。不依賴于輔助病毒的復制缺陷腺病毒5系統(tǒng)一般的，目的基因在體內(nèi)轉(zhuǎn)移到心臟(或骨骼肌)，包括心肌細胞(和骨骼肌)，可以指導編碼蛋白的組成性表達。有幾個不同的基因轉(zhuǎn)移方法是可行的。優(yōu)選的是不依賴于輔助病毒的復制缺陷腺病毒5系統(tǒng)。使用該系統(tǒng)，Giordano和Hammond已經(jīng)表明，通過體內(nèi)一次冠狀動脈內(nèi)注射可轉(zhuǎn)染超過60％的心肌細胞(Giodano and Hammond,Clin.Res.,42123A，1994)。非復制性重組腺病毒載體在轉(zhuǎn)染冠狀內(nèi)皮和心肌細胞時非常有用，在冠狀動脈內(nèi)注射后可導致高效轉(zhuǎn)染。在外周血管系統(tǒng)轉(zhuǎn)染預期細胞時也可得到相同的結(jié)果。
不依賴于輔助病毒的復制缺陷腺病毒5系統(tǒng)可有效的用于一次性體內(nèi)冠狀動脈內(nèi)注射，轉(zhuǎn)染心肌細胞的百分率很高。Hammond等也表明，該導入技術可有效的用于將載體導入到大型哺乳動物心臟的心肌。另外的將載體導入特定細胞或組織類型的方法在下面描述。
在以下描述的各種說明中，重組腺病毒載體基于人腺病毒5系統(tǒng)(如McGrory WJ等，Virology 163614-617，1998)，該系統(tǒng)缺失了腺病毒基因組中必須的早期基因(通常為E1A/E1B)，因此不能復制，除非在能夠提供所缺失的反式基因產(chǎn)物的容許細胞中生長。在腺病毒基因組序列缺失的地方，可以克隆上目的轉(zhuǎn)基因并在感染復制缺陷腺病毒的組織或細胞中表達。盡管基于腺病毒的基因轉(zhuǎn)移一般并不能導致轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定整和到宿主基因組(少于0.1％的腺病毒介導的轉(zhuǎn)染可導致轉(zhuǎn)基因整和到宿主DNA)，腺病毒仍可擴增到高滴度并轉(zhuǎn)染非復制細胞；此外，盡管轉(zhuǎn)基因不能傳遞給子代細胞，但卻適應于轉(zhuǎn)染給不能活躍分裂的成年心肌細胞。反轉(zhuǎn)錄病毒載體可提供穩(wěn)定的基因轉(zhuǎn)移，并且現(xiàn)在已經(jīng)用反轉(zhuǎn)錄病毒偽型(Burns等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)908033-8037，1993)獲得高滴度，但當前的反轉(zhuǎn)錄病毒載體一般不能有效的轉(zhuǎn)導非復制型細胞。
同非分裂細胞如肌細胞相關的一個優(yōu)點是，病毒載體不易通過宿主細胞分裂被“稀釋掉”。為了進一步加強轉(zhuǎn)基因在心臟的持久性，也可能使用各種第二代腺病毒載體，這類載體含有E1和E4的缺失，可同環(huán)磷酰胺給藥結(jié)合使用(參照，例如，Dai等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)921401-1405，1995)。為了進一步增加起初基因轉(zhuǎn)移的范圍，可以使用多次灌輸或在一分離的冠狀動脈線路中灌輸。
人293細胞為轉(zhuǎn)化了腺病毒E1A/E1B基因的人胚胎腎細胞，是用于產(chǎn)生此類復制缺陷載體的典型容許細胞系。但是也可使用其它允許復制缺陷腺病毒載體擴增的細胞系，如Hela細胞。
基于人腺病毒5的重組腺病毒載體系統(tǒng)(如McGrory WJ等，Virology163614-617，1998)缺失腺病毒基因組中必須的早期基因(通常為E1A/E1B)，因此不能復制，除非在能夠提供所缺失的反式基因產(chǎn)物的容許細胞中生長。在腺病毒基因組序列缺失的地方，可以克隆上目的轉(zhuǎn)基因，并在感染復制缺陷腺病毒的組織或細胞表達。盡管基于腺病毒的基因轉(zhuǎn)移一般并不能導致轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定整和到宿主基因組(少于0.1％的腺病毒介導的轉(zhuǎn)染可導致轉(zhuǎn)基因整和到宿主DNA)，腺病毒仍可擴增到高滴度并轉(zhuǎn)染非復制細胞；此外，盡管轉(zhuǎn)基因不能傳遞給子代細胞，但卻適應于轉(zhuǎn)染給不能活躍分裂的成年骨骼肌細胞和心肌細胞。反轉(zhuǎn)錄病毒載體可提供穩(wěn)定的基因轉(zhuǎn)移，并且現(xiàn)在已經(jīng)用反轉(zhuǎn)錄病毒偽型(Burns等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)908033-8037，1993)獲得高滴度，但當前的反轉(zhuǎn)錄病毒載體一般不能有效的轉(zhuǎn)導非復制型細胞(骨骼肌細胞和心肌細胞)。此外，如果短期轉(zhuǎn)基因是有效的，轉(zhuǎn)基因整和到宿主DNA的潛在危險性還沒保證。事實上，Hammond等已發(fā)現(xiàn)，一定限度持續(xù)的表達一血管生成蛋白足以導致血管發(fā)生，因此短時間的基因轉(zhuǎn)移對治療心血管疾病和外周疾病是足夠的。
人293細胞為轉(zhuǎn)化了腺病毒E1A/E1B基因的人胚胎腎細胞，是用于產(chǎn)生此類復制缺陷載體的典型容許細胞系。但是也可使用其它允許復制缺陷腺病毒載體擴增的細胞系。重組腺病毒載體的構(gòu)建本發(fā)明所使用的所有腺病毒載體都可通過Graham,Virology,163614-617，1998.描述的獲救重組技術來構(gòu)建。簡單的說，目的基因克隆到一穿梭載體，其中含有一啟動子、多位點接頭和已被刪除E1A/ElB基因的部分腺病毒序列。質(zhì)粒pACl(Virology,163614-617，1988)(或類似物)作為穿梭載體，編碼人腺病毒5基因組(Virology,163614-617，1988)左末端部分，其中不含對病毒復制必需的編碼E1A/E1B序列的早期蛋白，質(zhì)粒ACCMVPLPA(J.Biol.Chem.,26725129-25134，1992)也可以作為實例，其中含有一CMV啟動子、多位點接頭和已被刪除E1A/E1B基因的部分腺病毒序列。使用質(zhì)粒pACl或ACCMVPLA可有利于克隆的過程。然后將穿梭載體與含有腺病毒5整個基因組的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入293細胞，后者因長度太大而不能加核衣殼。共轉(zhuǎn)染可以使用磷酸鈣沉淀或脂轉(zhuǎn)染方法進行(Biotechniques,15868-872，1993)。質(zhì)粒JM17是編碼人腺病毒5整個基因組和含有氨芐青霉素抗性基因(4.3kb)的部分載體pBR322序列。盡管JM17編碼成熟病毒顆粒所必需的所有腺病毒蛋白，但它因太大而不能加核衣殼(40kb，其中野生型36kb)。在一小量共轉(zhuǎn)染細胞中，在含穿梭載體如質(zhì)粒pACl的轉(zhuǎn)基因和含整個腺病毒5基因組的質(zhì)粒如pJM17之間的獲救重組可得到一缺乏E1A/E1B序列的重組基因組，其中包含目的轉(zhuǎn)基因，但在重組中丟失了額外的序列如pBR322序列，因此較小，可以加核衣殼。關于上述的方法，已經(jīng)有成功的報道(Giordano等，Circulation，88I-139，1993，和Giordano and Hammond,Clin.Res.,42123A，1994)?？梢杂肵-gal處理CMV所啟動的編碼腺病毒HCMVSPllacZ(Clin.Res.,42123A，1994)中的β-半乳糖苷酶來評價基因轉(zhuǎn)移的效率。
起初的基因轉(zhuǎn)移模式使用上述的腺病毒載體。這些載體的優(yōu)勢包括高效基因轉(zhuǎn)移的能力(在體外超過60％的靶器官細胞能被轉(zhuǎn)染)、容易獲得高滴度的病毒貯存物和這些載體能高效導入不分裂細胞如心肌細胞的能力。組織特異性啟動子本發(fā)明考慮到不但通過將轉(zhuǎn)基因直接導入冠狀動脈、股動脈或其他定位位點的靶細胞，也考慮到使用組織特異性啟動子。通過將，例如左心室肌凝蛋白輕鏈-2(MLC2v)或肌凝蛋白重鏈(MHC)的組織特異性轉(zhuǎn)錄控制序列同轉(zhuǎn)基因的融合，如和腺病毒構(gòu)建體中的VEGF-A138融合，使轉(zhuǎn)基因的表達局限于心室肌細胞。MLC2v和MHC啟動子對LacZ基因的表達效率和特異性程度已經(jīng)用本發(fā)明的重組腺病毒系統(tǒng)進行測定。心臟特異性表達以前已經(jīng)被Lee，等報道(J.Biol.Chem.,26715875-15885，1992)。MLC2v啟動子由250bp組成，很容易在腺病毒5的長度包裝限制之內(nèi)。肌凝蛋白重鏈啟動子已知為一嚴格的轉(zhuǎn)錄啟動子，為一合適的可選擇的心臟特異啟動子，由少于300bp的序列組成。其它的啟動子，如肌鈣蛋白-C啟動子，盡管具有高效和足夠小的特征，但缺乏足夠的組織特異性。通過使用MLC2v或MHC啟動子并在體內(nèi)導入轉(zhuǎn)基因，則僅心肌細胞(也就是說沒有伴隨的在心臟內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞和成纖維細胞的表達)就可提供血管生成蛋白的足量表達，例如VEGF-A138蛋白的表達，促進血管發(fā)生。將基因限制在心肌細胞表達也具有利用基因轉(zhuǎn)移治療CHF的優(yōu)勢。將基因表達限定在心臟，可以避免血管發(fā)生對非心臟組織如視網(wǎng)膜的潛在損害。此外，對于心臟的細胞，肌細胞可能是提供轉(zhuǎn)基因表達持續(xù)時間最長的細胞類型，因為該細胞沒有快速的更新；因此它的表達和在內(nèi)皮細胞不同，不受細胞分裂和死亡的影響而減少。內(nèi)皮細胞特異的啟動子也已經(jīng)用于此目的(Lee，等，J.Biol.Chem.,26510446-10450，1990)。
在本發(fā)明中，當前優(yōu)選關于心臟病的治療、通過冠狀動脈內(nèi)注射高滴度載體導入心臟和轉(zhuǎn)染所有的細胞類型。腺病毒載體的擴增和純化重組載體用空斑純化的標準程序純化兩次。得到的病毒載體在293細胞擴增病毒顆粒滴度到優(yōu)選的1010-1012病毒顆粒/ml，293細胞提供了E1A/E1B基因的反式功能。感染80％豐度的細胞并在48小時后收集。在3次凍融后，用標準的離心程序去除細胞碎片，病毒進一步用氯化銫密度超離(優(yōu)選雙氯化銫梯度超離)。先于體內(nèi)注射之前，用Sepharose柱，如G25 Sephadex，對病毒儲存物進行凝膠過濾脫鹽。產(chǎn)物用0.3微米濾膜過濾，由此減少冠狀動脈內(nèi)注射未過濾物所帶來的有害影響(威脅生命的心律不齊)，并提高基因轉(zhuǎn)移效率。得到的病毒儲存物的病毒顆粒滴度大約在1010-1012病毒顆粒/ml。得到的腺病毒構(gòu)建體必須高度純化，沒有野生型(潛在復制的)的病毒。不純的構(gòu)建體在宿主動物可導致強烈的免疫應答。從此觀點出發(fā)，擴增和純化的進行可排除污染物和野生型病毒，例如通過用合適的引物進行PCR鑒定成功的重組子、進行兩輪空斑篩選、雙氯化銫梯度超離。在冠狀動脈內(nèi)注射之前，重組的腺病毒也可通過一孔徑大小合適的濾膜過濾。重組腺病毒載體的導入病毒儲存物可以制成可注射的制劑形式，其中包含藥物學上可接受的所需載體，例如鹽。可注射制劑中優(yōu)選的病毒載體最終滴度在107-1013病毒顆粒，以達到有效的基因轉(zhuǎn)移。其它的藥物學載體、制劑和劑量在下面描述。對于導入心肌，優(yōu)選用直接冠狀動脈內(nèi)(或移植血管)注射，使用標準的基于皮膚導管的方法，在熒光顯微鏡下將腺病毒轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體以合適的量注射，使表達的轉(zhuǎn)基因量達到高效的治療效果。注射應深入冠狀動脈(或血管移植)管腔(在動脈管腔內(nèi)大約1cm)，優(yōu)選在兩側(cè)冠狀動脈。
通過冠狀動脈導管將物質(zhì)直接注射到冠狀動脈的管腔，可能使基因相當有效地轉(zhuǎn)移到目標，可以減少在注射中重組載體到近側(cè)主動脈的損失。病毒儲存物，優(yōu)選不包含野生型病毒，可深入注射到一側(cè)或兩側(cè)冠狀動脈內(nèi)(或移植)，優(yōu)選注射到左右兩側(cè)冠狀動脈內(nèi)(或移植)，并優(yōu)選用光密度所測定的1010-1014病毒顆粒(更優(yōu)選1011-1013病毒顆粒，最優(yōu)選1012病毒顆粒)進行注射。這種類型的注射使用編碼血管生成蛋白或肽的基因，可以在受影響的心肌轉(zhuǎn)染局部預期數(shù)量的細胞，尤其是心肌細胞，由此增大了基因轉(zhuǎn)移的治療功效，減少了在心臟外位點非期望的血管發(fā)生以及對病毒蛋白炎癥反應的可能性?？梢允褂眯氖壹∪饧毎禺惖膯幼?，例如，可固定的使表達局限于心肌細胞，從而避免在非心臟組織如視網(wǎng)膜中血管發(fā)生所造成的危害。因此，這種轉(zhuǎn)基因的導入可導致靶基因表達在，例如，左側(cè)心室的細胞。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當以此種方式導入時，肝細胞沒有轉(zhuǎn)基因的表達，并且在冠狀動脈內(nèi)注射后任何時間都沒在尿中發(fā)現(xiàn)病毒RNA。例如，任何種類的冠狀動脈導管，或Stack灌注導管都可用于本發(fā)明。此外，其它對本領域普通技術人員已知的技術可用于將基因?qū)雱用}管壁。臨床應用通過用編碼VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b經(jīng)過修飾的VEGF蛋白的多核苷酸序列轉(zhuǎn)染細胞，可刺激哺乳動物的血管發(fā)生，轉(zhuǎn)染可用的程序為Giordano等在“在心臟缺血區(qū)域進行冠狀動脈內(nèi)成纖維生長因子-5的基因轉(zhuǎn)移可增強血流和收縮功能”，Nature Medicine,Vol.2 No.5，pp.534-539，May 1996中所描述的程序進行，在此引入作為參考。通過腺病毒載體指導VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b經(jīng)過修飾的VEGF蛋白在心臟細胞中的表達，感染細胞能夠釋放VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b經(jīng)過修飾的VEGF蛋白。這種可釋放性在VEGF-A121和VEGF-A165也有發(fā)現(xiàn)，但在VEGF-A189或VEGF-A206卻沒發(fā)現(xiàn)。但是，同VEGF-A121和VEGF-A165相比，VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b經(jīng)過修飾的VEGF蛋白在向臨近血管靶內(nèi)皮細胞擴散時可部分被ECM分子結(jié)合。結(jié)合的VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b經(jīng)過修飾的VEGF蛋白在隨后可緩慢地釋放，因此同VEGF-A121和VEGF-A165相比，可延長血管發(fā)生效應。此外，ECM結(jié)合的VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b經(jīng)過修飾的VEGF蛋白是具有活性的，在血管成熟的關鍵階段可支持新合成的血管，直到血管的存在不再依賴于血管生成生長因子。因此，VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b經(jīng)過修飾的VEGF蛋白作為一治療劑比其它形式的VEGF蛋白更有效，用于誘導旁系血管。當考慮到用基于腺病毒表達載體進行血管生成因子基因治療給藥時，這種優(yōu)勢很重要。因為VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b經(jīng)過修飾的VEGF蛋白的結(jié)合特性使得它清除的速度較慢，同其它被分泌的VEGF形式相比，它們是更有效的治療劑。
氣囊血管成型術是治療缺血性心臟病的主要治療方法，涉及到在栓塞的血管用氣囊膨脹，打開被堵塞的血管。遺憾的是，這種治療方法經(jīng)常導致排列在血管內(nèi)壁內(nèi)皮細胞的損傷。平滑肌細胞常浸潤到開放的血管，導致此過程的次級堵塞，稱為再狹窄。VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b經(jīng)過修飾的VEGF蛋白可用于誘導位于氣囊誘導損傷區(qū)域內(nèi)皮細胞的增殖，在血管腔面覆蓋上一層新的單層內(nèi)皮細胞，希望恢復血管的最初結(jié)構(gòu)。腺病毒介導的基因治療方法也可用于此種情況，將能誘導內(nèi)皮細胞增殖的物質(zhì)導入到因氣囊血管成型術造成的病變部位。同ECM結(jié)合的能力也使得在此應用中有一些優(yōu)勢。
為了阻止氣囊血管成型術后的再狹窄，可考慮使用兩種類型的方法?？赡軐胍坏鞍?，或能夠指導蛋白表達的表達載體，到因為氣囊擴充栓塞血管處的堵塞部位。這種蛋白可阻止侵入到重新打開血管內(nèi)的非內(nèi)皮細胞的增殖，直至在受傷內(nèi)皮細胞單層兩邊的內(nèi)皮細胞能夠重新生長。這種方法可以同導入一能夠加速內(nèi)皮細胞層再的生蛋白或載體，如重組腺病毒，相結(jié)合使用。但是，生長因子如FGF-5、bFGF或HGF對平滑肌細胞也有促有絲分裂活性，可誘導它們的增殖，導致同預期效果的相反效果。而VEGFs則一般對內(nèi)皮細胞是特異的。因為其ECM結(jié)合性質(zhì)，VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b經(jīng)過修飾的VEGF蛋白可能對此種情況尤其適用。在應用后，例如，通過用編碼蛋白的腺病毒感染附近細胞后，直接用編碼蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，或直接導入蛋白，則VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b經(jīng)過修飾的VEGF蛋白具有同氣囊治療血管中暴露的細胞外基質(zhì)結(jié)合潛能，由此促進在病變特定部位內(nèi)皮細胞的增殖和再生。因此，VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b經(jīng)過修飾的VEGF蛋白可以在需要其活性的區(qū)域定位集中，使其成為治療再狹窄具有特別吸引力的侯選蛋白。
冠狀動脈血管成型術經(jīng)常伴隨用血管內(nèi)斯滕特固定膜來幫助維持血管功能，避免再狹窄。斯滕特固定膜外覆蓋有肝素以阻止血栓形成，直至由斯滕特固定膜形成的新渠道達到內(nèi)皮愈合。6b經(jīng)過修飾的蛋白可直接用于斯滕特固定膜，或編碼6b經(jīng)過蛋白的核酸如質(zhì)粒、cDNA或腺病毒載體也可用于斯滕特固定膜，對臨近細胞的直接轉(zhuǎn)染，使用本領域眾所周知的方法。VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b經(jīng)過修飾的VEGF蛋白的局部應用，或通過轉(zhuǎn)染來產(chǎn)生可加強斯滕特固定膜的內(nèi)皮愈合，并因此減輕血栓形成和再狹窄。
也考慮到本發(fā)明中生長因子的其它用途。其中一個例子是治療潰瘍。如果在胃部有損傷，則存在潰瘍。已表明血管生成生長因子在治療十二指腸潰瘍中可能有效，血管生成生長因子的穩(wěn)定作用可能加強了一些治療劑如硫酸鋁產(chǎn)生有益的效果(Szabo,S.,等。Gastroenterology 106，1106-1111，1994)。因為VEGF是一在酸性條件下非常穩(wěn)定的血管生成生長因子，可以考慮使用它治療胃和十二指腸潰瘍。VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b經(jīng)過修飾的VEGF蛋白同肝素的結(jié)合能力使其處于非活性狀態(tài)，以及它在傷口處同暴露的ECM的結(jié)合能力，表明VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b經(jīng)過修飾的VEGF蛋白比其它形式的VEGF更適合于治療胃和十二指腸潰瘍。
為了有助于理解本發(fā)明，下述的實施例描述了一系列的實驗結(jié)果。同本發(fā)明相關的實驗當然不應該理解為特定地來限制本發(fā)明，本發(fā)明的一些對本領域技術人員可預見的變通，無論是已知的或以后發(fā)展的，都將在本發(fā)明此處所述和隨后權利要求的考慮范圍之內(nèi)。實施例Ⅰ-編碼VEGF-A138核酸序列的制備至少存在5種不同拼接形式的VEGF-A。包括VEGF-A121，145，165，189和206。(參照圖1，Houck等，(1991)Molecular Endocrinology 5(12)1806-14&Poltorack等，(1997)Journal pf Biological Chemistry 272(11)7151-7158)。只有其中之一的VEGF-A206(Houck等，(1991)MolecularEndocrinology 5(12)1806-14)包含有稱為6b的外顯子。名稱VEGF-A138反映了處理加工后的異構(gòu)體組成含138個氨基酸的長度。有兩種策略用于構(gòu)建VEGF-A138。在一種策略中，克隆VEGF-A206，用多聚酶鏈反應(PCR)得到外顯子6B。在第2種策略中，通過合成兩個互補的寡核苷酸，在亞克隆前使之退火，來達到置換外顯子的目的。在兩種策略中，第一步要刪除外顯子8，在最后一步重新克隆上來。外顯子8可通過PCR或合成互補寡核苷酸來得到。描述了外顯子8的合成。本領域的普通技術人員明白怎樣用本發(fā)明的這些策略或類似的策略來構(gòu)建VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b經(jīng)過修飾的VEGF蛋白。A．背景信息1．VEGF-A145的序列(顯示了側(cè)翼含BamHⅠ位點的序列；插入子克隆到Invitrogen載體，pCRⅡ)。外顯子6a以粗體顯示。GGATCCGAAACCATGAACTTTCTGCTGTCTTGGGTGCATTGGAGCCTTGCCTTGCTGCTCTACCTCCACCATGCCAAGTGGTCCCAGGCTGCACCCATGGCAGAAGGAGGAGGGCAGAATCATCACGAAGTGGTGAAGTTCATGGATGTCTATCAGCGCAGCTACTGCCATCCAATCGAGACCCTGGTGGACATCTTCCAGGAGTACCCTGATGAGATCGAGTACATCTTCAAGCCATCCTGTGTGCCCCTGATGCGATGCGGGGGCTGCTGCAATGACGAGGGCCTGGAGTGTGTGCCCACTGAGGAGTCCAACATCACCATGCAGATTATGCGGATCAAACCTCACCAAGGCCAGCACATAGGAGAGATGAGCTTCCTACAGCACAACAAATGTGAATGCAGACCAAAGAAAGATAGAGCAAGACAAGAAAAAAAATCAGTTCGAGGAAAGGGAAAGGGGCAAAAACGAAAGCGCAAGAAATCCCGGTATAAGTCCTGGAGCGTATGTGACAAGCCGAGGCGGTGATGAATGAATGAGGATCC2．置換匣子的序列(外顯子6b來自VEGF-A206)GTACGTTGGTGCCCGCTGCTGTCTAATGCCCTGGAGCCTCCCTGGCCCCCAB．亞克隆策略VEGF-A138的獲得可通過用外顯子6b替代VEGF-A145中的6a來進行，6b僅在VEGF-A206中有報道。需要的步驟有1．在VEGF-A145中進行位點特異突變，在外顯子6a的最5’端(即434和435核苷酸之間產(chǎn)生限制性位點。該突變產(chǎn)生了ApoⅠ位點。
通過定點突變將437和438核苷酸進行從腺嘌呤到胸腺嘧啶的轉(zhuǎn)變。從而將序列“AAAAAT”轉(zhuǎn)變?yōu)椤癆AATTT”。(ApoⅠ切割位點“Pu\AATTPy”)。
2．用限制酶ApoⅠ和EcoR5對位點特異突變的VEGF-A145進行限制酶切割，去除外顯子6a和8。EcoR5在VEGF的3’插入點處制造了一鈍端。
3．用綠豆核酸酶去除ApoⅠ消化所產(chǎn)生的5’突出端。
4．上述步驟已經(jīng)產(chǎn)生了截短的、線性化的VEGF-A145載體。凝膠純化此載體。
5．用PCR或互補寡核苷酸合成的方法產(chǎn)生置換外顯子(參照上述“A.2.”)。
a．PCR的5’寡核苷酸引物為(n)6tacGTACGTTGGTGCCCGCTGCT。
3’寡核苷酸引物為ACCTCGGAGGGACCGGGGGccctatag(n)2。
大寫字母代表含有VEGF-A序列的核苷酸。
小寫字母代表用以產(chǎn)生適于克隆的合適限制性位點而添加的核苷酸。
PCR產(chǎn)物用SnaB1(切割TAC/GTA)和EcoR5(切割GAT/ATC)進行限制酶消化。
注意3’寡核苷酸并不包括外顯子6b的最5’端核苷酸。該核苷酸將添加到外顯子8上，因此使必須的序列完整并保持合適的閱讀框。
b．如果直接合成置換外顯子，寡核苷酸序列為(n)6tacGTACGTTGGTGCCCGCTGCTGTCTAATGCCCTGGAGCCTCCCTGGCCCCCgggatatc(n)2和其反向互補序列。
在互補序列退火后，用SnaB1(切割TAC/GTA)和EcoR5(切割GAT/ATC)消化。
6．在凝膠純化后，將置換序列連接到截短的線性載體。得到的產(chǎn)物pE1-5/6b含有外顯子1-5和除了最3’端核苷酸的6b。
7．用限制性圖譜篩選合適的插入方向。
8．對pE1-5/6b進行線性化。用Smal(切割CCC/GGG)和Not1(切割GC/GGCCGC)。前者將切割pCRⅡ載體中VEGF-A序列的3’端。
9．通過合成寡核苷酸產(chǎn)生外顯子8AATGTGACAAGCCGAGGCGGTGATGAATGAATGAGGATGCGGCCGCAAAAGGAA和它的反向互補序列。本領域的普通技術人員會認識到該外顯子可以使用轉(zhuǎn)基因表達細胞類型優(yōu)先的密碼。
10．在退火后，用T4多核苷酸激酶加上5’磷。
11．將合成的外顯子8連接到線性化的pE1-5/6b載體。
12．用限制酶圖譜篩選合適的插入方向并測序鑒定插入子的完整性。實施例Ⅱ-VEGF-A138的表達該重組的VEGF-A138cDNA用以構(gòu)建含有VEGF-A138cDNA的重組桿狀病毒。按照Cohen，T等，Growth Factors.7131-138，1992描述的用于VEGF-A145的方法，將病毒感染Sf9細胞，在此引入作為參考。感染Sf9細胞產(chǎn)生的大部分VEGF-A138應該出現(xiàn)在培養(yǎng)基中。用dithiotreitol使VEGF-A138二聚體解離，用于純化。用肝素-sepharose可部分純化VEGF-A138。用分步鹽梯度從柱子上洗脫蛋白。重組的VEGF-A138具有生物學活性，可誘導人臍靜脈來源的內(nèi)皮細胞(HUVEC細胞)增殖。其它的6b經(jīng)過修飾的VEGF-A蛋白的表達可用類似的方法。實施例Ⅲ-內(nèi)皮細胞的增殖和血管發(fā)生為了證實VEGF-A138可在體內(nèi)誘導血管發(fā)生，將VEGF-A138DNA亞克隆到哺乳動物表達載體MIRB的BamH1位點，參照Macarthur,C.A.等，Cell Growth Differ.6，817-825，1995描述的技術，在此引入作為參考。將MIRB/VEGF-A138質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到BHK-21倉鼠腎來源的細胞(不產(chǎn)生VEGF-A145的細胞系)，分離能穩(wěn)定產(chǎn)生VEGF-A138的細胞系。哺乳動物細胞產(chǎn)生的VEGF-A138具有生物學活性并分泌到培養(yǎng)基中。將表達VEGF-A138的細胞植入海藻酸鹽珠上，后者植入Balb/c小鼠的皮膚下，使用Plunkett,M.L.等，Lab.Invest.62，510-517，1990所描述的方法，在此引入作為參考。四天后移去含有俘獲細胞的海藻酸鹽塊并拍照。含有表達VEGF-A138細胞的海藻酸鹽珠簇為暗紅血色，而含有僅轉(zhuǎn)染載體細胞的鹽珠具有很低程度的血色。當高倍檢測時，同對照細胞相比，含有表達VEGF-A138細胞的海藻酸鹽團塊似乎血管化很嚴重。這些結(jié)果同血管細胞增殖或血管發(fā)生促進因子預期的行為一致。實施例Ⅳ-用VEGF-A138基因轉(zhuǎn)移介導的血管發(fā)生治療編碼VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b經(jīng)過修飾的VEGF蛋白的DNA被用于基因轉(zhuǎn)移介導的血管發(fā)生治療，按照所述的方法進行，例如，國際專利申請PCT/US96/02631，于1996年9月6日公開，號碼為WO96/26742，在此完整引入作為參考。腺病毒構(gòu)建體基因轉(zhuǎn)移所用的體系為不依賴輔助病毒的復制缺陷人腺病毒5系統(tǒng)。編碼VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b經(jīng)過修飾的VEGF蛋白的核酸克隆到質(zhì)粒ACCMVPLPA的多位點接頭上，該質(zhì)粒含有CMV啟動子、SV40多聚A加尾信號，其側(cè)翼為去除了E1A和E1B基因(對病毒復制必需)的部分腺病毒序列。該質(zhì)粒和質(zhì)粒JM17共轉(zhuǎn)染(脂感染)到293細胞，后者含有人腺病毒5的完整基因組和額外的4.3kb的插入序列，使pJM17太大而不能加核衣殼。同源獲救重組可產(chǎn)生含有轉(zhuǎn)基因的腺病毒載體，但沒有E1A/E1B序列。盡管這些重組子在哺乳動物細胞不能夠復制，但可在293細胞中增殖，因為該種細胞已轉(zhuǎn)化有E1A/E1B基因，可提供這些基因的反式產(chǎn)物。監(jiān)測轉(zhuǎn)染細胞細胞病變效應的表現(xiàn)，病變通常在轉(zhuǎn)染后10-14天發(fā)生。為了鑒定成功的重組子，顯示細胞病變效應細胞的上清用蛋白酶K(50mg/ml，含0.5％SDS和20mM EDTA)在56℃處理60分鐘，酚/氯仿抽提并用乙醇沉淀。然后用和CMV啟動子和SV40加尾信號序列互補的引物進行PCR(Biotechniques，15868-72，1993)，來擴增VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b經(jīng)過修飾的VEGF蛋白的插入核酸序列，鑒定成功的重組子，設計的引物要能擴增腺病毒序列。對成功的重組子用空斑純化兩次。病毒儲存物在293細胞擴增到病毒顆粒的滴度到1010-1012，在用之前用氯化銫密度離心純化兩次。用于產(chǎn)生重組腺病毒的該系統(tǒng)插入轉(zhuǎn)基因的限制在5kb。受CMV驅(qū)動的VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b經(jīng)過修飾的VEGF蛋白基因和SV40加尾信號序列總和正好在包裝限度之內(nèi)。重組載體用空斑純化的標準程序純化兩次。得到的病毒載體在293細胞擴增病毒顆粒滴度到1010-1012。感染80％豐度的細胞并在36-48小時時收集。在幾次凍融后，用標準的離心程序去除細胞碎片，病毒進一步用氯化銫密度超離(不連續(xù)的1.33/1.45氯化銫梯度銫鹽在5mM的Tris和1mM EDTA(pH7.8)中；90000g(2hr)，105000g(18hr))。先于體內(nèi)注射之前，用Sepharose柱，如G25 Sephadex，對病毒儲存物進行凝膠過濾脫鹽。得到的病毒儲存物的病毒顆粒滴度大約在1010-1012。得到的腺病毒構(gòu)建體應該高度純化，沒有野生型(潛在復制的)的病毒。豬血管發(fā)生的局部缺血模型對家養(yǎng)的豬(30-40kg)在無菌條件下進行左開胸術，用于安裝儀器。(Hammond等，J.Clin.Invest 922644-52，和Roth等，J.Clin.Invest 91939-49，1993)。在左心房和主動脈安置導管，用于測定局部血流，監(jiān)測血壓。將線縫合在左心房上，從而允許ECG記錄和人工心房定速。最后，將一ameroid放置在近端LCx附近。在局部缺血穩(wěn)定生成后，治療組接受含有受CMV啟動子驅(qū)動的VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b經(jīng)過修飾的VEGF蛋白基因的腺病毒構(gòu)建體。對照組動物用一受CMV啟動子驅(qū)動的報告基因LacZ的腺病毒構(gòu)建體進行基因轉(zhuǎn)移。
在ameroid放置后35±3天后開始進行研究，此時旁系血管形成，定速誘導的功能異常比較穩(wěn)定(Roth等，Am.J.Physiol 2531-11279-1288，1987，和Roth等，Circulation 821778-89)。清醒狀態(tài)的動物用吊帶懸掛，以數(shù)字形式在線記錄LV、LA和主動脈的壓力和心電圖(在靜息和200bpm的心房起搏狀況下)。用Hewlett Packard超聲成像系統(tǒng)獲得兩維和M模式圖像。用右parastemal方法獲得在乳頭中央肌肉水平的圖象，并記錄在VHS錄音帶上。記錄處于基礎狀態(tài)和右心房定速(HR=200bpm)狀態(tài)的圖象。這些研究在基因轉(zhuǎn)移前一天完成，并在14±1天后重復。心率和血壓的乘積和左心房壓力對兩組動物在基因轉(zhuǎn)移前后應該相似，表明相似的心肌耗氧需要和負荷狀況。用標準化的標準測定超聲心電圖(Sahn，等，Circulation 581072，1978)。舒張端壁厚(EDWTh)和收縮端壁厚(ESWTh)取連續(xù)5次搏動的平均值。計算[(EDWTh-ESWTh)/EDWTh]×100％壁厚百分率(％WTh)。在不知道動物轉(zhuǎn)移哪個基因信息的情況下分析數(shù)據(jù)。為了證明心電圖測定的可重復性，應對動物進行連續(xù)兩天成像，顯示了較高正相關(r2=0.90；p=0.005)。
在ameroid放置35±3天后，即正好ameroid閉合后、但在基因轉(zhuǎn)移前，將對比材料(Levovist)注射到正在定速(200bpm)的左心房，進行對比超聲心電圖研究。在基因轉(zhuǎn)移后14±1天重復此研究。使用基于計算機的圖象分析軟件(Color VueⅡ,Nova Microsonics,Indianapolis,Indiana)從視頻圖象上測定對比強度的峰值，從而提供一個客觀的圖象強度測定。對比研究應在不知道動物轉(zhuǎn)移了什麼基因的前提下進行分析。
在完成實驗后，對動物麻醉并進行中線開胸術。分離brachycephalic動脈，插入一套管，并連接其它大的管子。使動物靜脈內(nèi)接受肝素(10000IU)和罌粟堿(60mg)。加入氯化鈉誘導舒張性心動停止，用十字夾夾住主動脈。通過brachycephalic動脈導管(120mm Hg壓力)導入鹽；由此灌注冠狀動脈。灌注(120mm Hg壓力)戊二醛溶液(6.25％，0.1M二甲紳酸緩沖液)直至心臟被固定好(10-15分鐘)。去除心臟，用有顏色染料通過順行注射到左前下行(LAD)、左旋繞(LCx)和右冠狀動脈，鑒定beds。檢查ameroid以確認閉合。從正常灌注和缺血區(qū)域所取的樣品分成3份，心內(nèi)和心外1/3埋入成形塑料。顯微鏡分析來定量毛細血管數(shù)目的方法按照以前的描述進行(Mathieu-Costello，等，Am.J.Physiol 359H204，1990)。每個樣品(內(nèi)心和外心的每個區(qū)域)進行4個1μM厚度的反向切片，在放大400倍條件下對每個纖維的毛細血管數(shù)進行點計數(shù)。每個樣品計數(shù)20-25個high power區(qū)域。在每一個區(qū)域內(nèi)，毛細血管數(shù)同纖維數(shù)的比率在內(nèi)心和外心應該相似，這樣可以對每個區(qū)域的40-50個視野進行平均，得到透壁毛細血管數(shù)同纖維數(shù)的比率。
為了證實因轉(zhuǎn)基因而帶來的區(qū)域功能和血流的改善，用PCR和RT-PCR對接受了VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b經(jīng)過修飾的VEGF蛋白基因轉(zhuǎn)移動物的心肌進行了VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b經(jīng)過修飾的VEGF蛋白DNA和mRNA的檢測。使用一CMV啟動子的正義引物[GCAGAGCTCGTTTAGTGAAC]和VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b經(jīng)過修飾的VEGF蛋白基因內(nèi)部序列的反義引物進行PCR擴增預期的500bp片段。使用一VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b經(jīng)過修飾的VEGF蛋白基因起始序列的正義引物和VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b經(jīng)過修飾的VEGF蛋白基因內(nèi)部序列的反義引物進行RT-PCR擴增預期的400bp片段。
最后，使用針對VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b經(jīng)過修飾的VEGF蛋白的抗體，對基因轉(zhuǎn)移后48小時的細胞和接受VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b經(jīng)過修飾的VEGF蛋白基因轉(zhuǎn)移后14±1天的動物心肌進行蛋白檢測。
可以使用不依賴于輔助病毒的復制缺陷型人腺病毒5系統(tǒng)來制備含有轉(zhuǎn)基因的載體。用于體內(nèi)注射的材料應高度純化，優(yōu)選不包括野生型(具復制能力)腺病毒。因此可減小心臟腺病毒感染和炎癥浸潤的可能。通過導管將材料直接注射到冠狀動脈內(nèi)，可能對導入基因非常有效。當以此種方式導入時，在肝細胞沒有轉(zhuǎn)基因的表達，并且在冠狀動脈內(nèi)注射后的任何時間，在尿內(nèi)都未發(fā)現(xiàn)病毒的RNA。
構(gòu)建體的注射(4ml，包含有大約1011腺病毒顆粒)可通過在左右冠狀動脈(流到LCx bed的旁系血流似乎來自這兩個血管)各注射2ml來進行。麻醉動物，通過右頸動脈造口術獲得動脈入口；放置一5F的心鞘。使用5F的多功能(A2)冠狀動脈導管處理冠狀動脈。通過對照注射左側(cè)主要的冠狀動脈來證實LCx ameroid的閉合。導管口放置到管腔內(nèi)1cm，使注射中材料在近端主動脈的損失減小。該程序用于每一頭豬。
一旦完成基因轉(zhuǎn)移，可用三種策略來證實成功的整合和表達(1)一些構(gòu)建體含有報告基因(lacZ)；(2)收集相關beds的心肌樣品，用免疫印跡對VEGF-A145蛋白的定量；和(3)用PCR檢測VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b經(jīng)過修飾的VEGF蛋白DNA和mRNA。
獲得的區(qū)域收縮功能數(shù)據(jù)表明，在轉(zhuǎn)基因前和轉(zhuǎn)基因后14±1天，對照豬在缺血區(qū)域具有相似程度的定速誘導的功能異常。相反，接受了VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b經(jīng)過修飾的VEGF蛋白基因轉(zhuǎn)移豬則表現(xiàn)為定速過程中缺血區(qū)域管壁的增厚，說明根據(jù)本發(fā)明進行的VEGF-A138、VEGF-A162、VEGF-A182或其它6b經(jīng)過修飾的VEGF蛋白基因的轉(zhuǎn)移同定速過程中缺血區(qū)域的收縮改善有關。在正常灌注區(qū)域(管腔間隔片板)的管壁增厚在定速中是正常的，并且不受基因轉(zhuǎn)移的影響。在相同動物模型的動脈定速中，通過胸廓超聲心動描記術測定的功能降低百分率應該同sonomicrometry測定的結(jié)果相似(Hammond，等，J.Clin.Invest.922644，1993)，說明了超聲心動描記術在評價缺血性功能異常的精確性。
盡管本發(fā)明對優(yōu)選實施方案進行了具體描述，但應該理解，根據(jù)上述的原則，以及在所述權利要求的預見范圍之內(nèi)，可以對本發(fā)明作出多種變通和改進，且不偏離本發(fā)明的實質(zhì)和范圍。
權利要求
1．一種含有由VEGF-A外顯子1-5、6b及8編碼的氨基酸序列的純化多肽及其衍生物。
2．一種含有由VEGF-A外顯子1-5、6b、7和8編碼的氨基酸序列的純化多肽及其衍生物。
3．一種含有由VEGF-A外顯子1-5、6a、6b和8編碼的氨基酸序列的純化多肽及其衍生物。
4．權利要求1的純化多肽，其中所述VEGF為人VEGF-A。
5．權利要求2的純化多肽，其中所述VEGF為人VEGF-A。
6．權利要求3的純化多肽，其中所述VEGF為人VEGF-A。
7．權利要求1的純化多肽，其中含有圖3所示的氨基酸序列。
8．權利要求2的純化多肽，其中含有圖4所示的氨基酸序列。
9．權利要求3的純化多肽，其中含有圖5所示的氨基酸序列。
10．一種編碼權利要求1的純化多肽的純化分離的核酸分子。
11．一種編碼權利要求2的純化多肽的純化分離的核酸分子。
12．一種編碼權利要求3的純化多肽的純化分離的核酸分子。
13．一種編碼權利要求4的純化多肽的純化分離的核酸分子。
14．一種編碼權利要求5的純化多肽的純化分離的核酸分子。
15．一種編碼權利要求6的純化多肽的純化分離的核酸分子。
16．一種編碼權利要求7的純化多肽的純化分離的核酸分子。
17．一種編碼權利要求8的純化多肽的純化分離的核酸分子。
18．一種編碼權利要求9的純化多肽的純化分離的核酸分子。
19．權利要求16的核酸分子，其中具有圖3所示的核苷酸序列。
20．權利要求17中的核酸分子，其中具有圖4所示的核苷酸序列。
21．權利要求18中的核酸分子，其中具有圖5所示的核苷酸序列。
22．一種編碼VEGF-A138生物活性片段或其衍生物的純化分離的核酸分子。
23．一種編碼VEGF-A182生物活性片段或其衍生物的純化分離的核酸分子。
24．一種編碼VEGF-A162生物活性片段或其衍生物且已經(jīng)過分離純化的核酸分子。
25．一種含有權利要求10-24中任一項中所述核酸分子的表達載體。
26．權利要求25的表達載體，其中所述載體進一步含有腺病毒序列。
27．權利要求26中的表達載體，其中所述核酸可操縱地連接于一個在血管內(nèi)皮細胞內(nèi)有活性的啟動子上。
28．權利要求27的表達載體，其中所述表達載體為腺病毒表達載體。
29．按照權利要求28的表達載體，其中所述載體進一步包含E1A/E1B基因已經(jīng)刪除的部分腺病毒序列。
30．一種表達VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182的重組載體的冠狀動脈注射用試劑盒，其中包括一種編碼VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182的核酸分子，該核酸分子被克隆到一種適于體內(nèi)表達所述多核苷酸的載體中，一種裝載所述載體的合適容器，以及用于說明將所述載體注射到患者體內(nèi)的說明書。
31．根據(jù)權利要求30的試劑盒，其中所述多核苷酸被克隆到腺病毒表達載體中。
32．一種用于治療哺乳動物血管疾病的方法，該方法包括下述步驟給所述哺乳動物施用治療有效劑量的VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182，從而刺激血管細胞增殖。
33．一種增強疾病血管內(nèi)皮愈合的方法，該方法包括下述步驟給哺乳動物施用治療有效劑量的VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182。
34．權利要求33的方法，其中內(nèi)皮愈合為血管成型術后的內(nèi)皮重新愈合。
35．權利要求34中的方法，其中內(nèi)皮重新愈合可減輕和預防再狹窄。
36．權利要求32或33中的方法，其中所述患者用斯滕特固定膜治療。
37．權利要求32或33中的方法，其中所述患者不用斯滕特固定膜治療。
38．權利要求32或33中的方法，其中所述哺乳動物為人。
39．權利要求32或33中的方法，其中用覆以VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182的膨脹氣囊導管施用所述VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182。
40．權利要求32或33中的方法，其中所述施用包括基因治療。
41．根據(jù)權利要求40中的方法，其中用覆以編碼VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182的多核苷酸的可膨脹氣囊導管實施所述基因治療。
42．一種用于加強藥物在腫瘤中滲透的方法，包括給患者施用編碼VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182的核酸分子。
43．權利要求42中的方法，其中所述VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182直接施用給腫瘤細胞。
44．一種治療組合物，其中包括一種藥物學上可接受的載體以及能刺激血管細胞增殖的治療有效量的VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182。
45．一種經(jīng)過濾的可注射的腺病毒載體制劑，其中包括一種重組的腺病毒載體，所述載體不含野生型病毒并且其中包括刪除了E1A/E1B基因的部分腺病毒序列，一種編碼VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182的轉(zhuǎn)基因，該基因受夾靠在部分腺病毒序列之間的啟動子所驅(qū)動，一種藥物學上可接受的載體。
46．一種用于治療哺乳動物心血管疾病的方法，該方法包括下述步驟用編碼下述多肽的核酸分子轉(zhuǎn)染所述哺乳動物細胞，所述多肽含有由VEGF-A外顯子1-5、6b和8編碼的氨基酸序列。
47．一種用于治療哺乳動物心血管疾病的方法，該方法包括下述步驟用編碼下述多肽的核酸分子轉(zhuǎn)染所述哺乳動物細胞，所述多肽含有由VEGF-A外顯子1-5、6b、7和8編碼的氨基酸序列。
48．一種用于治療哺乳動物心血管疾病的方法，該方法包括下述步驟用編碼下述多肽的核酸分子轉(zhuǎn)染所述哺乳動物細胞，所述多肽含有由VEGF-A外顯子1-5、6a、6b、和8編碼的氨基酸序列。
49．權利要求46的方法，其中所述VEGF-A為人的VEGF-A。
50．權利要求47的方法，其中所述VEGF-A為人的VEGF-A。
51．權利要求48的方法，其中所述VEGF-A為人的VEGF-A。
52．權利要求46的方法，其中所述核酸分子編碼VEGF-A138。
53．權利要求47的方法，其中所述核酸分子編碼VEGF-A182。
54．權利要求48的方法，其中所述核酸分子編碼VEGF-A162。
55．根據(jù)權利要求46-54中任一項所述的方法，其中所述核酸分子被克隆到一種載體中。
56．根據(jù)權利要求55的方法，其中所述載體包括腺病毒顆粒。
57．權利要求56中的方法，其中所述腺病毒載體顆粒通過注射輸送給所述哺乳動物。
58．權利要求57中的方法，其中所述腺病毒顆粒的數(shù)目約為1010～1014。
59．權利要求58中的方法，其中所述腺病毒顆粒的數(shù)目約為1011～1013。
60．權利要求46、47或48的方法，其中所述轉(zhuǎn)染細胞選自成肌細胞、肌細胞、心肌細胞、成心細胞和平滑肌細胞。
61．權利要求57中的方法，其中所述轉(zhuǎn)染細胞為冠狀動脈細胞，所述注射為冠狀動脈內(nèi)注射。
62．權利要求61中的方法，其中所述腺病毒顆粒注射到左和右冠狀動脈內(nèi)腔約1cm處。
63．根據(jù)權利要求46，47或48中的方法，其中所述細胞的轉(zhuǎn)染在體內(nèi)進行。
64．根據(jù)權利要求46，47或48中的方法，其中所述細胞的轉(zhuǎn)染離體進行。
65．根據(jù)權利要求61的方法，其中所述核酸分子通過一個插入到所述動脈中的導管導入冠狀動脈內(nèi)。
66．根據(jù)權利要求65的方法，其中所述導管含有一個可膨脹氣囊，后者的外表面適應于與所述動脈的內(nèi)壁吻合，并且所述核酸分子覆蓋在氣囊的外表面上。
67．根據(jù)權利要求46，47或48的方法，其中所述核酸分子包括圖3或圖4所示的核苷酸序列。
68．權利要求46，47或48的方法，其中所述哺乳動物為人。
69．一種轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細胞，其中含有權利要求25的表達載體。
70．一種用于制備VEGF-A多肽的方法，其中包括下述步驟在合適的條件下，使經(jīng)權利要求25的重組DNA表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細胞以能夠表達所述多肽的方式生長，并從宿主細胞中分離所述多肽。
71．權利要求46，47或48的方法，進一步包括施用一種增效劑，用以增強所述多肽的血管生成作用。
72．權利要求71的方法，其中所述增效劑為一種血管生成FGF。
73．權利要求72的方法，其中所述增效劑選自FGF-1、FGF-2、FGF-4、FGF-5和FGF-6。
74．一種用于治療患有缺血性疾病患者的方法，該方法包括施用治療藥物組合物，該組合物中含有置于合適載體中的VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182蛋白。
75．權利要求74的方法，該方法進一步包括施用一種可增強所述VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182蛋白的治療作用的藥物。
76．權利要求75的方法，其中所述增效劑選自FGF-1、FGF-2、FGF-4、FGF-5和FGF-6。
77．權利要求74的方法，其中所述局部缺血情況選自心肌梗塞、慢性冠狀動脈缺血、慢性下肢缺血、中風和外周性血管疾病。
78．一種增加血管通透性的方法，該方法包括下述步驟施用治療藥物組合物，該組合物中含有置于一合適載體中的VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182蛋白。
79．一種用于治療患者創(chuàng)傷的方法，該方法包括下述步驟施用治療藥物組合物，該組合物中含有置于一合適載體中的VEGF-A138、VEGF-A162或VEGF-A182蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開一種新型的血管內(nèi)皮細胞生長因子基因以及這些基因所編碼的新型蛋白。更具體地說,本發(fā)明公開了一種含有外顯子6b但不含外顯子6a的新型人VEGF－A。其他的新型人VEGF－A中除含有6a外還含有6b。這些新型的人VEGF－A包括VEGF－A
文檔編號C07K14/52GK1295617SQ99804533
公開日2001年5月16日 申請日期1999年2月4日 優(yōu)先權日1998年2月6日
發(fā)明者安德魯·貝爾德, 格拉伊·安德烈亞松 申請人:科萊特諾醫(yī)療公司