專利名稱：一種新的人神經(jīng)蛋白、其編碼序列及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種新的人基因核苷酸序列。更具體地說，本發(fā)明涉及人NP17.3的cDNA序列，該核酸序列所編碼的蛋白是小鼠神經(jīng)蛋白NP15.6的同系物。本發(fā)明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽，這些多核苷酸和多肽的應(yīng)用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生產(chǎn)方法。
神經(jīng)蛋白是一類與神經(jīng)功能密切相關(guān)、分子量中等以下的遍在蛋白，有內(nèi)源性和外源性蛋白之分。前者由神經(jīng)元的尼氏體內(nèi)的小核糖核蛋白體合成，在神經(jīng)元內(nèi)物質(zhì)運輸及信號傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用；后者由非神經(jīng)細(xì)胞的核糖體合成，經(jīng)修飾加工，運輸?shù)缴窠?jīng)元，錨定于突觸前膜或后膜，成為膜內(nèi)在蛋白或游離于突觸間隙，發(fā)揮神經(jīng)元之間物質(zhì)運輸與信號傳導(dǎo)的中轉(zhuǎn)站作用，促進(jìn)神經(jīng)元的生長發(fā)育、成熟分化等代謝活動的進(jìn)行及神經(jīng)功能的發(fā)揮。近四年來，十幾種神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白和各種遞質(zhì)受體的cDNA已被克隆。
腦發(fā)育異?？梢詫?dǎo)致多種疾病，如腦過小、腦回缺乏等。75％胎兒致死和40％一周歲以內(nèi)嬰兒死亡的病例與腦發(fā)育異常有關(guān)。約3％新生兒有嚴(yán)重的腦或全身系統(tǒng)性缺陷；約5-15％兒科神經(jīng)病例與顱脊柱畸形有關(guān)。在至少6％的病例中，染色體因子是致病原因。因此，研究腦發(fā)育過程中分子水平上的調(diào)控機制，以便在醫(yī)學(xué)上有所應(yīng)用便顯得十分重要。
新生兒的腦僅重500g，神經(jīng)元細(xì)胞的急劇增殖和遷移是哺乳動物胚胎發(fā)育后期的一個特點。在大鼠中，雖然神經(jīng)元的增殖開始于胚胎發(fā)育的第12-13天，但在胚胎發(fā)育后期以及新生期該過程大大加快了，腦的大部分重量是在此階段形成的。在人中，神經(jīng)元細(xì)胞的快速增殖、遷移開始于受精后的8-10周，但腦的大部分體積和重量是在第14至38周間形成的。
在早期階段監(jiān)控腦發(fā)育過程是十分有用的。例如，這樣就可以了解流產(chǎn)或新生兒神經(jīng)系統(tǒng)缺陷是否是由異常的腦發(fā)育和/或神經(jīng)元遷移所引起的；也可以了解孕婦子宮中的胎兒是否會受到異常的腦發(fā)育和/或神經(jīng)元遷移的威脅，從而提出合理的建議。
胎腦細(xì)胞移植的方法已經(jīng)在帕金森氏綜合癥(Parkinson′s Disease，PD)和早老性癡呆(Alzheimer′s Desease，AD)的治療中顯示了作用。此外，在Huntington氏舞蹈病、肌細(xì)胞萎縮側(cè)向硬化癥(amyltrophic lateral sclerosis，ALS)、遺傳性共濟(jì)失調(diào)(hereditary ataxia)的病例中，組織移植的方法也顯示了相似的結(jié)果。在早老性癡呆(AD)的治療中，轉(zhuǎn)入基因工程細(xì)胞可以使人們對腦微觀環(huán)境進(jìn)行改造。在移植胎兒神經(jīng)組織的過程中，監(jiān)視組織是否正常發(fā)育是很有用的。
絕大多數(shù)生理功能會隨著年齡而衰退，衰退的速度因組織的不同而不同。年齡也同樣嚴(yán)重地影響著神經(jīng)系統(tǒng)，尤其是神經(jīng)元，這使得老年人有時看上去象是無助的孩子。從30歲到100歲，人的大腦質(zhì)量平均下降233克。下降的原因可能是神經(jīng)元的退化以及置換性神經(jīng)膠質(zhì)增生癥(replacement gliosis)。位于額中部、上顳、下頂骨(parietal)區(qū)域的新大腦皮質(zhì)區(qū)的大型神經(jīng)元(＞90μM)的質(zhì)量隨年齡增長而下降，而小神經(jīng)元(40-90μM)和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞則將隨年齡增長而上升。
神經(jīng)元的喪失在70歲后尤為顯著。大于25％的海馬神經(jīng)元是在45-95歲間喪失的。有研究表明，衰老同樣會導(dǎo)致神經(jīng)元樹突的減少，盡管這尚有爭議，。這些形態(tài)上的改變可能是與隨年齡增長的記憶力下降，學(xué)習(xí)能力喪失及神經(jīng)元功能最終喪失的基本原因。
因此，無論對于衰老還是對于神經(jīng)元退化性疾病，能再生神經(jīng)元是十分有用的。在某些的神經(jīng)元病癥條件下，(如Huntington舞蹈病、早老性癡呆癥和帕金森氏綜合癥)中，這種退化過程在某些神經(jīng)病學(xué)人群中更為顯著。盡管成人神經(jīng)元生長退化的具體分子機制還不清楚，但很明顯將大腦發(fā)育相關(guān)基因轉(zhuǎn)入成人神經(jīng)元從而使之再生(即重建胎兒期)已有較好基礎(chǔ)。
衰老在細(xì)胞功能和分裂能力完全喪失時達(dá)到頂點。然而只有少部分人死于正常衰老。大多數(shù)人死于隨著衰老而易感性不斷提高的疾病。但是，即使引起老年人死亡的主要疾病如冠狀動脈疾病、癌癥被消除，人類期望壽命也只能相應(yīng)地增加3年和2.5年。
Hayflick和Moorhead發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞的分裂次數(shù)是固定的。嬰兒成纖維細(xì)胞約分裂50次，二十歲成人成纖維細(xì)胞分裂約30次，八十歲老人的成纖維細(xì)胞只分裂20次。大量的研究已經(jīng)培養(yǎng)的衰老成纖維細(xì)胞作為研究衰老分子機制的模型。隨著年紀(jì)的增加，細(xì)胞內(nèi)大分子不斷累積各種錯誤，如突變、端粒縮短、DNA甲基化不足、DNA修復(fù)損傷、蛋白交連和蛋白降解能力降低等。然而這些變化影響衰老的具體機制還不清楚。不可避免的衰老過程很可能與基因表達(dá)的改變有關(guān)，這種改變表現(xiàn)為基因的正調(diào)控，或負(fù)調(diào)控，或者兩者兼有。
雖然在衰老過程中RNA總量發(fā)生了減少，但與年輕腦組織相比，衰老腦組織中mRNA的合成速度和穩(wěn)定性并未降低。在年輕成纖維細(xì)胞和衰老成纖維細(xì)胞所構(gòu)建的雜交細(xì)胞中，衰老表型是顯性的。造成這種衰老顯性表型的因子可能與衰老細(xì)胞中過度表達(dá)或表達(dá)不足的基因有關(guān)。衰老細(xì)胞中DNA合成起始過程所必需的c-fos基因的轉(zhuǎn)錄有缺陷。另外，c-fos的翻譯后修飾的異常損害了其與c-jun結(jié)合形成AP-1轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物的功能。細(xì)胞周期控制基因cdc2和周期蛋白A和B在衰老細(xì)胞中表現(xiàn)為低水平或功能損傷。在衰老細(xì)胞中，鳥氨酸脫氫酶mRNA水平降低，翻譯受阻，蛋白迅速降解。衰老細(xì)胞還表達(dá)抑制素和terminin，這兩種蛋白在衰老細(xì)胞中被特異地誘導(dǎo)，這有可能是溶酶體蛋白水解作用的損傷引起的。
酵母是另一研究衰老的模型。Jazwinski等鑒定了幾個在年輕和年老酵母細(xì)胞中呈差異表達(dá)的基因。衰老酵母細(xì)胞不表達(dá)在信號傳導(dǎo)和細(xì)胞生長中起作用的ras-2基因，同時也不表達(dá)lag-1基因。有意義的是，lag-1基因的過度表達(dá)可延長生命期30％左右。在果蠅中也觀察到了類似結(jié)果。最近，已表明果蠅種群中衰老速度存在遺傳差異中可遺傳的衰老率變異種群已被鑒定。
雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和分離出了許多種與神經(jīng)發(fā)育、衰老有關(guān)的基因，但是在申請之前，沒有人公開或發(fā)表過本發(fā)明的NP17.3基因和蛋白。
本發(fā)明的一個目的是提供一種新的多核苷酸序列，該多核苷酸序列編碼人神經(jīng)蛋白，其分子量為17300Da，本發(fā)明的基因被命名為NP17.3(GenBank AccessionNo.AF064257)(注因申請保密一段時間，故在本申請之前該序列不對公眾公開)。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種新的蛋白，該蛋白被命名為NP17.3蛋白。
本發(fā)明的再一個目的是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)所述的新的人NP17.3蛋白的方法。
本發(fā)明還提供了這種人NP17.3基因序列和多肽的應(yīng)用。
在本發(fā)明的一個方面，提供了一種分離出的DNA分子，它包括編碼具有人NP17.3蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.5中從核苷酸19-480位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.5中從核苷酸19-480位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.6所示的序列。更佳地，該序列具有SEQ ID NO.5中從核苷酸19-480位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離的NP17.3蛋白多肽，它包括具有SEQID NO.6氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.6序列的多肽。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種載體，它含有上述分離出的DNA。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種產(chǎn)生具有NP17.3蛋白活性的多肽的方法，該方法包括(a)將編碼具有NP17.3蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成NP17.3蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.5中從核苷酸19-480位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成NP17.3蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)NP17.3蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有NP17.3蛋白活性的多肽。
在本發(fā)明的一個具體實施方案中，本發(fā)明的分離的多核苷酸全長為595個核苷酸，其詳細(xì)序列見SEQ ID NO.5，其中開放讀框位于19-480位核苷酸。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”或“基本純的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。
在本發(fā)明中，術(shù)語“NP17.3蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有NP17.3蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.5中19-480位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO.5序列的編碼框19-480位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO.5中19-480位核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO.6所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳地在高度嚴(yán)緊條件下能與SEQ ID NO.5中從核苷酸19-480位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。此外，該術(shù)語還包括與SEQ ID NO.5中從核苷酸19-480位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
該術(shù)語還包括能編碼具有與人NP17.3相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.5中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(通常為60個以內(nèi)，較佳地為30個以內(nèi)，更佳地為10個以內(nèi)，最佳地為5個以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，“基本純的”蛋白質(zhì)或多肽是指其至少占樣品總物質(zhì)的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或濕重計)。純度可以用任何合適的方法進(jìn)行測量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測量多肽的純度。基本純的多肽基本上不含天然狀態(tài)下的伴隨其的組分。
在本發(fā)明中，術(shù)語“NP17.3蛋白多肽”指具有NP17.3蛋白活性的SEQ ID NO.6序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與人NP17.3相同功能的、SEQ ID NO.6序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括NP17.3蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)謹(jǐn)度條件下能與NP17.3DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗NP17.3多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含NP17.3多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了NP17.3多肽的可溶性片段。通常，該片段具有NP17.3多肽序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供NP17.3蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然NP17.3多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
本發(fā)明還包括NP17.3多肽編碼序列的反義序列。這種反義序列可用于抑制細(xì)胞內(nèi)NP17.3的表達(dá)。
本發(fā)明還包括一種可用作探針的核酸分子，該分子通常具有NP17.3多肽編碼序列的8-100個，較佳地15-50個連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼NP17.3的核酸分子。
本發(fā)明還包括檢測NP17.3核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對應(yīng)于NP17.3多肽的編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長度一般為20-50個核苷酸。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體。
在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞、和哺乳動物細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞等。
另一方面，本發(fā)明還包括對NP17.3DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于NP17.3基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與NP17.3基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制NP17.3蛋白的分子，也包括那些并不影響NP17.3蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的NP17.3基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的NP17.3基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)NP17.3或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature 256495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷NP17.3功能的抗體以及不影響NP17.3功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用NP17.3基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與NP17.3基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而獲得。
本發(fā)明的人NP17.3核苷酸序列全長序列或其片段通常可以用PCR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按已知方法制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。當(dāng)然，通過先合成多個小片段，然后再進(jìn)行連接而獲得序列很長的片段。
在本發(fā)明中，人NP17.3的cDNA核苷酸序列是如此獲得的，以人睪丸λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，合成正向引物C5′-CTAGCTTCTCCAGGACTGTGGTC-3′和反向引物B5′-AATCCACGAGACTCTTCTCCAGTC-3′，進(jìn)行PCR，獲得450bp的目的片段。用α32P-dATP標(biāo)記此片斷，并對睪丸λgt11cDNA文庫進(jìn)行篩選。挑選向兩端延伸最長的克隆進(jìn)行測序，得到SEQ ID NO.5的全長cDNA序列。
在附圖中，

圖1為本發(fā)明的人NP17.3蛋白(NP17.3P)與NP15.6蛋白(NP15.6P)的氨基酸序列的同源比較圖。其中，相同的氨基酸在兩個序列之間用“｜”標(biāo)出，相似的氨基酸用“.”標(biāo)出。
下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1NP17.3的cDNA的克隆和測序1.引物擴(kuò)增以人睪丸λgt10cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用寡核苷酸C5′-CTAGCTTCTCCAGGACTGTGGTC-3′(SEQ ID NO.1)為正向引物，寡核苷酸B5′-AATCCACGAGACTCTTCTCCAGTC-3′(SEQ ID NO.2)為反向引物，進(jìn)行PCR，PCR條件為93℃4分鐘，隨之以93℃1分鐘、64℃1.5分鐘和72℃2分鐘進(jìn)行35個循環(huán)，最后72℃延伸5分鐘。電泳檢測得到的450bp目的片段。
2.探針及其標(biāo)記以如上獲得的PCR目的片段為探針，用α-32P-dATP(DuPont公司)對其進(jìn)行PCR引物標(biāo)記，條件如上。
3.cDNA文庫擴(kuò)增及印跡標(biāo)記(篩選文庫)將人睪丸λgt10cDNA文庫進(jìn)行擴(kuò)增，克隆數(shù)達(dá)50萬個，然后將擴(kuò)增好的cDNA文庫印跡到Hybond TM-N+尼龍膜上(Amersham)，再將標(biāo)記好的探針變性后與印跡膜雜交，洗膜，放入帶增感屏的片夾，與FUJI MEDIAIX光膠片于-80℃下進(jìn)行放射自顯影，72小時后沖片。
4.挑取克隆及初篩克隆的復(fù)篩通過上述雜交篩選獲得89個初篩陽性克隆，用上述相同的探針雜交和篩選過程對這89個陽性克隆進(jìn)行復(fù)篩，最終得到19個陽性單克隆。
5.單克隆的鑒定和測序以上述步驟4中得到的單克隆噬菌體為模板，用上述步驟1的兩個正反引物分別與λgt10左右臂上的引物λgt10EF及λgt10ER(EF5′-AGCAGCCAGTCAACACTTACG-3′SEQ ID NO.3；ER5′-GAGTTTGCATATCGCCTCCATC-3′SEQ ID NO.4)進(jìn)行搭配擴(kuò)增，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，以判斷每個克隆從探針出發(fā)向5′或3′步移(延伸)的長度，從中選出向5′延伸最長和向3′延伸最長的克隆。將這兩個克隆EF，ER擴(kuò)增產(chǎn)物與pGEM-T載體(Promega)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，用QIAprep Plasmid試劑盒(QIAGEN)提取質(zhì)粒，用雙鏈嵌套式缺失試劑盒(Pharmacia)對插入片段進(jìn)行定向系列缺失，然后用PCR對缺失子進(jìn)行快速鑒定及排序。用SequiTherm EXCELTMDNA測序試劑盒(Epicentre Technologies)對依次截短的缺失子進(jìn)行測序，最后用電腦軟件拼接順序，獲得全長cDNA序列，共595bp，詳細(xì)序列見SEQ ID NO5，其中開放讀框位于19-480核苷酸根據(jù)得到的cDNA序列推導(dǎo)出NP17.3的氨基酸序列，共153個氨基酸殘基，其氨基酸序列詳見SEQ ID NO6。
實施例2NP17.3的表達(dá)譜分析和染色體定位多種組織Northern(MNTTM)印跡膜(16種組織)購自Clontech公司，以上實施例1步驟中的450bp克隆片段為探針，探針的標(biāo)記方法同實施例1步驟2，Northern雜交按用戶手冊操作。
16種組織的Northern雜交結(jié)果顯示NP17.3基因為廣譜表達(dá)基因，在心、腦、胎盤、睪丸、卵巢、結(jié)腸、脾、胸腺、小腸、外周血白細(xì)胞、肺、肝、骨骼肌、腎、胰腺、前列腺16種組織中均有表達(dá)，表達(dá)量稍有差異，在骨骼肌最高，心臟中次之，胰腺中居第三，肺最低。
通過人/鼠體細(xì)胞雜種系DNA Southern印跡膜雜交，將該基因定位于人第3號染色體，進(jìn)一步用熒光原位雜交法(FISH法)將之精細(xì)定位于3q32。
實施例3同源比較和結(jié)構(gòu)研究用NP17.3基因的全長cDNA序列及其編碼蛋白在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫及Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR數(shù)據(jù)庫中用BLAST進(jìn)行核酸和蛋白同源檢索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們與小鼠神經(jīng)蛋白NP15.6顯示了極高同源性。用PCGENE軟件進(jìn)行分析，它與NP15.6在蛋白水平上的同一性和相似性分別達(dá)到了81.2％和88.0％。根據(jù)結(jié)構(gòu)決定功能，結(jié)構(gòu)相似功能相似的原理，有理由相信本發(fā)明的蛋白質(zhì)也是一個神經(jīng)蛋白，并在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育中起作用。
根據(jù)對本發(fā)明的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析推測，本發(fā)明的NP17.3蛋白為一跨膜蛋白，極可能定位于突觸前膜或后膜，在神經(jīng)元間物質(zhì)運輸和神經(jīng)信號傳導(dǎo)中發(fā)揮重要的中轉(zhuǎn)站作用。有鑒于此，除了能利用本發(fā)明的蛋白制備的抗體進(jìn)行免疫機能的基礎(chǔ)研究外，還可以將之制成藥物用于神經(jīng)系統(tǒng)機能障礙及病變的臨床治療，因而將具有廣闊的市場前景。
本發(fā)明的人NP17.3除了可作為神經(jīng)蛋白家族一員用于進(jìn)一步的功能研究，還可用于與其他蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白，比如與免疫球蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白。此外，本發(fā)明人NP17.3還可以與該家族的其他成員進(jìn)行融合或交換片段，以產(chǎn)生新的蛋白。例如將本發(fā)明人NP17.3的N端與人NP15.6的N端進(jìn)行交換，以產(chǎn)生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
針對本發(fā)明人NP17.3的抗體，用于篩選該家族的其他成員，或者用于親和純化相關(guān)蛋白(如該家族的其他成員)。
此外，本發(fā)明人NP17.3核酸(編碼序列或反義序列)可以被引入細(xì)胞，以提高人NP17.3的表達(dá)水平或者抑制人NP17.3的過度表達(dá)。本發(fā)明的人NP17.3蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治療或減輕因人NP17.3缺失、無功能或異常而導(dǎo)致的有關(guān)病癥。此外，還可以用基于本發(fā)明的核酸序列或抗體進(jìn)行有關(guān)的診斷或預(yù)后判斷。
實施例4NP17.3在大腸桿菌中的表達(dá)編碼NP17.3的DNA序列(GenBank Accession No.AF069054)用對應(yīng)于該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物，進(jìn)行擴(kuò)增，以合成插入片段。
5′寡核苷酸引物序列為5′-GCATGGATCCATGG CGGCTGGGCT GTTTG-3′(SEQ ID NO.7)，其含有BamH1限制性內(nèi)切酶的酶切位點，接之是由起始密碼子開始的NP17.3編碼序列的19個核苷酸；3′寡核苷酸引物序列為5’-TTCCGTCGACTCAC TCATCCTCTG GCAGC-3′(SEQ ID NO.8)，其含有SalI限制性內(nèi)切酶的酶切位點，一個翻譯終止子和NP17.3的編碼序列。
限制性內(nèi)切酶的酶切位點對應(yīng)于細(xì)菌表達(dá)載體pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性內(nèi)切酶酶切位點，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個細(xì)菌復(fù)制起點(ori)、一個IPTG-可調(diào)啟動子/操縱子(P/O)、一個核糖體結(jié)合位點(RBS)、一個6-組氨酸標(biāo)記物(6-His)以及限制性內(nèi)切酶克隆位點。用BamHI和SalI消化pQE-9載體，隨后將插入片段連接到pQE-9載體并保持開放讀框在細(xì)菌RBS起始。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化購自Qiagen，商品名為M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷貝的質(zhì)粒pREP4，其表達(dá)lacI阻遏物并攜帶卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，抽體質(zhì)粒，測序驗證NP17.3的cDNA片段已正確插入載體。
在補加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物陽性轉(zhuǎn)化子的克隆。過夜(O/N)培養(yǎng)物以1∶100-1∶250的稀釋率稀釋，然后接種到大體積培養(yǎng)基中，培養(yǎng)細(xì)胞至600光密度(OD600)為0.4-0.6，隨后加入IPTG(“異丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至終濃度為1mM。通過使lacI阻遏物失活，IPTG誘導(dǎo)啟動P/O導(dǎo)致基因表達(dá)水平提高。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞3-4小時，隨后離心(6000×g，20分鐘)。超聲裂解包涵體，收集細(xì)胞并將細(xì)胞沉淀溶于6M的鹽酸胍中。澄清后，通過在能使含6-His標(biāo)記物蛋白緊密結(jié)合的條件下，用鎳-螯合柱層析從溶液中純化溶解的NP17.3。用6M鹽酸胍(pH5.0)從柱中洗脫NP17.3。可用幾種方法從鹽酸胍中變性沉淀蛋白。首先，使用透析步驟除去鹽酸胍，或者從鎳-螯合柱中分離出的純化蛋白可以結(jié)合到第二個柱中，該柱中具有遞減的線性鹽酸胍梯度。在結(jié)合到該柱時蛋白質(zhì)變性，隨后用鹽酸胍(pHS.0)洗脫。最后，將可溶的蛋白質(zhì)對含PBS進(jìn)行透析，然后將蛋白質(zhì)保存在終濃度為10％(w/v)甘油的貯存液中。
用12％的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，鑒定出表達(dá)蛋白的分子量約為17kDa.
此外，用常規(guī)方法對表達(dá)蛋白的N端和C端各10個氨基酸長度的氨基酸進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO6的序列一致。
實施例5NP17.3在真核細(xì)胞(CHO細(xì)胞株)中的表達(dá)參照實施例3，編碼NP17.3的DNA序列(GenBank Accession No.AF069054)用對應(yīng)于該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物，以合成插入片段。
5′寡核苷酸引物序列為5′-GCATGGATCCATGG CGGCTGGGCT GTTTG-3′(SEQIDNO.7)，其含有BamH1限制性內(nèi)切酶的酶切位點，接之是由起始密碼子開始的NP17.3編碼序列的19個核苷酸；3′端寡核苷酸引物序列為5’-AGTCCTCGAGTCACTCATCCTCTGGCAGC-3′(SEQ ID NO.9)，其含有XhoI限制性內(nèi)切酶的酶切位點，一個翻譯終止子和NP17.3的編碼序列。
限制性內(nèi)切酶的酶切位點對應(yīng)于CHO細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3上的限制性內(nèi)切酶酶切位點，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr和Neor)、一個噬菌體復(fù)制起點(flori)、一個病毒復(fù)制起點(SV40 ori)、一個病毒啟動子(P-CMV)、一個Sp6啟動子、一個SV40啟動子、一個SV40加尾信號和相應(yīng)的polyA順序、一個BGH加尾信號和相應(yīng)的polyA順序、。用BamHI和XhoI消化pcDNA3載體，隨后將插入片段連接到pcDNA3載體。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，在補加Amp(100μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的克隆。抽提質(zhì)粒，測序驗證NP17.3的cDNA片段已正確插入載體。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)染是采用脂轉(zhuǎn)染法，用Lipofectin試劑盒(GiBco Life)進(jìn)行的。轉(zhuǎn)染48小時后，經(jīng)2-3周的持續(xù)G418加壓篩選，收集細(xì)胞及細(xì)胞上清測定表達(dá)蛋白酶活力。去G418，連續(xù)傳代培養(yǎng)；對混合克隆細(xì)胞極限稀釋，選擇具有較高蛋白活性的細(xì)胞亞克隆。按常規(guī)方法大量培養(yǎng)上述陽性亞克隆。48小時后，開始收集細(xì)胞及上清，用超聲裂解方法破碎細(xì)胞。以含0.05％Triton的50mM Tris·HCl(pH7.6)溶液為平衡液及洗脫液，用經(jīng)預(yù)平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mM Tris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含1M NaCl的50mMTris·HCl(pH8.0)溶液為洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)為透析液對表達(dá)蛋白溶液進(jìn)行透析。最后凍干保存?zhèn)溆谩?br> 用12％的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，鑒定出表達(dá)蛋白的分子量約為17kDa.
此外，用常規(guī)方法對表達(dá)蛋白的N端和C端各10個氨基酸長度的氨基酸進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO6的序列一致。
實施例6制備抗體將實施例4和5中獲得的重組蛋白用來免疫動物以產(chǎn)生抗體，具體方法如下。重組蛋白用層析法進(jìn)行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進(jìn)行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原，對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進(jìn)行腹膜內(nèi)注射以加強免疫。每隔14天進(jìn)行一次加強免疫，至少進(jìn)行三次。獲得的抗血清的特異反應(yīng)活性用它在體外沉淀人NP17.3基因翻譯產(chǎn)物的能力加以評估。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表(1)一般信息(i)申請人復(fù)旦大學(xué)(ii)發(fā)明名稱一種新的人神經(jīng)蛋白、其編碼序列及制備方法(iii)序列數(shù)目9(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度23核苷酸(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1CTAGCTTCTC CAGGACTGTG GTC 23(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度24核苷酸(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO2AATCCACGAG ACTCTTCTCC AGTC 24(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征
(A)長度21核苷酸(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO3AGCAGCCAGT CAACACTTACG 21(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度22核苷酸(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO4GAGTTTGCAT ATCGCCTCCA TC 22(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度595bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO51 CCTGCAGCAC CATCTGTCAT GGCGGCTGGG CTGTTTGGTT TGAGCGCTCG CCGTCCTTTG61 GCGGCAGCGG CGACGCGAGG CCTCCCGGCC GCCCGCGTCC GCTGGGAATC TAGCTTCTCC121 AGGACTGTGG TCGCCCCGTC CGCTGTGGCG GGAAAGCGGC CCCCAGAACC GACCACACCG181 TGGCAAGAGG ACCCAGAACC CGAGGACGAA AACTTGTATG AGAAGAACCC AGACTCCCAT241 GGTTATGACA AGGACCCCGT TTTGGACGTC TGGAACATGC GACTTGTCTT CTTCTTTGGC301 GTCTCCATCA TCCTGGTCCT TGGCAGCACC TTTGTGGCCT ATCTGCCTGA CTACAGGATG361 AAAGAGTGGT CCCGCCGCGA AGCTGAGAGG CTTGTGAAAT ACCGAGAGGC CAATGGCCTT421 CCCATCATGG AATCCAACTG CTTCGACCCC AGCAAGATCC AGCTGCCAGA GGATGAGTGA481 CCAGTTGCTA AGTGGGGCTC AAGAAGCACC GCCTTCCCCA CCCCCTGCCT GCCATTCTGA541 CCTCTTCTCA GAGCACCTAA TTAAAGGGGC TGAAAGTCTG AAAAAAAAAA AAAAA(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度153氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO61 Met Ala Ala Gly Leu Phe Gly Leu Ser Ala Arg Arg Pro Leu Ala16 Ala Ala Ala Thr Arg Gly Leu Pro Ala Ala Arg Val Arg Trp Glu31 Ser Ser Phe Ser Arg Thr Val Val Ala Pro Ser Ala Val Ala Gly46 Lys Arg Pro Pro Glu Pro Thr Thr Pro Trp Gln Glu Asp Pro Glu61 Pro Glu Asp Glu Asn Leu Tyr Glu Lys Asn Pro Asp Ser His Gly76 Tyr Asp Lys Asp Pro Val Leu Asp Val Trp Asn Met Arg Leu Val91 Phe Phe Phe Gly Val Ser Ile Ile Leu Val Leu Gly Ser Thr Phe106 Val Ala Tyr Leu Pro Asp Tyr Arg Met Lys Glu Trp Ser Arg Arg121 Glu Ala Glu Arg Leu Val Lys Tyr Arg Glu Ala Asn Gly Leu Pro136 Ile Met Glu Ser Asn Cys Phe Asp Pro Ser Lys Ile Gln Leu Pro151 Glu Asp Glu(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度29核苷酸(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO7GCATGGATCC ATGGCGGCTG GGCTGTTTG29(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度29核苷酸(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO8TTCCGTCGAC TCACTCATCC TCTGGCAGC29(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長度29核苷酸(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO9AGTCCTCGAG TCACTCATCC JTCTGGCAGC 29
權(quán)利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有人NP17.3蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.5中從核苷酸19-480位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.5中從核苷酸19-480位的核苷酸序列雜交。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.6所示的序列。
3.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列是SEQ ID NO.5中核苷酸19-480位的序列。
4.一種分離的NP17.3蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.6氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如權(quán)利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO.6序列的多肽。
6.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA。
7.一種用權(quán)利要求6所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，該細(xì)胞是大腸桿菌。
9.如權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，該細(xì)胞是真核細(xì)胞。
10.一種產(chǎn)生具有NP17.3蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，該方法包括(a)將編碼具有NP17.3蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成NP17.3蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.5中從核苷酸19-480位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成NP17.3蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)NP17.3蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有NP17.3蛋白活性的多肽。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，該序列為SEQ ID NO.5中從核苷酸19-480位。
12.一種能與權(quán)利要求4所述的NP17.3蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。
13.一種核苷酸分子，其特征在于，它是權(quán)利要求1所述DNA分子的反義序列。
14.一種探針分子，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA分子中約8-100個連續(xù)核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的人基因核苷酸序列。更具體地說,本發(fā)明提供了人NP17.3的cDNA序列, 該核酸序列所編碼的蛋白是小鼠神經(jīng)蛋白NP15.6的同系物。本發(fā)明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽,這些多核苷酸和多肽的應(yīng)用,以及所述多核苷酸和所述多肽的生產(chǎn)方法。
文檔編號C07K16/18GK1249343SQ98121909
公開日2000年4月5日 申請日期1998年9月28日 優(yōu)先權(quán)日1998年9月28日
發(fā)明者余龍, 龔若沐, 高潔, 崔映宇, 趙壽元 申請人:復(fù)旦大學(xué)