專利名稱：用于抑制α的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總的涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，并且具體地涉及使用玻連蛋白受體αvβ5的拮抗劑抑制αvβ5介導(dǎo)的組織血管發(fā)生的方法和組合物。背景整聯(lián)蛋白是已知結(jié)合胞外基質(zhì)蛋白并因此介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-胞外基質(zhì)相互作用(一般稱為細(xì)胞粘連事件)的一類細(xì)胞受體。然而，盡管在文獻(xiàn)中描述了許多整聯(lián)蛋白及其相應(yīng)的配體，仍然難以理解許多整聯(lián)蛋白的生物學(xué)功能。整聯(lián)蛋白受體構(gòu)成了一個(gè)蛋白家族，這些蛋白具有共享的由α和β亞基組成的非共價(jià)異二聚體糖蛋白復(fù)合物的結(jié)構(gòu)特征。
目前已知以其優(yōu)先結(jié)合玻連蛋白的原始特征命名的玻連蛋白受體，指稱為αvβ1、αvβ3和αvβ5的三個(gè)不同的整聯(lián)蛋白。Horton,Int.J.Exp.Pathol.,71:741-759(1990)。αvβ1結(jié)合纖連蛋白和玻連蛋白。αvβ3結(jié)合種類繁多的配體，包括血纖蛋白、血纖蛋白原、層粘連蛋白、血小板反應(yīng)蛋白、玻連蛋白、威勒布蘭特因子、骨反應(yīng)素和骨唾液蛋白Ⅰ。αvβ5結(jié)合玻連蛋白。目前仍在研究這三種整聯(lián)蛋白在組織中的許多細(xì)胞相互作用中所起的特異性細(xì)胞粘連作用。然而，已知有許多具有不同生物學(xué)功能的不同的整聯(lián)蛋白以及具有共享的生物學(xué)特異性的不同的整聯(lián)蛋白和亞基。
許多整聯(lián)蛋白的配體內(nèi)的一個(gè)重要識別位點(diǎn)是精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)三肽序列。在以上鑒別為玻連蛋白受體整聯(lián)蛋白的所有配體中都發(fā)現(xiàn)了RGD?？梢杂煤性揜GD序列的多肽(“肽”)模擬該RGD識別位點(diǎn)，并且這種RGD肽是整聯(lián)蛋白功能的已知抑制劑。然而，重要的是注意到，根據(jù)該RGD肽的序列和結(jié)構(gòu)，可以改變該抑制的特異性以導(dǎo)向特定的整聯(lián)蛋白。
有關(guān)該RGD識別位點(diǎn)的討論，參見Pierschbacher等，Nature,309:30-33(1984)、和Pierschbacher等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:5985-5988(1984)。改變整聯(lián)蛋白特異性的各種RGD多肽亦描述于Grant等，Cell,58:933-943(1989),Cheresh，等，Cell,58:945-953(1989)、Aumailley等，F(xiàn)EBS Letts.,291:50-54(1991)和Pfaff等，J.Biol.Chem.269:20233-20238(1994)和美國專利4,517,686、4,578,079、4,589,881、4,614,517、4,661,111、4,792,525、4,683,291、4,879,237、4,988,621、5,041,380和5,061,693號。
血管發(fā)生亦稱為新血管形成，是涉及新發(fā)育血管生長進(jìn)入組織的組織血管形成的過程。該過程由內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的浸潤介導(dǎo)。據(jù)信該過程以以下三種方式之一進(jìn)行1)該脈管可以從先前存在的脈管出芽；2)可以從前體細(xì)胞發(fā)生脈管的從頭發(fā)育(血管發(fā)生)；或3)現(xiàn)存的小脈管的直徑可以擴(kuò)大。Blood等，Bioch.Biophys.Acta,1032:89-118(1990)。已知血管內(nèi)皮細(xì)胞含有至少五種RGD依賴性整聯(lián)蛋白，包括玻連蛋白受體(αvβ3或αvβ5)、膠原蛋白Ⅰ型和Ⅳ型受體(α1β1)、層粘連蛋白受體(α2β1)、纖連蛋白/層粘連蛋白/膠原蛋白受體(α3β1)和纖連蛋白受體(α5β1)。Davis等，J.Cell.Biochem.,51:206-218(1993)。已知平滑肌細(xì)胞含有至少六種RGD依賴性整聯(lián)蛋白，包括α5β1、αvβ3和αvβ5。
血管發(fā)生是新生兒生長中的重要過程，但在傷口愈合和在包括組織炎癥、關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、癌癥、糖尿病性視網(wǎng)膜病、黃斑變性和其它新血管性眼病的種類繁多的臨床重要疾病中亦很重要。這些與血管發(fā)生相關(guān)的臨床疾病被稱為生血管性疾病(angiogenic disease)。Folkman等，Science,235:442-447(1987)。在成人或成熟組織中一般沒有血管發(fā)生，盡管其的確在傷口愈合和在黃體生長周期中發(fā)生。參見例如，Science,248:1408-1410(1990)。
使用對各種整聯(lián)蛋白α或β亞基免疫特異性的單克隆抗體體外抑制細(xì)胞粘連，已將玻連蛋白受體αvβ3與包括微血管內(nèi)皮細(xì)胞的種種細(xì)胞類型的細(xì)胞粘連相關(guān)聯(lián)。Davis等，J.Cell.Biol.51:206-218(1993)。另外，Nicosia等，Am.J.Pathol.,138:829-833(1991)描述了使用RGD肽GRGDS抑制從在膠原蛋白凝膠中培養(yǎng)的大鼠主動(dòng)脈體外形成“微脈管”。
但是，抑制膠原蛋白凝膠培養(yǎng)物中的體外“微脈管”形成不是抑制組織中血管發(fā)生的模型，因?yàn)槲达@示所述微脈管結(jié)構(gòu)與毛細(xì)管出芽相同，或在膠原蛋白凝膠培養(yǎng)物中微脈管的形成等同于新血管生長進(jìn)入完整的組織，例如關(guān)節(jié)炎組織、腫瘤組織或希望抑制血管發(fā)生的疾病組織。
近來證實(shí)了αvβ3在血管發(fā)生中的作用。參見，Brook等，Science,264:569-571(1994)。顯示整聯(lián)蛋白在人類傷口肉芽發(fā)生組織中而不是在正常皮膚中的血管上表達(dá)?？功羦β3受體的單克隆抗體抑制由生長因子(細(xì)胞因子)堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)以及由黑素瘤片段誘導(dǎo)的血管發(fā)生。然而，所述拮抗劑僅抑制新脈管，而不抑制先前存在的脈管。另外，特定的含有RGD的線性和環(huán)狀肽亦顯示抑制新血管形成。
已有提議抑制血管發(fā)生將對限制腫瘤生長是有用的治療法。已提議通過(1)抑制釋放諸如bFGF(堿性成纖維細(xì)胞生長因子)的“生血管分子”，(2)諸如通過使用抗bFGF抗體中和生血管分子和(3)抑制內(nèi)皮細(xì)胞對血管發(fā)生刺激物應(yīng)答抑制血管發(fā)生。后一策略受到了注意，并且Folkman等，Cancer Biology,3:89-96(1992)已描述了可以用于抑制血管發(fā)生的幾種內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)答抑制劑，包括膠原酶抑制劑、基膜更新抑制劑、血管抑制性(angiostatic)類固醇、真菌源血管發(fā)生抑制劑、血小板因子4、血小板反應(yīng)蛋白、諸如D-青霉胺和硫代蘋果酸金的關(guān)節(jié)炎藥物、維生素D3類似物、α-干擾素等等。有關(guān)其它建議的血管發(fā)生抑制劑，參見Blood等，Bioch.Biophys.Acta.,1032:89-118(1990)、Moses等，Science,248:1408-1410(1990)、Ingber等，Lab.Invest.,59:44-51(1988)和美國專利5,092,885、5,112,946、5,192,744和5,202,352。
然而，在本發(fā)明之前從未提示或鑒別整聯(lián)蛋白αvβ5在血管發(fā)生中的作用，亦未有先前參考文獻(xiàn)中描述的任一種血管發(fā)生抑制劑導(dǎo)向抑制αvβ5。另外，除本發(fā)明之外，沒有任何參考文獻(xiàn)暗示αvβ5整聯(lián)蛋白在新血管形成、特別是由生長因子、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、轉(zhuǎn)化生長因子-α(TGF-α)和表皮生長因子(EGF)誘導(dǎo)的新血管形成中的作用。
盡管參與控制血管發(fā)生的生長因子的數(shù)量有限，但存在對從非活動(dòng)狀態(tài)向新血管狀態(tài)轉(zhuǎn)換的不同水平的過程控制。參見，D’Amore,Investigative Ophthal.Visual Sci.,35:3974-3979(1994)。雖然一些參與血管發(fā)生的生長因子在合成水平受調(diào)節(jié)，而其它的則由激活狀態(tài)調(diào)節(jié)。當(dāng)非活動(dòng)脈管在受傷或局部缺血后進(jìn)行新血管形成時(shí)，發(fā)生這些細(xì)胞事件。
據(jù)認(rèn)為特別是VEGF是原發(fā)性腫瘤中和局部缺血性眼病中血管發(fā)生的主要介質(zhì)。有關(guān)綜述，參見Foldman,Nature Medicine,1:27-31(1995)。VEGF是46千道爾頓(kDa)的同二聚體，它是內(nèi)皮細(xì)胞特異性生血管的(Ferrara等，Endocrin.Rev.,13:18-32(1992))和血管通透因子(Senger等，Cancer Res.,46:5629-5632(1986))，它與具有酪氨酸激酶活性的高親和性膜結(jié)合受體結(jié)合(Jakeman等，J.Clin.Invest.,89:244-253(1992))。
近來已顯示受體酪氨酸激酶的激活促進(jìn)整聯(lián)蛋白依賴性細(xì)胞在胞外基質(zhì)蛋白上遷移。具體地說，Klemke等，J.Cell Biol.,127:859-866(1994)已暗示，EGF受體(EGFR)酪氨酸激酶促進(jìn)使用αvβ5整聯(lián)蛋白的FG人胰腺癌細(xì)胞在玻連蛋白上的細(xì)胞機(jī)動(dòng)性而不是粘連。作者提供了直接證據(jù)，表明用該EGF配體占據(jù)EGFR激活了該EGFR酪氨酸激酶的活化，其最終刺激導(dǎo)致誘導(dǎo)αvβ5依賴性細(xì)胞在玻連蛋白基質(zhì)上遷移的蛋白激酶C(PKC)依賴性路徑，而在正常情況下所述細(xì)胞不能在玻連蛋白基質(zhì)上遷移。因此，Klemke等的發(fā)現(xiàn)提供了將細(xì)胞因子特別是EGF的存在與細(xì)胞遷移中的整聯(lián)蛋白活性相對應(yīng)的證據(jù)。已顯示PKC的激活參與雞尿囊絨膜模型系統(tǒng)中血管發(fā)生的調(diào)節(jié)。參見，Tsopanoglou等，J.Vasc.Res.,30:202-208(1993)。所述作者鑒定了在該模型系統(tǒng)中分別刺激和抑制血管發(fā)生的特定的PKC激活劑和抑制劑。
然而，上述Klemke等或Tsopanoglou等均未描述細(xì)胞因子和所述αvβ5整聯(lián)蛋白的表達(dá)和/或激活在促進(jìn)各種病癥和疾病狀態(tài)中血管發(fā)生的作用以及用特異性αvβ5拮抗劑對其抑制。
近來的實(shí)驗(yàn)證據(jù)已顯示，在眼病的猴子模型系統(tǒng)中由視網(wǎng)膜靜脈閉合誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜局部缺血導(dǎo)致在眼睛的眼房中VEGF快速上升。該上升與如Miller等，Am.J.Path.,145:574-584(1994)所述所觀察到的虹膜新血管形成同時(shí)發(fā)生。其中誘導(dǎo)了缺氧的增殖性視網(wǎng)膜病的小鼠模型系統(tǒng)中的另外的數(shù)據(jù)，顯示VEGF信使RNA在相對缺氧的6-12小時(shí)內(nèi)增加并保持升高直至發(fā)展新血管形成。當(dāng)新血管衰退時(shí)，VEGF表達(dá)亦然，如Pierce等，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,92:905-909(1995)。
因此，在局部缺血的動(dòng)物模型中證實(shí)的近期數(shù)據(jù)已將VEGF誘導(dǎo)與新血管形成之前的局部缺血的誘導(dǎo)相關(guān)聯(lián)。也已將VEGF以及其他生長因子牽涉在涉及新血管形成的其它病癥和疾病狀態(tài)中，如Folkman,Nature Medicine,1:27-31(1995)綜述。
Folkman等的文獻(xiàn)亦概括了目前用于控制不需要的血管發(fā)生的臨床途徑。臨床試驗(yàn)中的病人接受了使用包括血小板因子4、煙曲霉素衍生物、羧基-氨基三唑等等的生血管抑制劑的治療性處理。但是，文獻(xiàn)或目前的治療參考均未將αvβ5的表達(dá)與血管發(fā)生、特別是由VEGF誘導(dǎo)的血管發(fā)生相關(guān)聯(lián)。因此，在本發(fā)明之前，沒有任何人描述或利用使用αvβ5拮抗劑的治療制度控制正在進(jìn)行的與αvβ5的存在和激活相關(guān)的血管發(fā)生的組織中的血管發(fā)生。
因此，除了本文對αvβ3和與血管發(fā)生生長因子的關(guān)系的報(bào)道，本申請人不知道任何其它的可以使用αvβ5介導(dǎo)的細(xì)胞粘連的抑制劑抑制組織中血管發(fā)生的證明。具體地說，先前從未證明組織中的血管發(fā)生需要αvβ5功能或αvβ5拮抗劑可以抑制組織中、特別是眼新血管疾病中的血管發(fā)生。發(fā)明簡述本發(fā)明證明除了組織中的需要αvβ3的血管發(fā)生途徑，亦存在獨(dú)立的新的αvβ5依賴性途徑。因此，本發(fā)明描述了可以抑制血管發(fā)生的αvβ5抑制劑。本發(fā)明再描述了在促進(jìn)血管發(fā)生中的αvβ5介導(dǎo)的活性與生長因子受體酪氨酸激酶和蛋白激酶C(PKC)的生長因子(細(xì)胞因子)激活相關(guān)。以這種方式起作用的生長因子(細(xì)胞因子)包括血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、轉(zhuǎn)化生長因子-α(TGF-α)、表皮生長因子(EGF)等等。
本發(fā)明因此描述了在組織中抑制血管發(fā)生的方法，包含給予該組織包含血管發(fā)生抑制量的αvβ5拮抗劑的組合物。
欲處理的組織可以是需要抑制血管發(fā)生的任何組織，例如發(fā)生新血管形成的疾病組織。典型的組織包括正在進(jìn)行新血管形成的眼組織、炎癥組織、實(shí)體瘤、轉(zhuǎn)移瘤、進(jìn)行再狹窄的組織等等組織。在推薦實(shí)施方案中，與αvβ5表達(dá)相關(guān)的新血管形成是暴露給生長因子VEGF、TGF-α和EGF的結(jié)果。
特別優(yōu)選的是針對在諸如眼睛的組織中抑制VEGF誘導(dǎo)的血管形成的治療方法，在該組織中疾病時(shí)血管發(fā)生顯著，所述疾病包括糖尿病性視網(wǎng)膜病(亦稱為增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病)、年齡相關(guān)的黃斑變性、假定的眼組織胞漿菌病、未熟兒視網(wǎng)膜病、鐮形細(xì)胞視網(wǎng)膜病和新血管青光眼。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述治療方法針對抑制包括角膜移植、皰疹性角膜炎、梅毒性角膜炎、翼狀胬肉、與使用隱性眼鏡片相關(guān)的新血管角膜翳等等的角膜新血管疾病中發(fā)生的血管發(fā)生。
用于本發(fā)明方法的αvβ5拮抗劑可以結(jié)合αvβ5并競爭性地抑制αvβ5結(jié)合至天然玻連蛋白配體的能力。最好是，該拮抗劑對αvβ5展示出超過其它整聯(lián)蛋白的特異性。在特別推薦的實(shí)施方案中，該αvβ5拮抗劑抑制玻連蛋白或其它含有RGD的配體與αvβ5的結(jié)合，但是基本上不抑制玻連蛋白與αvβ3或αⅡbβ3的結(jié)合。優(yōu)選的αvβ5拮抗劑可以是融合多肽、線性或環(huán)狀多肽、衍生多肽、單克隆抗體或其功能片段、或亦稱為有機(jī)模擬物的αvβ5配體模擬物的有機(jī)分子，它們均特異性地與αvβ5相互作用。
本發(fā)明的αvβ5拮抗劑的給予包括眼內(nèi)、靜脈內(nèi)、經(jīng)皮、滑液內(nèi)、肌內(nèi)和口服給予。在其它推薦實(shí)施方案中，與控制腫瘤發(fā)生和癌癥轉(zhuǎn)移的化療制度協(xié)同給予。附圖簡述附圖構(gòu)成本說明書的一部分

圖1A-1D描述αv整聯(lián)蛋白抗體拮抗劑抑制細(xì)胞因子誘導(dǎo)的兔子角膜血管發(fā)生。在實(shí)施例4中描述了用或者bFGF或者VEGF處理誘導(dǎo)血管發(fā)生及其用αv整聯(lián)蛋白抗體拮抗劑P1F6(αvβ5)和LM609(αvβ3)處理的效果。OD和OS分別是實(shí)驗(yàn)兔子的右眼和左眼。大箭頭標(biāo)明具有水腫的角膜血管發(fā)生，而小箭頭指向正常結(jié)膜緣脈管。圖1A和1B顯示用bFGF誘導(dǎo)血管發(fā)生，而圖1C和1D顯示用VEGF誘導(dǎo)血管發(fā)生。圖1A和1C中的兔子角膜顯示用P1F6處理，而圖1B和1D顯示用LM609處理。
圖2A和2B是顯示分別用或者bFGF或者VEGF誘導(dǎo)并接著用或者P1F6或者LM609進(jìn)行單克隆抗體處理后的以mm2+/-標(biāo)準(zhǔn)差(兩個(gè)系列的每個(gè)均為n=8)表示的平均新血管面積的矩形圖。所述結(jié)果在實(shí)施例4中討論。
圖3A-3F以照片描述了抗整聯(lián)蛋白抗體處理對雞CAM制備物的效果。結(jié)果在實(shí)施例6A中描述。用或者bFGF或者VFGF誘導(dǎo)血管發(fā)生，接著靜脈內(nèi)給予做為對照的磷酸緩沖鹽水(PBS)或者具有描述于圖1的圖例中的P1F6或者LM609單克隆抗體的磷酸緩沖鹽水(PBS)。用bFGF處理的CAM示于圖3A、3C和3E，而用VEGF處理的CAM示于圖3B、3D和3F。接受靜脈內(nèi)注射PBS的對照CAM示于圖3A和3B。在圖3C和3D中使用P1F6抗體處理CAM，而在圖3E和3F中使用LM609抗體處理CAM。
圖4A和4B以矩形圖的格式提供示于圖3A-3F的結(jié)果的定量。相對于對照或抗體處理在Y軸上描繪血管發(fā)生指數(shù)。圖4A和4B分別顯示bFGF和VEGF誘導(dǎo)的血管發(fā)生。所述結(jié)果在實(shí)施例4中討論。
圖5A-5F以照片描述了如實(shí)施例6中描述的合成肽處理對雞CAM制備物的效果?；蛘哂胋FGF或者用VEGF誘導(dǎo)血管發(fā)生，接著靜脈內(nèi)給予做為對照的磷酸緩沖鹽水(PBS)或者具有合成環(huán)狀肽RGDfV(SEQID NO 4)或者RADfV(SEQ ID NO 5)的磷酸緩沖鹽水(PBS)。用bFGF處理的CAM示于圖5A、5C和5E，而用VEGF處理的CAM在圖5B、5D和5F中。接受靜脈內(nèi)注射PBS的對照CAM示于圖5A和5B中。在圖5C和5D中使用RDGfV肽處理CAM，而在圖5E和5F中使用RADfV肽處理CAM。
圖6A和6B以矩形圖的格式提供示于圖5A-5F的結(jié)果的定量。相對于對照或抗體處理在Y軸上描繪血管發(fā)生指數(shù)。圖6A和6B分別顯示bFGF和VEGF誘導(dǎo)的血管發(fā)生。所述結(jié)果在實(shí)施例6中討論。
圖7A-7E顯示抗整聯(lián)蛋白單克隆抗體和鈣感光蛋白(calphostin)C對由獨(dú)立的細(xì)胞因子bFGF、TNF-α、VEGF和TGF-α誘導(dǎo)的CAM血管發(fā)生的效果。亦評價(jià)了PMA。所述檢測和結(jié)果在實(shí)施例6中描述。以矩形圖格式描繪結(jié)果，在Y軸上畫血管發(fā)生指數(shù)，而在X軸上顯示各種對照或抑制劑。圖7A-7E分別顯示用bFGF、TNF-α、VEGF、TGF-α和PMA誘導(dǎo)的血管發(fā)生。
圖8是矩形圖，顯示抗體處理對雞胚CAM中CSl黑素瘤腫瘤生長的效果，按照實(shí)施例5C和6D中的描述進(jìn)行檢測。將以毫克(mg)表示的腫瘤重量在Y軸上對X軸上標(biāo)明的各種處理作圖。CSAT是對先前描述的整聯(lián)蛋白β1亞基特異性的對照抗體，先前描述了LM609和P1F6。
圖9是對照對比αvβ5肽拮抗劑、標(biāo)記肽189(SEQ ID NO 9)對黑素瘤腫瘤生長的效果的矩形圖，以mm3計(jì)的腫瘤體積描繪于Y軸上。該檢測和結(jié)果描述于實(shí)施例8中。
圖10描述如在實(shí)施例10A-G中描述的化合物7的合成。
圖11描述如在實(shí)施例10A-C、H-I中描述的化合物9的合成。
圖12描述如在實(shí)施例10J中描述的化合物10的合成。
圖13描述分別描述于實(shí)施例10K-L和10M-N中的化合物12和化合物14的合成。
圖14描述化合物15、化合物16、化合物17和化合物18的化學(xué)結(jié)構(gòu)。所述化合物的詳細(xì)合成描述于實(shí)施例10O-R。
圖15A和15B顯示雞MMP-2的連續(xù)cDNA序列以及顯示于第二行的推測氨基酸序列。第三和第四行分別顯示如實(shí)施例7中描述的人和小鼠MMP-2的推測氨基酸序列。該雞cDNA序列列于SEQ ID NO 23中，以及編碼氨基酸序列亦做為SEQ ID NO 24單獨(dú)展示。示于圖15A中做為負(fù)數(shù)的5’非翻譯區(qū)和編碼酶原的區(qū)的第一個(gè)核苷酸的編號實(shí)際在序列表中代表編號1，使得后者看起來比該圖長；但是，除了編號之外，該核苷酸序列在長度和序列上與展示于序列表中的序列是相同的。因此，有關(guān)本說明書中雞或人MMP-2核苷酸位置的參考(例如用于擴(kuò)增人MMP-2片段的引物中)是基于圖中標(biāo)明的核苷酸位置，而不是列于序列表中的核苷酸位置。
圖16顯示具有631個(gè)殘基的成熟人MMP-2蛋白的氨基酸殘基序列。人MMP-2源片段的氨基酸殘基位置對應(yīng)于該圖中的位置。該氨基酸殘基序列列于SEQ ID NO 25。
圖17顯示肽85189和惰性鹽對應(yīng)物121974對CAM模型中VEGF誘導(dǎo)的血管發(fā)生的影響，在實(shí)施例6A中進(jìn)一步描述。將該效果與未處理(標(biāo)為NT)和對照(標(biāo)記為69601)肽處理的制備物比較。通過如實(shí)施例6A中的進(jìn)一步描述計(jì)算分枝點(diǎn)的數(shù)量，測定對血管發(fā)生的影響。
圖18、19和20分別顯示如實(shí)施例6D中進(jìn)一步描述的、在靜脈內(nèi)暴露給對照肽69601和拮抗劑85189后UCLAP-3、M21-L和FgM腫瘤的腫瘤重量的減少。以腫瘤重量在Y軸對X軸上的肽處理用數(shù)據(jù)作圖。
圖21描述肽和抗體對如實(shí)施例8中進(jìn)一步描述的嵌合小鼠人模型中黑素瘤腫瘤生長的影響。評價(jià)的肽包括對照69601(標(biāo)記為601)和拮抗劑85189(標(biāo)記為189)。測試的抗體是LM609。以mm3計(jì)的腫瘤體積于Y軸上對在X軸上的各種處理作圖。
圖22A和圖22B分別顯示與對照肽69601(標(biāo)記為601)相比、劑量范圍為10、50和250μg/注射的拮抗劑85189(標(biāo)記為189)降低M21L腫瘤體積和濕重的效果，如實(shí)施例8中所述。
圖23A和23B顯示拮抗劑肽85189(在虛線和實(shí)心圓圈上標(biāo)記為189)對比對照肽69601(在虛線和空心方塊上標(biāo)記為601)、以二種不同處理制度在小鼠人類模型中抑制M21 L中瘤體積的效力，在實(shí)施例8中進(jìn)一步描述。以mm3計(jì)的腫瘤體積于Y軸上對在X軸上的天數(shù)作圖。發(fā)明詳述A．定義氨基酸殘基在其肽鍵處化學(xué)消化(水解)多肽形成的氨基酸。本文描述的氨基酸殘基最好是“L”異構(gòu)型。但是，可以用“D”異構(gòu)型的殘基置換任何L氨基酸殘基，只要該多肽保持目的功能性質(zhì)。NH2指多肽氨基末端的游離氨基。COOH指多肽羧基末端的游離羧基。與標(biāo)準(zhǔn)多肽命名法(描述于J.Biol.Chem.,243:3552-59(1969)并于37 CFR§1.822(b)2)采用)保持一致，在以下對應(yīng)表中顯示氨基酸殘基的縮寫對應(yīng)表符號 氨基酸單字母 三字母Y Tyr酪氨酸G Gly甘氨酸
FPhe苯丙氨酸MMet甲硫氨酸AAla丙氨酸SSer絲氨酸IIle異亮氨酸LLeu亮氨酸TThr蘇氨酸VVal纈氨酸PPro脯氨酸KLys賴氨酸HHis組氨酸QGln谷氨酰胺EGlu谷氨酸ZGlxGlu和/或GlnWTrp色氨酸RArg精氨酸DAsp天冬氨酸NAsn天冬酰胺BAsxAsn和/或AspCCys半胱氨酸XXaa未知或其它另外，以下具有以下含義BOC叔丁酯基DCCI 二環(huán)己基碳二亞胺DMF二甲基甲酰胺OMe甲氧基HOBt 1-羥基苯并三唑(1-hydroxybezotriazole)
應(yīng)注意，本文按慣用法表示所有氨基酸殘基序列，其左右定向是常規(guī)的氨基末端至羧基末端方向。再者，應(yīng)注意氨基酸殘基序列的開始或結(jié)束處的破折號表明與一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的再一序列的肽鍵。
多肽通過相鄰氨基酸殘基的氨基和羧基之間的肽鍵相互連接的氨基酸殘基的線性序列。
肽以多肽中方式相互連接的不超過50個(gè)氨基酸殘基的線性序列。
環(huán)狀肽指具有包含如典型肽中的幾個(gè)酰胺鍵的雜原子環(huán)的化合物。該環(huán)狀肽可以是“首尾相連”環(huán)化線性肽，其中線性肽的n-末端與該線性肽的末端羧酸鹽形成酰胺鍵，或者其可以含有其中該聚合物為homodetic ore heterodetic并包含酰胺鍵和/或其它鍵(例如二硫橋、硫酯、硫代酰胺、胍基等等鍵)以閉合該環(huán)的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。
蛋白以多肽中方式相互連接的超過50個(gè)氨基酸殘基的線性序列。
融合蛋白指含有通過典型的肽鍵可操作地連接(“融合”)的至少兩個(gè)不同的多肽域的多肽，這兩個(gè)域?qū)?yīng)于自然中未發(fā)現(xiàn)融合的肽。
合成肽通過肽鍵連接的化學(xué)產(chǎn)生的氨基酸殘基鏈，不含有天然存在的蛋白和其片段。
B．一般考慮本發(fā)明總的涉及血管發(fā)生由特異性玻連蛋白受體αvβ5介導(dǎo)以及抑制αvβ5功能抑制血管發(fā)生的發(fā)現(xiàn)。本發(fā)現(xiàn)由于血管發(fā)生在各種疾病過程中的作用而是重要的。通過抑制血管發(fā)生，可以干預(yù)疾病、減輕癥狀、并在一些病例中治愈疾病。當(dāng)新血管生長是與疾病相關(guān)的病理學(xué)起因或?qū)ζ洳±韺W(xué)起作用時(shí)，抑制血管發(fā)生將減輕該疾病的有害效應(yīng)。實(shí)例包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病性視網(wǎng)膜病、炎癥性疾病、再狹窄等等。當(dāng)需要新血管生長支持有害組織生長時(shí)，抑制血管發(fā)生將降低對該組織的血液供應(yīng)，并由此對降低基于血液供應(yīng)需要的組織質(zhì)量起作用。實(shí)例包括對局部缺血應(yīng)答的新血管生長、導(dǎo)致生長因子誘導(dǎo)的血管發(fā)生、持續(xù)需要新血管形成以使腫瘤生長超過幾毫米厚的腫瘤生長、以及建立實(shí)體瘤轉(zhuǎn)移瘤。
本發(fā)明的方法是有效，部分是因?yàn)樵撝委煼▽ρ馨l(fā)生有高度選擇，并對其它生物學(xué)過程無高度選擇。如實(shí)施例中所示，僅新脈管的生長含有大量的αvβ5，因此所述治療方法不會不利地影響成熟脈管。
僅抑制αvβ5即有效地抑制血管發(fā)生的發(fā)現(xiàn)允許研制具有潛在高度特異性、并因此具有相對低毒性的治療組合物。雖然本發(fā)明公開了使用具有抑制一種或多種整聯(lián)蛋白能力的基于肽的試劑，但人們也可以設(shè)計(jì)更選擇性地抑制αvβ5的其它試劑。因此，某些基于肽的試劑不具有抑制除由αvβ5介導(dǎo)之外的其它生物學(xué)過程的副作用。
例如，如本內(nèi)容所示，可以制備對與αvβ5而不是αvβ1、αvβ3或αⅡbβ3免疫反應(yīng)高度選擇性的單克隆抗體，其對抑制αvβ5功能具相似選擇性。另外，可以設(shè)計(jì)對抑制αvβ5具選擇性的含RGD肽，如本文進(jìn)一步描述的。
在本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)之前，不知道可以通過使用拮抗αvβ5生物學(xué)功能的試劑體內(nèi)抑制血管發(fā)生以及任何依賴血管發(fā)生的過程。
C．抑制血管發(fā)生的方法本發(fā)明提供在組織中抑制血管發(fā)生并由此抑制組織中依賴血管發(fā)生的事件的方法。一般而言，該方法包含給予組織包含血管發(fā)生抑制量的αvβ5拮抗劑的組合物。
用于實(shí)踐本發(fā)明方法的靶組織定義為含αvβ5組織，其特征在于可檢測的αvβ5整聯(lián)蛋白受體的存在。換言之，通過在細(xì)胞膜中存在αvβ5受體復(fù)合物定義含αvβ5組織。這種組織包括上皮和間充質(zhì)源細(xì)胞?？梢酝ㄟ^一些方法檢測該受體的存在，這些方法包括該受體與抗αvβ5整聯(lián)蛋白受體抗體的免疫反應(yīng)性，其中通過顯微鏡、免疫沉淀、配體結(jié)合檢測中的競爭等等技術(shù)檢測組織中的該免疫反應(yīng)。以下和在實(shí)施例1中描述優(yōu)選用于檢測組織中αvβ5存在的抗體。例如，在實(shí)施例2中借助免疫熒光顯微術(shù)描述了αvβ5在腎臟、皮膚和眼組織中的分布。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，亦將含αvβ5組織定義為具有血管發(fā)生標(biāo)記的組織。如先前所述，血管發(fā)生包括種種涉及組織新血管形成的過程，該過程包括“出芽”、血管發(fā)生或脈管變大，所有的血管發(fā)生過程都由αvβ5表達(dá)介導(dǎo)并依賴于αvβ5表達(dá)。除了創(chuàng)傷傷口愈合、黃體形成和胚胎發(fā)生，據(jù)信大多數(shù)血管發(fā)生過程與疾病過程相關(guān)，因此本治療法的應(yīng)用對疾病有選擇性且沒有有害副作用。
有各種據(jù)信其中血管發(fā)生是重要的疾病，稱為生血管性疾病，這種疾病包括但不限于諸如免疫和非免疫性炎癥、慢性關(guān)節(jié)風(fēng)濕病和牛皮癬的炎癥性疾病、諸如再狹窄、動(dòng)脈粥樣硬化斑和骨質(zhì)疏松中的毛細(xì)管增生的與脈管不適當(dāng)或不合適侵入相關(guān)的疾病、和諸如實(shí)體瘤、實(shí)體瘤轉(zhuǎn)移瘤、血管纖維瘤、晶狀體后纖維形成、血管瘤、卡波西肉瘤和需要新血管形成以支持腫瘤生長的類似癌癥相關(guān)的疾病。
特征為新血管形成的眼病提供了特別優(yōu)選的治療目標(biāo)。眼部新血管形成是在導(dǎo)致災(zāi)難性視力喪失的絕大多數(shù)眼病中觀察到的最常見的病理變化。從預(yù)先存在的脈絡(luò)膜、視網(wǎng)膜或parlimbal脈管的新血管生長可以引起導(dǎo)致破壞眼睛正常解剖學(xué)關(guān)系和同時(shí)喪失正常視覺功能的水腫、出血或維管膜形成。
特征為血管發(fā)生的眼病包括角膜新血管疾病，它們包括角膜移植、皰疹性角膜炎、梅毒性角膜炎、翼狀胬肉、與使用隱性眼鏡片相關(guān)的新血管角膜翳等等。其它的眼病亦包括糖尿病性視網(wǎng)膜病(DR)、年齡相關(guān)的黃斑變性(ARMD)、假定的眼組織胞漿菌病(POHS)、未熟兒視網(wǎng)膜病(ROP)和新血管性青光眼等等。雖然抑制這些疾病中的血管發(fā)生不一定治愈根本的疾病，但它會顯著地降低與這些疾病相關(guān)的視覺發(fā)病率。
例如，患有糖尿病超過25年的300,000人的90％會有某種形式的DR,DR是特征為滲漏和/或增生的血管的視網(wǎng)膜疾病。這些患者的30％事實(shí)上將有可以用本發(fā)明的治療法減輕的后一種病癥。對于ARDM，超過65歲的人群中的25％，即約630,000人，將會有該疾病的某種形式，預(yù)期到2030年，超過630萬人將有ARDM。因此，擁有使用本發(fā)明的治療組合物和方法抑制αvβ5相關(guān)血管發(fā)生的能力具有重大醫(yī)學(xué)價(jià)值。
因此，抑制疾病組織中血管發(fā)生的方法減輕該疾病的癥狀，并根據(jù)疾病可以對治愈該疾病起作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明考慮在組織中抑制血管發(fā)生本身。可以通過諸如在通過免疫組織化學(xué)檢測免疫αvβ5免疫陽性新生和未成熟脈管結(jié)構(gòu)的實(shí)施例中描述的各種方法，評價(jià)組織中血管發(fā)生的程度和由此本發(fā)明方法達(dá)到的抑制程度。
如本文所述，任何的各種組織或由器官化組織組成的器官都可以支持在疾病狀態(tài)下的血管發(fā)生，它們包括皮膚、肌肉、腸、結(jié)締組織、關(guān)節(jié)、骨骼和在有生成血管刺激物時(shí)血管可以入侵的類似組織。
具體而言，本發(fā)明的方法和αvβ5拮抗劑組合物可以治療性地用于抑制由生長因子(亦稱為細(xì)胞因子)誘導(dǎo)的血管發(fā)生。在生理?xiàng)l件下，血管發(fā)生受高度調(diào)節(jié)，并如Brook等，Science,264:569-5761(1994)先前發(fā)表的，已顯示被諸如堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)的特定生血管分子激活。亦已描述了血管發(fā)生的負(fù)調(diào)節(jié)劑。因此，血管發(fā)生由局部刺激劑和抑制劑的精細(xì)平衡所調(diào)節(jié)。參見，D’Amore,InvestigativeOphthal.Visual Sci.,35:3974-3979(1994)。
當(dāng)嚴(yán)格控制正常非活動(dòng)毛細(xì)血管的生血管刺激劑和抑制劑的生理平衡被擾亂時(shí)，例如在某些疾病狀態(tài)發(fā)生的，毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞受誘導(dǎo)增生、遷移并最終分化形成新血管。
如Leibovich，“細(xì)胞因子在腫瘤血管發(fā)生過程中的作用”，載于“Human Ctokines:Their Role in Disease and THerapy”，編輯Aggarwal和Puri，第35章，Blackwell Science,Inc.(1995)綜述，血管發(fā)生的特征為具有一套早期事件后續(xù)一套晚期事件的事件級聯(lián)。早期事件之前是傳遞從血管外源傳送的生血管生長因子和細(xì)胞因子。然后在靶微血管系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行早期事件，伴隨著破壞胞間連接點(diǎn)、誘導(dǎo)表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞激活抗原和蛋白水解表現(xiàn)型、以及內(nèi)皮細(xì)胞定向方式遷移的起始。晚期事件的特征為在發(fā)育的毛細(xì)管芽的細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、周皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞內(nèi)生長因子和細(xì)胞因子基因的自分泌表達(dá)和旁分泌表達(dá)。這些細(xì)胞依次調(diào)節(jié)細(xì)胞與胞外基質(zhì)的相互作用，導(dǎo)致從現(xiàn)存成熟脈管形成新功能性毛細(xì)管環(huán)。
如此處和發(fā)明背景中所討論的，文獻(xiàn)中的報(bào)道描述了一種在生長因子(包括那些與增加αvβ5表達(dá)相關(guān)的生長因子，即VEGF、TGF-α和EGF)的出現(xiàn)與腫瘤質(zhì)量擴(kuò)增之間以及在人類和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的增生性新血管疾病中血管發(fā)生的開始中的聯(lián)系。
因此，在許多其它生長因子中，VEGF、EGF、TGF-α是特征為其刺激細(xì)胞生長的性質(zhì)的受考慮的生長因子。生長因子是由作用于分泌細(xì)胞或另一細(xì)胞的一種細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)。它們作用的能力取決于通常為跨膜蛋白的生長因子受體的存在。諸如VEGF的生長因子亦一般稱為細(xì)胞因子，其被定義為由細(xì)胞分泌的、影響同一(自分泌)或另一(旁分泌)細(xì)胞的生長和代謝的多肽激素。術(shù)語細(xì)胞因子不限于由免疫系統(tǒng)細(xì)胞產(chǎn)生的分子和同一系統(tǒng)的生物學(xué)應(yīng)答修飾物。因此，術(shù)語細(xì)胞因子是一廣泛的類別，其基于一個(gè)類型的生物學(xué)應(yīng)答的一個(gè)亞類型是諸如VEGF、bFGF、EGF、TGF-α等等的刺激性生長因子或增強(qiáng)子。有關(guān)綜述參見，Aggarwal等，“細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體的常見和非常見特征綜述”，載于“Human Ctokines:Their Role in Disease and THerapy”，編輯Aggarwal和Puri，第1章，Blackwell Science,Inc.(1995)。
在本發(fā)明中，考慮αvβ5特異性拮抗劑和諸如抗VEGF抗體的非生長因子拮抗劑用于抑制組織中的血管發(fā)生。在推薦實(shí)施方案中，本文描述的αvβ5拮抗劑用于抑制其中αvβ5整聯(lián)蛋白受體表達(dá)被誘導(dǎo)的生長因子誘導(dǎo)的血管發(fā)生。在此方面優(yōu)選的生長因子包括VEGF、EGF、TGF-α等等。
如在發(fā)明背景中討論的，已知生長因子EGF和VEGF與其做為酪氨酸激酶起作用的細(xì)胞受體結(jié)合。另外顯示該EGF受體的激活與導(dǎo)致激活αvβ5以使特定細(xì)胞子在玻連蛋白基底上遷移的蛋白激酶C的激活相對應(yīng)。因此，暴露給細(xì)胞因子或生長因子與整聯(lián)蛋白表達(dá)或激活中的協(xié)同應(yīng)答之間的作用機(jī)制是一復(fù)雜的生物學(xué)過程。如本發(fā)明所示(參見實(shí)施例6A)，用細(xì)胞因子VEGF在或者兔眼模型或雞絨毛膜尿囊模型中處理組織，導(dǎo)致依賴于蛋白激酶C激活的αvβ5增強(qiáng)的血管發(fā)生。
在一個(gè)特別推薦的實(shí)施方案中，本發(fā)明考慮使用αvβ5拮抗劑抑制其中血管發(fā)生由VEGF誘導(dǎo)的任何組織中的血管發(fā)生。例如，已顯示在各種動(dòng)物模型中的視網(wǎng)膜局部缺血導(dǎo)致從苗勒細(xì)胞分泌的VEGF向上調(diào)節(jié)，VEGF的產(chǎn)生必然誘導(dǎo)眼內(nèi)組織的新血管形成。參見，Miller等，Am.J.Path.,145:574-584(1994)和Pierce等，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA、92:905-909(1995)。
因此，在本發(fā)明中，欲處理的組織是患有糖尿病性視網(wǎng)膜病、黃斑變性、新血管性青光眼或以上討論的等等疾病的患者的視網(wǎng)膜組織，而欲抑制的血管發(fā)生是其中有視網(wǎng)膜組織新血管形成的視網(wǎng)膜組織血管發(fā)生。以上和在實(shí)施例中討論了來自患有眼新血管形成病癥或疾病病人的典型組織，包括角膜組織。評價(jià)本發(fā)明的αvβ5拮抗劑治療視網(wǎng)膜血管發(fā)生效果的典型模型系統(tǒng)，是在實(shí)施例9中描述的視網(wǎng)膜新血管形成的鼠模型。
在另一相關(guān)實(shí)施方案中，欲處理的組織是炎癥組織，并且欲抑制的血管發(fā)生是有炎癥組織新血管形成的炎癥組織新血管形成。在這一類中，該方法考慮了在諸如患有慢性關(guān)節(jié)風(fēng)濕病的關(guān)節(jié)炎組織中、在免疫或非免疫性炎癥組織中、在牛皮癬組織等等之中抑制血管發(fā)生。
根據(jù)在內(nèi)皮細(xì)胞上粘連分子表達(dá)的誘導(dǎo)和酶的釋放，認(rèn)為細(xì)胞因子白介素1和腫瘤壞死因子-α與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)，在關(guān)節(jié)損傷中起直接作用。參見，Arend等，Arthritis & Rheumatism,38:151-160(1995)。已提出用細(xì)胞因子特異性抑制劑阻斷這兩種細(xì)胞因子以及導(dǎo)向在該病癥中表達(dá)的細(xì)胞粘連分子的治療制度。參見，Haskard等，Cell AdhesionComm.,2:235-238(1994)。
因此，通過使該治療法針對(address)并導(dǎo)向該αvβ5粘連分子的涉及的事物而抑制關(guān)節(jié)炎病癥中的血管發(fā)生，是在本發(fā)明之前的發(fā)明的另一推薦實(shí)施方案。
在另一相關(guān)實(shí)施方案中，欲處理的組織是患有實(shí)體瘤、轉(zhuǎn)移瘤、皮膚癌、乳腺癌、血管瘤或血管纖維瘤等等癌癥的患者的腫瘤組織，并且欲抑制的血管發(fā)生是有腫瘤組織新血管形成的腫瘤組織血管發(fā)生?？梢酝ㄟ^本方法治療的典型的實(shí)體瘤組織包括肺、胰臟、乳腺、結(jié)腸、喉、卵巢等等組織。
在人類實(shí)體瘤中存在的復(fù)雜細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的作用是Leek等，J.Leukocyte Biol.,56:423-435(1994)綜述的主題，其內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。據(jù)認(rèn)為一些細(xì)胞因子包括VEGF、酸性和堿性FGF(bFGF)、TGF-α和TGF-β、EGF、TNF-α、血小板源內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、血管生成素、干擾素α和γ、白介素1、6和8等等影響惡性組織和細(xì)胞系中血管發(fā)生的各種細(xì)胞機(jī)制。例如，除了VEGF在各種腫瘤定位之外，近來顯示VEGF與乳腺癌中的血管發(fā)生有關(guān)，如Brown等Human Path.,26:86-91(1995)所述。
通過用抗細(xì)胞因子抗體篩選腫瘤組織樣品，可以鑒別分泌各種細(xì)胞因子并因此誘導(dǎo)應(yīng)答中的局部血管發(fā)生的腫瘤，特別是在本發(fā)明中具有細(xì)胞因子VEGF、TGF-α和EGF以及產(chǎn)生的αvβ5介導(dǎo)的血管發(fā)生的腫瘤。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員對于這種方法用于或者培養(yǎng)的或者活檢腫瘤組織樣品是熟悉的?？股鲜黾?xì)胞因子的抗體可以通過OncogeneSciences(Uniondale,NY)或Upstate Biotech Incorporated(Lake Placid,NY)購得。因此通過這些方法篩選選擇的腫瘤組織，使得人們可以評價(jià)用本發(fā)明αvβ5拮抗劑的血管發(fā)生抑制性活性的潛力。
在實(shí)施例中描述了典型的腫瘤組織血管發(fā)生及其抑制。
由于新血管形成在腫瘤生長中的重要作用，抑制腫瘤組織血管發(fā)生是本發(fā)明的再一推薦實(shí)施方案。缺乏腫瘤組織新血管形成時(shí)，該腫瘤組織不會得到需要的營養(yǎng)、生長緩慢、停止額外的生長、退化并最終變?yōu)閴乃缹?dǎo)致殺死該腫瘤。
換言之，本發(fā)明提供通過按照本方法抑制腫瘤血管發(fā)生而抑制腫瘤新血管形成的方法。類似地，本發(fā)明提供通過實(shí)踐所述血管發(fā)生抑制方法而抑制腫瘤生長的方法。
所述方法亦對轉(zhuǎn)移瘤形成特別有效，因?yàn)?1)它們的形成需要原發(fā)性腫瘤的血管形成，以使轉(zhuǎn)移性癌癥細(xì)胞可以逸出該原發(fā)性腫瘤，和(2)它們在第二位點(diǎn)的建立需要新血管形成以支持該轉(zhuǎn)移瘤的生長。在相關(guān)實(shí)施方案中，本發(fā)明考慮與其它諸如針對實(shí)體瘤和用于控制轉(zhuǎn)移瘤建立的常規(guī)化療的治療法聯(lián)合實(shí)踐該方法。血管發(fā)生抑制劑的給予通常在化療期間或之后進(jìn)行，盡管最好在化療制度后，在該腫瘤組織通過誘導(dǎo)血管發(fā)生以通過對該腫瘤組織提供血液供應(yīng)和營養(yǎng)而恢復(fù)而對該毒性攻擊應(yīng)答時(shí)抑制血管發(fā)生。另外，最好在切除實(shí)體瘤的手術(shù)后給予該血管發(fā)生抑制方法，做為對抗轉(zhuǎn)移瘤的預(yù)防。
在本方法用于抑制腫瘤新血管形成的范圍內(nèi)，該方法亦可以用于抑制腫瘤組織生長、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移瘤形成以及使已建立的腫瘤退化。對于后者，如對用于本發(fā)明中所述的或在兔眼檢測模型中或用嵌合小鼠人模型的模型系統(tǒng)評價(jià)腫瘤質(zhì)量的減小，在該小鼠人模型系統(tǒng)中將患有嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)的小鼠的皮膚用人新生兒包皮取代，如Yan等，J.Clin.Invest.,91:986-996(1993)所述，其公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。后一模型提供了研究血管發(fā)生和用本發(fā)明的方法抑制其的另一體內(nèi)模型。在實(shí)施例5C和6D中提出了使用該兔腫瘤模型和本發(fā)明的αvβ5拮抗劑的典型結(jié)果，在實(shí)施例8中描述了在SCD小鼠模型中抑制血管發(fā)生的結(jié)果。
再狹窄是阻礙血管成形術(shù)成功的、在經(jīng)皮經(jīng)腔冠狀血管成形術(shù)位點(diǎn)平滑肌細(xì)胞(SMC)遷移和增殖的過程。可以將再狹窄過程中的SMC遷移和增殖考慮為由本方法抑制的血管發(fā)生過程。因此，本發(fā)明亦考慮通過按照本方法于血管成形術(shù)之后在患者中抑制血管發(fā)生，抑制再狹窄。為抑制再狹窄，通常將αvβ5拮抗劑于血管成形術(shù)程序后給予約2至約28天，更通常是在該程序后的約頭14天給予。
在本發(fā)明的許多實(shí)施方案中，治療的患者最好是人類患者，盡管應(yīng)理解本發(fā)明的原理表明本發(fā)明對所有的哺乳動(dòng)物均有效，所有的哺乳動(dòng)物都包括于術(shù)語“患者”中。在此范圍內(nèi)，將哺乳動(dòng)物理解為包括尋求按照本發(fā)明的方法治療疾病的任何哺乳動(dòng)物物種，特別是農(nóng)業(yè)和家養(yǎng)哺乳動(dòng)物物種。
抑制組織中血管發(fā)生的本方法以及因此也實(shí)踐治療血管發(fā)生相關(guān)疾病的方法，包括用包含治療有效量的可以抑制αvβ5與其天然配體結(jié)合的αvβ5拮抗劑的組合物接觸其中發(fā)生或有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生血管發(fā)生的組織。因此，該方法包含給予患者治療有效量的含有本發(fā)明的αvβ5拮抗劑的生理上可耐受的組合物。
給予該αvβ5拮抗劑的劑量范圍取決于該拮抗劑的形式及其效力，如本文進(jìn)一步描述的，該劑量范圍的量大到足以產(chǎn)生其中血管發(fā)生和由血管發(fā)生介導(dǎo)的疾病癥狀被減輕所需的效果。該劑量不應(yīng)大至引起不良副作用，例如高粘滯性綜合癥、肺水腫、充血性心力衰竭等等。一般而言，該劑量根據(jù)病人的年齡、病癥、性別和疾病程度變化，并可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。亦可以由醫(yī)生在有任何并發(fā)癥時(shí)調(diào)整該劑量。
αvβ5拮抗劑是通過抑制該受體與其配體即玻連蛋白的結(jié)合活性阻斷或抑制αvβ5的生理或藥理活性的分子。優(yōu)選的αvβ5拮抗劑可以或者是單克隆抗體、肽或者是αvβ5配體模擬物的有機(jī)基分子。
治療有效量是足以在被處理的組織中產(chǎn)生可測量的血管發(fā)生抑制的αvβ5拮抗劑量，即血管發(fā)生抑制量?？梢匀绫疚乃?，通過免疫組織化學(xué)或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法原位測定血管發(fā)生的抑制。
就αvβ5拮抗劑可以采取αvβ5配體有機(jī)模擬物、含RGD肽、抗αvβ5單克隆抗體或其片段、或αvβ5受體模擬物的形式所及的范圍內(nèi)，應(yīng)理解其效力和因此的“治療有效”量的表達(dá)可以變化。但是，如本檢測方法所示，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地評價(jià)本發(fā)明的候選αvβ5拮抗劑的效力。
可以通過包括在CAM檢測中、在體內(nèi)兔眼檢測中抑制血管發(fā)生和通過天然配體與αvβ5結(jié)合的抑制等在本文中描述的以及諸如此類的檢測的各種方法測定αvβ5拮抗劑的效力。
優(yōu)選的αvβ5拮抗劑具有在拮抗劑濃度低于0.5微摩爾濃度(μM)、優(yōu)選地低于0.1μM、更優(yōu)選地低于0.05μM時(shí)，大體上抑制諸如玻連蛋白的天然配體與αvβ5在溶液中結(jié)合的能力?！按篌w上”指在存在該αvβ5拮抗劑時(shí)，觀察到通過抑制使玻連蛋白的結(jié)合減少至少50％，本文將50％抑制稱為IC50值。
更優(yōu)選的αvβ5拮抗劑表現(xiàn)出對αvβ5超出其它整聯(lián)蛋白的選擇性。因此，優(yōu)選的αvβ5拮抗劑大體上抑制玻連蛋白與αvβ5結(jié)合，但大體上不抑制玻連蛋白與諸如αvβⅠ、αvβ3或αⅡbβ3的另一整聯(lián)蛋白的結(jié)合。特別優(yōu)選的是與抑制玻連蛋白與另一整聯(lián)蛋白結(jié)合時(shí)的IC50活性相比，在抑制玻連蛋白與αvβ5結(jié)合時(shí)表現(xiàn)出IC50活性低10倍至100倍的αvβ5拮抗劑。在實(shí)施例中描述了測定抑制玻連蛋白與整聯(lián)蛋白結(jié)合的IC50活性的典型檢測。
單克隆抗體形式的本發(fā)明αvβ5拮抗劑治療有效量的量，通常使得當(dāng)以生理上可耐受組合物給予時(shí)足以達(dá)到的血漿濃度為從約0.01微克(μg)/毫升(ml)至約100μg/ml，優(yōu)選從約1μg/ml至約5μg/ml，通常為約5μg/ml。換言之，該劑量可以變化，從約0.1mg/kg至約300mg/kg，優(yōu)選從約0.2mg/kg至約200mg/kg，更優(yōu)選從約0.5mg/kg至約20mg/kg，每天給予一個(gè)或多個(gè)劑量，給予一天或幾天。
當(dāng)該拮抗劑采取單克隆抗體的片段形式時(shí)，可以根據(jù)相對于完整抗體質(zhì)量的該片段的質(zhì)量容易地調(diào)整該量。推薦的血漿摩爾濃度是從約2微摩爾濃度(μM)至約5毫摩爾濃度(mM)，優(yōu)選地為約100μM至1mM抗體拮抗劑。
多肽或其它類似大小的小分子αvβ5配體模擬物形式的本發(fā)明αvβ5拮抗劑，其治療有效量的多肽量通常使得當(dāng)以生理上可耐受組合物給予時(shí)足以達(dá)到的血漿濃度為從約0.1微克(μg)/毫升(ml)至約200μg/ml、優(yōu)選從約1μg/ml至約150μg/ml?；谫|(zhì)量為每摩爾約500克的多肽，優(yōu)選的血漿摩爾濃度是從約2微摩爾濃度(μM)至約5毫摩爾濃度(mM)，優(yōu)選地為約100μM至1mM多肽拮抗劑。換言之，按照體重的劑量可以變化，從約0.1mg/kg至約300mg/kg，優(yōu)選從約0.2mg/kg至約200mg/kg，每天給予一個(gè)或多個(gè)劑量，給予一天或幾天。
本發(fā)明的單克隆抗體、多肽或有機(jī)模擬物可以通過注射或通過長時(shí)間(over time)逐漸輸注非腸道地給予。盡管欲處理的組織通?？梢酝ㄟ^系統(tǒng)給予在體內(nèi)被接觸，并因此最常通過靜脈內(nèi)給予治療組合物治療，但考慮了當(dāng)有可能該被導(dǎo)向的組織含有靶分子的其它組織和傳遞方法。因此，本發(fā)明的單克隆抗體、多肽或有機(jī)模擬物可以眼內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腔內(nèi)、透皮給予，亦可以通過蠕動(dòng)(peristaltic)方法傳遞。
含有本發(fā)明的αvβ5拮抗劑的治療組合物常規(guī)靜脈內(nèi)給予，例如通過注射一個(gè)單位劑量。術(shù)語“單位劑量”當(dāng)關(guān)系到本發(fā)明的治療組合物使用時(shí)，指適于做為受治療者單位劑量的物理上獨(dú)立的單位，每單位含有預(yù)定量的計(jì)算用以產(chǎn)生目的治療效果的、與所需稀釋劑(即溶媒)或載體聯(lián)用的活性物質(zhì)。
在示于實(shí)施例中的一個(gè)推薦實(shí)施方案中，以單劑量靜脈內(nèi)給予該αvβ5拮抗劑。
以與劑量制劑相匹配的方式和治療有效量給予所述組合物。給予的量和給予的時(shí)間取決于欲治療的受治療者、受治療者的系統(tǒng)利用該活性成分的能力、和目的治療效果的程度。所需給予的活性成分的精確量取決于醫(yī)生的判斷，并對每個(gè)人都是特別的。不過，本文公開了系統(tǒng)應(yīng)用的合適劑量范圍并取決于給藥途徑。給藥的適當(dāng)制度亦可變化，但通常為首次給予后，通過后續(xù)注射或其它給予以1小時(shí)或幾個(gè)小時(shí)的間隔給予重復(fù)劑量。或者，考慮了足以保持體內(nèi)治療法規(guī)定的血液濃度范圍的連續(xù)靜脈內(nèi)輸注。
D.治療組合物本發(fā)明考慮了用于實(shí)踐本文描述的治療方法的治療組合物。本發(fā)明的治療組合物含有生理上可耐受的載體以及本文描述的、溶解于或分散于該載體中做為活性成分的αvβ5拮抗劑。在推薦實(shí)施方案中，當(dāng)給予哺乳動(dòng)物或人類患者用于治療目的時(shí)，該治療性αvβ5拮抗劑組合物不具免疫原性。
本文使用的術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”、“生理上可耐受的”以及其語法變化，當(dāng)其指組合物、載體、稀釋劑和試劑時(shí)可以互換使用，并表示所述物質(zhì)可以給予哺乳動(dòng)物，或給予時(shí)不會產(chǎn)生不良的生理效果，例如惡心、頭暈、胃不適等等。
含有溶解于或分散于其中的活性成分的藥用組合物的制備是本領(lǐng)域非常清楚的，并且不需要基于配方而限制。通常這種組合物做為或者液體溶液或者懸浮液的注射劑制備，但是，亦可以制備適于在使用前在液體中的溶液或懸浮液的固體形式。該制劑亦可以乳化。
該活性成分可以與藥學(xué)上可接受的和與該活性成分匹配的賦形劑混合，并且其量適于在本文描述的治療方法中使用。合適的賦形劑是例如水、鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇或諸如此類的及其組合。另外，如果需要，該組合物可以含有少量增強(qiáng)該活性成分效力的輔助物質(zhì)，例如潤濕劑或乳化劑、pH緩中劑等等。
本發(fā)明的治療組合物可以包括其中組分的藥學(xué)上可接受的鹽。藥學(xué)上可接受的鹽包括與例如鹽酸或磷酸無機(jī)酸或諸如乙酸、酒石酸、苯乙醇酸等等的有機(jī)酸形成的酸加成鹽(與多肽的游離氨基形成的)。亦可以從無機(jī)堿例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵以及有機(jī)堿例如異丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等等衍生與游離羧基形成的鹽。
當(dāng)用于制備環(huán)狀多肽αvβ5拮抗劑時(shí)，特別推薦鹽酸鹽。
生理上可耐受的載體是本領(lǐng)域眾所周知的。典型的液體載體是除了該活性成分和水之外不含任何物質(zhì)的、或含有緩沖液的無菌水溶液，諸如含有生理pH值下的磷酸鈉、生理鹽水或含有這兩者的無菌水溶液，諸如磷酸緩沖鹽水。而且，水性載體可以含有超過一種緩沖鹽以及諸如氯化鈉和氯化鉀的鹽、葡萄糖、聚乙二醇和其它溶質(zhì)。
液體組合物亦可以含有除水外的液相和不包含水的液相。這種其它液相的典型是甘油、諸如棉籽油的植物油和水-油乳液。
治療組合物含有血管發(fā)生抑制量的本發(fā)明的αvβ5拮抗劑，通常配制為含有占總治療組合物重量的至少0.1％(重量)量的拮抗劑。重量百分比是抑制劑與總組合物的重量比例。因此，例如0.1％(重量)是每100克總組合物0.1克抑制劑。
E整聯(lián)蛋白αvβ5的拮抗劑αvβ5拮抗劑用于本方法以抑制組織中的血管發(fā)生，并可以采取各種形式，所述形式包括以使得與天然αvβ5配體的功能性相互作用受到干擾的方式與αvβ5相互作用的化合物。典型的拮抗劑包括衍生自αvβ5上的配體結(jié)合位點(diǎn)的αvβ5類似物或模擬物、模擬參與αvβ5-配體結(jié)合相互作用的結(jié)構(gòu)區(qū)的αvβ5天然配體模擬物、具有對應(yīng)于αvβ5特異性天然配體的功能結(jié)合域、特別是對應(yīng)于αvβ5天然配體的含RGD域的序列的多肽、和與或者αvβ5或者天然配體免疫反應(yīng)的抗體，它們均表現(xiàn)出本文定義的拮抗劑活性。
1．多肽在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明考慮了多肽形式的αvβ5拮抗劑。多肽(肽)αvβ5拮抗劑可以在參與αvβ5-配體相互作用的區(qū)具有或者αvβ5天然配體或者αvβ5自身的序列特征，并且表現(xiàn)出本文描述的αvβ5拮抗劑活性。優(yōu)選的αvβ5拮抗劑肽含有RGD三肽，并在該含RGD區(qū)中在序列上對應(yīng)于天然配體。
優(yōu)選的含RGD多肽的序列對應(yīng)于諸如其序列是眾所周知的玻連蛋白的αvβ5天然配體的含RGD區(qū)的氨基酸殘基序列。
如先前所述，與其它整聯(lián)蛋白相比，特別優(yōu)選的αvβ5拮抗劑肽優(yōu)先抑制αvβ5與其天然配體的結(jié)合。這些αvβ5特異性肽是特別優(yōu)選的，至少是因?yàn)閷Ζ羦β5的特異性降低了諸如抑制其它整聯(lián)蛋白的不良副作用的發(fā)生率?？梢栽谥T如實(shí)施例中描述的ELISA檢測的典型的結(jié)合抑制檢測中，容易地鑒別優(yōu)選的具有對αvβ5選擇性的αvβ5拮抗劑肽的身份。
本發(fā)明的多肽通常包含不超過約100個(gè)氨基酸殘基、優(yōu)選地不超過約60個(gè)殘基、更優(yōu)選地不超過約30個(gè)殘基。肽可以是線性或環(huán)狀，盡管特別優(yōu)選的肽是環(huán)狀。在實(shí)施例中描述了優(yōu)選的肽。
當(dāng)該多肽超過100個(gè)殘基時(shí)，如本文所述，通常以融合蛋白或蛋白片段的形式提供。
應(yīng)理解，主題多肽不需要與αvβ5天然配體的氨基酸殘基序列相同，只要它包括對拮抗αvβ5配體與αvβ5結(jié)合必需的序列并且可以在諸如本文描述的那些檢測中做為αvβ5拮抗劑起作用。
主題多肽包括其氨基酸殘基序列示于本文的多肽的任何類似物、片段或化學(xué)衍生物，只要該多肽是αvβ5拮抗劑。因此，對本多肽可以進(jìn)行各種改變、置換、插入和缺失，這里這種改變對其使用提供某種優(yōu)點(diǎn)。在此方面，本發(fā)明的αvβ5拮抗劑多肽相當(dāng)于而不是等同于列舉的肽的序列，其中制造了一個(gè)或多個(gè)變化并且其保留在本文定義的一個(gè)或多個(gè)檢測中做為αvβ5拮抗劑起作用的能力。
因此，多肽可以采取肽衍生物的各種形式的任何形式，包括酰胺、與蛋白的綴合物、環(huán)狀肽、多聚化肽、類似物、片段、化學(xué)修飾肽等等衍生物。
術(shù)語“類似物”包括其氨基酸殘基序列與本文具體所示的序列大體上相同的任何多肽，其中一個(gè)或多個(gè)殘基已被功能類似的殘基保守置換并且展示本文描述的αvβ5拮抗劑活性。保守置換的實(shí)例包括諸如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸的一個(gè)非極性(疏水性)殘基置換另一非極性殘基；諸如精氨酸與賴氨酸之間、谷氨酰胺與天冬酰胺之間、甘氨酸與絲氨酸之間一個(gè)極性(親水性)殘基置換另一個(gè)殘基、一個(gè)堿性殘基諸如賴氨酸、精氨酸或組氨酸置換另一堿性殘基、或諸如天冬氨酸或谷氨酸的一個(gè)酸性殘基置換另一酸性殘基。
短語“保守置換”亦包括使用化學(xué)衍生的殘基代替非衍生的殘基，只要這種多肽展示必要的抑制活性。
“化學(xué)衍生”指主題多肽具有一個(gè)或多個(gè)通過側(cè)鏈官能團(tuán)反應(yīng)化學(xué)衍生的殘基。除了側(cè)鏈基團(tuán)衍生，化學(xué)衍生物可以具有一個(gè)或多個(gè)主鏈修飾，包括諸如N-甲基、N-乙基、N-丙基等等的α-氨基取代；諸如硫酯、硫代酰胺、胍基等等的α-羰基取代。這種衍生分子包括例如那些其中游離氨基已被衍生形成鹽酸胺、對甲苯磺?；?、芐酯基、叔丁酯基、氯乙?；蚣柞；姆肿印Ｓ坞x羧基可以被衍生形成鹽、甲酯和乙酯或其它類型的酯或酰肼。游離羥基可以被衍生形成O-?；騉-烷基衍生物。組氨酸的咪唑氮可以被衍生形成N-im-芐基組氨酸(N-im-benzylhistidine)。做為化學(xué)衍生物亦包括的是那些含有一個(gè)或多個(gè)20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物的肽。例如4-羥脯氨酸可以置換脯氨酸；5-羥賴氨酸可以置換賴氨酸；3-甲基組氨酸可以置換組氨酸；高絲氨酸可以置換絲氨酸；和鳥氨酸可以置換賴氨酸。本發(fā)明的多肽亦包括具有相對于本文所示序列的多肽序列的一個(gè)或多個(gè)殘基添加和/或缺失的任何多肽，只要保持必要的活性。
特別優(yōu)選的衍生物是按照分子式環(huán)(Arg-Gly-Asp-D-Phe-NMe Val)簡寫為c(RGDf-NMeV)的環(huán)狀肽，其中在該肽的纈氨酸殘基上有一個(gè)N-甲基取代的α-氨基，并且環(huán)化將該肽的伯氨基和羧基末端連接起來。
術(shù)語“片段”指具有的氨基酸殘基序列短于其氨基酸殘基序列示于本文的多肽的氨基酸殘基序列的任何主題多肽。
當(dāng)本發(fā)明的多肽具有的序列與αvβ5天然配體序列不同時(shí)，通常是因?yàn)橐堰M(jìn)行了一個(gè)或多個(gè)保守或非保守置換，通常不超過30數(shù)量百分比，并且優(yōu)選地不超過氨基酸殘基數(shù)量的10％被置換。亦可以在多肽的任一端添加額外的殘基以提供“接頭”，通過“接頭”可以將本發(fā)明的多肽方便地添加至標(biāo)記或固體基質(zhì)或載體。
在以下描述了可以與本發(fā)明的多肽一起使用的標(biāo)記、固體基質(zhì)和載體。
氨基酸殘基接頭一般至少為一個(gè)殘基，并可以為40或更多個(gè)殘基，更常見為1-10個(gè)殘基，但不形成αvβ5配體表位。用于連接的典型的氨基酸殘基包括酪氨酸、半胱氨酸、賴氨酸、谷氨酸和天冬氨酸或諸如此類的。另外，主題多肽除了另外具體說明之外，可以由于序列被修飾而與αvβ5配體的天然序列不同，這種修飾通過末端NH2?；饔茫缫阴；驇€基乙酸酰胺化、通過末端羧基酰胺化，例如用氨、甲胺等等的末端修飾進(jìn)行。如眾所周知的，末端修飾可以用于降低對蛋白酶消化的易感性，并因此延長該多肽在溶液中、特別是可能存在蛋白酶的生物體液中的半衰期。在此方面，因?yàn)榄h(huán)化形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)以及觀察到本文描述的環(huán)狀肽的生物學(xué)活性，多肽環(huán)化亦是有用的修飾，并且亦是特別優(yōu)選的。
本發(fā)明的任何肽均可以以藥學(xué)上可接受的鹽的形式使用?？梢耘c本發(fā)明的肽形成鹽的合適的酸包括無機(jī)酸，諸如三氟乙酸(TFA)、鹽酸(HCl)、氫溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸、甲磺酸、乙酸、phosphoricacetic acid、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、馬來酸、富馬酸、鄰氨基苯甲酸、肉桂酸、萘磺酸、對氨基苯磺酸或諸如此類的。特別優(yōu)選HCl鹽。
可以與本發(fā)明的肽形成鹽的合適的堿包括諸如氫氧化鈉、氫氧化銨、氫氧化鉀等等的無機(jī)堿；和諸如單、雙和三烷基和芳基胺(例如三乙胺、二異丙胺、甲胺、二甲胺等等)和可選取代的乙醇胺(例如乙醇胺、二乙醇胺等等)的有機(jī)堿。
另外，可以如實(shí)施例中所述制備不包括游離離子鹽本發(fā)明的肽，其中存在于氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)(例如Arg、Asp等等)的帶電荷酸或堿基團(tuán)相互結(jié)合，并中和形成“內(nèi)鹽”化合物。
可以通過多肽領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)包括重組DNA技術(shù)，合成亦稱為主題多肽的本發(fā)明的肽。因?yàn)榧兌?、抗原特異性、不含不需要的副產(chǎn)物、生產(chǎn)容易等等原因，優(yōu)選諸如固相Merrifield型合成的合成化學(xué)技術(shù)。許多可利用的技術(shù)的優(yōu)秀的概括可以參考Steward等，“Solid Phase Peptide Synthesis”,W.H.Freeman Co.,San Francisco,1969；Bodanszky，等，“Peptide Synthesis”,John Wiley & Sons，第二版，1976；J.Meienhofer,“Hormonal Proteins and Peptides”，第2卷，第46頁，Academic Press(紐約)，1983；Merrifield,Adv.Enzymol.,32:221-96,1969；Fields等，Int.J.Peptide Protein Res.,35:161-214,1990；和有關(guān)固相肽合成的美國專利4,244,946和有關(guān)經(jīng)典溶液合成的Schroder等，“ThePeptides”，第1卷，Acadmeic Press(紐約)，1965，它們均通過引用結(jié)合到本文中。在上述文獻(xiàn)中描述了可用于這種合成的適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基團(tuán)并描述于J.F.W.McOmie,“Protective Groups in Organic Chemistry”,Plenum Press，紐約，1973，該文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中。
一般而言，所考慮的固相合成方法包含向一生長中的肽鏈順序添加一種或多種氨基酸殘基或適當(dāng)保護(hù)的氨基酸殘基。正常情況下，第一個(gè)氨基酸殘基的或者氨基或者羧基由合適的、選擇性可除去的保護(hù)基團(tuán)保護(hù)。利用一個(gè)不同的選擇性可除去的保護(hù)基團(tuán)用于含有反應(yīng)性側(cè)鏈基團(tuán)的氨基酸，例如賴氨酸。
用固相合成做為典型，將受保護(hù)的或衍生的氨基酸通過其未保護(hù)羧基或氨基連接至惰性固相支持體。然后選擇性地除去該氨基或羧基的保護(hù)基團(tuán)，并在適于形成酰胺鍵的條件下將具有適當(dāng)保護(hù)的互補(bǔ)(氨基或羧基)基團(tuán)的序列中的下一個(gè)氨基酸與已連接至該固相支持體的殘基混合和反應(yīng)。然后從該新加入的氨基酸殘基除去氨基或羧基的保護(hù)基團(tuán)，然后加入下一個(gè)氨基酸(適當(dāng)保護(hù))并如此繼續(xù)。所有需要的氨基酸已按正確序列連接后，順序或同時(shí)除去任何存留的末端和側(cè)鏈基團(tuán)保護(hù)基團(tuán)(和固相支持體)，以提供最終線性多肽。
可以使例如如上述得到的線性多肽反應(yīng)，形成其相應(yīng)的環(huán)狀肽。Zimmer等，Peptides 1992，第393-394頁，ESCOM Science Publishers,B.V.,1993描述了制備環(huán)狀肽的典型方法。通常，將叔丁酯基保護(hù)的肽甲酯溶解于甲醇中，加入氫氧化鈉溶液，并將該混合物于20℃(20C)反應(yīng)以水解除去該甲酯保護(hù)基團(tuán)。將溶劑蒸發(fā)后，用乙酸乙酯從酸化的水性溶劑萃取該叔丁酯基保護(hù)的肽。然后于溫和酸性條件下，在二氧雜環(huán)己烷共溶劑中除去該叔丁酯基保護(hù)基團(tuán)。通過在存在1-羥基苯并三唑和N-甲基嗎啉的情況下，將該線性肽的稀釋溶液與二環(huán)己基碳二亞胺在二氯甲烷和二甲基甲酰胺的混合物中反應(yīng)，將如此得到的具有游離氨基和羧基末端的未保護(hù)的線性肽轉(zhuǎn)化成為其相應(yīng)的環(huán)狀肽。然后通過層析純化得到的環(huán)狀肽。
Gurrath等，Eur.J.Biochem.,210:911-921(1992)描述了環(huán)狀肽合成的替代方法，在實(shí)施例中有描述。
另外，可以以融合蛋白的形式提供該αvβ5拮抗劑。融合蛋白是通過本文描述的重組DNA方法產(chǎn)生的蛋白，其中該主題多肽做為與諸如谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)或其它眾所周知的載體的第二個(gè)載體蛋白的融合物表達(dá)。優(yōu)選的融合蛋白包含本文描述的MMP-2多肽。在實(shí)施例中描述了MMP-2融合蛋白的制備。
在實(shí)施例中描述了用于本方法在主要表現(xiàn)出αvβ5相關(guān)的血管發(fā)生的組織中的特別優(yōu)選的肽或衍生肽，它們包括示于SEQ ID NO 4、6、7、8和9的多肽。
亦優(yōu)選源自本文描述的MMP-2的多肽，它具有示于SEQ IDNo:11-22的序列。
2．單克隆抗體本發(fā)明在一個(gè)實(shí)施方案中描述了單克隆抗體形式的αvβ5拮抗劑，如本文所述該抗體與αvβ5免疫反應(yīng)，并抑制αvβ5與其天然配體結(jié)合。本發(fā)明亦描述產(chǎn)生所述抗體的細(xì)胞系、產(chǎn)生所述細(xì)胞系的方法和產(chǎn)生單克隆抗體的方法。
本發(fā)明的單克隆抗體包含抗體分子，該抗體分子1)與分離的αvβ5免疫反應(yīng)，和2)抑制玻連蛋白與αvβ55結(jié)合。優(yōu)選的優(yōu)先與αvβ5結(jié)合的單克隆抗體包括具有mAb P1F6和mAb P5H9的免疫反應(yīng)特征的單克隆抗體，在實(shí)施例中對其進(jìn)行了描述。
本文使用各種語法形式的術(shù)語“抗體或抗體分子”做為指免疫球蛋白分子和/或免疫球蛋白分子的免疫活性部分(即含有抗體結(jié)合位點(diǎn)或互補(bǔ)位的分子)群的集合名詞。
“抗體結(jié)合位點(diǎn)”是由特異性結(jié)合抗原的重鏈和輕鏈可變區(qū)和超可變區(qū)組成的抗體分子的結(jié)構(gòu)部分。
用于本發(fā)明的典型抗體是完整的免疫球蛋白分子、大體上完整的免疫球蛋白分子和含有互補(bǔ)位的免疫球蛋白分子的那些部分，包括本領(lǐng)域稱為Fab、Fab’、F(ab’)2和F(v)的那些部分，這些部分亦稱為抗體片段。
在另一推薦實(shí)施方案中，本發(fā)明考慮包含源自本發(fā)明單克隆抗體的Fab片段的截短的免疫球蛋白分子。該缺失Fc受體的Fab片段是可溶性的，并提供在血清半衰期方面的治療優(yōu)點(diǎn)和在使用該可溶性Fab片段模式方面的診斷優(yōu)點(diǎn)?？扇苄訤ab片段的制備是免疫學(xué)領(lǐng)域一般已知的，并可以通過各種方法完成。
例如，通過眾所周知的方法通過分別用木瓜蛋白酶和胃蛋白酶對大體上完整抗體進(jìn)行蛋白水解反應(yīng)，制備抗體的Fab和F(ab’)2部分(片段)。參見例如授予Theofilopolous和Dixon的美國專利4,342,566號。Fab’抗體部分亦是眾所周知的，從F(ab’)2部分產(chǎn)生，接著通過用巰基乙醇還原連接兩個(gè)重鏈部分的二硫鍵、并接著用諸如碘乙酰胺的試劑烷基化產(chǎn)生的蛋白硫醇。優(yōu)選含有完整免疫球蛋白分子的抗體并如本文描述的加以使用。
各種語法形式的短語“單克隆抗體”指僅含有一種抗體結(jié)合位點(diǎn)、可以與一特定表位免疫反應(yīng)的抗體分子群。因此單克隆抗體通常展示與其免疫反應(yīng)的任何表位的單一結(jié)合親和性。因此，單克隆抗體可以含有具有許多抗體結(jié)合位點(diǎn)的抗體分子，每個(gè)位點(diǎn)對不同表位有免疫特異性，例如雙特異性單克隆抗體。
單克隆抗體通常由稱為雜交瘤的單細(xì)胞克隆產(chǎn)生的抗體組成，該雜交瘤僅分泌(產(chǎn)生)一種抗體分子。通過融合抗體產(chǎn)生細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞或其它自持細(xì)胞系，形成該雜交瘤細(xì)胞。這種抗體的制備首先由Kohler和Milstein,Nature,256:495-497(1975)描述，該文獻(xiàn)的描述通過引用結(jié)合到本文中。其它的方法由Zola,Monoclonal Antibodies:AManual of Techniques,CRC Press,Inc.(1987)描述。然后可以就與αvβ5免疫反應(yīng)的抗體分子的存在和抑制αvβ5與天然配體結(jié)合方面篩選如此制備的雜交瘤上清液。
簡言之，為形成產(chǎn)生該單克隆抗體組合物的雜交瘤，將骨髓瘤或其它自持細(xì)胞系與從用αvβ5源超免疫的哺乳動(dòng)物脾臟得到的淋巴細(xì)胞融合。
用于制備雜交瘤的骨髓瘤細(xì)胞系優(yōu)選來自與該淋巴細(xì)胞相同的物種。通常，129 GlX+品系小鼠是優(yōu)選的哺乳動(dòng)物。用于本發(fā)明的合適的骨髓瘤包括次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸苷-敏感型(HAT)細(xì)胞系P3X63-Ag8.653和Sp2/0-Ag14，它們可以從美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville,MD分別以CRL 1580和CRL 1581的名稱得到。
通常用聚乙二醇(PEG)1500將脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合。通過對HAT的敏感性選擇融合的雜種。采用酶聯(lián)免疫吸附檢測(ELISA)鑒別產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤，在實(shí)施例中描述了ELISA的變化。
亦可以通過起始包含含有分泌恰當(dāng)特異性抗體分子的雜交瘤的營養(yǎng)培養(yǎng)基的單克隆雜交瘤培養(yǎng)物，產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體。在足以使該雜交瘤將抗體分子分泌入培養(yǎng)基的條件和時(shí)間內(nèi)保持該培養(yǎng)物。然后收集含有抗體的培養(yǎng)基。然后可以通過眾所周知的技術(shù)進(jìn)一步分離所述抗體分子。
用于制備這些組合物的培養(yǎng)基是本領(lǐng)域眾所周知的并可以購得，包括合成培養(yǎng)基、近交小鼠等等。典型的合成培養(yǎng)基是添加了4.5gm/l葡萄糖、20mM谷氨酰胺和20％胎牛血清的Dulbecco基本必需培養(yǎng)基(DMEM；Dulbecco等，Virol.,8:396,1959)。典型的近交小鼠品系是Balb/c。
產(chǎn)生單克隆抗體、雜交瘤細(xì)胞或雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)物的其它方法亦是眾所周知的。參見，例如，Sastry，等，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,86:5728-5732(1989)和Huse等，Science,246:1275-1281(1989)描述的從免疫學(xué)所有組成部分分離單克隆抗體的方法。
本發(fā)明亦考慮的是雜交瘤細(xì)胞、含有產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)物。特別優(yōu)選的是分泌單克隆抗體mAb P1F6和mAbP5H9的雜交瘤細(xì)胞系，在實(shí)施例中描述了其制備。
本發(fā)明在一個(gè)實(shí)施方案中考慮了具有mAb P1F6或mAb P5H9的免疫反應(yīng)特性的單克隆抗體。
不需要過度實(shí)驗(yàn)，亦有可能確定單克隆抗體是否具有與本發(fā)明的單克隆抗體相同(即，相等)的特異性(免疫反應(yīng)特性)，即通過確定前者是否防止后者與預(yù)選擇的靶分子結(jié)合來確定。如果被測試的單克隆抗體與本發(fā)明的單克隆抗體競爭，如本發(fā)明的單克隆抗體在用于與處于固相的靶分子結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)競爭檢測中的結(jié)合下降所示的，則有可能這兩個(gè)單克隆抗體與同一表位或密切相關(guān)的表位結(jié)合。
確定單克隆抗體是否具有本發(fā)明單克隆抗體的特異性的再一方法是，用與其正常反應(yīng)的靶分子預(yù)溫育本發(fā)明的單克隆抗體，然后加入測試的單克隆抗體，以確定被測試的單克隆抗體是否在其與該靶分子結(jié)合的能力方面受抑制。如果被測試的單克隆抗體受抑制，則它多半具有與本發(fā)明的單克隆抗體相同或功能相等的表位特異性。
確定單克隆抗體是否具有本發(fā)明單克隆抗體的特異性的另一方法是，測定所研究的抗體的CDR區(qū)的氨基酸殘基序列。在其CDR區(qū)中具有相等或功能相同氨基酸殘基序列的抗體分子具有同樣的結(jié)合特異性。多肽測序的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。
由抗體與其免疫反應(yīng)的表位定義抗體的免疫特異性、其靶分子結(jié)合能力和抗體對該表位展示的伴隨的親和性。該表位的特異性至少部分由抗體免疫球蛋白重鏈可變區(qū)的氨基酸殘基序列限定，部分由輕鏈可變區(qū)氨基酸殘基序列限定。
使用術(shù)語“具有結(jié)合特異性”表明相當(dāng)?shù)膯慰寺】贵w展示同樣或類似的免疫反應(yīng)(結(jié)合)特性，并競爭結(jié)合預(yù)選擇的靶分子。
人化單克隆抗體提供超出鼠單克隆抗體的特別的優(yōu)點(diǎn)，特別是因?yàn)樗鼈兛梢栽谌祟愔杏糜谥委?。具體而言，人抗體不會象“異源”抗原那樣快速從循環(huán)中清除。另外，人抗體不會以異源抗原和異源抗體的同樣方式激活免疫系統(tǒng)。制備“人化”抗體的方法一般是本領(lǐng)域眾所周知的，并可以容易地應(yīng)用于本發(fā)明的抗體。
因此，本發(fā)明在一個(gè)實(shí)施方案中考慮通過移植導(dǎo)入人類免疫系統(tǒng)的組分而大體上不影響該抗體結(jié)合抗原能力人化的本發(fā)明的單克隆抗體。
3．αvβ5特異性模擬物本發(fā)明證實(shí)αvβ5拮抗劑一般可以用于本發(fā)明，所述拮抗劑可以包括多肽、抗體和命名為“模擬物”、具有干擾αvβ5功能能力的其它分子。特別優(yōu)選的是特異性干擾αvβ5功能但不干擾其它整聯(lián)蛋白功能的拮抗劑。
在此范圍內(nèi)，應(yīng)理解各種試劑可以適于用于本方法中，只要這些試劑具有必要的生物學(xué)活性。這些試劑一般稱為模擬物，因?yàn)樗鼈兺ㄟ^阻斷受體中配體結(jié)合域并因此干擾(即，抑制)正常功能，具有“模擬”參與該受體功能性相互作用的αvβ5配體的能力。在一替代實(shí)施方案中，αvβ5拮抗劑可以是該受體的模擬物，而不是其配體。
模擬物是除了抗體或配體源肽之外的、表現(xiàn)上述特性的任何分子。它可以是合成肽、肽的類似物或衍生物、諸如有機(jī)模擬分子的形狀象上述結(jié)合域的結(jié)合口袋的化合物或其它分子。
優(yōu)選的本發(fā)明模擬物是基于有機(jī)的分子，并因此稱為有機(jī)模擬物。特別優(yōu)選的通過做為αvβ5配體模擬物而做為αvβ5拮抗劑起作用的有機(jī)模擬物是描述于實(shí)施例10中的化合物7、9、10、12、14、15、16、17和18。
可以通過本領(lǐng)域已知的藥物設(shè)計(jì)的各種結(jié)構(gòu)分析方法的任一種進(jìn)行αvβ5模擬物的設(shè)計(jì)，所述方法包括制作分子模型、二維核磁共振(2-D NMR)分析、X射線晶體學(xué)、肽隨機(jī)篩選、肽類似物或其它化學(xué)聚合物或化合物文庫等等藥物設(shè)計(jì)方法學(xué)。
在本說明書中呈現(xiàn)的廣泛結(jié)構(gòu)證據(jù)顯示αvβ5拮抗劑可以是融合多肽(例如，MMP-2融合蛋白)、小多肽、環(huán)形肽、衍生化肽、有機(jī)模仿分子或單克隆抗體，它們是共享選擇性抑制αvβ5功能特性的各種各樣不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)，以所述結(jié)構(gòu)證據(jù)的觀點(diǎn)來看，可以用于本方法的主題αvβ5拮抗劑的結(jié)構(gòu)不需要如此限制，但包括本文定義的任何αvβ5模仿物。
F．鑒別αvβ5拮抗劑的方法本發(fā)明亦描述鑒別按照本方法使用的候選αvβ5拮抗劑的檢測方法。在這些檢測方法中，評價(jià)候選分子抑制αvβ5與其天然配體結(jié)合的效力，并評價(jià)其抑制組織中血管發(fā)生的效力。
第一種檢測測定雞尿囊絨膜(CAM)中的血管發(fā)生，并被稱為CAM檢測。CAM檢測已由其它作者詳細(xì)描述，并被進(jìn)一步用于測定腫瘤組織的血管發(fā)生和新血管形成。參見Auspmnk等，Am.J.Pathol.,79:597-618(1975)和Ossonski等，Cancer Res.,40:2300-2309(1980)。
CAM檢測是廣泛認(rèn)可的體內(nèi)血管發(fā)生的檢測模型，因?yàn)榘l(fā)生了整個(gè)組織的新血管形成。實(shí)際的雞胚血管生長進(jìn)入CAM，或生長進(jìn)入在CAM上生長的組織。
如本文所證實(shí)的，CAM檢測基于新血管生長的量和程度描繪了新血管形成的抑制。另外，容易的是監(jiān)視移植到CAM上的任何組織的生長，例如腫瘤組織。最后，因?yàn)樵谠摍z測系統(tǒng)中有內(nèi)部毒性對照，該檢測特別有用。將雞胚暴露給任何檢測試劑。照這樣，該胚胎的健康是毒性的指標(biāo)。
測定血管發(fā)生的第二個(gè)檢測是體內(nèi)兔眼模型，并稱為兔眼檢測。兔眼檢測已由其它作者詳細(xì)描述，并被進(jìn)一步用于存在諸如沙利度胺的生血管抑制劑時(shí)檢測血管發(fā)生和新血管形成。參見D’Amato等，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,91:4082-4085(1994)。
兔眼檢測是廣泛認(rèn)可的體內(nèi)血管發(fā)生的檢測模型，因?yàn)橐詮慕悄み吘壪蚪悄?nèi)生長的兔血管為例證，新血管形成過程可以容易地通過眼睛的天然透明的角膜觀察。另外，可以容易地隨時(shí)間監(jiān)視新血管形成的刺激或抑制的程度和量或新血管形成的退化。
最后，將兔暴露給任何檢測試劑，照這樣，兔子的健康是該檢測試劑的毒性指標(biāo)。
在實(shí)施例中詳細(xì)描述了測定天然配體玻連蛋白與αvβ5直接結(jié)合抑制的第三種檢測和優(yōu)選實(shí)施方案。該檢測通常通過ELISA測定諸如玻連蛋白的天然配體與固相中的分離αvβ5結(jié)合抑制的程度，該抑制是由αvβ5特異性抑制所介導(dǎo)。
因此，該檢測亦可以用于鑒別展示對αvβ5的特異性并且不抑制天然配體與其它整聯(lián)蛋白結(jié)合的化合物。通過進(jìn)行平行ELISA檢測檢測該特異性，其中在分離的檢測室中，就對天然配體的結(jié)合能力和候選化合物抑制整聯(lián)蛋白結(jié)合預(yù)選擇配體的相對能力同時(shí)篩選αvβ5和其它整聯(lián)蛋白。在實(shí)施例中描述了優(yōu)選的篩選檢測形式。
G．產(chǎn)品本發(fā)明亦考慮了產(chǎn)品，該產(chǎn)品是提供本發(fā)明的αvβ5拮抗劑的貼有標(biāo)簽的容器。產(chǎn)品包含包裝材料和包含于該包裝材料內(nèi)的藥物。
在產(chǎn)品中的藥物是本發(fā)明的任一αvβ5拮抗劑，將其按照本公開的說明配制成如本文所述藥學(xué)上可接受的形式。該產(chǎn)品含有足以用于治療本文指明的病癥的量或者單劑量或者多劑量量的藥物。
該包裝材料包含表明其中說明的該藥物用途的標(biāo)簽，例如，用于由抑制血管發(fā)生協(xié)助治療病癥或本文公開的其它病癥。該標(biāo)簽可以再包括用法說明和市場銷售必需的相關(guān)信息。該包裝材料可以包括儲存該藥物的容器。
本文使用的術(shù)語包裝材料指諸如玻璃、塑料、紙、鋁箔等等可以以固定工具內(nèi)保持藥物的材料。因此，例如，該包裝材料可以是塑料或玻璃西林瓶、層壓封袋等等用于包含包括該藥物藥用組合物的容器。
在推薦實(shí)施方案中，該包裝材料包括是明確表達(dá)的標(biāo)簽，其描述了該產(chǎn)品的內(nèi)容和其包含的藥物的用途。實(shí)施例與本發(fā)明相關(guān)的以下實(shí)施例是描述性的，不應(yīng)視為具體限制本發(fā)明。另外，認(rèn)為在本領(lǐng)域技術(shù)人員技術(shù)范圍內(nèi)的現(xiàn)在已知的或后來開發(fā)的本發(fā)明的變化屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。1．制備αvβ5特異性單克隆抗體如Wayner等，J.Cell Biol.,113:919-929(1991)所述(其公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)，通過用A549肺癌細(xì)胞免疫入RBF/DnJ小鼠，使用標(biāo)準(zhǔn)雜交瘤方法產(chǎn)生單克隆抗體P1F6和P5H9。從免疫后的小鼠取出脾臟，并與Ns-1/FOX-NY骨髓瘤細(xì)胞融合。如Wayner等所述，通過特異性抑制UCLA-P3粘連至玻連蛋白包被的表面，篩選產(chǎn)生導(dǎo)向癌細(xì)胞玻連蛋白受體的雜交瘤，并通過在胸腺細(xì)胞飼養(yǎng)層上有限稀釋進(jìn)行克隆。
P1F6和P5H9單克隆抗體均顯示與該αvβ5復(fù)合物特異性免疫反應(yīng)，并不與αv亞基、β5亞基或其它整聯(lián)蛋白免疫反應(yīng)。該P(yáng)1F6單克隆抗體可從Gibco BRL(Life Technologies,Inc.,Gaithersburg,MD)購得，該P(yáng)5H9單克隆抗體可以從Fred Hutchinson Cancer Research Institute,Seattle,WA的E Wayner博士處得到。
如本文所述類似地衍生和表征用于本發(fā)明的其它αvβ5單克隆抗體。另外，通過融合分離自用或者不純或者純化形式的αvβ5受體免疫的小鼠的脾臟產(chǎn)生αvβ5單克隆抗體。該αvβ5的純化是整聯(lián)蛋白生物學(xué)領(lǐng)域一般技術(shù)人員眾所周知的方法，并已由Smith等，J.Biol.Chem.,265:11008-11013(1990)描述，其說明書通過引用結(jié)合到本文中。純化后，如E2小節(jié)中所述將分離的受體制備為免疫小鼠的免疫原，并基本上按照Kohler和Milstein,Nature,256:495-497(1975)描述制備，其說明書通過引用結(jié)合到本文中。篩選得到的雜交瘤克隆與該免疫原的反應(yīng)性，并如在以下實(shí)施例中所述進(jìn)行表征。2．表征抗αvβ5單克隆抗體的特異性并用于αvβ5表達(dá)的組織分布定位
A．對玻連蛋白的特異性Wayner等，J.Cell.Biol.,113:919-929(1991)顯示在實(shí)施例1中制備的P5H9單克隆抗體阻斷UCLA-P3癌細(xì)胞附著玻連蛋白，但不影響細(xì)胞附著膠原蛋白或纖連蛋白。亦顯示同樣的細(xì)胞僅含有該αvβ5玻連蛋白受體，并且都不具有αvβ3特異性、在非還原條件下免疫沉淀由α鏈(160kD)和β鏈(95kD)組成的異二聚體。用P5H9檢測到的該αvβ5受體亦表明介導(dǎo)M21骨髓瘤細(xì)胞和H2981癌細(xì)胞與玻連蛋白的粘連。該P(yáng)1F6單克隆抗體具有同樣的免疫反應(yīng)性特性。
B．與抗整聯(lián)蛋白受體抗體的免疫熒光在傷口愈合過程中，血管的基膜表達(dá)幾種粘連蛋白，包括威勒布蘭特因子、纖連蛋白和血纖蛋白。另外，在培養(yǎng)平滑肌和內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)粘連受體的整聯(lián)蛋白家族的幾個(gè)成員。參見，Cheresh,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,84:6471(1987)；Janat等，J.Cell Physiol.,151:588(1992)；和Cheng等，J.Cell Physiol.,139:275(1989)。
除了整聯(lián)蛋白β5亞基的結(jié)構(gòu)和功能，Pasqualini等，J.Cell Sci.,105:101-111(1993)(其說明書通過引用結(jié)合到本文中)描述了用其它抗β5單克隆抗體定位的該亞基的組織分布。
上述與實(shí)施例1中描述的那些類似的β5亞基特異性單克隆抗體系從用接受用A549人肺癌細(xì)胞系免疫的小鼠的脾臟制備的雜交瘤分泌的。通過用該雜交瘤培養(yǎng)上清液陽性表面染色A549細(xì)胞，和通過免疫沉淀來自表面標(biāo)記的A549提取物的αvβ5復(fù)合物，選擇該雜交瘤。然后使用所述單克隆抗體定位該β5亞基在正常人胸腺、皮膚和腎臟中的組織分布。在恒冷箱切片機(jī)上從該冷凍組織塊上切下4微米厚切片，以進(jìn)行后續(xù)的使用對該β5整聯(lián)蛋白特異性的抗體的抗生蛋白鏈菌素-生物素免疫過氧化物酶染色，如Pasqualini等的參考文獻(xiàn)中描述的進(jìn)行。
胸腺切片的染色顯示，β5在血管、哈索爾小體、皮質(zhì)和髓質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞和基膜上的分布。皮膚切片顯示，β5在表皮基層和在一些皮血管壁上，腎臟切片顯示腎小球區(qū)、近腎小球體、近曲小管和集合小管的染色。因此，β5的分布對包括毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞的不同細(xì)胞類型是非均質(zhì)的，更重要的是在毛細(xì)內(nèi)皮細(xì)胞上，其染色與培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的染色一致。
C．患有眼病的患者的人視網(wǎng)膜組織與抗整聯(lián)蛋白受體抗體的免疫熒光眼部新血管形成是在導(dǎo)致災(zāi)難性視力喪失的絕大多數(shù)眼病中觀察到的最常見的病理變化。從預(yù)先存在的脈絡(luò)膜、視網(wǎng)膜或parlimbal脈管的新血管生長，可以引起導(dǎo)致破壞眼睛正常解剖學(xué)關(guān)系和同時(shí)喪失正常視覺功能的水腫、出血或纖維血管膜形成。
在生理?xiàng)l件下血管發(fā)生受高度調(diào)節(jié)，并已顯示由諸如堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的特定生血管細(xì)胞因子激活。如Brooks等，Science,264:569-571(1994)描述的，已顯示抗αvβ3單克隆抗體在包括下述CAM模型中的模型系統(tǒng)中阻斷bFGF和TNF-α誘導(dǎo)的血管發(fā)生。如在實(shí)施例4-6中所述，抗αvβ5單克隆抗體阻斷血管發(fā)生的獨(dú)立途徑，具體而言是由血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、轉(zhuǎn)化生長因子-α(TGF-α)和表皮生長因子(EGF)誘導(dǎo)的血管發(fā)生。
因此，如在本發(fā)明的范圍內(nèi)描述的，用獨(dú)特的整聯(lián)蛋白αvβ3和αvβ5定義了兩個(gè)血管發(fā)生途徑。為調(diào)查這些整聯(lián)蛋白在人類眼病中的表達(dá)和作用，從患有增生性糖尿病性視網(wǎng)膜病(PDR)的患者于玻璃體摘出術(shù)時(shí)整塊得到視網(wǎng)膜上(epiretinal)新血管膜和視網(wǎng)膜下(subretinal)新血管膜。這些患者已被臨床追蹤并選擇用于在臨床檢驗(yàn)和基底熒光素血管造影術(shù)證明的具有活動(dòng)增生性新血管疾病的基礎(chǔ)進(jìn)行組織學(xué)評價(jià)。將得到的組織立即在Tissue Tek冷凍保藏劑中冷凍并切片。
當(dāng)通過免疫熒光檢驗(yàn)這些患者的組織時(shí)，如與小鼠單克隆抗體LM609的免疫反應(yīng)性表明的，血管對整聯(lián)蛋白αvβ3呈陽性。該整聯(lián)蛋白的分布看起來限于血管，并與血管標(biāo)記威勒布蘭特因子的染色(用抗該因子的兔抗體定位)一致。用或者若丹明綴合的抗小鼠免疫球蛋白或熒光素綴合的抗兔免疫球蛋白使免疫反應(yīng)性位點(diǎn)可見，這兩種染色劑的使用使得可以共定位該整聯(lián)蛋白的位置和血管特異性抗體。
從正常眼或患有萎縮膜的、沒有活動(dòng)性增生血管的患者得到的樣本對該整聯(lián)蛋白αvβ3免疫熒光陰性。
用在實(shí)施例1中制備的抗αvβ5單克隆抗體P1F6平行地對同樣的組織平行地進(jìn)行αvβ5存在和分布的免疫組織化學(xué)分析。該染色揭示αvβ5存在于用威勒布蘭特因子分布共定位的血管上。然而，非血管組織用該P(yáng)1F6抗體亦展示有限的熒光，表明αvβ5的較廣泛的分布。這與αvβ3的存在限于血管形成對比。
當(dāng)比較αvβ3和αvβ5之間分別用抗體LM609和P1F6的膜免疫熒光染色時(shí)，血管壁上的染色型式實(shí)際上相同，表明αvβ3和αvβ5均呈現(xiàn)于存在于諸如糖尿病性視網(wǎng)膜病的新血管眼病的新增生人血管的表面。
本文描述的結(jié)果由此表明，αvβ5整聯(lián)蛋白受體在其中發(fā)生血管發(fā)生的特定組織類型中選擇性表達(dá)，例如從患有活動(dòng)性增生性新血管疾病的患者的新血管膜所觀察到的。這些組織與在以下實(shí)施例4-6中描述的暴露給特定生長因子的那些組織一起，為本發(fā)明的治療方面提供了理想的靶。3．制備合成肽a．合成程序使用例如Merrifield,Adv.Enzymol.,32:221-296(1969)和Fields,G.B.和Noble,R.L.,Int.J.Peptide Protein Res.,35:161-214(1990)描述的標(biāo)準(zhǔn)固相合成技術(shù)，合成用于實(shí)踐本發(fā)明方法的環(huán)狀多肽。
將2克(g)BOC-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val-OMe(SEQ ID NO 1)首先溶解于60毫升(ml)甲醇中，向其中加入1.5ml 2N氫氧化鈉溶液以形成混合物。然后將該混合物于20℃(20C)攪拌3小時(shí)。蒸發(fā)后，將殘留物吸收于水中，并用稀鹽酸酸化至pH3，用乙酸乙酯萃取。將萃取物在Na2SO4上干燥，再蒸發(fā)并將產(chǎn)生的BOC-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val-OH(SEQ ID NO 2)與20ml二氧雜環(huán)己烷中的2N HCl于20C一起攪拌2小時(shí)。將產(chǎn)生的混合物蒸發(fā)以得到H-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val-OH(SEQ IDNO 3)，將其接著溶解于1800ml二氯甲烷和200ml二甲基甲酰胺(DMF)的混合物中，并接著被冷卻至0C。其后，邊攪拌邊順序加入0.5g二環(huán)己基碳二亞胺(DCCI)、0.3g1-羥基苯并三唑(HOBt)和0.23ml N-甲基嗎啉。
將產(chǎn)生的混合物于0C再攪拌24小時(shí)，然后于20C再攪拌48小時(shí)。濃縮該溶液并用混合床離子交換劑處理以除去鹽。將產(chǎn)生的樹脂通過過濾除去后，蒸發(fā)澄清的溶液，通過層析純化殘留物，導(dǎo)致回收環(huán)(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val)(亦以單字母代碼列出為c-RGDfV)(SEQ IDNO 4)。肽中的小寫字母表示該氨基酸的D形式，而不是由大寫字母表示的L形式。
如上述制備環(huán)狀對照肽環(huán)(Arg-Ala-Asp-D-Phe-Val)(亦以單字母代碼列出為RADfV)(SEQ ID NO 5)。先前已顯示該環(huán)狀肽c-RADfV(SEQID NO 5)抑制血纖蛋白原與整聯(lián)蛋白αvβ3結(jié)合，并且不抑制血纖蛋白原與整聯(lián)蛋白αⅡbβ3或αvβ1的結(jié)合(Pfaff，等，J.Biol.Chem.,269:20233-20238,1994)。
類似地制備特異性抑制天然配體與αvβ5結(jié)合的其它肽，并如以下實(shí)施例所述測試其特異性和活性范圍。這些包括以下類似得到的肽環(huán)(Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val)(SEQ ID NO 6)和環(huán)(Arg-Gly-Asp-Phe-D-Val)(SEQ ID NO 7)。亦合成制備具有氨基酸殘基序列Tyr-Thr-Ala-Glu-Cys-Lys-Pro-Gln-Val-Thr-Arg-Gly-Asp-Val-Phe(SEQ ID NO 8)和環(huán)(Arg-Gly-Asp-D-Phe-NMeVal)(SEQ ID NO 9)的肽。在SEQ ID NO 9中，Me Val中的前綴“Me”表明位置6的纈氨酸在該纈氨酸殘基酰胺鍵的α氨基氮被甲基化修飾。
b．替代合成程序?。铣森h(huán)-(Arg-Gly-Asp-DPhe-Nme Val)、TFA鹽使用固相Merrifield型程序，通過以分步方式順序?qū)Me Val、DPhe、Asp(OBut)、Gly和Fmoc-Arg(Mtr)加入4-羥甲基-苯氧基甲基-聚苯乙烯樹脂(Wang型樹脂)(應(yīng)用了在Houben-Weyl,l,c.，第15/Ⅱ卷，第1-806頁(1974)中描述了慣常的Merrifield型肽合成方法)合成Fmoc-Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-DPhe-NMeVal-ONa。該聚苯乙烯樹脂和氨基酸殘基前體可從Aldrich、Sigrna或Fluka化學(xué)公司購得)。完成順序加入所述氨基酸殘基后，使用1∶1的TFA/二氯甲烷混合物從肽鏈除去該樹脂，提供Fmoc-Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-DPhe-NMeVal-OH產(chǎn)物。然后用1∶1的哌啶/DMF混合物除去Fmoc基團(tuán)，提供粗Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-DPhe-NMe Val-OH前體，然后用HPLC以慣常方式純化該前體。
為了環(huán)化，用85ml的二氯甲烷(Aldrich)稀釋在15ml DMF(二甲基甲酰胺；Aldrich)中的0.6g Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-DPhe-NMe Val-OH(上述合成的)的溶液，并加入50mg NaHCO3。在干冰/丙酮混合物中冷卻后，加入40μl的二苯基磷?；B氮化物(Aldrich)。于室溫靜置16小時(shí)后，濃縮該溶液。將濃縮物進(jìn)行凝膠過濾(Sephadex G10柱，在異丙醇/水8∶2中)，然后以慣常方式通過HPLC純化。用TFA(三氟乙酸)/H2O(98∶2)處理，產(chǎn)生環(huán)-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NmeVal)xTFA，然后以慣常方式通過HPLC純化它；RT=19.5；FAB-MS(M+H):589。
ⅱ．合成“內(nèi)鹽”通過將環(huán)-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NmeVal)xTFA懸浮于水中并接著在真空下蒸發(fā)以除去TFA，從上述產(chǎn)生的環(huán)狀肽除去TFA鹽。將形成的環(huán)狀肽稱為“內(nèi)鹽”，并命名為環(huán)-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)。使用術(shù)語“內(nèi)鹽”，因?yàn)樵摥h(huán)狀肽含有兩個(gè)帶相反電荷的殘基，它們互相之間內(nèi)電平衡，形成總的不帶電的分子。一個(gè)帶電殘基含有酸部分，另一帶電殘基含有氨基部分。當(dāng)該酸等分和該氨基部分互相之間非常接近時(shí)，該酸部分可以被該氨基部分脫質(zhì)子，形成總的帶電中性的羧酸鹽/銨鹽種類。
ⅲ．HCl處理產(chǎn)生環(huán)-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)xHCl將80mg的環(huán)-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)溶解于0.01M HCl中5至6次，并在每次溶解操作后冷凍干燥。隨后通過HPLC純化，產(chǎn)生環(huán)-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)xHCl；FAB-MS(M+H):589。
ⅳ．甲磺酸處理產(chǎn)生環(huán)-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)xMeSO3H將80mg的環(huán)-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)溶解于0.01M MeSO3H中5至6次，并在每次溶解操作后冷凍干燥。隨后通過HPLC純化，產(chǎn)生環(huán)-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)xMeSO3H；RT=17.8；FAB-MS(M+H):589。
替代的環(huán)化方法包括衍生具有巰基部分的無環(huán)狀肽前體的側(cè)鏈基團(tuán)，并當(dāng)暴露于略高于正常生理pH條件(pH7.5)時(shí)，與該分子內(nèi)存在的其它巰基基團(tuán)分子內(nèi)形成二硫鍵，形成環(huán)狀肽。另外，無環(huán)狀肽前體的C末端羧酸鹽部分可以與該分子內(nèi)存在的游離巰基部分反應(yīng)，產(chǎn)生硫酯環(huán)化肽。
表1肽命名 氨基酸序列SEQ ID NO62184(66203*) 環(huán)(RGDfV) 462185(69601*) 環(huán)(RADfV) 562181 環(huán)(GrGDFV)662187 環(huán)(RGDFv) 762880 YTAECKPQVTRGDVF 8121974(85189*) 環(huán)(RDGf-NMeV) 9112784環(huán)(RGEf-NMeV) 10huMMP-2(410-631)**11huMMP-2(439-631)**12huMMP-2(439-512)**13huMMP-2(439-546)**14huMMP-2(510-631)**15huMMP-2(543-631)**16chMMP-2(410-637)***17chMMP-2(445-637)***18chMMP-2(445-518)***19chMMP-2(445-552)***20chMMP-2(516-637)***21chMMP-2(549-637)***22*以星號標(biāo)明的肽是在HCl中制備的，并與同一行命名的肽在序列上相同；沒有星號的肽是在TFA中制備的。小寫字母表明D-氨基酸；大寫字母表明L-氨基酸。**合成肽的人類MMP-2氨基酸殘基序列由示于圖15A和15B以及圖16的對應(yīng)殘基位置標(biāo)明。(MMP-2指基質(zhì)金屬硫蛋白酶家族的一個(gè)成員)。所述人類MMP-2序列以天然半胱氨酸殘基列出，而不以如融合肽所述的工程化的半胱氨酸殘基列出。用非天然半胱氨酸殘基于指明的殘基位置置換該天然氨基酸殘基，以增強(qiáng)該合成以及表達(dá)的融合蛋白的溶解度，并確保正確折疊以呈現(xiàn)該結(jié)合位點(diǎn)。***合成肽的雞MMP-2氨基酸殘基序列由示于圖15A和15B的對應(yīng)殘基位置標(biāo)明。所述雞MMP-2序列以天然半胱氨酸殘基列出，而不以如上述融合肽的工程化的半胱氨酸殘基列出。4．通過體內(nèi)兔眼模型檢測測定的用αvβ5拮抗劑抑制生長因子誘導(dǎo)的血管發(fā)生可以在以眼睛角膜為典型的天然透明結(jié)構(gòu)中觀察抗αvβ5拮抗劑對生長因子誘導(dǎo)的血管發(fā)生的影響。新血管從具有豐富血液供應(yīng)的角膜邊緣向通常不具有血管的角膜中央生長。當(dāng)將諸如VEGF和TGF-α的血管發(fā)生刺激劑用于角膜時(shí)，誘導(dǎo)新血管從角膜邊緣生長。當(dāng)將血管發(fā)生的拮抗劑用于角膜時(shí)，抑制新血管從角膜邊緣生長。因此，角膜通過內(nèi)皮細(xì)胞從角膜邊緣向堅(jiān)韌的堆積膠原蛋白的角膜組織侵入進(jìn)行血管發(fā)生是輕易可見的。該兔眼模型檢測因此提供在將化合物直接植入眼睛角膜后直接觀察血管發(fā)生的刺激和抑制的體內(nèi)模型。
A．體內(nèi)兔眼模型檢測1)由生長因子誘導(dǎo)的血管發(fā)生用生長因子在該體內(nèi)兔眼模型檢測中誘導(dǎo)血管發(fā)生，并在以下進(jìn)行描述。
a．制備含有生長因子和單克隆抗體的hydron丸如D’Amato等，Proc.Natl.Acad.Sci.,91:4082-4085(1994)所述制備含有生長因子和單克隆抗體(mAbs)的hydron聚合物丸。單個(gè)的丸含有750ng生長因子(亦稱為細(xì)胞因子)，具體地說是或者bFGF或者VEGF,它們結(jié)合至硫糖鋁(Carafet,Marion Merrel Dow Corporation,Cincinnati,OH)，以穩(wěn)定所述細(xì)胞因子并確保它們緩慢釋入周圍組織。另外，制備含有PBS中的或者40μgmAb P1F6(抗αvβ5)或?qū)φ湛贵wLM609(抗αvβ3)的hydron丸。
按照眾所周知的方法，使用A蛋白Sepharose CL-4B親和柱層析從腹水純化所有測試的mAb。然后將洗脫的免疫球蛋白對PBS透析，并用Detoxi-gel(Pierce Chemicals,Rocford,IL)處理以去除內(nèi)毒素。已顯示內(nèi)毒素是有效的生血管和炎癥刺激劑。因此用產(chǎn)色素鱟變形細(xì)胞溶解物檢測(Bio Whittaker,Walkersville,MD)測試單克隆抗體中內(nèi)毒素的存在，并且只有那些沒有可檢測的內(nèi)毒素的mAb用于兔眼模型檢測中。
在特別制造的在其表面有2.5mm鉆孔核的特氟隆栓內(nèi)鑄造所述丸。將約12μl的鑄造材料置于每個(gè)栓中，并在無菌櫥中聚合過夜。然后通過紫外輻射將丸滅菌。
將一系列的8只動(dòng)物用于成對眼實(shí)驗(yàn)，其中每只動(dòng)物接受含有預(yù)選擇的細(xì)胞因子與預(yù)選擇的抗體或?qū)φ彰庖咔虻鞍椎膆ydron植入物。具體地說，對于每只兔子，一只角膜外科手術(shù)植入含有與mAb P1F6聯(lián)用的或者bFGF或者VEGF的hydron丸，另一只角膜用與MAb LM609聯(lián)用的或者bFGF或者VEGF處理。將單個(gè)的丸植入在兔子角膜的中基質(zhì)中外科手術(shù)創(chuàng)造形成的“口袋”中。使用裝備有其上裝有用于攝影記錄各個(gè)角膜的照相機(jī)的分束器的Wild M691型手術(shù)顯微鏡，在無菌條件下進(jìn)行外科手術(shù)。通過用69 Beaver刀片做一個(gè)3mm的至一半角膜厚度的切口，在角膜基質(zhì)中制作一個(gè)3mm×5mm的“口袋”。使用虹膜復(fù)位器沿周邊解劑基質(zhì)，并將該丸植入，使其周邊距邊緣2mm。
在以后的12天中，所述細(xì)胞因子和mAb從該植入丸擴(kuò)散進(jìn)入周圍組織，由此影響從角膜邊緣的血管發(fā)生。
分別將左和右角膜稱為OS和OD。然后觀察角膜12天。在手術(shù)后第10天照相，此時(shí)新血管形成為最高峰。
使用細(xì)胞因子/mAb混合物的上述處理的代表性攝影結(jié)果示于圖1A-1D。mAb抑制細(xì)胞因子誘導(dǎo)的血管發(fā)生的平行定量示于圖2A和2B。在圖1A和1D中，其中角膜分別暴露給bFGF/P1F6和VEGF/LM609組合物，如大箭頭所示，細(xì)胞因子誘導(dǎo)的帶有水腫的血管發(fā)生是顯著的。因此，αvβ5抗體P1F6對抑制bFGF誘導(dǎo)血管發(fā)生無效。類似地，αvβ3抗體LM609對抑制VEGF誘導(dǎo)的血管發(fā)生無效。
與之相反，當(dāng)將細(xì)胞因子/mAb組合物bFGF/LM609和VEGF/P1F6用于兔眼模型時(shí)，如圖1B和1C中分別所示，細(xì)胞因子誘導(dǎo)的血管發(fā)生被抗體抑制。在這些圖中，顯示由小箭頭指示的正常結(jié)膜緣脈管，表明所述整聯(lián)蛋白抗體抑制一種類型的細(xì)胞因子誘導(dǎo)的血管發(fā)生的效力。
如圖2A和2B中所示，亦定量了特定mAb的整聯(lián)蛋白免疫反應(yīng)性對上述細(xì)胞因子誘導(dǎo)的血管發(fā)生的效果。如圖2A和2B中分別所示，用或者bFGF或者VEGF刺激血管發(fā)生。每天通過裝有Nikon照相機(jī)的Wild手術(shù)顯微鏡對受處理的眼睛照相。將影像記錄在Kodak Ektachrome 64T幻燈片上，并在通過GS670型成象顯象密度計(jì)獲得后，使用Biorad的Molecular Analyst 1.1軟件，將圖象轉(zhuǎn)換做計(jì)算機(jī)輔助定量。矩形圖描繪了暴露給mAb P1F6或LM609后的平均新血管面積±標(biāo)準(zhǔn)差(兩個(gè)系列中的每個(gè)n=8)。
如圖2A中所示，當(dāng)與用P1F6處理同一動(dòng)物的另一只眼相比時(shí)，LM609將bFGF誘導(dǎo)的血管發(fā)生降低86％(p＜0.005，成對t-檢定)。當(dāng)如圖2B所示使用VEGF刺激血管發(fā)生時(shí)，觀察到相反的效果，其中與LM609處理的眼睛具有對VEGF誘導(dǎo)的血管發(fā)生的最低效果相比，P1F6將新血管形成的平均面積降低60％(p＜0.03，成對t-檢定)。
很明顯，僅新的細(xì)胞因子誘導(dǎo)的血管受暴露給特定的mAb影響，而預(yù)先存在的周緣脈管未受兩種mAb影響，提示觀察到的效果局限于角膜新形成的血管。
用在實(shí)施例3中制備的合成肽進(jìn)行類似的檢測，并如下述用于抑制特異性地與αvβ5表達(dá)相關(guān)的細(xì)胞因子誘導(dǎo)的血管發(fā)生。
這些結(jié)果表明由特定細(xì)胞因子誘導(dǎo)的血管發(fā)生僅受一種類型的抗整聯(lián)蛋白抗體影響，具體地說αvβ5整聯(lián)蛋白受體在VEGF誘導(dǎo)的血管發(fā)生中起作用，為證實(shí)這些結(jié)果，如在下一個(gè)實(shí)施例中所示，用細(xì)胞因子和整聯(lián)蛋白抗體的組合物評價(jià)雞尿囊絨膜(CAM)的另一個(gè)新血管模型。
b．用多肽處理每個(gè)實(shí)驗(yàn)由8只兔子組成，其中兔子的一只眼睛接受包含100納克(ng)bFGF的丸，而另一只眼睛接受包含1微克(ug)VEGF的丸。如上述將所述丸插入角膜口袋，所述細(xì)胞因子接著就刺激新血管生長進(jìn)入角膜。肽在1ml PBS中皮下(s.q.)給予，在插入丸的那天的起始劑量為50ug/kg兔，其后每天皮下劑量以20ug/kg給予。7天后，如上述評價(jià)角膜。
在vFGF和VEGF刺激的眼睛中，接受對照肽的兔子在7天時(shí)均顯示大量角膜血管生長。接受肽85189的兔子顯示與對照相比，在vFGF刺激的眼睛中角膜血管生長的量小于50％，在VEGF刺激的眼睛中幾乎100％抑制。5．雞尿囊絨膜(CAM)制備物中的血管發(fā)生A．未處理CAM的表征1)制備CAM在正常胚胎血管發(fā)生已導(dǎo)致形成成熟血管之后，可以在雞尿囊絨膜(CAM)上誘導(dǎo)血管發(fā)生。如Leibovich等，Nature,329:630(1987)和Ausprunk等，Am.J.Pathol.,79:597(1975)所述，已顯示血管發(fā)生對特定細(xì)胞因子或腫瘤片段應(yīng)答而被誘導(dǎo)。從雞胚制備CAM，以進(jìn)行后續(xù)的誘導(dǎo)血管發(fā)生以及用本發(fā)明的αvβ5拮抗劑如以下和在實(shí)施例6中所述進(jìn)行抑制。
從McIntyre Poultry(Lakeside,CA)得到10日齡的雞胚，并于37C以60％濕度溫育。使用小型專用鉆(crafts drill)Dremel,Division of EmersonElectric Co.,Racine,WI)在蛋的末端直接通過蛋殼在氣囊上穿一小孔。在蛋的寬邊的預(yù)先用對光檢查該蛋確定的無胚胎血管的區(qū)鉆第二個(gè)孔。在第一個(gè)孔施以負(fù)壓，導(dǎo)致CAM(尿囊絨膜)從殼膜扯離，并在CAM上形成一個(gè)假氣囊。使用小型砂輪(Dremel)在掉落的CAM上方的殼切出一個(gè)1.0厘米(cm)×1.0cm的正方形窗口。該小窗口使得可以直接利用下面的CAM。
然后，將產(chǎn)生的CAM制備物于胚胎發(fā)生10天時(shí)使用，此時(shí)血管發(fā)生已減退。因此將該制備物用于本發(fā)明，以誘導(dǎo)對細(xì)胞因子處理應(yīng)答的新生的血管發(fā)生。
2)CAM的組織學(xué)為分析雞胚CAM的顯微結(jié)構(gòu)，在恒冷箱切片機(jī)上從冷凍塊上切下6微米(μm)厚的切片，做免疫熒光分析。
未處理的10日齡的CAM的典型是沒有血管的區(qū)。由于到胚胎發(fā)生的此階段時(shí)，CAM系統(tǒng)中的血管發(fā)生正在減退，該系統(tǒng)可以用于本發(fā)明，以用各種細(xì)胞因子刺激從已存在的脈管產(chǎn)生新血管系統(tǒng)從鄰近區(qū)域向此時(shí)缺乏任何脈管的CAM區(qū)生長。
如在該CAM模型和在以下實(shí)施例中顯示的，當(dāng)血管在正常胚胎發(fā)生或由細(xì)胞因子誘導(dǎo)進(jìn)行新生長時(shí)，所述血管表達(dá)αvβ3和αvβ5。
B.由生長因子誘導(dǎo)的血管發(fā)生如實(shí)施例4A所述，在兔眼模型中血管發(fā)生已顯示由細(xì)胞因子或生長因子誘導(dǎo)。在本文描述的實(shí)驗(yàn)中，在實(shí)施例4中描述的兔角膜制備物中的血管發(fā)生同樣被如本文所述局部用于CAM血管上的生長因子誘導(dǎo)。
通過將用Hanks平衡鹽溶液(HBSS,GIBCO,Grand Island,NY)或含有預(yù)選擇濃度(即測試影響血管發(fā)生的濃度)細(xì)胞因子的HBSS飽和的5毫米(mm)×5mm Whatman濾片(1號Whatman濾紙)置于沒有血管的10日齡雞胚的CAM區(qū)，誘導(dǎo)血管發(fā)生，然后將窗口用膠帶封閉。于72小時(shí)后通過照相顯微鏡監(jiān)視血管發(fā)生。將CAM快速冷凍，然后如實(shí)施例2B和2C中所述用丙酮將6μm恒冷切片固定，并用10μg/ml的選擇的抗整聯(lián)蛋白抗體包括如實(shí)施例1中所述的導(dǎo)向抗αvβ5的抗體，通過免疫熒光染色。
Brooks等，Science,264:569-571(1994)的先前研究已顯示，血管在bFGF和TNF-α處理的制備物中是極其明顯的，但不存在于未處理的CAM。所述作者亦顯示在bFGF誘導(dǎo)的血管發(fā)生之后αvβ3表達(dá)增強(qiáng)。雖然整聯(lián)蛋白β1的表達(dá)與在未處理CAM中觀察到的沒有改變，但β1在受刺激的血管中亦是容易檢測到的。
這些發(fā)表的發(fā)現(xiàn)表明，在人類和雞中，涉及血管發(fā)生的血管均顯示αvβ3的增強(qiáng)表達(dá)。與此一致的是，αvβ3在培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá)由各種體內(nèi)細(xì)胞因子誘導(dǎo)，如Janat等，J.Cell Physiol.,151:588(1992)；Enenstein等，Exp.Cell Res.,203:499(1992)和Swerlick等，J.Invest.Derm.,99:715(1993)所述。
在本發(fā)明中，現(xiàn)已確定一種獨(dú)立的細(xì)胞因子介導(dǎo)途徑，它刺激依賴于一種不同的粘連整聯(lián)蛋白受體αvβ5的表達(dá)和激活的血管發(fā)生。如本文所述的CAM暴露給細(xì)胞因子VEGF、TGF-α和EGF的效果與αvβ5的表達(dá)、與血管發(fā)生和用αvβ5拮抗劑抑制該血管發(fā)生的關(guān)系在實(shí)施例6中進(jìn)行了描述。
C.由腫瘤誘導(dǎo)的血管發(fā)生為研究αvβ5在腫瘤誘導(dǎo)的血管發(fā)生中的作用，將各種αvβ5陰性人類黑素瘤和癌片段用于CAM檢測中，該CAM系從17天雞胚的CAM如Brooks等，J.Cell Biol.,122:1351(1993)和如本文所述預(yù)先生長和分離。
通過直接將腫瘤片段添附在CAM上，在CAM檢測系統(tǒng)中誘導(dǎo)血管發(fā)生。該雞胚CAM的制備與上述程序相同。未使用濾紙片，而將50毫克(mg)至55mg重量的得自如下述細(xì)胞系懸浮液生長的αvβ5陰性腫瘤片段置于CAM上原先沒有血管的區(qū)。
將由Pasqualini等J.Cell Sci.,105:101-111(1993)描述的細(xì)胞系rabdomyosarcoma、髓細(xì)胞樣(HL-60或KG-1)和淋巴樣(T細(xì)胞-Jurkat,HPB/ALL,PEER；和各種B細(xì)胞系)用于在雞胚CAM上生長人類實(shí)體瘤。首先以在總體積為30μl的無菌HBSS中的各種細(xì)胞系的單細(xì)胞懸浮液加在CAM上。用膠帶封閉窗口并將胚胎培養(yǎng)7天使人類腫瘤損害生長。在7天結(jié)束時(shí)(此時(shí)胚胎為17天)，從所述CAM切除腫瘤，并將周圍的CAM組織去除干凈。將腫瘤切成50mg至55mg的腫瘤片段，以用于血管發(fā)生。將所述腫瘤片段置于如實(shí)施例5A中描述的新的一組10天雞胚CAM的無血管區(qū)。
然后用先前描述的mAb P1F6或P5H9，對在有或無局部或靜脈內(nèi)應(yīng)用誘導(dǎo)αvβ5的細(xì)胞因子(VEGF、TGF-α或EGF)的雞胚CAM上體內(nèi)生長的腫瘤進(jìn)行αvβ5表達(dá)染色。
然后如實(shí)施例6C和6D中所述，對這些CAM腫瘤制備物進(jìn)行后續(xù)處理，以測定抗體和包括MMP-2C末端片段的肽對腫瘤誘導(dǎo)的血管發(fā)生的影響。
在一個(gè)實(shí)施方案中，將從加州大學(xué)舊金山分校的Caroline Damsky博士處得到的倉鼠黑素瘤細(xì)胞CS-1用于如上述用于黑素瘤腫瘤形成的CAM檢測。在將約50mgCS-1腫瘤片段轉(zhuǎn)移至新的10天雞胚CAM上之后，獨(dú)立的制備物分別接受靜脈內(nèi)注射或者100μg或者300μg P1F6抗體、LM609抗體或?qū)φ誄SAT(抗β1)抗體。另一對照包括未接受處理的制備物。結(jié)果在以下實(shí)施例6D中討論。6．抑制如在CAM檢測中測定的血管發(fā)生A．通過靜脈內(nèi)應(yīng)用抑制劑抑制生長因子誘導(dǎo)的血管發(fā)生評價(jià)了用靜脈內(nèi)注射入CAM制備物的單克隆抗體對生長因子誘導(dǎo)的血管發(fā)生的影響，做為本發(fā)明的體內(nèi)模型系統(tǒng)使用。
在活動(dòng)性新血管形成之后，一旦脈管停止發(fā)育，αvβ5表達(dá)降低至無法用免疫熒光分析檢測的水平。與成熟脈管缺乏αvβ5表達(dá)相反的這種在進(jìn)行血管發(fā)生的血管中αvβ5表達(dá)調(diào)節(jié)，為本發(fā)明提供了控制和抑制血管發(fā)生的獨(dú)特能力，如以下在CAM血管發(fā)生檢測系統(tǒng)的模型所示。
用于進(jìn)行靜脈內(nèi)注射的雞胚CAM的制備基本上如上述。
首先通過使用生長因子飽和的濾片在10日齡的雞胚上誘導(dǎo)血管發(fā)生。具體地說，在首次檢測中，通過暴露給濃度均為150ng/ml的或者bFGF或者VEGF誘導(dǎo)血管發(fā)生。
對于使用生長因子，在對光檢查程序中選擇顯著的血管，并在蛋殼上做標(biāo)記以標(biāo)明其位置。在蛋殼上鉆孔，使CAM掉落，然后將生長因子飽和的濾紙如上述獨(dú)立地放置于CAM上。用無菌膠帶封閉窗口并將胚胎置于培養(yǎng)箱中。
24小時(shí)后，在蛋殼的側(cè)邊直接在先前選擇的顯著血管之上小心地切出第二個(gè)小窗口。小心地除去外部蛋殼使胚胎膜完整。用一小滴使血管容易看見的礦物油(Perkin-Elmer Corp.Norwalk,CT)使殼膜透明。然后，將磷酸緩沖鹽水(PBS)、PBS中的75μg的純化無菌抗整聯(lián)蛋白抗體或75μg的合成肽(環(huán)狀肽RGDfV,SEQ ID NO 4和對照環(huán)狀肽RADfV,SEQ ID NO 5)注射入在生長因子誘導(dǎo)的CAM上明顯的血管里。用膠帶封閉窗口并使胚胎培養(yǎng)直至72小時(shí)。
在立體顯微鏡中對濾片和代表性的周圍CAM組織照相(圖3A-3F和圖5A-5F)，確定每種條件12個(gè)CAM的平均生血管指數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(圖4A-4B和圖6A-6B)。以雙盲方式通過分析在每個(gè)片的面積內(nèi)血管分枝的數(shù)量和程度，對每個(gè)胚胎的血管發(fā)生計(jì)分。分?jǐn)?shù)范圍為1(低)至4(高)，并通過從所有的數(shù)據(jù)減去本底值1，確定血管發(fā)生指數(shù)。
在CAM模型中整聯(lián)蛋白抗體介導(dǎo)的抑制生長因子誘導(dǎo)的血管發(fā)生的特異性與上述在兔眼角膜模型中觀察到的一致。如分別在圖3A和3B中所示，bFGF和VEGF均在對照PBS處理的CAM中引起血管發(fā)生。然而，用αvβ5特異性抗體P1F6處理，導(dǎo)致如圖3D中所示的抑制VEGF誘導(dǎo)的血管發(fā)生，而如在圖3C中所見，未檢測到對bFGF誘導(dǎo)的血管發(fā)生的抑制。與之相反，LM609αvβ5特異性抗體抑制bFGF誘導(dǎo)的血管發(fā)生(圖3E)，但對VEGF誘導(dǎo)的CAM中的血管發(fā)生幾乎沒有作用(圖3F)。
這些結(jié)果亦分別示于有關(guān)bFGF和VEGF處理的CAM的圖4A和4B的方塊圖中，其中將血管發(fā)生指數(shù)對以未暴露給抗體做為對照的僅暴露給或者LM609或者P1F6作圖。因此，整聯(lián)蛋白特異性抗體對生長因子誘導(dǎo)的血管發(fā)生的抑制取決于生長因子類型。
暴露給含RGD肽支持上述結(jié)果。在存在PBS時(shí)，如圖5A和5B中所示，暴露給bFGF和VEGF均導(dǎo)致在對照CAM中的血管發(fā)生。與之相反，針對αvβ3和αvβ5的環(huán)狀肽拮抗劑RGDfV(SEQ ID NO 4)消除了由或者bFGF或者VEGF誘導(dǎo)的血管發(fā)生。環(huán)狀肽RADfV(SEQ ID NO 5)不影響或者bFGF或者VEGF處理的CAM制備物中的血管發(fā)生。所示結(jié)果亦示于圖6A和6B，其中bFGF和VEGF刺激的CAM的血管發(fā)生指數(shù)以顯示暴露給測試和對照肽作圖。因此，這些發(fā)現(xiàn)與在兔角膜中的發(fā)現(xiàn)一起表明，bFGF和VEGF誘導(dǎo)的血管發(fā)生依賴于獨(dú)特的、但為同源的αv特異性整聯(lián)蛋白，但都可以用環(huán)狀肽RGDfV抑制。
在具有VEGF誘導(dǎo)的血管發(fā)生的CAM模型中進(jìn)行的再一檢測中，如先前所述將2μg肽85189(SEQ ID NO 9)和惰性鹽對應(yīng)物121974獨(dú)立地靜脈內(nèi)注射。與對照肽69601(SEQ ID NO 5)和未處理(以NT為標(biāo)記)制備物的效果相比較，評價(jià)所述肽的效果。
通過測定血管分枝點(diǎn)的數(shù)量，測定所述肽對VEGF誘導(dǎo)的血管發(fā)生的影響。因此，通過計(jì)數(shù)在該濾片范圍內(nèi)發(fā)生的血管分枝點(diǎn)的數(shù)量，定量血管發(fā)生或缺乏血管發(fā)生。認(rèn)為分枝的血管主要對應(yīng)于新生血管出芽血管。以雙盲方式由至少二名觀察者進(jìn)行定量。將該結(jié)果表達(dá)為生血管指數(shù)，其中生血管指數(shù)是每個(gè)濾片的分枝點(diǎn)(VEGF刺激的)的數(shù)量減去分枝點(diǎn)(對照未刺激的)的數(shù)量。實(shí)驗(yàn)常規(guī)是每種條件有6-10個(gè)胚胎。如圖17中所示，肽85189和121974均完全抑制血管發(fā)生，正如與未處理或?qū)φ针奶幚淼闹苽湮锵啾瓤蓽y定分枝點(diǎn)的減少所表明的。
用如在實(shí)施例3中所述制備的合成肽進(jìn)行其它的類似檢測，以定義表現(xiàn)出對αvβ5而不是αvβ3相關(guān)的血管發(fā)生特異性的肽。亦用如在實(shí)施例3和7中所述制備的MMP-2C末端片段和用如在實(shí)施例10中所述制備的有機(jī)分子進(jìn)行檢測。
通過將生長因子的血管發(fā)生誘導(dǎo)分析延伸至包括腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長因子-α(TGF-α)或佛波醇酯4-β-佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯(PMA)，進(jìn)一步確認(rèn)和加強(qiáng)整聯(lián)蛋白抗體抑制生長因子誘導(dǎo)的血管發(fā)生的特異性。
將包括bFGF和VEGF的上述生長因子(細(xì)胞因子)以1.0μg/ml的濃度如先前所述獨(dú)立應(yīng)用于10日齡的CAM模型。以20ng/ml的濃度使用PMA。
在生長因子處理24小時(shí)后，或者通過如上述的單血管內(nèi)劑量或者通過在下一實(shí)施例中描述的局部給予，將抗體LM609和P1F6或者蛋白激酶C(PKC)抑制劑鈣感光蛋白C獨(dú)立地提供給該CAM模型。對于以后3天連續(xù)時(shí)期的血管內(nèi)注射，以每個(gè)胚胎75μg的濃度使用所述抗體，并以100nM的劑量使用鈣感光蛋白C。
在第13天時(shí)，解剖出濾片和相連的CAM組織，并用立體顯微鏡分析血管發(fā)生。以雙盲方式通過分析在所述片面積內(nèi)的血管分枝的數(shù)量和程度給血管發(fā)生計(jì)分。分?jǐn)?shù)范圍從低(1)至高(4)。通過從所有的數(shù)據(jù)減去本底計(jì)分1確定血管發(fā)生指數(shù)。用每種條件5-6個(gè)胚胎重復(fù)實(shí)驗(yàn)2-4次。
如圖7A和7B中分別所示，抗αvβ3抗體LM609阻斷了對bFGF和TNF-α應(yīng)答的血管發(fā)生，而抗αvβ5抗體P1F6幾乎沒有抑制效果。與之相反，如圖7C-7E中分別所示，P1F6對抑制由VEGF、TGF-α或PMA誘導(dǎo)的血管發(fā)生有效，而LM609不能抑制。
PMA是有效的血管發(fā)生誘導(dǎo)劑，它可以激活蛋白激酶C(PKC)，后者為絲氨酸蘇氨酸激酶的胞內(nèi)家族。因此，我們亦檢測了PKC抑制劑鈣感光蛋白C對雞CAM上血管發(fā)生的影響。Calphostin C阻斷了由PMA(圖7E)以及VEGF和TGF-α(分別示于圖7C和7D)誘導(dǎo)的血管發(fā)生而對bFGF或TNF-α介導(dǎo)的血管發(fā)生(分別示于圖7A和7B)有最小效果。
總而言之，這些結(jié)果表明存在兩個(gè)獨(dú)立的獨(dú)特血管發(fā)生途徑，其中一個(gè)途徑如Brooks等，Science,264:569-571(1994)先前所述，依賴于αvβ3介導(dǎo)信號，其主要不依賴于PKC，第二個(gè)途徑由關(guān)鍵依賴PKC激活的αvβ5介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)信號增強(qiáng)。
除上述實(shí)驗(yàn)之外，為確定P1F6和LM609 mAb在靜脈內(nèi)接種了LM609的CAM組織中的定位，于室溫將固定的切片用HBSS中的2.5％BSA封閉1小時(shí)，接著通過用1∶250稀釋的山羊抗小鼠若丹明標(biāo)記的二級抗體(Tago)染色。然后用Zeiss免疫熒光化合物顯微鏡分析切片。
B．通過局部應(yīng)用抑制劑抑制生長因子誘導(dǎo)的血管發(fā)生為確定αvβ5是否在血管發(fā)生中起活躍的作用，將如上述用生長因子飽和的濾片置于CAM上，以誘導(dǎo)血管發(fā)生并接著應(yīng)用或者P1F6或者LM609。
然后用50ml含有25mg mAb的HBSS，總體積25μl無菌HBSS于0、24和48小時(shí)處理濾片。72小時(shí)后，收獲CAM并置于35mm陪替氏培養(yǎng)皿中，并用1ml PBS清洗一次。然后在Olympus立體顯微鏡下以雙盲方式由兩個(gè)觀察者分析濾紙的底面和CAM組織。當(dāng)CAM表現(xiàn)出在直接位于濾片下的CAM血管浸潤方面有大于50％的減少時(shí)，就認(rèn)為血管發(fā)生抑制是顯著的。每種抗體重復(fù)實(shí)驗(yàn)4次，每種條件有6-7個(gè)胚胎。
為檢測整聯(lián)蛋白抗體對來自正常脈管發(fā)育的預(yù)先存在的鄰近無脈管區(qū)的成熟血管的影響，將用mAb飽和的濾片置于未接受局部應(yīng)用細(xì)胞因子的10天胚胎的CAM血管化區(qū)域上。
亦用本發(fā)明的合成肽進(jìn)行CAM檢測，以確定環(huán)狀和線性肽對生長因子誘導(dǎo)的血管發(fā)生的影響。如前述制備的8μg肽獨(dú)立地存在于總體積25μl的無菌HBSS中。立即將該肽溶液應(yīng)用于該CAM制備物上，并且然后于24和48小時(shí)再次應(yīng)用。于72小時(shí)，將該濾紙和周圍的CAM組織解剖并如上述觀察。
用分別如實(shí)施例7和10所述制備的所述MMP-2片段和有機(jī)分子進(jìn)行類似的檢測。
C．通過局部應(yīng)用抑制腫瘤誘導(dǎo)的血管發(fā)生1)用單克隆抗體處理除了上述評價(jià)抗αvβ5抗體和肽拮抗劑影響的血管發(fā)生檢測之外，亦調(diào)查了αvβ5在腫瘤誘導(dǎo)的血管發(fā)生中的作用。做為誘導(dǎo)物，使用了預(yù)先生長和分離自17天雞胚CAM的αvβ5陰性人類組織。如在實(shí)施例5C中所述制備所述片段。
如上所述，以25μg在25μl HBSS中的濃度將mAb獨(dú)立的局部應(yīng)用于所述腫瘤片段，并用膠帶封閉窗口。以同樣方式于24小時(shí)和48小時(shí)再次加入mAb。于72小時(shí)，如上述分析所述腫瘤和周圍的CAM組織。
如在實(shí)施例5C中所述，通過移植不表達(dá)整聯(lián)蛋白αvβ5的人類細(xì)胞系到10日齡雞胚CAM上，初始產(chǎn)生腫瘤。
為定量所述mAb對腫瘤誘導(dǎo)的血管發(fā)生的影響，以雙盲方式由兩個(gè)觀察者在立體顯微鏡下計(jì)數(shù)進(jìn)入該CAM病灶平面內(nèi)的腫瘤的血管。
類似地將在實(shí)施例3中制備的合成肽、描述于實(shí)施例7中的MMP-2制備物和在實(shí)施例10中制備的有機(jī)分子如上述局部應(yīng)用于所述腫瘤誘導(dǎo)的生血管CAM檢測系統(tǒng)。類似地評價(jià)包括本發(fā)明描述的MMP-2制備物和有機(jī)分子的所述肽對所述脈管生存能力的影響。
D．通過靜脈內(nèi)應(yīng)用抑制腫瘤誘導(dǎo)的血管發(fā)生1)用單克隆抗體處理亦用通過靜脈內(nèi)注射應(yīng)用的mAb處理上述制備的腫瘤誘導(dǎo)的血管。如實(shí)施例5C中所述將CS-1黑素瘤腫瘤置于CAM上，并用膠帶封閉窗口，24小時(shí)后如前述將100-300μg純化的mAb一次靜脈內(nèi)接種入雞胚血管中。然后使所述雞胚培養(yǎng)7天。然后如上述觀察血管發(fā)生的程度。在此時(shí)期后，切除腫瘤并通過其腫瘤分析，以確定抗體暴露對腫瘤生長或抑制的影響。
用300μgαvβ5特異性抗體P1F6處理CS-1腫瘤的結(jié)果示于圖8。與未處理的和CSAT處理的腫瘤相比，該腫瘤重量顯著地降低至小于50mg。αvβ3特異性抗體LM609亦抑制腫瘤生長，但是比用P1F6的效力低。用接受100μgP1F6處理的腫瘤得到了相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果。因此，P1F6有效地抑制αvβ5介導(dǎo)的CAM制備物上腫瘤模型的血管發(fā)生，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞團(tuán)減小。
2)用其它αvβ5拮抗劑處理亦評價(jià)了肽、MMP-2制備物或有機(jī)分子對腫瘤誘導(dǎo)的CAM檢測系統(tǒng)中的血管發(fā)生的影響。如上述使用該腫瘤-CAM制備物，除了不靜脈內(nèi)注射mAb，將如實(shí)施例7中所述制備的MMP-2制備物和實(shí)施例10中制備的有機(jī)分子獨(dú)立地靜脈內(nèi)注射入可見的血管。
在特定的一組檢測中，用抗69601(SEQ ID NO 5)的所述αvβ5反應(yīng)性肽85189(SEQ ID NO 9)做為對照，進(jìn)行另外的腫瘤退化檢測。如上述進(jìn)行所述檢測，除了將100ug肽于各種腫瘤植入后的18小時(shí)時(shí)靜脈內(nèi)注射入該CAM，此時(shí)所述腫瘤包括UCLAP-3、M21-L和FgM腫瘤類型。再過48小時(shí)后，切除所述腫瘤并得到濕重。
圖18、19和20分別顯示與用或者PBS或者肽69601的缺乏效果相反的、在靜脈內(nèi)暴露給肽851 89后UCLAP-3、M21-L和FgM腫瘤的腫瘤重量的減少。7．鑒別通過抑制細(xì)胞附著和通過配體-受體結(jié)合檢測檢測到的αvβ5特異性拮抗劑A．抑制細(xì)胞附著做為確定本發(fā)明的拮抗劑的整聯(lián)蛋白受體特異性的一種方法，如下述進(jìn)行細(xì)胞附著抑制檢測。
簡言之，如先前Filardo等，J.Cell Biol.,130:441-450(1995)所述，用表達(dá)β5亞基的質(zhì)粒首先轉(zhuǎn)染缺乏αvβ3和αvβ5表達(dá)的CS-1倉鼠黑素瘤細(xì)胞。通過阻斷表達(dá)αvβ5的CS-1細(xì)胞與VN或?qū)诱尺B蛋白包被的平板結(jié)合的能力，確定潛在的αvβ5拮抗劑的特異性。做為典型檢測的實(shí)例，將孔首先用10ug/ml底物包被過夜。在清洗和用PBS中的1％熱變性BSA于室溫封閉30分鐘后，將濃度范圍0.0001uM至100uM的肽85189(SEQID NO 9)獨(dú)立地與CS-1細(xì)胞混合，以50,000細(xì)胞/孔的細(xì)胞數(shù)量加入孔中。于37C溫育10-15分鐘后，將含有細(xì)胞和肽的溶液廢棄。在用1％結(jié)晶紫染色后測定附著細(xì)胞的數(shù)量。通過加入100微升(μl)10％乙酸洗脫與細(xì)胞相連的結(jié)晶紫。通過于600nm波長測定該洗脫結(jié)晶紫的光密度對細(xì)胞附著定量。
用融合蛋白或含有該MMP-2蛋白的各種區(qū)的合成肽對應(yīng)物進(jìn)行類似的檢測。所述MMP-2源多肽包括在與αvβ5結(jié)合相互作用中活躍的并由此可以抑制MMP-2激活和相關(guān)活性的MMP-2C末端區(qū)。這些多肽或者做為具有源自如實(shí)施例1中所述的MMP-2C末端域的序列的合成多肽或者做為包括所有或部分如下述制備的MMP-2C末端域的融合蛋白制備。MMP-2C末端分子均提呈雞和人類特異性序列。
雞源MMP-2C末端域(亦稱為與鉸鏈區(qū)緊密鄰近的血紅素結(jié)合蛋白域)包含MMP-2的氨基酸殘基445-637。雞MMP-2的完整核苷酸序列和編碼的氨基酸序列在以下描述并示于圖15A和15B中，所述核苷酸序列和氨基酸序列分別列為SEQ ID NO 23和24。以下亦描述了人類MMP-2核苷酸序列和編碼的氨基酸序列，后者示于圖16和SEQ ID NO25。人類MMP-2中對應(yīng)于雞的445-637區(qū)的C末端域開始于氨基酸殘基439并結(jié)束于631，因?yàn)槿鐖D15A和15B中所示，該人類序列中缺失6個(gè)殘基。用于實(shí)踐本發(fā)明方法的人類和雞源的C末端MMP-2合成肽均列于表1。所述合成肽的氨基酸殘基序列與通過重組融合蛋白對應(yīng)物產(chǎn)生的那些氨基酸殘基序列相同但沒有GST融合組分。如下述制備源自雞和人類的C末端MMP-2融合蛋白。
MMP-2融合蛋白是具有與諸如谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)的載體(融合)蛋白融合(通過共價(jià)肽鍵可操作地連接)的MMP-2C末端域序列或其部分的嵌合多肽。
為擴(kuò)增雞和人類MMP-2的各個(gè)區(qū)，基于已知的雞和人類MMP-2分別的cDNA序列設(shè)計(jì)引物序列。將亦稱為明膠酶原的未加工雞MMP-2的cDNA核苷酸序列的完整的上鏈與示于第二行的推測氨基酸序列(Aimes等，Biochem J.,300:729-736,1994)一起示于圖15A和15B。該圖的第三和第四行分別顯示人類(Collier等，J.Biol.Chem.,263:6579-6587(1988))和小鼠MMP-2(Reponen等，J.Biol.Chem.,267:7856-7862(1992))的推測氨基酸序列。相同的殘基用點(diǎn)標(biāo)明，而不同的殘基則以其單字母IUPAC字給出。缺失的殘基用破折號標(biāo)明。氨基酸殘基的編號從該酶原的第一個(gè)殘基開始，信號肽的殘基則以負(fù)數(shù)編號。如此在圖中將核苷酸序列編號，但在序列表中將第一個(gè)核苷酸列為1號。用三個(gè)向前的箭頭標(biāo)記推定的翻譯起點(diǎn)(ATG)，并用星號標(biāo)明翻譯終止信號(TGA)。雞酶原和活性酶的氨基末端序列用菱形和單箭頭包括。如前述，將雞明膠酶原核苷酸序列和氨基酸殘基序列一起做為SEQ IDNO 23列出，而將編碼的氨基酸殘基序列獨(dú)立地做為SEQ ID NO 24列出。
產(chǎn)生雞MMP-2擴(kuò)增區(qū)的模板或者是編碼全長成熟雞MMP-2多肽的cDNA(由紐約州立大學(xué)Stoney Brook分校(紐約)的J.P.Quigley博士提供)，或者是通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從雞尿囊絨膜組織切除的樣本得到的總細(xì)胞RNA制備的cDNA。對于后者，用MuL V逆轉(zhuǎn)錄酶和對3’末端核苷酸特異性的下游引物5’ATTGAATTCTTCTACAGTTCA3’(SEQ ID NO 26)得到該cDNA，所述下游引物的5’和3’末端分別互補(bǔ)于發(fā)表的雞MMP-2序列的核苷酸1932-1912)。如圖15的圖例中所示，本文描述的引物的核苷酸位置對應(yīng)于在該圖中顯示的那些位置，而不對應(yīng)于在序列表中顯示的那些位置，因?yàn)楹笳咭詳?shù)字1開始，而不是如該圖例中所示的負(fù)數(shù)。按照GeneAmp RNA PCR試劑盒(Perkin Elmer)制造商的說明書，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)。亦將該引物工程改造以含有內(nèi)部EcoRⅠ限制位點(diǎn)。
從上述cDNA模板的二者之一，通過用上述列出的3’引物(SEQ IDNO 26)與以下列出的多種5’引物的一種配對的PCR，得到一些雞MMP-2 C末端區(qū)，它們均在羧基末端的位置637具有天然半胱氨酸殘基。所述擴(kuò)增區(qū)編碼以下MMP-2融合蛋白，其序列對應(yīng)于圖15A和15B中所示的并亦列于SEQ ID NO 24的氨基酸殘基位置1)203-637；2)274-637；3)292-637；4)410-637；5)445-637。設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增編碼以上列出的MMP-2融合蛋白的每個(gè)核苷酸區(qū)的上游或5’引物，以編碼在工程改造的(即PCR導(dǎo)入的)內(nèi)部BamHⅠ限制位點(diǎn)3’的多肽起始位點(diǎn)，以使定向連接入或者pGEX-1λT或者pGEX-3X表達(dá)載體。5’引物包括以下序列，其5’和3’末端對應(yīng)于該圖中所示的雞MMP-2序列標(biāo)明的5’和3’核苷酸位置(亦對每個(gè)引物標(biāo)明了氨基酸殘基位置起始位點(diǎn))1)核苷酸599-619，編碼203起始位點(diǎn)5’ATGGGATCCACTGCAAATTTC3’(SEQID NO 27)；2)核苷酸809-830，編碼274起始位點(diǎn)5’GCCGGATCCATGACCAGTGT’A3’(SEQ D NO 28)；3)核苷酸863-883，編碼292起始位點(diǎn)5’GTGGGATCCCTGAAGACTATG3’(SEQ D NO 29)；4)核苷酸1217-1237，編碼410起始5’AGGGGATCCTTAAGGGGATTC3’(SEQID NO 30)；和5)核苷酸1325-1345，編碼445起始位點(diǎn)5,CTCGGATCCTCTGCAAGCACG3’(SEQ ID NO 31)。
隨后按照制造商關(guān)于擴(kuò)增高保真性PCR系統(tǒng)(BoehringerMannheim)的說明書，對該模板DNA的標(biāo)明的核苷酸區(qū)擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)(退火溫度55C)。將產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物凝膠純化，用BamHⅠ和EcoRⅠ限制性酶消化，并在連接入在連接反應(yīng)之前已類似地消化以及脫磷酸的或者pGEX-1λT或者pGEX-3X載體(Pharmacia Biotech,Uppsala,Sweden)之前再次純化。質(zhì)粒的選擇基于擴(kuò)增產(chǎn)物所需的閱讀框架。通過熱休克用獨(dú)立的構(gòu)建物轉(zhuǎn)化感受態(tài)的大腸桿菌菌株BSJ72或者BL21細(xì)胞。在對陽性克隆雙脫氧測序以確認(rèn)導(dǎo)入編碼序列的完整性之前，通過PCR篩選產(chǎn)生的加入相應(yīng)MMP-2融合蛋白編碼質(zhì)粒的菌落。另外，通過表達(dá)適當(dāng)大小的GST-MMP-2融合蛋白，證實(shí)質(zhì)粒加入的確認(rèn)。
基本上如GST基因融合系統(tǒng)(Pharmacia Biotech)的制造商所述，使用IPTG誘導(dǎo)的對數(shù)期培養(yǎng)物進(jìn)行每種重組GST-MMP-2融合蛋白的純化。簡言之，通過超聲處理裂解回收的細(xì)菌，并在澄清和在sepharose 4B偶聯(lián)的谷胱甘肽(Pharmacia Biotech)固定化該重組蛋白之前，與去污劑溫育。在充分清洗后，用50 mM Tris-HCl,pH8.0中的10mM還原的谷胱甘肽從該親和基質(zhì)獨(dú)立洗脫固定化的融合蛋白，并對PBS充分地透析，以在使用之前除去殘留的谷胱甘肽。
先前嘗試產(chǎn)生雞MMP-2殘基445和637之間的、只有一個(gè)編碼的半胱氨酸殘基的融合蛋白，產(chǎn)生不溶性產(chǎn)物。因此，為制備源自該C末端區(qū)、不包括存在于先前描述的融合蛋白中的內(nèi)源末端半胱氨酸殘基的其它可溶性MMP-2融合蛋白，將核苷酸序列導(dǎo)入擴(kuò)增的MMP-2區(qū)，以編碼需要時(shí)根據(jù)特定融合蛋白的半胱氨酸殘基。半胱氨酸殘基天然地存在于雞MMP-2序列的位置446和位置637。在人類序列中，這些位置分別對應(yīng)于440和631。因此，設(shè)計(jì)融合蛋白以在目的雞MMP-2序列的氨基或羧基末端含有工程改造的末端半胱氨酸殘基，以與另一末端的天然存在的半胱氨酸提供二硫鍵，如該構(gòu)建物需要的。如實(shí)施例3中先前所述，類似地制備雞和人類的合成MMP-2片段。
如此設(shè)計(jì)寡聚核苷酸引物，以擴(kuò)增用于表達(dá)可溶性MMP-2/GST融合蛋白的雞MMP-2C末端區(qū)。擴(kuò)增的雞MMP-2C末端區(qū)包括編碼氨基酸殘基位置445-518、445-552、516-637和549-637的那些區(qū)。對于含有殘基517的融合蛋白，用半胱氨酸置換天然編碼的酪氨酸殘基，以與位于殘基位置446或者637的半胱氨酸之一形成二硫鍵。對于含有殘基551的融合蛋白，用半胱氨酸置換天然編碼的色氨酸殘基，以與位于殘基位置446或者637的天然編碼的半胱氨酸之一形成二硫鍵。
簡言之，使用編碼重組GST/MMP-2(410-637)融合蛋白的如上述制備的pGEX-3X質(zhì)粒構(gòu)建物做為按照擴(kuò)增高保真性PCR試劑盒(Boehringer Mannheim)的制造商方案的擴(kuò)增模板，該擴(kuò)增使用了一組寡聚核苷酸引物，其設(shè)計(jì)是基于發(fā)表的雞MMP-2序列(亦示于圖15A和圖15B和SEQ ID NO 23)。一個(gè)上游引物具有核苷酸序列(5’CTCGGATCCTCTGCAAGCACG3’(SEQ ID NO 32))，該引物被設(shè)計(jì)編碼起始位點(diǎn)位于在用于插入pGEX-3X GST載體的工程化內(nèi)部BamHⅠ核酸內(nèi)切酶限制位點(diǎn)之后的位置445的雞MMP-2蛋白。該引物的5’和3’端分別對應(yīng)于圖15A和15B中的雞MMP-2序列的位置1325-1345。另一設(shè)計(jì)以編碼位于在用于插入pGEX-1λT GST載體的工程化內(nèi)部BamHⅠ限制位點(diǎn)之后的位置516的雞MMP-2蛋白起始位點(diǎn)和在位置517編碼半胱氨酸殘基的上游引物，具有核苷酸序列(5’GCAGGATCCGAGTGCTGGGTTTATAC3’(SEQ ID NO 33))。該引物的5’和3’末端分別對應(yīng)于該圖中的雞MMP-2序列的位置1537-1562。設(shè)計(jì)以編碼位于在用于插入pGEX-1λT GST載體的工程化內(nèi)部EcoRⅠ核酸內(nèi)切酶限制位點(diǎn)之后的位置549的雞MMP-2蛋白起始位點(diǎn)和在位置551編碼半胱氨酸殘基的第三個(gè)上游引物，具有核苷酸序列(5’GCAGAATTCAACTGTGGCAGAAACAAG3’(SEQ ID NO 34))。該引物的5’和3’末端分別對應(yīng)于該圖中的雞MMP-2序列的位置1639-1665。
將這些上游引物獨(dú)立與下列下游引物之一使用，以產(chǎn)生源自雞MMP-2C末端域的上述區(qū)。設(shè)計(jì)以在位置518編碼雞MMP-2蛋白終止位點(diǎn)、在位置517編碼半胱氨酸殘基、和含有用于插入GST載體的內(nèi)部EcoRⅠ核酸內(nèi)切酶限制位點(diǎn)的第一個(gè)下游引物(反義)，具有核苷酸序列(5’GTAGAATTCCAGCACTCATTTCCTGC3’(SEQ ID NO 35))。以5’-3’方向書寫的該引物的5’和3’末端分別與該圖中的雞MMP-2序列的位置1562-1537部分互補(bǔ)。設(shè)計(jì)以在位置552編碼雞MMP-2蛋白終止位點(diǎn)、在位置551編碼半胱氨酸殘基、和含有用于插入GST載體的內(nèi)部EcoRⅠ核酸內(nèi)切酶限制位點(diǎn)的第二個(gè)下游引物，具有核苷酸序列(5’TCTGAATTCTGCCACAGTTGAAGG3’(SEQ ID NO 36))。以5’-3’方向書寫的該引物的5’和3’末端分別與該圖中的雞MMP-2序列的位置1666-1643部分互補(bǔ)。設(shè)計(jì)以在位置637編碼雞MMP-2蛋白終止位點(diǎn)和含有用于插入GST載體的內(nèi)部EcoRⅠ核酸內(nèi)切酶限制位點(diǎn)的第三個(gè)下游引物，具有核苷酸序列(5’ATTGAATTCTTCTACAGTTCA3’(SEQID NO 37))。以5’-3’方向書寫的該引物的5’和3’末端分別與該圖中的雞MMP-2序列的位置1932-1912部分互補(bǔ)。
將由以特定組合使用以產(chǎn)生含有至少一個(gè)如上述的工程化半胱氨酸殘基的上述上游和下游引物連接的雞MMP-2羧基末端區(qū)，按照擴(kuò)增高保真性PCR系統(tǒng)(Boehringer Mannheim)的制造商說明書獨(dú)立地用55C的退火溫度擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)。將產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物獨(dú)立地純化，根據(jù)需要用BamHⅠ和或用EcoRⅠ限制性酶消化，并在連接入適當(dāng)?shù)腉ST融合蛋白載體(或者pGEX-3X或者pGEX-1λT，如由該上游寡聚核苷酸引物的閱讀框架所表明)之前再次純化。為連接所述擴(kuò)增的MMP-2產(chǎn)物，在連接反應(yīng)之前將所述載體類似地消化和脫磷酸。然后用產(chǎn)生的含有MMP-2的載體構(gòu)建物通過熱休克獨(dú)立地轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌菌株BL21細(xì)胞。在對陽性克隆雙脫氧測序以確認(rèn)導(dǎo)入編碼序列的完整性之前，通過PCR和適當(dāng)大小的GST融合蛋白的產(chǎn)生，篩選編碼適當(dāng)大小融合蛋白的質(zhì)粒的菌落?；旧先缟鲜霎a(chǎn)生其它GST-MMP-2融合蛋白那樣，使用IPTG誘導(dǎo)的對數(shù)期培養(yǎng)物進(jìn)行重組GST融合蛋白的純化。
除上述雞MMP-2 GST融合蛋白之外，制備兩個(gè)人類MMP-2 GST融合蛋白，以表達(dá)成熟人類MMP-2酶原多肽的氨基酸區(qū)203-631和439-631。標(biāo)明的區(qū)分別對應(yīng)于雞MMP-2區(qū)203-637和445-637。如上述對雞MMP-2-GST融合蛋白那樣，使用由國立癌癥研究院，Bethesda,MD的W.G.Stetler-Stevenson博士提供的編碼完整人類MMP-2開放閱讀框的cDNA模板，通過PCR產(chǎn)生人類MMP-2-GST融合蛋白?；谙惹鞍l(fā)表的人類MMP-2序列(Collier等，J.Biol.Chem.,263:6579-6587(1988))設(shè)計(jì)上游5’引物序列，以編碼導(dǎo)入的內(nèi)部EcoRⅠ限制位點(diǎn)，以將擴(kuò)增的產(chǎn)物插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體。
一個(gè)設(shè)計(jì)以編碼位于在用于插入pGEX-1λT GST載體的工程化內(nèi)部EcoRI核酸內(nèi)切酶限制位點(diǎn)之后的位置203的人類MMP-2蛋白起始位點(diǎn)的上游引物，具有核苷酸序列(5’GATGAATTCTACTGCAAGTT3’(SEQ ID NO 38))。該引物的5’和3’末端分別對應(yīng)于該人類MMP-2開放閱讀框架序列的位置685-704。另一個(gè)設(shè)計(jì)以編碼位于在用于插入pGEX-1λT GST載體的工程化內(nèi)部EcoRⅠ限制位點(diǎn)之后的位置439的人類MMP-2蛋白起始位點(diǎn)的上游引物，具有核苷酸序列(5’CACTGAATTCATCTGCAAACA3’(SEQ ID NO 39))。該引物的5’和3’末端分別對應(yīng)于該人類MMP-2開放閱讀框架序列的位置1392和1412。
將上述引物的每種獨(dú)立地與具有與結(jié)尾遠(yuǎn)離MMP-2開放閱讀框架并指導(dǎo)蛋白在氨基酸殘基631后終止的5’和3’末端與人類MMP-2序列的堿基1998和1978分別互補(bǔ)的一種下游引物一起使用。產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物表達(dá)含有人類MMP-2氨基酸殘基203-631(SEQ ID NO 40)和439-631(SEQ ID NO 12)的融合蛋白。
將產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物純化，用EcoRⅠ消化并在連接反應(yīng)之前，為連接入類似地消化和脫磷酸的pGEX-1λT質(zhì)粒再純化。如上述轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
也如上述制備含有氨基酸殘基410-631(SEQ ID NO 11)、439-512(SEQ ID NO 13)、439-546(SEQ ID NO 14)、510-631(SEQ ID NO 15)和543-631(SEQ ID NO 16)的其它人類MMP-2融合蛋白，以用于本發(fā)明的方法。
B．配體-受體結(jié)合檢測將分別于實(shí)施例1和3中制備的αvβ5免疫反應(yīng)性抗體和合成肽，通過測定其在純化的配體-受體結(jié)合檢測中拮抗αvβ5、αvβ3和αⅡbβ3受體結(jié)合活性的能力進(jìn)行篩選。這些結(jié)合研究的方法已由Barbas等，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,90:10003-10007(1993)、Smith等，J.Biol.Chem.,265:11008-11013(1990)和Pfaff等，J.Biol.Chem.,269:20233-20238(1994)描述，其說明書通過引用結(jié)合到本文中。
描述了在配體-受體結(jié)合檢測中鑒別拮抗劑的方法，其中該受體被固定到固相支持體上，并且該配體和拮抗劑是可溶性的。亦描述了一種配體-受體結(jié)合檢測，其中該配體被固定到固相支持體上，并且該受體和拮抗劑是可溶性的。
簡言之，以50納克(ng)/孔的包被濃度將選擇的純化整聯(lián)蛋白獨(dú)立地固定于Titertek微滴定孔中。用于所述配體-受體結(jié)合檢測的受體的純化是本領(lǐng)域眾所周知的，并可以用本領(lǐng)域一般技術(shù)人員熟悉的方法容易地得到。于4C溫育18小時(shí)后，用Tris緩沖鹽水中的10毫克/毫升(mg/ml)牛血清白蛋白(BSA)封閉平板上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。對于抑制研究，測試選定抗體或肽的各種濃度的阻斷125I-玻連蛋白或其它標(biāo)記的配體與整聯(lián)蛋白受體αvβ5、αvβ3、αvβ1和αⅡbβ3結(jié)合的能力。
盡管這些配體表現(xiàn)出對特定整聯(lián)蛋白的最佳結(jié)合，例如玻連蛋白對αvβ5和αvβ3，血纖蛋白原對αⅡbβ3，使用阻斷玻連蛋白與所述受體之一的結(jié)合的或者抗體或者肽的結(jié)合抑制研究，使得可以精確地測定半最大抑制受體與配體結(jié)合必需的以微摩爾濃度(μM)計(jì)的量。使用濃度為1nM的放射性標(biāo)記的配體，并用未標(biāo)記合成肽獨(dú)立地競爭結(jié)合。3小時(shí)溫育后，清洗除去游離的配體，并通過γ計(jì)數(shù)檢測結(jié)合的配體。
因此，將本文描述的配體-受體結(jié)合檢測用于篩選表現(xiàn)出對特定整聯(lián)蛋白受體(具體地說即αvβ5)選擇性特異性的環(huán)狀或線性合成肽以及單克隆抗體和有機(jī)分子，做為實(shí)踐本發(fā)明中的玻連蛋白受體(αvβ5)拮抗劑使用。8．通過嵌合小鼠人檢測測定的用αvβ5拮抗劑的腫瘤組織生長的體內(nèi)退化通過用人新生兒包皮代替SCID小鼠皮膚的一部分，制備體內(nèi)嵌合小鼠人模型?；旧先鏨an等，J.Clin.Invest.,91:986-996(1993)所述制備該體內(nèi)嵌合小鼠人模型。簡言之，從SCD小鼠(6-8周齡)手術(shù)切除2cm2正方面積，并用人包皮代替。將該小鼠麻醉，并通過剃須從側(cè)腹區(qū)的每邊5cm2區(qū)除去毛發(fā)。通過除去皮膚全厚度直至筋膜，制備兩個(gè)環(huán)狀的2cm2移植床。將源自人新生兒包皮的同樣大小的全厚度人皮膚移植物置于該創(chuàng)口床并縫合到位。使用縫合至皮膚的Band-Aid覆蓋該移植物。使用微孔紗布(clothtape)覆蓋該傷口。
建立該皮膚移植物后，用黑素瘤細(xì)胞接種該人類包皮。使用M21L人類黑素瘤細(xì)胞系，以在該SCID小鼠上的人皮膚移植物上形成人類實(shí)體瘤。將2×106M21L的單細(xì)胞懸浮液皮內(nèi)注射入該人類皮膚移植物。然后觀察該小鼠2-4周，以使可測定的人類腫瘤生長。
在可測定的腫瘤建立后，將250μg的或者具有SEQ ID NO 9(含RGD環(huán)狀肽Arg-Gly-Asp-D-Phe-Asn-NMeVal)的肽(體積為100μl)或者對照肽環(huán)Arg-βAla-Asp-D-Phe-Val在三周內(nèi)每周三次腹膜內(nèi)注射入該小鼠。該時(shí)間結(jié)束時(shí)，摘除該腫瘤并通過重量和組織學(xué)分析。
結(jié)果示于圖9，其中以mm3計(jì)的腫瘤體積在Y軸上相對于X軸上的肽處理作圖。與腫瘤體積大于300mm3的對照肽(標(biāo)記為肽601)相比，在該圖中標(biāo)記為肽189的具有SEQ ID NO 9的測試肽顯著地將腫瘤體積降低至約25mm3。
因此，通過靜脈內(nèi)使用αvβ5拮抗劑肽189阻斷αvβ5受體，導(dǎo)致該模型系統(tǒng)中黑素瘤腫瘤的退化，與前述CAM和兔眼模型系統(tǒng)中的方式一樣。
在用M21-L黑素瘤腫瘤細(xì)胞在該小鼠人嵌合檢測系統(tǒng)中的其它實(shí)驗(yàn)中，將用mAB LM609的應(yīng)答與用合成肽85189(SEQ ID NO 9)與對照合成肽69601(SEQ ID NO 5)相比得到的應(yīng)答相比較。如上述進(jìn)行檢測。示于圖21中的結(jié)果證實(shí)，與腫瘤體積為約360mm3的對照肽相比，合成肽85189顯著地將腫瘤體積降低至約25mm3。mAB LM609亦顯著地將腫瘤體積降低至60mm3。
因此，通過靜脈內(nèi)使用αvβ3特異性LM609抗體和肽阻斷αvβ3受體，導(dǎo)致與本發(fā)明描述的其它模型系統(tǒng)相比的該模型系統(tǒng)中癌的退化。
在使用具有可測定M21-L中瘤的SCD小鼠模型的另外檢測中，在一初步分析中，對以10-250μg/ml濃度范圍注射的肽69601(對照)和85189(測試)進(jìn)行劑量反應(yīng)曲線。確定處理后切除的腫瘤的平均體積和重量，結(jié)果分別示于圖22A和22B。與用對照肽處理相比，肽85189在測試濃度范圍內(nèi)有效抑制M21-L中瘤生長，最有效的劑量為250μg/ml。
為分析肽85189隨時(shí)間進(jìn)程的處理效力，在同一SCD腫瘤模型中評價(jià)兩個(gè)處理制度。在一個(gè)檢測中，在第6天時(shí)開始用或者肽85189或者69601處理，第0天則是將3×106細(xì)胞的M21-L中瘤皮下注射入小鼠皮膚，每隔一天用250μg/ml的肽85189或?qū)φ?9601腹膜內(nèi)注射直至29天。同樣地進(jìn)行另一檢測，除了在第20天時(shí)開始處理。在檢測結(jié)束時(shí)，切除腫瘤并測定以mm3計(jì)的平均腫瘤體積。以此值±平均標(biāo)準(zhǔn)差將該數(shù)據(jù)作圖。
分別示于圖23A和23B中的這些檢測的結(jié)果表明，取決于特定的處理制度，肽85189而不是69601抑制開始處理后各天的腫瘤生長。因此，肽85189是血管發(fā)生和由此的腫瘤生長的有效的αvβ5拮抗劑。
亦將該SCID/人嵌合模型用于評價(jià)本發(fā)明的其它αvβ5拮抗劑的效力，即先前制備的抗體、MMP-2制備物和有機(jī)分子，后者如實(shí)施例10中所述制備。9．制備αvβ5介導(dǎo)的視網(wǎng)膜血管發(fā)生的鼠小鼠模型以及用αvβ5拮抗劑的抑制基于實(shí)施例2C中對αvβ3和αvβ5在視網(wǎng)膜新血管組織中表達(dá)的觀察，使用一新的小鼠模型研究系統(tǒng)給予這兩種整聯(lián)蛋白的環(huán)狀肽拮抗劑對視網(wǎng)膜血管發(fā)生的影響。新生小鼠以與在其它哺乳動(dòng)物和人類中觀察到的類似方式，在出生后的頭二周內(nèi)發(fā)育視網(wǎng)膜脈管，在此期間表面視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)形成了豐富、高度分枝的脈管網(wǎng)絡(luò)，其起始于視神經(jīng)頭并向周邊輻射覆蓋視網(wǎng)膜表面(Jiang等，Glia,15:1-10(1995)。
對于該模型，用環(huán)狀肽kRGDfV(SEQ ID NO 4)(亦稱為肽203)或?qū)φ针腞ADfV(SEQ ID NO 5)從第0天開始，每天二次皮下注射新生小鼠4天。在出生后第5天，取出眼球并于室溫在4.0％多聚甲醛(PFA)中固定。
為定量小鼠視網(wǎng)膜血管發(fā)生，測定從視神經(jīng)頭至選自12小時(shí)時(shí)鐘的六個(gè)相等扇形中每個(gè)的單根脈管的最遠(yuǎn)點(diǎn)的距離。計(jì)算平均距離，并與從整個(gè)同窩仔中得到的類似數(shù)據(jù)平均。為測定視網(wǎng)膜血管的總體積，以2.0μm光學(xué)切片掃描整個(gè)樣本并數(shù)字化儲存數(shù)據(jù)。然后使用Bio-Rad Lasersharp軟件的“種子(seed)”功能以確定閾值，并計(jì)數(shù)每個(gè)切片中的立體像素。寫入一個(gè)宏以計(jì)算所有切片的體積總和并確定所有血管結(jié)構(gòu)的值。
直接從照片測定血管的二維生長(的結(jié)果表明)，與對照肽相比，系統(tǒng)給予的肽拮抗劑203抑制視網(wǎng)膜血管發(fā)生的40％(N=9,p＜.0000001，配對t-測試)。在未處理的新生小鼠與接受肽203的5日齡小鼠之間未觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，因此該肽有效地抑制血管發(fā)生。另外，在未處理5日齡小鼠和同日齡的接受對照肽的小鼠之間未觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。因此，當(dāng)與未處理對應(yīng)物相比時(shí)，RGDfV處理的新生小鼠的視網(wǎng)膜血管發(fā)生的抑制為100％有效。
使用一個(gè)采用脈管生長三維本質(zhì)的更為定量的分析，與對照相比，在肽203處理的動(dòng)物中觀察到視網(wǎng)膜血管體積減少78％。203處理的動(dòng)物的出生后第5天的平均脈管體積為3.6×106μm3，在對照處理的動(dòng)物中為15.7×106μm3。未處理新生小鼠中視網(wǎng)膜血管所占體積與5日齡203處理的動(dòng)物無法區(qū)別。
上述得到的結(jié)果顯示，所述拮抗劑特異性地阻斷新血管形成，而對已建立的血管無影響。所述結(jié)果表明，視網(wǎng)膜新血管疾病的病理學(xué)與視網(wǎng)膜下新血管形成疾病觀察到的不同，并且αvβ5拮抗劑有效地治療患有與血管發(fā)生相關(guān)的盲眼疾病的患者。
使用如分別于實(shí)施例7和實(shí)施例10描述的制備的MMP-2和有機(jī)模擬物αvβ5拮抗劑進(jìn)行類似的檢測。
10．制備有機(jī)分子αvβ5拮抗劑有機(jī)αvβ5拮抗劑化合物7、9、10、12、14、15、16、17和18的合成在以下描述，并亦示于注釋的圖中。然后將稱為本發(fā)明的有機(jī)模擬物的產(chǎn)生的有機(jī)分子用于抑制αvβ5介導(dǎo)的血管發(fā)生的方法中。
對于下述的每個(gè)合成物，在Perkin-Elmer 241分光光度計(jì)UV上測定旋光，并在Beckman DU-70光度計(jì)上記錄可見光譜。在Bruker AMX-400和AMX-500光度計(jì)上于400和500 MHz下記錄1H和13C NMR譜。將快速原子轟擊(FAB)條件下，在VG ZAB-ZSE質(zhì)譜儀記錄高分辨率質(zhì)譜(HRMS)。用70-230目硅膠進(jìn)行柱層析。在Merck Art.5744(0.5mm)上進(jìn)行制備性TLC。在Thomas Hoover裝置上測定熔點(diǎn)。
A．化合物1如圖10中描繪的t-Boc-L-酪氨酸芐酯

化合物1
于25℃向0.10M(M)二氯甲烷中的N-(叔丁酯基)-L-酪氨酸(t-Boc-L-酪氨酸)(1.0當(dāng)量；Aldrich)的溶液中加入二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)(1.5當(dāng)量)，并攪拌1小時(shí)。接著，加入1.5當(dāng)量苯甲醇，并將該混合物于25℃再攪拌12小時(shí)。然后用乙酸乙酯(0.10M)稀釋該反應(yīng)混合物，并用水洗滌二次(2X)，用鹽水洗滌一次(1X)并在硫酸鎂上干燥。然后在真空中除去溶劑并通過硅膠柱層析純化粗產(chǎn)物。亦可從Sigrna購得化合物1-t-Boc-L-酪氨酸芐酯。
B．化合物2如圖10步驟Ⅰ中描繪的(S)-3-(4-(4-溴丁氧基)苯基-2-N-叔丁酯基-丙酸芐酯

化合物2將t-Boc-L-酪氨酸芐酯(2克，5.38mmol；如上述合成)、1,4-二溴丁烷(1.9ml,16.2 mmol；Aldrich)、碳酸鉀(5g)和18-冠醚-6(0.1g；Aldrich)的混合物于80℃加熱12小時(shí)。冷卻后，濾掉沉淀并將該反應(yīng)混合物在真空中蒸發(fā)至干燥。然后使用100％己烷通過結(jié)晶純化該粗產(chǎn)物，產(chǎn)生2.5g(92％)的化合物2。C．化合物3如圖10步驟ⅱ中描繪的(S)-3-(4-(4-疊氮基丁氧基)苯基-2-N-叔丁酯基-丙酸芐酯

化合物3將化合物2(2.5g,4.9mmol)與疊氮鈉(1.6g,25mmol)在二甲基甲酰胺(DMF)(20ml)中于25℃攪拌12小時(shí)。然后蒸發(fā)溶劑，并將殘留物用水(約10ml)處理，并用乙酸乙酯萃取二次。將有機(jī)層合并，借助硫酸鎂干燥并蒸發(fā)，產(chǎn)生無色漿的2.0克(90％)化合物3(FAB-MS:469(M+H+)。
D．化合物4如圖10步驟ⅲ中描繪的(S)-3-(4-(4-疊氮基丁氧基)苯基-2-氨基-丙酸芐酯

化合物4將化合物3(2.0g(4.4mmol))溶解于三氟乙酸(TFA；2ml)，并于室溫?cái)嚢?小時(shí)。在真空中蒸發(fā)產(chǎn)生無色漿的1.6克(定量的)的化合物4，它不用進(jìn)一步純化即用于下一步。FAB-MS:369(M+H+)。E．化合物5如圖10步驟ⅳ中描繪的(S)-3-(4-(4-疊氮基丁氧基)苯基-2-丁亞磺酰氨基-丙酸芐酯

化合物5將化合物4(1.6g；4.3mmol)、丁磺酰氯(0.84ml；6.6mmol)和三乙胺(1.5當(dāng)量)的混合物在二氯甲烷(20ml)中于室溫?cái)嚢?2小時(shí)。然后將反應(yīng)混合物蒸發(fā)，并將殘留物溶解于乙酸乙酯，用稀鹽酸、碳酸氫鈉水溶液和水洗滌。在蒸發(fā)至干燥后，通過急驟層析(硅膠，甲苯/乙酸乙酯15∶1)純化該粗產(chǎn)物，產(chǎn)生1.4克(67％)的非晶形固體的化合物5。
F．化合物6如圖10步驟ⅴ中描繪的(S)-3-(4-(4-氨基丁氧基)苯基-2-丁亞磺酰氨基-丙酸

化合物6將化合物5(1.3g(2.6mmol)溶解于20ml乙酸乙酯/甲醇/水5/3/1和0.2ml三氟乙酸(TFA)并在氫氣中(1個(gè)大氣壓；Parr Shaker裝置)于25℃在存在100mg鈀(在活性炭上10％)時(shí)氫化。3小時(shí)后，濾掉該催化劑，并將溶劑蒸發(fā)，產(chǎn)生油狀殘留物的化合物6。在從水中凍干后，得到白色粉末的1.0克(定量)的化合物6。FAB-MS:373(M+H+)。
G．化合物7如圖10步驟ⅵ中描繪的(S)-3-(4-(4-胍基丁氧基)苯基-2-丁亞磺酰氨基-丙酸

化合物7將二甲基甲酰胺(DMF；5ml)中的化合物6(200mg；0.5mmol)、硝酸3,5-二甲基吡唑-1-甲脒(DPFN)(170mg；0.8 mmol；Aldrich ChemicalCompany)和三乙胺(0.15ml,1.0mmol)于60℃加熱12小時(shí)。冷卻后，在真空中蒸發(fā)溶劑，并通過HPLC(Lichrocart RP-18，梯度乙腈/水+0.3％TFA 99∶1至1∶99)純化殘留物，凍干后產(chǎn)生白色非晶形粉末的50mg(25％)化合物7。FAB-MS:415(M+H+),m.p.:70℃。
H．化合物8如圖11步驟ⅲ中描繪的(S)-3-(4-(4-氨基丁氧基)苯基-2-N-叔丁酯基-丙酸

化合物8
將化合物3(0.5g(1.07mmol)溶解于10ml乙酸乙酯/甲醇/水5/3/1和0.1ml三氟乙酸(TFA)，并在氫氣中(1個(gè)大氣壓；Parr Shaker裝置)于25℃在存在30mg鈀(在活性炭上10％)時(shí)氫化。3小時(shí)后，濾掉該催化劑并將溶劑蒸發(fā)，產(chǎn)生油狀殘留物的化合物8。在從水中凍干后，得到白色粉末的370毫克(定量)的化合物8。FAB-MS:353(M+H+)。
I.化合物9如圖11步驟ⅳ中描繪的(S)-3-(4-(4-胍基丁氧基)苯基-2-N-叔丁酯基-丙酸

化合物9將二甲基甲酰胺(DMF；5ml)中的化合物8(200mg；0.5mmol)、硝酸3,5-二甲基吡唑-1-甲脒(DPFN)(170mg；0.8mmol；Aldrich ChemicalCompany)和三乙胺(0.15ml,1.0mmol)于60℃加熱12小時(shí)。冷卻后，在真空中蒸發(fā)溶劑，并通過HPLC(Lichrocart RP-18，梯度乙腈/水+0.3％TFA 99∶1至1∶99)純化殘留物，凍干后產(chǎn)生白色非晶形粉末的160mg(90％)化合物7。FAB-MS:395(M+H+)。
J．化合物10如圖12步驟ⅰ-ⅵ中描繪的(R)-3-(4-(4-胍基丁氧基)苯基-2-丁亞磺酰氨基-丙酸

化合物10使用與合成化合物7相同的反應(yīng)順序制備D-酪氨酸類似物10，如下述使用中間體化合物100-600以形成化合物10，得到205 mg的白色非晶形物質(zhì)FAB-MS:415(M+H+)。
1)化合物100如圖12中描繪的t-Boc-D-酪氨酸芐酯

化合物100于25℃向0.10M(M)二氯甲烷中的N-(叔丁酯基)-L-酪氨酸(t-Boc-L-酪氨酸)溶液(1-0當(dāng)量；Aldrich)中加入二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)(1.5當(dāng)量)并攪拌1小時(shí)。接著，加入1.5當(dāng)量苯甲醇，并將該混合物于25℃再攪拌12小時(shí)。然后用乙酸乙酯(0.10M)稀釋該反應(yīng)混合物，并用水洗滌2X、用鹽水洗滌1X，并在硫酸鎂上干燥。然后在真空中除去溶劑并通過硅膠柱層析純化粗產(chǎn)物。
2)化合物200如圖12步驟ⅰ中描繪的(R)-3-(4-(4-溴丁氧基)苯基-2-N-叔丁酯基-丙酸芐酯

化合物200將t-Boc-D-酪氨酸芐酯(2克，5.38mmol；如上述合成)、1,4-二溴丁烷(1.9ml,16.2mmol；Aldrich)、碳酸鉀(5g)和18-冠醚-6(0.1g；Aldrich)的混合物于80℃加熱12小時(shí)。冷卻后，濾掉沉淀并將該反應(yīng)混合物在真空中蒸發(fā)至干燥。然后使用100％己烷通過結(jié)晶純化該粗產(chǎn)物，產(chǎn)生2.5g(92％)的化合物200。
3)化合物300如圖12步驟ⅱ中描繪的(R)-3-(4-(4-疊氮基丁氧基)苯基-2-N-叔丁酯基-丙酸芐酯

化合物300將化合物200(2.5g,4.9mmol)與疊氮鈉(1.6g,25mmol)在二甲基甲酰胺(DMF)(20ml)中于25℃攪拌12小時(shí)。然后蒸發(fā)溶劑并將殘留物用水(約10ml)處理，并用乙酸乙酯萃取二次。將有機(jī)層合并，借助硫酸鎂干燥并蒸發(fā)，產(chǎn)生無色漿的2.0克(90％)化合物300(FAB-MS:469(M+H+)。
4)化合物400如圖12步驟ⅲ中描繪的(R)-3-(4-(4-疊氮基丁氧基)苯基-2-氨基-丙酸芐酯

化合物400將化合物300(2.0g(4.4mmol)溶解于三氟乙酸(TFA；2ml)并于室溫?cái)嚢?小時(shí)。在真空中蒸發(fā)，產(chǎn)生無色漿的1.6克(定量的)的化合物400，它不用進(jìn)一步純化即用于下一步。FAB-MS:369(M+H+)。
5)化合物500如圖12步驟ⅳ中描繪的(R)-3-(4-(4-疊氮基丁氧基)苯基-2-丁亞磺酰氨基-丙酸芐酯

化合物500將化合物400(1-6g；4.3mmol)、丁磺酰氯(0.84ml；6.6mmol)和三乙胺(1.5當(dāng)量)的混合物在二氯甲烷(20ml)中于室溫?cái)嚢?2小時(shí)。然后將反應(yīng)混合物蒸發(fā)并將殘留物溶解于乙酸乙酯，用稀鹽酸、碳酸氫鈉水溶液和水洗滌。在蒸發(fā)至干燥后通過急驟層析(硅膠，甲苯/乙酸乙酯15∶1)純化該粗產(chǎn)物，產(chǎn)生1.4克(67％)的非晶形固體的化合物500。
6)化合物600如圖12步驟ⅴ中描繪的(R)-3-(4-(4-氨基丁氧基)苯基-2-丁亞磺酰氨基-丙酸

化合物600將化合物500(1.3g(2.6mmol)溶解于20ml乙酸乙酯/甲醇/水5/3/1和0.2ml三氟乙酸(TFA)，并在氫氣中(1個(gè)大氣壓；Parr Shaker裝置)于25℃在存在100mg鈀(在活性炭上10％)時(shí)氫化。3小時(shí)后，濾掉該催化劑并將溶劑蒸發(fā)，產(chǎn)生如油狀殘留物的化合物600。在從水中凍干后，得到白色粉末的1.0克(定量)的化合物600。FAB-MS:373(M+H+)。
7)化合物10如圖12步驟ⅵ中描繪的(R)-3-(4-(4-胍基丁氧基)苯基-2-丁亞磺酰氨基-丙酸將二甲基甲酰胺(DMF；5ml)中的化合物600(200mg；0.5mmol)、硝酸3,5-二甲基吡唑-1-甲脒(DPFN)(170mg；0.8mmol；Aldrich ChemicalCompany)和三乙胺(0.15ml,1.0mmol)于60℃加熱12小時(shí)。冷卻后，在真空中蒸發(fā)溶劑，并通過HPLC(Lichrocart RP-18，梯度乙腈/水+0.3％TFA 99∶1至1∶99)純化殘留物，凍干后產(chǎn)生白色非晶形粉末的50mg(25％)化合物10。FAB-MS:415(M+H+),m.p.:70℃。5)化合物11如圖4中描繪的(S)-3-(4-(4-疊氮基丁氧基)苯基-2-(10-樟腦亞磺酰氨基)-丙酸芐酯

化合物11將化合物4(1.0g；2.7mmol)、1 0-樟腦磺酰氯(6.6mmol；AldrichChemical Company)和三乙胺(1.5當(dāng)量)的混合物在二氯甲烷(20ml)中于室溫?cái)嚢?2小時(shí)。然后將反應(yīng)混合物蒸發(fā)并將殘留物溶解于乙酸乙酯，用稀鹽酸、碳酸氫鈉水溶液和水洗滌。在蒸發(fā)至干燥后通過急驟層析(硅膠，甲苯/乙酸乙酯15∶1)純化該粗產(chǎn)物，產(chǎn)生1.4克(67％)的非晶形固體的化合物11。
L．化合物12如圖4步驟ⅰ-ⅱ中描繪的(S)-3-(4-(4-胍基丁氧基)苯基-2-(10-樟腦亞磺酰氨基)-丙酸

化合物12按照以下條件將化合物11氫化和脒基化得到化合物12步驟ⅱ將化合物11(1.3g(2.6mmol)溶解于20ml乙酸乙酯/甲醇/水5/3/1和0.2ml三氟乙酸(TFA)，并在氫氣中(1個(gè)大氣壓；Parr Shaker裝置)于25℃在存在100mg鈀(在活性炭上10％)時(shí)氫化。3小時(shí)后，濾掉該催化劑并將溶劑蒸發(fā)，產(chǎn)生油狀中間體胺。在從水中凍干后，得到白色粉末的1.0克(定量)的中間體胺，接著如下述進(jìn)行步驟ⅱ將二甲基甲酰胺(DMF；5ml)中的上述形成的中間體胺化合物(200mg；0.5mmol)、硝酸3,5-二甲基吡唑-1-甲脒(DPFN)(170mg；0.8mmol；Aldrich Chemical Company)和三乙胺(0.15ml,1.0mmol)于60℃加熱12小時(shí)。冷卻后，在真空中蒸發(fā)溶劑，并通過HPLC(LichrocartRP-18，梯度乙腈/水+0.3％TFA99∶1至1∶99)純化殘留物，凍干之后產(chǎn)生白色非晶形粉末的50mg(25％)化合物12。FAB-MS:509.6(M+H+)。
M．化合物13如圖13中描繪的(S)-3-(4-(5-溴戊氧基)苯基-2-N-叔丁酯基-丙酸芐酯

化合物13將t-Boc-L-酪氨酸芐酯(4.5克，12.1mmol；如上述合成的化合物1)、1,5-二溴戊烷(5ml,36.7mmol；Aldrich)、碳酸鉀(10g)和18-冠醚-6(0.25g；Aldrich)的混合物于80℃加熱12小時(shí)。冷卻后，濾掉沉淀并將該反應(yīng)混合物在真空中蒸發(fā)至干燥。然后使用100％己烷通過結(jié)晶純化該粗產(chǎn)物，產(chǎn)生5.35g(85％)的化合物13。N．化合物14如圖13步驟ⅰ-ⅴ中描繪的(S)-3-(4-(5-胍基戊氧基)苯基-2-丁亞磺酰氨基-丙酸

化合物14與上述使用中間體化合物1-6形成化合物7的程序或使用化合物100-600形成化合物10的上述公開的程序相同地進(jìn)行溴-疊氮化物-交換、Boc-切割、用丁磺酰氯磺?；⒂肈PFN氫化和脒基化的五步驟反應(yīng)順序。得到白色粉末的化合物14 FAB-MS:429(M+H+)。
O．化合物15如圖14中描繪的3-(4-脒基苯基)-5-(4-(2-羧基-2-氨基乙基)苯氧基)-2-噁唑烷二鹽酸鹽1)合成化合物15的原材料2-N-BOC-氨基-3-(4-羥基苯基)丙酸鹽

化合物15通過酯化0.10M甲醇和稀1％HCl中的(D或L)N-(叔丁酯基)-L(D)-酪氨酸(t-Boc-L(D)-酪氨酸)(1.0當(dāng)量；Sigma)，得到原材料2-N-BOC-氨基-3-(4-羥基-苯基)丙酸鹽。將該混合物于25℃攪拌12小時(shí)，然后用碳酸鉀中和并用乙酸乙酯(0.10M)稀釋，并用水洗滌2X、用鹽水洗滌1X并在硫酸鎂上干燥。然后在真空中除去溶劑并通過硅膠柱層析純化粗產(chǎn)物，得到2-N-BOC-氨基-3-(4-羥基-苯基)丙酸鹽。
2)合成化合物1 5的原材料3-對-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-噁唑烷三步驟程序如下將二氯甲烷(0.10M)中的對氨基-芐腈(1.0當(dāng)量；Aldrich)與2,3-環(huán)氧丙醇(1.0當(dāng)量；Aldrich)于25℃攪拌12小時(shí)。接著在真空中除去溶劑并如下述將粗4-(2,3-二羥基丙氨基)芐腈進(jìn)行到下一步驟將25℃的二甲基甲酰胺(0.10M)中的4-(2,3-二羥基丙氨基)芐腈(1.0當(dāng)量；如上述)與碳酸二乙酯(1.1當(dāng)量；Aldrich)和叔丁酸鉀(potassium tert-butylate)(1.1當(dāng)量；Aldrich)于110℃攪拌6小時(shí)。然后將該反應(yīng)混合物用乙酸乙酯(0.10M)稀釋，并用水洗滌2X、用鹽水洗滌1X并在硫酸鎂上干燥。然后在真空中除去溶劑并通過硅膠柱層析純化粗產(chǎn)物，得到3-(4-氰基苯基)-5-羥甲基-2-噁唑烷，并將其進(jìn)行到如下述的下一步驟將二氯甲烷(0.10M)中的3-(4-氰基苯基)-5-羥甲基-2-噁唑烷(1-0當(dāng)量；如上述)與1.1當(dāng)量硫化氫、1.1當(dāng)量甲基碘和1.1當(dāng)量乙酸銨于25℃攪拌。將該反應(yīng)混合物攪拌6小時(shí)，然后用乙酸乙酯(0.10M)稀釋，并用水洗滌2X、用鹽水洗滌1X并在硫酸鎂上干燥。然后在真空中除去溶劑并通過硅膠柱層析純化粗產(chǎn)物得到所述脒，并將其進(jìn)行到如下述的下一步驟將1.0當(dāng)量的如上述合成的脒用二氯甲烷(0.10M)中的1.1當(dāng)量的BOC-ON(2-(BOC-氧代亞氨基)-2-苯乙腈；Aldrich)于25℃保護(hù)并攪拌6小時(shí)。然后將該反應(yīng)混合物用乙酸乙酯(0.10M)稀釋，并用水洗滌2X、用鹽水洗滌1X并在硫酸鎂上干燥。然后在真空中除去溶劑，并將粗產(chǎn)物在0.10M二氯甲烷和1.1當(dāng)量甲磺酰氯中酯化。將該反應(yīng)混合物在0℃攪拌6小時(shí)，然后用水(5當(dāng)量)淬火，并接著用乙酸乙酯(0.10M)稀釋，并用水洗滌2X、用鹽水洗滌1X并在硫酸鎂上干燥。然后在真空中除去溶劑并通過硅膠柱層析純化粗產(chǎn)物，得到3-對-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-噁唑烷。
3)中間體2-N-BOC-氨基-3-(4-羥基苯基)丙酸鹽與3-對-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-噁唑烷偶聯(lián)，形成化合物15的保護(hù)形式3-(4-BOC-脒基苯基)-5-(4-(2-甲氧基-羰基-2N-BOC-氨乙基)苯氧基甲基-2噁唑烷將1.9克2-N-BOC-氨基-3-(4-羥基苯基)丙酸鹽(如上述)、20ml二甲基甲酰胺(DMF)和NaH(1.0當(dāng)量)于室溫?cái)嚢?0分鐘。攪拌后，加入10ml二甲基甲酰胺(DMF)中的1.8克3-對-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-噁唑烷(如上述)，并于室溫再攪拌15分鐘。然后將該反應(yīng)混合物用乙酸乙酯(0.10M)稀釋，并用水洗滌2X、用鹽水洗滌1X并在硫酸鎂上干燥。然后在真空中除去溶劑并通過硅膠柱層析純化粗產(chǎn)物得到化合物15的保護(hù)形式3-(4-BOC-脒基苯基)-5-(4-(2-甲氧基-羰基-2N-BOC-氨乙基)苯氧基甲基-2-噁唑烷，并將其進(jìn)行到下一步驟。
4)將化合物15的保護(hù)形式脫保護(hù)形成化合物15:3-(4-脒基苯基)-5-(4-(2-羧基-2-氨基-乙基)苯氧基)甲基-2-噁唑烷二鹽酸鹽，圖14將化合物15的保護(hù)形式3-(4-BOC-脒基苯基)-5-(4-(2-甲氧基-羰基-2N-BOC-氨乙基)苯氧基甲基-2-噁唑烷(1.0當(dāng)量；如上述合成)用4ml 2NNaOH于室溫處理4小時(shí)。然后接著于0℃至25℃滴加二氧雜環(huán)己烷中的40ml 2N HCl溶液處理3小時(shí)。然后將該反應(yīng)混合物用碳酸氫鈉(5當(dāng)量)淬火，并接著用乙酸乙酯(0.10M)稀釋，并用水洗滌2X、用鹽水洗滌1X并在硫酸鎂上干燥。然后在真空中除去溶劑并通過硅膠柱層析純化粗產(chǎn)物，得到化合物15:3-(4-脒基苯基)-5-(4-(2-羧基-2-氨基-乙基)苯氧基)甲基-2-噁唑烷二鹽酸鹽；m.p.165℃(d)。P．化合物16如圖14中所示的3-(4-脒基苯基)-5-(4-(2-羧基-2-N-丁磺酰氨基乙基)苯氧基)甲基-2-噁唑烷1)合成化合物16的原材料2-N-丁磺酰氨基-3-(4-羥基-苯基)丙酸鹽

化合物16通過酯化0.10M甲醇和稀1％HCl中的((D或L)酪氨酸)(1.0當(dāng)量；Sigma)，得到原材料2-N-丁磺酰氨基-3-(4-羥基-苯基)丙酸鹽。將該反應(yīng)混合物于25℃攪拌12小時(shí)，然后用碳酸鉀中和并用乙酸乙酯(0.10M)稀釋，用水洗滌2X、用鹽水洗滌1X并在硫酸鎂上干燥。然后在真空中除去溶劑并對粗產(chǎn)物如下處理將上述化合物(4.3mmol)、丁磺酰氯(6.6mmol)和三乙胺(1.5當(dāng)量)的混合物在二氯甲烷(20ml)中于室溫?cái)嚢?2小時(shí)。然后將反應(yīng)混合物蒸發(fā)并將殘留物溶解于乙酸乙酯，用稀鹽酸、碳酸氫鈉水溶液和水洗滌。在蒸發(fā)至干燥后通過急驟層析(硅膠，甲苯/乙酸乙酯15∶1)純化該粗產(chǎn)物，產(chǎn)生標(biāo)題化合物。
2)合成化合物16的原材料3-對-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-噁唑烷三步驟程序如下將二氯甲烷(0.10M)中的對氨基-芐腈(1.0當(dāng)量；Aldrich)與2,3-環(huán)氧丙醇(1.0當(dāng)量；Aldrich)于25℃C攪拌12小時(shí)。接著在真空中除去溶劑并如下述將粗4-(2,3-二羥基丙氨基)芐腈進(jìn)行到下一步驟
將25℃的二甲基甲酰胺(0.10M)中的4-(2,3-二羥基丙氨基)芐腈(1.0當(dāng)量；如上述)與碳酸二乙酯(1.1當(dāng)量；Aldrich)和叔丁酸鉀(1.1當(dāng)量；Aldrich)于110℃攪拌6小時(shí)。然后將該反應(yīng)混合物用乙酸乙酯(0.10M)稀釋，并用水洗滌2X、用鹽水洗滌1X并在硫酸鎂上干燥。然后在真空中除去溶劑并通過硅膠柱層析純化粗產(chǎn)物，得到3-(4-氰基苯基)-5-羥甲基-2-噁唑烷，并將其進(jìn)行到如下述的下一步驟將二氯甲烷(0.10M)中的3-(4-氰基苯基)-5-羥甲基-2-噁唑烷(1.0當(dāng)量；如上述)與1.1當(dāng)量硫化氫、1.1當(dāng)量甲基碘和1.1當(dāng)量乙酸銨于25℃攪拌。將該反應(yīng)混合物攪拌6小時(shí)，然后用乙酸乙酯(0.10M)稀釋，并用水洗滌2X、用鹽水洗滌1X并在硫酸鎂上干燥。然后在真空中除去溶劑并通過硅膠柱層析純化粗產(chǎn)物得到所述脒，并將其進(jìn)行到如下述的下一步驟將1.0當(dāng)量的如上述合成的該脒用二氯甲烷(0.10M)中的1.1當(dāng)量的BOC-ON(2-(BOC-氧代亞氨基)-2-苯乙腈；Aldrich)于25℃保護(hù)，并攪拌6小時(shí)。然后將該反應(yīng)混合物用乙酸乙酯(0.10M)稀釋，并用水洗滌2X、用鹽水洗滌1X并在硫酸鎂上干燥。然后在真空中除去溶劑并將粗產(chǎn)物在0.10M二氯甲烷和1.1當(dāng)量甲磺酰氯中酯化。將該反應(yīng)混合物在0℃攪拌6小時(shí)，然后用水(5當(dāng)量)淬火并接著用乙酸乙酯(0.10M)稀釋，并用水洗滌2X、用鹽水洗滌1X并在硫酸鎂上干燥。然后在真空中除去溶劑并通過硅膠柱層析純化粗產(chǎn)物，得到3-對-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-噁唑烷。
3)中間體2-N-BOC-丁磺酰氨基-3-(4-羥基苯基)丙酸鹽與3-對-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-噁唑烷偶聯(lián)，形成化合物16的保護(hù)形式3-(4-BOC-脒基苯基)-5-(4-(2-甲氧基-羰基-2-N-丁磺酰氨基乙基)苯氧基甲基-2噁唑烷將1.9克2-N-丁磺酰氨基-3-(4-羥基苯基)丙酸鹽(如上述)、20ml二甲基甲酰胺(DMF)和NaH(1.0當(dāng)量)于室溫?cái)嚢?0分鐘。攪拌后，將10ml二甲基甲酰胺(DMF)中的1.8克3-對-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-噁唑烷(如上述)加入，并于室溫再攪拌15分鐘。然后將該反應(yīng)混合物用乙酸乙酯(0.10M)稀釋，并用水洗滌2X、用鹽水洗滌1X并在硫酸鎂上干燥。然后在真空中除去溶劑并通過硅膠柱層析純化粗產(chǎn)物，得到化合物16的保護(hù)形式3-(4-BOC-脒基苯基)-5-(4-(2-甲氧基-羰基-2-N-丁磺酰氨基乙基)苯氧基甲基-2-噁唑烷，并將其進(jìn)行到下一步驟。
4)將化合物16的保護(hù)形式脫保護(hù)形成化合物16:3-(4-脒基苯基)-5-(4-(2-羧基-2-N-丁磺酰氨基乙基)苯氧基)甲基-2-噁唑烷，圖14將化合物16的保護(hù)形式3-(4-BOC-脒基苯基)-5-(4-(2-甲氧基-羰基-2-N-丁磺酰氨基乙基)苯氧基甲基-2-噁唑烷(1.0當(dāng)量；如上述合成)用4ml 2N NaOH于室溫處理4小時(shí)。然后接著于0℃至25℃滴加二氧雜環(huán)己烷中的40ml 2N HCl溶液處理3小時(shí)。然后將該反應(yīng)混合物用碳酸氫鈉(5當(dāng)量)淬火，并接著用乙酸乙酯(0.10M)稀釋，并用水洗滌2X、用鹽水洗滌1X并在硫酸鎂上干燥。然后在真空中除去溶劑并通過硅膠柱層析純化粗產(chǎn)物得到化合物16:3-(4-脒基苯基)-5-(4-(2-羧基-2-N-丁磺酰氨基乙基)苯氧基)甲基-2-噁唑烷；m.p.236-237℃。Q．化合物17如圖14中所示的3-(4-脒基苯基)-5-(4-(2-羧基-2-N-丙磺酰氨基乙基)苯氧基)甲基-2-噁唑烷1)合成化合物17的原材料2-N-丙基-磺酰氨基-3-(4-羥基-苯基)丙酸鹽

通過酯化0.10M甲醇和稀1％HCl中的((D或L)酪氨酸)(1.0當(dāng)量；Sigma)，得到原材料2-N-丙基-磺酰氨基-3-(4-羥基-苯基)丙酸鹽。將該反應(yīng)混合物于25℃攪拌12小時(shí)，然后用碳酸鉀中和并用乙酸乙酯(0.10M)稀釋，并用水洗滌2X、用鹽水洗滌1X并在硫酸鎂上干燥。然后在真空中除去溶劑，并對粗產(chǎn)物如下處理將上述化合物(4.3mmol)、丙磺酰氯(6.6mmol)和三乙胺(1.5當(dāng)量)的混合物在二氯甲烷(20ml)中于室溫?cái)嚢?2小時(shí)。然后將反應(yīng)混合物蒸發(fā)并將殘留物溶解于乙酸乙酯，用稀鹽酸、碳酸氫鈉水溶液和水洗滌。在蒸發(fā)至干燥后通過急驟層析(硅膠，甲苯/乙酸乙酯15∶1)純化該粗產(chǎn)物，產(chǎn)生標(biāo)題化合物。
2)合成化合物17的原材料3-對-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-噁唑烷三步驟程序如下將二氯甲烷(0.10M)中的對氨基-芐腈(1.0當(dāng)量；Aldrich)與2,3-環(huán)氧丙醇(1.0當(dāng)量；Aldrich)于25℃攪拌12小時(shí)。接著在真空中除去溶劑并如下述將粗4-(2,3-二羥基丙氨基)芐腈進(jìn)行到下一步驟
將25℃的二甲基甲酰胺(0.10M)中的4-(2,3-二羥基丙氨基)芐腈(1.0當(dāng)量；如上述)與碳酸二乙酯(1.1當(dāng)量；Aldrich)和叔丁酸鉀(1.1當(dāng)量；Aldrich)于110℃攪拌6小時(shí)。然后將該反應(yīng)混合物用乙酸乙酯(0.10M)稀釋，并用水洗滌2X、用鹽水洗滌1X并在硫酸鎂上干燥。然后在真空中除去溶劑并通過硅膠柱層析純化粗產(chǎn)物，得到3-(4-氰基苯基)-5-羥甲基-2-噁唑烷，并將其進(jìn)行到如下述的下一步驟將二氯甲烷(0.10M)中的3-(4-氰基苯基)-5-羥甲基-2-噁唑烷(1.0當(dāng)量；如上述)與1.1當(dāng)量硫化氫、1.1當(dāng)量甲基碘和1.1當(dāng)量乙酸銨于25℃攪拌。將該反應(yīng)混合物攪拌6小時(shí)，然后用乙酸乙酯(0.10M)稀釋，并用水洗滌2X、用鹽水洗滌1X并在硫酸鎂上干燥。然后在真空中除去溶劑并通過硅膠柱層析純化粗產(chǎn)物得到所述脒，并將其進(jìn)行到如下述的下一步驟將1.0當(dāng)量的如上述合成的該脒用二氯甲烷(0.10M)中的1.1當(dāng)量的BOC-ON(2-(BOC-氧代亞氨基)-2-苯乙腈；Aldrich)于25℃保護(hù)并攪拌6小時(shí)。然后將該反應(yīng)混合物用乙酸乙酯(0.10M)稀釋，并用水洗滌2X、用鹽水洗滌1X并在硫酸鎂上干燥。然后在真空中除去溶劑，并將粗產(chǎn)物在0.10M二氯甲烷和1.1當(dāng)量甲磺酰氯中酯化。將該反應(yīng)混合物在0℃攪拌6小時(shí)，然后用水(5當(dāng)量)淬火并接著用乙酸乙酯(0.10M)稀釋，并用水洗滌2X、用鹽水洗滌1X并在硫酸鎂上干燥。然后在真空中除去溶劑并通過硅膠柱層析純化粗產(chǎn)物，得到3-對-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-噁唑烷。
3)中間體2-N-丙基-磺酰氨基-3-(4-羥基苯基)丙酸鹽與3-對-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-噁唑烷偶聯(lián)，形成化合物17的保護(hù)形式3-(4-BOC-脒基苯基)-5-(4-(2-甲氧基-羰基-2-N-丙基-磺酰氨基乙基)苯氧基甲基-2-噁唑烷將1.9克2-N-丙基-磺酰氨基-3-(4-羥基苯基)丙酸鹽(如上述)、20ml二甲基甲酰胺(DMF)和NaH(1.0當(dāng)量)于室溫?cái)嚢?0分鐘。攪拌后，將10ml二甲基甲酰胺(DMF)中的1.8克3-對-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-噁唑烷(如上述)加入，并于室溫再攪拌15分鐘。然后將該反應(yīng)混合物用乙酸乙酯(0.10M)稀釋，并用水洗滌2X、用鹽水洗滌1X并在硫酸鎂上干燥。然后在真空中除去溶劑并通過硅膠柱層析純化粗產(chǎn)物，得到化合物17的保護(hù)形式3-(4-BOC-脒基苯基)-5-(4-(2-甲氧基-羰基-2-N-丙基-磺酰氨基乙基)苯氧基甲基-2-噁唑烷，并將其進(jìn)行到下一步驟。
4)將化合物17的保護(hù)形式脫保護(hù)形成化合物17:3-(4-脒基苯基)-5-(4-(2-羧基-2-N-丙磺酰氨基乙基)苯氧基)甲基-2-噁唑烷，圖14將化合物17的保護(hù)形式3-(4-BOC-脒基苯基)-5-(4-(2-甲氧基-羰基-2-N-丙磺酰氨基乙基)苯氧基甲基-2-噁唑烷(1.0當(dāng)量；如上述合成)用4ml 2N NaOH于室溫處理4小時(shí)。然后接著于0℃至25℃滴加二氧雜環(huán)己烷中的40ml 2N HCl溶液處理3小時(shí)。然后將該反應(yīng)混合物用碳酸氫鈉(5當(dāng)量)淬火并接著用乙酸乙酯(0.10M)稀釋，并用水洗滌2X、用鹽水洗滌1X并在硫酸鎂上干燥。然后在真空中除去溶劑并通過硅膠柱層析純化粗產(chǎn)物得到化合物17:3-(4-脒基苯基)-5-(4-(2-羧基-2-N-丙磺酰氨基乙基)苯氧基)甲基-2-噁唑烷；m.p.200℃(d)。R．化合物18如圖14中所示的3-(4-脒基苯基)-5-(4-(2-羧基-2-N-乙基-磺酰氨基乙基)苯氧基)甲基-2-噁唑烷1)合成化合物18的原材料2-N-乙基-磺酰氨基-3-(4-羥基-苯基)丙酸鹽

通過酯化0.10 M甲醇和稀1％HCl中的((D或L)酪氨酸)(1.0當(dāng)量；Sigma)，得到原材料2-N-乙基-磺酰氨基-3-(4-羥基-苯基)丙酸鹽。將該反應(yīng)混合物于25℃攪拌12小時(shí)，然后用碳酸鉀中和并用乙酸乙酯(0.10M)稀釋，并用水洗滌2X、用鹽水洗滌1X并在硫酸鎂上干燥。然后在真空中除去溶劑并對粗產(chǎn)物如下處理將上述化合物(4.3mmol)、乙磺酰氯(6.6mmol；Aldrich)和三乙胺(1.5當(dāng)量)的混合物在二氯甲烷(20ml)中于室溫?cái)嚢?2小時(shí)。然后將反應(yīng)混合物蒸發(fā)并將殘留物溶解于乙酸乙酯，用稀鹽酸、水溶性碳酸氫鈉和水洗滌。在蒸發(fā)至干燥后通過急驟層析(硅膠，甲苯/乙酸乙酯15∶1)純化該粗產(chǎn)物，產(chǎn)生標(biāo)題化合物。
2)合成化合物18的原材料3-對-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-噁唑烷三步驟程序如下將二氯甲烷(0.10M)中的對氨基-芐腈(1.0當(dāng)量；Aldrich)與2,3-環(huán)氧丙醇(1.0當(dāng)量；Aldrich)于25℃攪拌12小時(shí)。接著在真空中除去溶劑并如下述將粗4-(2,3-二羥基丙氨基)芐腈進(jìn)行到下一步驟
將25℃的二甲基甲酰胺(0.10M)中的4-(2,3-二羥基丙氨)芐腈(1.0當(dāng)量；如上述)與碳酸二乙酯(1.1當(dāng)量；Aldrich)和叔丁酸鉀(1.1當(dāng)量；Aldrich)于110℃攪拌6小時(shí)。然后將該反應(yīng)混合物用乙酸乙酯(0.10M)稀釋，并用水洗滌2X、用鹽水洗滌1X并在硫酸鎂上干燥。然后在真空中除去溶劑并通過硅膠柱層析純化粗產(chǎn)物，得到3-(4-氰基苯基)-5-羥甲基-2-噁唑烷，并將其進(jìn)行到如下述的下一步驟將二氯甲烷(0.10M)中的3-(4-氰基苯基)-5-羥甲基-2-噁唑烷(1.0當(dāng)量；如上述)與1.1當(dāng)量硫化氫、1.1當(dāng)量甲基碘和1.1當(dāng)量乙酸銨于25℃攪拌。將該反應(yīng)混合物攪拌6小時(shí)，然后用乙酸乙酯(0.10M)稀釋，并用水洗滌2X、用鹽水洗滌1X并在硫酸鎂上干燥。然后在真空中除去溶劑并通過硅膠柱層析純化粗產(chǎn)物得到所述脒，并將其進(jìn)行到如下述的下一步驟將1.0當(dāng)量的如上述合成的該脒用二氯甲烷(0.10M)中的1.1當(dāng)量的BOC-ON(2-(BOC-氧代亞氨基)-2-苯乙腈；Aldrich)于25℃保護(hù)并攪拌6小時(shí)。然后將該反應(yīng)混合物用乙酸乙酯(0.10M)稀釋，并用水洗滌2X、用鹽水洗滌1X并在硫酸鎂上干燥。然后在真空中除去溶劑，并將粗產(chǎn)物在0.10M二氯甲烷和1.1當(dāng)量甲磺酰氯中酯化。將該反應(yīng)混合物在0℃攪拌6小時(shí)，然后用水(5當(dāng)量)淬火并接著用乙酸乙酯(0.10M)稀釋，并用水洗滌2X、用鹽水洗滌1X并在硫酸鎂上干燥。然后在真空中除去溶劑并通過硅膠柱層析純化粗產(chǎn)物，得到3-對-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-噁唑烷。
3)中間體2-N-乙基-磺酰氨基-3-(4-羥基苯基)丙酸鹽與3-對-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-噁唑烷偶聯(lián)，形成化合物18的保護(hù)形式3-(4-BOC-瞇基苯基)-5-(4-(2-甲氧基-羰基-2-N-乙基-磺酰氨基乙基)苯氧基甲基-2噁唑烷將1.9克2-N-乙基-磺酰氨基-3-(4-羥基苯基)丙酸鹽(如上述)、20ml二甲基甲酰胺(DMF)和NaH(1.0當(dāng)量)于室溫?cái)嚢?0分鐘。攪拌后，將10ml二甲基甲酰胺(DMF)中的1.8克3-對-N-BOC-脒基-苯基-5-甲磺酰氧基-甲基-2-噁唑烷(如上述)加入并于室溫再攪拌15分鐘。然后將該反應(yīng)混合物用乙酸乙酯(0.10M)稀釋，并用水洗滌2X、用鹽水洗滌1X并在硫酸鎂上干燥。然后在真空中除去溶劑并通過硅膠柱層析純化粗產(chǎn)物，得到化合物18的保護(hù)形式3-(4-BOC-脒基苯基)-5-(4-(2-甲氧基-羰基-2-N-乙基-磺酰氨基乙基)苯氧基甲基-2-噁唑烷，并將其進(jìn)行到下一步驟。
4)將化合物18的保護(hù)形式脫保護(hù)形成化合物18:3-(4-脒基苯基)-5-(4-(2-羧基-2-N-乙基磺酰氨基乙基)苯氧基)甲基-2-噁唑烷，圖14將化合物18的保護(hù)形式3-(4-BOC-脒基苯基)-5-(4-(2-甲氧基-羰基-2-N-乙基磺酰氨基乙基)苯氧基甲基-2-噁唑烷(1.0當(dāng)量；如上述合成)用4ml 2N NaOH于室溫處理4小時(shí)。然后接著于0℃至25℃滴加二氧雜環(huán)己烷中的40ml 2N HCl溶液處理3小時(shí)。然后將該反應(yīng)混合物用碳酸氫鈉(5當(dāng)量)淬火并接著用乙酸乙酯(0.10M)稀釋，并用水洗滌2X、用鹽水洗滌1X并在硫酸鎂上干燥。然后在真空中除去溶劑并通過硅膠柱層析純化粗產(chǎn)物得到化合物18:3-(4-脒基苯基)-5-(4-(2-羧基-2-N-乙基磺酰氨基乙基)苯氧基)甲基-2-噁唑烷；m.p.212℃(d)。
考慮到以上書面說明書已足以使本領(lǐng)域技術(shù)人員實(shí)踐本發(fā)明。確實(shí)，除本文這些已顯示的和描述外的本發(fā)明的各種修飾對本領(lǐng)域技術(shù)人員是明顯的，并屬于所附的權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1．產(chǎn)品，它包含包裝材料和包含于所述包裝材料之中的藥物，其中所述藥物有效抑制組織中的血管發(fā)生并且其中所述包裝材料包含一標(biāo)簽，該標(biāo)簽表明所述藥物可以用于通過抑制血管發(fā)生治療疾病并且其中所述藥物包含血管發(fā)生抑制量的αvβ5拮抗劑，該拮抗劑包含其氨基酸殘基序列包括基質(zhì)金屬蛋白酶羧基末端域的部分的多肽，所述多肽可以結(jié)合整聯(lián)蛋白αvβ5。
2．權(quán)利要求1的產(chǎn)品，其中所述多肽包括示于SEQ ID NO 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的氨基酸殘基序列。
3．權(quán)利要求1的產(chǎn)品，其中所述組織是炎癥組織，并且所述疾病是關(guān)節(jié)炎或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
4．權(quán)利要求1的產(chǎn)品，其中所述組織是實(shí)體瘤或?qū)嶓w腫瘤轉(zhuǎn)移瘤。
5．權(quán)利要求1的產(chǎn)品，其中所述組織是視網(wǎng)膜組織，并且所述疾病是視網(wǎng)膜病、糖尿病性視網(wǎng)膜病或黃斑變性。
6．αvβ5拮抗劑，它包含其氨基酸殘基序列包括基質(zhì)金屬蛋白酶羧基末端域的部分的多肽，所述多肽可以結(jié)合整聯(lián)蛋白αvβ5。
7．權(quán)利要求6的拮抗劑，其中所述多肽包括示于SEQ ID NO 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的氨基酸殘基序列。
8．權(quán)利要求6的拮抗劑，其中所述多肽是融合蛋白。
9．權(quán)利要求6的拮抗劑，其中所述多肽具有示于SEQ ID NO 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的氨基酸殘基序列。
10．藥物，它包含在藥學(xué)上可接受載體中的、按照權(quán)利要求6的αvβ5拮抗劑，其中所述拮抗劑的量足以在組織中抑制血管發(fā)生。
11．在組織中抑制血管發(fā)生的方法，它包括給予所述組織包含血管發(fā)生抑制量的αvβ5拮抗劑的組合物。
12．權(quán)利要求11的方法，其中所述拮抗劑是融合蛋白、多肽、衍生多肽、環(huán)狀多肽、單克隆抗體或有機(jī)模擬化合物。
13．權(quán)利要求11的方法，其中所述整聯(lián)蛋白αvβ5拮抗劑與抑制纖維蛋白原與αⅡbβ3結(jié)合相比，優(yōu)先地抑制纖維蛋白原與αvβ5結(jié)合。
14．權(quán)利要求11的方法，其中所述αvβ5拮抗劑包含其氨基酸殘基序列包括基質(zhì)金屬蛋白酶羧基末端域的部分的多肽，所述多肽可以與整聯(lián)蛋白αvβ5結(jié)合。
15．權(quán)利要求11的方法，其中所述多肽包括示于SEQ ID NO 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的氨基酸殘基序列。
16．權(quán)利要求11的方法，其中所述多肽是融合蛋白。
17．權(quán)利要求11的方法，其中所述多肽具有示于SEQ ID NO 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22的氨基酸殘基序列。
18．權(quán)利要求11的方法，其中所述組織是炎癥組織，并且所述血管發(fā)生是炎癥組織的血管發(fā)生。
19權(quán)利要求18的方法，其中所述組織是關(guān)節(jié)炎組織。
20．權(quán)利要求19的方法，其中所述關(guān)節(jié)炎組織存在于患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的哺乳動(dòng)物中。
21．權(quán)利要求11的方法，其中所述組織是患有糖尿病性視網(wǎng)膜病的視網(wǎng)膜組織，并且所述血管發(fā)生是視網(wǎng)膜血管發(fā)生。
22．權(quán)利要求11的方法，其中所述組織是實(shí)體瘤或?qū)嶓w腫瘤轉(zhuǎn)移瘤，并且所述血管發(fā)生是腫瘤血管發(fā)生。
23．權(quán)利要求11的方法，其中所述給予包括靜脈內(nèi)、經(jīng)皮、滑膜內(nèi)、肌內(nèi)或口服給予。
24．權(quán)利要求22的方法，其中所述給予與化療聯(lián)合進(jìn)行。
25．權(quán)利要求11的方法，其中所述給予包含單劑量靜脈內(nèi)給予。
26．在患者中誘導(dǎo)實(shí)體瘤組織退化的方法，包括給予所述患者包含足以抑制實(shí)體瘤組織新血管形成的治療有效量的整聯(lián)蛋白αvβ5拮抗劑的組合物。
27．權(quán)利要求26的方法，其中所述拮抗劑是融合蛋白、多肽、衍生多肽、環(huán)狀多肽、單克隆抗體或有機(jī)模擬化合物。
28．權(quán)利要求26的方法，其中所述αvβ5拮抗劑是按照權(quán)利要求6的αvβ5拮抗劑。
29．抑制患者中進(jìn)行新血管形成的實(shí)體瘤組織生長的方法，包括給予所述患者包含足以抑制實(shí)體瘤組織生長的治療有效量的整聯(lián)蛋白αvβ5拮抗劑的組合物。
30．權(quán)利要求29的方法，其中所述拮抗劑是融合蛋白、多肽、衍生多肽、環(huán)狀多肽、單克隆抗體或有機(jī)模擬化合物。
31．權(quán)利要求29的方法，其中所述αvβ5拮抗劑是按照權(quán)利要求6的αvβ5拮抗劑。
32．治療具有其中發(fā)生新血管形成的炎癥組織的患者的方法，包括給予所述患者包含治療有效量的整聯(lián)蛋白αvβ5拮抗劑的組合物。
33．權(quán)利要求32的方法，其中所述拮抗劑是融合蛋白、多肽、衍生多肽、環(huán)狀多肽、單克隆抗體或有機(jī)模擬化合物。
34．權(quán)利要求32的方法，其中所述αvβ5拮抗劑是按照權(quán)利要求6的αvβ5拮抗劑。
35．治療其中視網(wǎng)膜組織中發(fā)生新血管形成的患者的方法，包括給予所述患者包含新血管形成抑制量的整聯(lián)蛋白αvβ5拮抗劑的組合物。
36．權(quán)利要求35的方法，其中所述拮抗劑是融合蛋白、多肽、衍生多肽、環(huán)狀多肽、單克隆抗體或有機(jī)模擬化合物。
37．權(quán)利要求35的方法，其中所述αvβ5拮抗劑是按照權(quán)利要求6的αvβ5拮抗劑。
38．治療其中在血管成形術(shù)后發(fā)生平滑肌細(xì)胞遷移的組織中再狹窄的患者的方法，包括給予所述患者包含治療有效量的整聯(lián)蛋白αvβ5拮抗劑的組合物。
39．權(quán)利要求38的方法，其中所述拮抗劑是融合蛋白、多肽、衍生多肽、環(huán)狀多肽、單克隆抗體或有機(jī)模擬化合物。
40．權(quán)利要求38的方法，其中所述αvβ5拮抗劑是按照權(quán)利要求6的αvβ5拮抗劑。
41．降低患者支持所述組織新生長需要的組織血液供應(yīng)的方法，包括給予所述患者包含足以降低對所述組織的所述血液供應(yīng)的治療有效量的整聯(lián)蛋白αvβ5拮抗劑的組合物。
42．權(quán)利要求41的方法，其中所述拮抗劑是融合蛋白、多肽、衍生多肽、環(huán)狀多肽、單克隆抗體或有機(jī)模擬化合物。
43．權(quán)利要求41的方法，其中所述αvβ5拮抗劑是按照權(quán)利要求6的αvβ5拮抗劑。
44．權(quán)利要求24的方法，其中所述血管發(fā)生存在于患有眼病的患者中，該眼病選自糖尿病性視網(wǎng)膜病、年齡相關(guān)性黃斑變性、假定的眼組織胞漿菌病、未熟兒視網(wǎng)膜病和新血管性青光眼。
45．權(quán)利要求24的方法，其中所述血管發(fā)生存在于有角膜新血管疾病的患者中，該角膜新血管疾病選自角膜移植、皰疹性角膜炎、梅毒性角膜炎、翼狀胬肉和與使用隱性眼鏡片相關(guān)的新血管角膜翳。
46．權(quán)利要求24的方法，其中所述血管發(fā)生由細(xì)胞因子誘導(dǎo)。
47．權(quán)利要求46的方法，其中所述細(xì)胞因子選自血管內(nèi)皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子-α和表皮生長因子。
48．權(quán)利要求46的方法，其中所述細(xì)胞因子是血管內(nèi)皮生長因子并且所述血管發(fā)生選自視網(wǎng)膜血管發(fā)生、角膜血管發(fā)生、腫瘤血管發(fā)生和炎癥組織血管發(fā)生。
全文摘要
本發(fā)明描述了使用玻連蛋白α
文檔編號C07K19/00GK1226254SQ97196818
公開日1999年8月18日 申請日期1997年5月30日 優(yōu)先權(quán)日1996年5月31日
發(fā)明者P·布羅克斯, D·A·徹雷斯, M·弗里德蘭德 申請人:斯克里普斯研究學(xué)院