專利名稱：合成多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及合成的多肽。特別是涉及模擬病毒衣殼蛋白特定區(qū)域之三維結(jié)構(gòu)和/或靜電表面和/或其他物理、化學(xué)及結(jié)構(gòu)特性的合成多肽。特別引起人們興趣的是可據(jù)此設(shè)計與獲得性免疫缺陷綜合癥(愛滋病)之致病因子，即人類免疫缺陷病毒(HIV)有關(guān)的疫苗、免疫學(xué)活性治療劑、診斷及其他醫(yī)學(xué)或科學(xué)試劑。
近十年來，愛滋病已成為全世界范圍內(nèi)的重要醫(yī)學(xué)問題，并且近來越發(fā)迫切需要用于研究、診斷、治療和/或預(yù)防由該疾病的致病因子即HIV引起之感染的試劑或藥劑。利用已知由HIV和HIVⅡ病毒產(chǎn)生之蛋白質(zhì)的氨基酸序列(如參見，Rather，L.etocl，Nature 313，277(1985);Meusing，M.A.etal、Nature 313，450(1985);Wain-Hobson，S.etal.，Cell40，9(1985))，已有可能設(shè)計出模擬病毒衣殼蛋白之抗原特性的合成多肽。
本發(fā)明的一個目的是發(fā)展可引發(fā)抗HIV病毒抗體，更好是中和抗體產(chǎn)生的合成多肽，即所說的抗體可通過被動或主動免疫來預(yù)防HIV病毒感染和/或HIV病毒播散。用這類抗體進(jìn)行被動免疫可作治療愛滋病病人的有效手段，從而控制病毒在病人個體內(nèi)或個體之間傳播，進(jìn)而減慢或阻止病性進(jìn)展。
本發(fā)明提供了至少有一種人類免疫缺陷病毒(HIV)毒株之至少一種衣殼蛋白抗原特性的合成多肽，所說的多肽基本上由下列式(Ⅰ)的氨基酸序列構(gòu)式X-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-Trp-Gly-Cys-R8-R9-R10-R11-R12-Cys-Y (Ⅰ)其中R1是ASP或Glu;
R2是選自Gly、Ala、Pro、Ser、Thr、Asn或Gln的氨基酸殘基;
R3是選自Gly、Ala、Pro、Ser、Thr、Asp、Glu、Asn、Lys、His、Gln或Arg的氨基酸殘基;
R4、R5和R11各自是任何氨基酸殘基;
R6和R8各自是選自Gly、Ala、Pro、Ser、Thr或Asn的氨基酸殘基;
R7是選自Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Thr、Asn、Gln、Phe、Tyr、Trp、Cys、Met或Pro的氨基酸殘基;
R9和R12各自是選自Gly、Ala、Leu、Ile、Val、Met、Cys、Phe、Tyr或Trp的氨基酸殘基;
R10是選自Lys、His或Arg的氨基酸殘基;且X和Y各自可以是不存在的，或者各自是一個或多個，如3個額外的氨基酸殘基。
沒有X和Y的上述式Ⅰ的肽，當(dāng)然是有用的，例如用于生產(chǎn)抗HIV抗體。但當(dāng)存在X或Y時，它們可以是任何長度的，較好少于20個氨基酸，更好少于10個，如3至6個氨基酸。
當(dāng)然，比較合適的是在式Ⅰ的序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)中，X和Y為該蛋白質(zhì)的主要部分，抗原序列則為例如球蛋白的裸露環(huán)上的一部分。
優(yōu)選的是，R2選自Gln或Thr，R3選自Ser、Asn、Gln、Arg或Ala，R4選自Leu、Ile、Gln或Arg，R5是Leu或Lys，R6是Gly或Asn，R7選自Gly、Ala、Leu、Ile、Val、Met、Cys、Phe、Tyr、Trp或Ser，R8是Ser或Ala，R9是Gly或Phe，R10是Arg或Lys，R11選自Leu、His、IleGln，R12選自Ala、Ile或Val。10和16位上的Cys殘基可以是或不是由分子內(nèi)二硫橋鍵連接的。
本發(fā)明之多肽的一種優(yōu)選形式是其基本上由式(Ⅱ)的氨基酸序列構(gòu)成X-Asp-Gln-R3-Leu-R5-Gly-R7-Trp-Gly-Cys-Ser-Gly-Lys-R11-R12-Cys-Y (Ⅱ)其中R3、R5、R11、R12、X和Y定義同上，且R7是選自Gly、Ala、Leu、Ile、Val、MetCys、Phe、Tyr或Trp的氨基酸殘基。
根據(jù)式(Ⅱ)的序列，較好是R3選自Ser、Asn、Gln和Arg，R11選自Leu、His或Ile，且R12是Ile或Ala。更有利的是，R7選自Ile、Phe、Met、Val或Leu。最好R3是Ser或Asn或Asn，且R5是Lys。
根據(jù)本發(fā)明的式(Ⅱ)多肽的優(yōu)選形式是由下示序列構(gòu)成X-Asp-Gln-Ser-Leu-Lys-Gly-Ile-Trp-Gly-Cys-Ser-Gly-Lys-Leu-Ala-Cys-Y其中X和Y定義同上，且10和16位上的Cys殘基可以是由分子內(nèi)二硫橋鍵連接的。
式(Ⅱ)多肽的另一個優(yōu)選形式包括R3選自Gln或Arg，R5是Leu，R7選自Ile、Phe和Met，R11選自LeuHis或Ile且R12為Ala。優(yōu)選序列具有下列結(jié)構(gòu)式X-Asp-Gln-Ser-Leu-Leu-Gly-Ile-Trp-Gly-Cys-Ser-Gly-Lys-Leu-Ala-Cys-Y其中X和Y定義同上，且處于10和16位上的Cys殘基可以是由分子內(nèi)二硫橋鍵連接的。
根據(jù)式Ⅱ的多肽組裝成HIVI衣殼蛋白的某些抗原決定基部分。
根據(jù)本發(fā)明之多肽的另一個優(yōu)選形式基本上由式(Ⅲ)的氨基酸序列構(gòu)成X-R1-R2-R3-R4-R5-Asn-Ser-Trp-Gly-Cys-Ala-Phe-Arg-Gln-Val-Cys-Y (Ⅲ)其中R1是Glu或Asp;
R2是Thr或Gln;
R3是選自Ser、Asn、Arg、Gln或Ala的氨基酸;
R4是選自Leu、Arg、Ile或Gln的氨基酸;
R5是Lys或Leu，且其中X和Y定義同上，處于10和16位上的Cys殘基可以是或不是由分子內(nèi)二硫橋鍵連接的。
根據(jù)式(Ⅲ)之多肽的一個優(yōu)選形式是它基本上由下列式(Ⅲa)的氨基酸序列構(gòu)成
X-Glu-Thr-R3-R4-Lys-Asn-Ser-Trp-Gly-Cys-Ala-Phe-Arg-Gln-Val-Cys-Y (Ⅲa)其中R3是選自Ser、Asn、Arg、Gln或Ala的氨基酸殘基，R4是選自Leu、Ile、Arg或Gln的氨基酸殘基，X和Y定義同前，且處于10和16位上的Cys殘基可以是或不是由分子內(nèi)二硫橋鍵連接的。當(dāng)R4是Ile時，R3較好是Ser，且當(dāng)R3是Ala時，R4較好是Arg或Gln，但更好是Arg。
根據(jù)式Ⅲ的多肽相似于HIVⅡ衣殼蛋白的某些抗原決定基。
本發(fā)明的優(yōu)選多肽序列是基于它們與HIV衣殼蛋白的一個以上抗原決定基的細(xì)部結(jié)構(gòu)相似性而被選擇的。例如，最初被設(shè)計成某抗原決定基之結(jié)構(gòu)類似物的給定多肽，可能由于祖先基因的復(fù)制、或因為該多肽是不連續(xù)抗原決定基的結(jié)構(gòu)類似物，或因為這些多肽已被設(shè)計為多價的，所以也可顯示出與HIV衣殼蛋白之一個或多個其他區(qū)域的局部結(jié)構(gòu)相似性。不連續(xù)抗原決定基可以看作是由密切相對的序列抗原決定基組成的，就它們自身的作用來說可以是有其抗原意義的，而且一個多價多肽可在單一多肽鏈上含有兩個或多個(連續(xù)或不連續(xù)的)抗原決定基類似物，從而為同時誘發(fā)產(chǎn)生一系列抗體，用以識別HIV衣殼蛋白上的兩個或多個抗原決定基。
例如，可使用常規(guī)的9-芴基-甲氧基羰基(F-Moc)化學(xué)(如參見Atherton，E.and Sheppard，R.C.(1985)J.Chem.Soc.Chem.Comm.165)或常規(guī)丁氧基碳酸酯(T-Boc)化學(xué)來合成本發(fā)明的肽。
應(yīng)仔細(xì)檢查結(jié)構(gòu)的正確性和純度水平(一般應(yīng)在85%以上)，而且當(dāng)存在分子內(nèi)二硫橋鍵時，還應(yīng)特別注意其排布的正確性。可使用各種層析分析法(包括高效液相層析)及光譜分析法(包括拉曼光譜分析)來達(dá)到這一目的。
本文所有序列中均使用標(biāo)準(zhǔn)的I.U.P.A.C.三字母代碼縮寫符來表示如下限定的氨基酸殘基Gly-甘氨酸，Ala-丙氨酸，Val-纈氨酸，Leu-亮氨酸，Ile-異亮氨酸，Ser-絲氨酸，Thr-蘇氨酸，Asp-天冬氨酸，Glu-谷氨酸;Asn-天冬酰胺，Gln-谷氨酰胺，Lys-賴氨酸，His-組氨酸，Arg-精氨酸，Phe-苯丙氨酸，Tyr-酪氨酸，Trp-色氨酸，Cys-半胱氨酸，Met-蛋氨酸，Pro-脯氨酸。
本發(fā)明的多肽或其抗體可以單獨使用或與其他藥劑合用，如3′疊氮基-3′-脫氧胸苷(AZT)(Zidovudine)-其可通過干擾病毒遺傳材料的復(fù)制在不同水平上發(fā)揮作用，和/或HIV蛋白酶抑制劑-其可阻斷病毒發(fā)育所必需之酶的作用。
本發(fā)明的多肽可用于產(chǎn)生抗體，而所說的抗體可以與廣泛的HIV-1和/或HIVⅡ病毒株產(chǎn)生的衣殼蛋白有交叉反應(yīng)。我們的分析表明，鑒于本發(fā)明之多肽的構(gòu)象/局部結(jié)構(gòu)/靜電特性，故它們極可能誘發(fā)產(chǎn)生可與幾個或許多個病毒株之HIV衣殼蛋白有交叉反應(yīng)的抗體，并且可能將幾個變異多肽的優(yōu)點結(jié)合于一個較大多肽中。這樣的多肽可具有下列通式(Ⅳ)〔La-F〕m-〔Lb-G〕n-Lc(Ⅳ)其中F和G各自可以是根據(jù)式Ⅰ至Ⅲa之一的多肽，L是連接序列，a、b和c各自是0或1，m和n各自是1和10之間的正數(shù)。L較好是短的、構(gòu)象上可曲拆的多肽鏈的小片段，例如但不限于Gly-Gly-Gly-Gly、Gly-Pro-Gly-Pro-Gly-Pro或Gly-Ser-Ala-Gly-Ser-Gly-Ala。應(yīng)明確的是，各重復(fù)部分可以有或沒有根據(jù)本發(fā)明之多肽的不同變異體。
由式Ⅳ限定的多價抗原決定基類似物是指假均多價的(pseudohomopolyvalent)類似物，其中在單一多肽鏈內(nèi)重復(fù)出現(xiàn)基本上同一抗原決定基類似物的變異體。此外，簡單的均質(zhì)多價多肽免疫原-其含有根據(jù)式Ⅰ至Ⅲa之一的一個抗原決定基類似物之同樣變異體的多個拷貝-也可望是有效的，并且也包括于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
可望假均多價免疫原多肽作為疫苗是特別有價值的，它們可引發(fā)產(chǎn)生一系列有相似但不完全相同之基本特異性的(中和)抗體，它們與多種HIV病毒株的衣殼蛋白之間有交叉反應(yīng)，因而就保護(hù)免疫力來說是更為有效的。就構(gòu)建異質(zhì)多價多肽來說也有其多方面的優(yōu)點，所說的異多價多肽含有以任何次療存在的、根據(jù)本發(fā)明之一種多肽的一個或多個拷貝，以及抗原決定基類似物的一種或多種其他類似物。本發(fā)明提供的這類多肽具有下列通式(Ⅴ)Ld-〔G-L〕m-F-〔L-G〕n-Le(Ⅴ)其中F是根據(jù)式Ⅰ至Ⅲa的任何一種多肽，G是根據(jù)式Ⅰ至Ⅲa或其他序列的任何一種多肽，m和n各自是如1和10之間的正數(shù)，且d和e各自是0或1。“L”較好是多肽鏈的短的，構(gòu)象上可拆曲的小片段，例如但不僅限于Gly-Gly-Gly-Gly-Gly、Gly-Pro-Gly-Pro-Gly-Pro或Gly-Ser-Ala-Gly-Ser-Gly-Ala。在肽Ⅴ的優(yōu)選形式中，G可包括式Ⅰ至Ⅲa中之一或下示序列的多肽X-Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-Gly-Gly-Glu-Leu-Y其中各個Gly可獨自地被任何其他氨基酸所取代，和/或X與Y可各自是不存在的或者是一個或多個，如三個氨基酸殘基?；蛘撸珿可包括一些與HIV抗原蛋白相關(guān)的其它多肽序列。
應(yīng)明確的是，保留了親代多肽之一般形式和功能的、上面鑒定之多肽序列的抗原上有意義的亞片段和/或抗原上有意義的變異體，也包括于本發(fā)明的范圍內(nèi)。具體地說，用有差不多構(gòu)象和/或物理特性的殘基取代任何特定的殘基，包括用罕見的(但是天然存在的，如D-立體異構(gòu)體)或合成的氨基酸類似物取代者，也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。例如，被如下限定的同一組中的另一氨基酸取代即包括在本發(fā)明的范圍內(nèi);1組-Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp和Met;2組-Ser、Thr、Asn和Gln;3組-Asp和Glu;4組-Lys、His和Arg;5組-Asn和Asp;6組-Glu和Gln;7組-Gly、Ala、Pro、Ser和Thr。所有氨基酸類型的D-立體異構(gòu)型均可被取代，如D-Phe、D-Tyr和D-Trp。
本發(fā)明的優(yōu)選方案中，如果X和Y存在的話，它們各自獨立地包括蛋白質(zhì)序列的一個或多個片段，這些片段具有與T-細(xì)胞抗原決定基相同的能力。例如，通式1-2-3-4之氨基酸序列的各小片段、其中1是Gly或帶電荷的氨基酸(如Lys、His、Arg、Asp或Glu)、2是疏水氨基酸(如Ile、Leu、Val、Met、Tyr、Phe、Trp、Ala)、3是疏水氨基酸(如上限定的)或不帶電荷的極性氨基酸(如Asn、Ser、Thr、Pro、Gln、Gly)，且4是極性氨基酸(如Lys、Arg、His、Glu、Asp、Asn、Gln、Ser、ThrPro)，似乎可至少在某些情況下作為T細(xì)胞抗原決定基(Rothbard，J.B.&Taylor，W.R.，(1988)A Sequence pattern in common to T-Cell epitopes The EMBO Journal，7(1)93-100)。相似小片段可以是序列1′-2′-3′-4′-5′的小片段，其中1′是等同于上面限定的1，2′等同于2，3′和4′等同于3，而5′等同于4(文獻(xiàn)同上)。兩種形式均包括于本發(fā)明的范圍內(nèi)，且均可作為1個或多個T細(xì)胞抗原決定基(最好少于5個)，其可以是上面限定的類型或有其他結(jié)構(gòu)，且可以被具有任何長度或組成的、但較好是少于5個氨基酸(長度)并包括如選自Gly、Ala、Pro、Asn、Thr、Ser之殘基或非α氨基酸等多功能連接子的間隔基分離開的。有可能借助C或N未端連接子(接頭)提供一個完整的蛋白質(zhì)，從而可不必將其連接到載體蛋白上。
根據(jù)式Ⅰ之多肽的衍生物也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，其中X或Y是或包括“反向一倒置”(“retro-inverso”)氨基酸，即具有相當(dāng)于氨基酸之功能性基團(tuán)的雙功能胺。例如，根據(jù)本發(fā)明的，并含有反向一倒置氨基酸的類似物可具有下列結(jié)構(gòu)式
式中R是任何功能基團(tuán)，例如甘氨酸側(cè)鏈，A1和A2各較好是由其N或C未端連接的本文限定之一種類似物(但不一定是同樣的)的拷貝。也可包括前面討論過的T細(xì)胞抗原決定基。
對肽的反轉(zhuǎn)-倒置修飾包括倒轉(zhuǎn)一個或多個肽鍵，以產(chǎn)生比原始分子對酶促消化有更大抗性的類似物，或者提供一種能產(chǎn)生分支免疫原的方便途徑，這樣的分支免疫原可含有如中至大免疫原所具有的高濃度抗原決定基。在大批量溶液中使用這些化合物，合成短鏈生物學(xué)活性肽的“反轉(zhuǎn)一倒置”結(jié)構(gòu)類似物，具有很大的潛在價值。
應(yīng)當(dāng)指出的是，不能使用重組DNA系統(tǒng)直接制備加進(jìn)了反轉(zhuǎn)一倒置氨基酸衍生物的類似物。但可直接制備基本類似物，然后使用標(biāo)準(zhǔn)肽/有機(jī)化學(xué)方法對其進(jìn)行純化并與反轉(zhuǎn)一倒置氨基酸化學(xué)連接。一個實用的、簡便的在聚酰胺型樹膠上合成反轉(zhuǎn)一倒置肽的固相合成法最近已有所述〔Gazerro，H.，Pinori，M.&Verdini，A.S.(1990).A neugenecal Procedune kor tie Solid-phase synthescs ok retro-inwerso peptide.Ia“Jnnovation and perspectwesin solid phase Synthesis”Ed Roger Epton.SPCC(UK)Ltd.，Birmingham，uk〕。
可以通過多肽本身的化學(xué)基團(tuán)，或通過加到其C或N未端上的附加氨基酸，使多肽連接到載體分子上，為使其免疫學(xué)功能最佳化，可以與多肽本身分開或者由一個或多個附加氨基酸所包繞。許多鍵合都是適用的，如包括使用Tyr、Cys和Lys殘基的側(cè)鏈。適用的載體如包括純化的結(jié)核菌素蛋白衍生物(PPD)、破傷風(fēng)類毒素、霍亂毒素B及其亞單位、卵白蛋白、牛血清白蛋白、大豆胰蛋白酶抑制物、胞壁酰二肽和其類似物，以及Braun氏脂蛋白，以及其他一些本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適用載體。當(dāng)使用PPD作為本發(fā)明之多肽的載體時，如果多肽-PPD結(jié)合物的接受者體已在以前因例如接受過BCG免疫接種而對結(jié)核菌素敏感，便可產(chǎn)生更高濃度的抗體。就人疫苗來說，值得提到的是，在英國和許多其他國家的人口都定期接種BCG，因此都對PPD有很大敏感性。那么在這些國家就可以優(yōu)選PPD作為載體。
多肽與載體偶聯(lián)的方式將取決于被偶聯(lián)材料的性質(zhì)。例如，可用N-γ-馬來酰亞氨基丁酰氧基-琥珀酰亞胺使載體中的賴氨酸殘基偶聯(lián)到多肽中C未端或其他半胱氨酸殘基上(Kitagawa，T.&Ackawa，T.(1976)，J.Biochem.，79，233)?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)中已描述了其他一些偶聯(lián)反應(yīng)和試劑。
可經(jīng)任何給藥途徑(如胃腸道外、鼻內(nèi)、口服、直腸、子宮內(nèi))使用或不使用常規(guī)佐劑(如氫氧化鋁或弗氏完全或不完全佐劑)及/或其他免疫增效劑給予單獨的多肽或已連接到載體分子上的多肽。本發(fā)明還包括緩釋形式的本發(fā)明的多肽配方，如包含脂質(zhì)體(Allison A.C.&Gregoriadis，G.(1974)Nature(London)252，252)或由乳酸與羥基乙酸之共聚物制成的生物可降解微膠囊、(Gresser，J.D.and Sanderson，J.E.(1984)，“Biopolymer Controlled Release Systems”，PP127-138，Ed.D.L.Wise)的皮下植入劑或貯存劑。
可以用任何一種常規(guī)方法合成本發(fā)明的多肽，如直接使用人工合成方法或上面提到的自動肽合成技術(shù)，或者間接地使用RNA或DNA合成方法及分子生物學(xué)及遺傳工程的常規(guī)技術(shù)?？捎眠@些技術(shù)產(chǎn)生含有已插入到其他多肽序列中之一種或多種多肽的雜合蛋白質(zhì)。
因此本發(fā)明的另一個方面是提供至少編碼本發(fā)明之一種合成多肽的DNA分子，且該DNA分子最好是摻入到可在微生物或哺乳動物細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的適當(dāng)表達(dá)載體中。該DNA可以是編碼較長產(chǎn)物之DNA序列的一部分，如這些多肽可以作為其他蛋白質(zhì)(在這些蛋白質(zhì)編碼DNA中已借助基因工程技術(shù)插入了目的多肽的DNA編碼序列)的一部分得以表達(dá)。作為上述技術(shù)的實踐指南，可參見“Molecular cloninga Laboratory manual”，by Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F、and Maniatis，T.(2nd Editon，1989)。
本發(fā)明的多肽可以單獨或結(jié)合到適當(dāng)載體上使用，用作(a)預(yù)防一個或多個HN病毒株感染的肽疫苗;
(b)作為例如HIV陽性患者的血清檢驗中的配體;
(c)作為測試?yán)缈乖摱嚯牡目贵w的結(jié)合水平的質(zhì)量控制劑;
(d)通過接種適當(dāng)動物以產(chǎn)生單克隆或多克隆抗體的抗原劑，所產(chǎn)生的抗體適用于(ⅰ)對HIV病毒進(jìn)行科學(xué)研究，(ⅱ)作為診斷試劑，如作為組織化學(xué)劑的一部分，(ⅲ)對HIV感染的病人作被動免疫，單獨使用或與其他藥劑如AZT和/或HIV蛋白酶抑制劑合用以治療愛滋病，以及(ⅳ)作為一種工具，可作其他藥劑(如AZT或HIV蛋白酶抑制劑)擊中其表示上可表達(dá)HIV衣殼蛋白的HIV感染的細(xì)胞，其中這些藥劑可以是被共價結(jié)合的或以其他方式結(jié)合的，如作為含有這些藥劑并摻入抗任何抗原性多肽之抗體的脂質(zhì)體。本發(fā)明進(jìn)一步提供了基因工程化形式的抗多肽抗體或其亞部分，特別是VH區(qū)域，并提供使用文獻(xiàn)中所述技術(shù)制得的最初是在動物體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生之“人源化”形式的抗多肽抗體;
(e)通過在體內(nèi)解離HIV病毒與人或動物細(xì)胞的結(jié)合或破壞病毒的三維組織來治療HIV感染;以及幫助對HIV病毒的體外科學(xué)研究。
對于HIV或HIV抗體的檢測和診斷，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員均知道各種免疫檢測法，如夾層檢測法，競爭性或非競爭性檢測法以及直接或間接標(biāo)記法。
本發(fā)明的再一個方面提供了一種檢測HIV或HIV抗體的藥盒，它包括本發(fā)明的至少一種合成多肽。
可用常規(guī)手段制備能與本發(fā)明的合成多肽特異性結(jié)合的多克隆或單克隆抗體、這些抗體的擬人源化形式(如參見Thompson，K.M.et al.，(1986)Immunology 58，157-160)、單一結(jié)構(gòu)區(qū)域抗體(如參見Ward，E.S.，Gussow，D.，Griffiths，A.D.，Jones，P.and Winter，G.(1989)Nature 341，544-546)、以及可跨越血腦屏障的抗體，且這些抗體均構(gòu)成本發(fā)明的一部分。本發(fā)明的抗體自身可用于診斷哺乳動物HIV感染的方法中，其包括將哺乳動物的組織或體液樣品與有效量的上述抗體一起保溫，并確定所說樣品與所說抗體間是否發(fā)生交叉反應(yīng)，并根據(jù)需要測定交叉反應(yīng)的程度和/或速率。至少含有一種所說抗體的診斷藥盒也構(gòu)成本發(fā)明的一部分。
本發(fā)明的再一個方面是提供可用于治療或預(yù)防哺乳動物HIV感染，和/或刺激哺乳動物免疫系統(tǒng)和/或封閉HIV病毒的細(xì)胞受體的合成多肽，以及適于這些應(yīng)用的醫(yī)藥制劑。還包括有關(guān)的醫(yī)藥組合物，所說的組合物含有至少一種作為活性成分的上述多肽或多肽一載體結(jié)合物，并可配有一種或多種醫(yī)藥上可接受的佐劑、載體和/或賦形劑。該組合物可以配制成適于口服、經(jīng)鼻腔、直腸或非胃腸道給藥(包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)給藥)的劑型。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了治療或預(yù)防哺乳動物HIV感染和/或刺激哺乳動物免疫系統(tǒng)和/或封閉HIV病毒之細(xì)胞受體的方法，其包括給予有效量的上文中限定的多肽。該多肽可單獨使用或與其他愛滋病治療劑如AZT和/或HIV蛋白酶的抑制劑聯(lián)合使用。
下列實施例旨在進(jìn)一步闡述而不是以任何方式限制本發(fā)明。
實施例1使用標(biāo)準(zhǔn)固相F-moc方法合成C未端擴(kuò)展形式的有下列序列的堿性肽(a)Asp-Gln-Ser-Leu-Lys-Gly-Ile-Trp-Gly-Cys-Ser-Gly-Lys-Leu-Ala-Cys并在兩個Cys殘基之間形成分子內(nèi)二硫橋鍵。在三氟乙酸存在下由樹脂上裂解得到肽，然后用凝膠過濾法、離子交換層析法和反相高效液相層析法純化肽。所得肽的純度在85%以上。C末端帶有丙氨酸酸，以促使連接。將該肽溶解于磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，5mg/ml)中并與等體積卵白蛋白(5mg/ml)混合，然后加入戊二醛至終濃度為0.1%(W/V)。將連接混合物放置30分鐘，然后加弗氏佐劑乳化。用在弗氏完全佐劑(FCA)中乳化的250ug肽免疫各組動物(5只動物/組)，其后(14天)用在弗氏不完全佐劑(FIA)中乳化的相似量肽攻擊動物。3-4周后，再次用在FIA中乳化的肽攻擊動物。攻擊后17-10天收集血液樣品，并檢測對HIV衣殼蛋白的結(jié)合。
利用已構(gòu)建的可在被感染細(xì)胞之表面上表達(dá)HIV衣殼蛋白的重組牛痘病毒(如參見Macket，M.and Smith，G.L.(1986)J.gen.Virol.67，2067，por general ncethodolgy)檢測可識別HIV衣殼蛋白的抗合成肽抗體。之所以優(yōu)選這一檢測方法，是因為可檢測與病毒感染之細(xì)胞表面上的抗原的結(jié)合，這樣便可比檢測與溶液相抗原(例如因為衣殼蛋白上的某些潛在抗原決定基可在體內(nèi)通過與膜磷脂的相互作用而被掩蔽)的結(jié)合更有代表性。用重組牛痘病毒感染在96孔微量濃定板中以單層生長的CVI猴腎細(xì)胞。該病毒構(gòu)建體含有編碼HIV衣殼糖蛋白的基因，而且知道已被加工并可在被感染細(xì)胞的表面上得以表達(dá)。用重復(fù)的樣品檢測羊的抗血清。將50μl不同稀釋度的抗血清加到小孔內(nèi)并保溫4小時，然后洗兩次并加入第二抗體，即過氧化物酶標(biāo)記的抗羊血清。在微量板測讀器中讀出光密度，以確定陽性孔。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)該抗肽抗血清與被感染細(xì)胞之表面上表達(dá)的HIV衣殼蛋白有高親合性交叉反應(yīng)(見表1和1A)。這些結(jié)果證明這些抗肽抗體可作為有價值的研究工具和診斷試劑。
表1用肽(a)的連接物免疫之羊的血清與猴腎細(xì)胞表面上表達(dá)之重組HIV衣殼蛋白的交叉反應(yīng)交叉反應(yīng)<
<p>表1A與猴腎細(xì)胞表面上表達(dá)的重組HIV衣殼蛋白反應(yīng)時，用肽(a)之連接物免疫之羊的陽性抗血清的典型濃度
上表表明，即使在對試驗綿羊血清進(jìn)行顯著稀釋的情況下(相對于對照組)，滴度仍大大提高。
實施例2中和抗體的一個作用是阻止病毒由被感染細(xì)胞向未感染細(xì)胞傳遞。阻止病毒由T細(xì)胞向巨噬細(xì)胞傳遞或降低傳遞比率是很關(guān)鍵的，因為這樣可以明顯地延長愛滋病病人的壽命。檢測了抗肽抗血清于體外抑制合胞體形成的能力。合胞體(syncitia)是因HIV感染的細(xì)胞之間形成“橋”而產(chǎn)生的多核巨型細(xì)胞。
合成含下示序并并在兩個Cys殘基間有分子內(nèi)二硫橋鍵的C未端伸展形式的堿性肽(a)Asp-Gln-Ser-Leu-Lys-Gly-Ile-Trp-Gly-Cys-Ser-Gly-Lys-Leu-Ala-Cys純化并連接后，用以按實施例1所述方法免疫各組羊。將該抗肽抗血清用于體外HIV中和試驗。將抗肽抗體引入用強(qiáng)毒力HIV病毒株感染的人T淋巴細(xì)胞和未感染之人巨噬細(xì)胞的體外培養(yǎng)物中。發(fā)現(xiàn)抗肽抗血清能夠抑制該接能了強(qiáng)毒力HIVI病毒株的T細(xì)胞與巨噬細(xì)胞之混合細(xì)胞群體中合胞體的形成，即它們可抑制HIV感染由T細(xì)胞向巨噬細(xì)胞的播散。
發(fā)現(xiàn)該抗體可阻止HIV感染巨噬細(xì)胞，因此在該體外檢測試驗中其為中和抗體，而在對照培養(yǎng)物中巨噬細(xì)胞顯示出已受到感染。結(jié)果如表2所示。
表2 在HIV感染的人T淋巴細(xì)胞和未感染之人巨噬細(xì)胞的體外培養(yǎng)物中對強(qiáng)毒力HIV病毒的中和作用“
”表示高度感染;“-”表示有效地對抗感染細(xì)胞培養(yǎng)物 巨噬細(xì)胞的感染程度只有HIV感染的T淋巴細(xì)胞和未感染的巨噬細(xì)胞
HIV感染的T淋巴細(xì)胞未感染的巨噬細(xì)胞和抗肽(a)抗體 -另外，以合胞體檢測法估計了抗肽(a)的陽性抗血清。該試驗確定了抗血清阻止活病毒由被感染細(xì)胞向未被感染細(xì)胞播散的能力，以及阻止通過病毒糖蛋白(gp160)與CD4分子間的反應(yīng)活性介導(dǎo)的細(xì)胞間融合的能力。檢測試驗是借助檢驗和計數(shù)合胞體而完成的。
按下述程序進(jìn)行合胞體檢測試驗將供活病毒復(fù)制的已知濃度的HIV生產(chǎn)(CD+4)細(xì)胞系洗三次，并與特定稀釋度的待測抗血清混合。37℃下保溫30分鐘后，將這些細(xì)胞以特定比例與對HIV感染和合胞體誘導(dǎo)作用高度敏感的指示細(xì)胞，即CD4+細(xì)胞系混合。然后每天觀察合胞體形成情況。
如表3所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗肽抗體可抑制合胞體形成。
表3抗血清對HIV感染的生產(chǎn)細(xì)胞和指示細(xì)胞系間合胞體形成的抑制作用血清樣品 合胞體抑制作用抗肽(a)抗血清 +(3/5動物)正常羊血清 -實施例3得到一批處在獲得性免疫缺陷綜合癥(愛滋病)之不同病性進(jìn)展階段，即從無癥狀到癥狀全面爆發(fā)階段的HIV感染之病人的血清，以便制得用ELISA程序測出的這些病人的血清與合成肽間反應(yīng)性的有代表性的圖形，從而確定合成肽(HIV之gp120和gp40跨膜蛋白質(zhì)各區(qū)域的結(jié)構(gòu)類似物)與抗HIV-1陽性病人血清中HIV-1表面糖蛋白之抗體間反應(yīng)性的程度。
一百份HIV陽性病人的抗血清均與合成肽(a)起反應(yīng)。如表4所示，其中有兩份血清(得自無癥狀病人)含有HIV中和抗體，并與肽(a)有交叉反應(yīng)。
表4肽(a)與兩份無癥狀病人的陽性抗血清的交叉反應(yīng)性
權(quán)利要求
1.一種制造具有至少一株人免疫缺陷病毒(HIV)的衣殼蛋白的至少一種抗原性質(zhì)的合成多肽的方法，該多肽基本上由式(I)所示的氨基酸序列組成X-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-Trp-Cly-Cys-R8-R9-R10-R11-R12Cys-Y (Ⅰ)其中R1為Asp或Glu；R2為選自Cly、Ala、Pro、Ser、Thr、Asn及Gln的氨基酸殘基；R3為選自Cly、Ala、Pro、Ser、Thr、Asp、Glu、Asn、Lys、HiS、Gln或Arg的氨基酸殘基；R4、R5和R11各自代表任何氨基酸殘基；R6和R8各自為選自Cly、Ala、Pro、Ser、Thr、或Asn的氨基酸殘基；R7為選自Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Thr、Asn、Gln、Phe、Tyr、Trp、CyS、Met或Pro的氨基酸殘基；R9和R12各自為選自Cly、Ala、Leu、Ile、Val、Met、Cys、Phe、Tyr或Trp的氨基酸殘基；R10為選自Lys、His或Arg的氨基酸殘基；X和Y各自存在不存在，或各自為一個或多個附加的氨基酸殘基；該方法包括使用本身已知的化學(xué)、生物學(xué)或重組技術(shù)偶聯(lián)殘基以及分離多肽。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中R2選自Gln或Thr，R3選自Ser、Asn、Gln、Arg或Ala，R4選自Leu、Ile、Gln或Arg，R5為Leu或Iys，R6為Gly或Asn，R7選自Gly、Ala、Leu、Ile、ValMet、Cys、Phe、Tyr、Trp或Ser，R8為Ser或Ala，R9為Gly或Phe，R10為Arg或Lys，R11選自Leu、His、Ile、Gln，且R12選自Ala、Ile或Val。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中多肽基本上由式(Ⅱ)的氨基酸序列組成X-Asp-Gln-R3-Leu-R5-Gly-R7-Trp-Gly-Cys-Ser-Gly-Lys-R11-R12-Cys-Y (Ⅱ)其中R3、R5、R11、R12的定義同權(quán)利要求2，R7為選自Gly、Ala、Leu、Ile、Val、Met、Cys、Phe、Tyr或Trp的氨基酸;X和Y各自存在或不存在，或各自為一個或多個附加氨基酸殘基。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中R3選自Ser、Asn、Gln和Arg，R11選自Leu、His或Ile，R12為Ile或Ala。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中R7選自Ile、Phe、Met、Val或Leu。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中R3為Ser或Asn，R5為Lys。
7.如權(quán)利要求1-6中任一項所述的方法，其中多肽由以下序列組成X-Asp-Gln-Ser-Leu-Lys-Gly-Ile-Trp-Gly-Cys-Ser-Gly-Lys-Leu-Ala-Cys-Y其中X和Y各自可存在或不存在，或各自為一個或多個附加氨基酸殘基。
8.如權(quán)利要求3所述的方法，其中R3選自Gln或Arg，R5為Leu，R7選自Ile、Phe和Met，R11選自Leu、His或Ile，R12為Ala。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中多肽由以下序列組成X-Asp-Gln-Gln-Leu-Leu-Gly-Ile-Trp-Gly-Cys-Ser-Gly-Lys-Leu-Ala-Cys-Y其中X和Y各自可存在或不存在，或各自為一個或多個附加氨基酸殘基。
10.如權(quán)利要求2所述的方法，其中多肽基本上由式(Ⅲ)所示的氨基酸序列組成X-R1-R2-R3-R4-R5-Asn-Ser-Trp-Gly-Cys-Ala-Phe-Arg-Gln-Val-Cys-Y (Ⅲ)其中R1為Glu或Asp;R2為Thr或Gln;R3為選自Ser、Asn、Arg、Gln或Ala的氨基酸;R4為選自Leu、Ile、Arg或Gln的氨基酸;R5為Lys或Leu;X和Y各自可存在或不存在，或各自為一個或多個附加氨基酸殘基。
11.如權(quán)利要求2或權(quán)利要求10所述的方法，其中多肽基本上由式(Ⅲa)的氨基酸序列組成X-Glu-Thr-R3-R4-Lys-Asn-Ser-Trp-Gly-Cys-Ala-Phe-Arg-Gln-Val-Cys-Y (Ⅲa)其中R3為選自Ser、Asn、Arg、Gln或Ala的氨基酸殘基;R4為選自Leu、Ile、Arg或Gln的氨基酸殘基;其中X和Y各自可存在或不存在，或各自為一個或多個附加氨基酸殘基。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中當(dāng)R4為Ile時R3為Ser，當(dāng)R4為Arg或Gln時R3為Ala。
13.如權(quán)利要求1-6中任一項所述的方法，其中多肽鏈上10位和16位的Cys殘基通過分子內(nèi)二硫橋鍵相連。
14.一種制備通式(Ⅳ)所示合成多肽的方法[La-F]m-[Lb-G]n-Lc (Ⅳ)其中F和G各自可為式Ⅰ至式Ⅲa之任一多肽，L為連接序列，每一連接序列C可相同或不同，a、b和c各自為0或1，m和n各自為正數(shù)，該方法包括使用本身已知的化學(xué)、生物學(xué)或重組技術(shù)偶聯(lián)殘基，以及分離多肽。
15.一種制備通式(Ⅴ)所示合成多肽的方法其中F為式Ⅰ至式Ⅲa之任一多肽，G為式Ⅰ至式Ⅲa之任一多肽或其它序列，m和n各自為正數(shù)，d和e各自為0或1，該方法包括使用本身已知的化學(xué)、生物學(xué)或重組技術(shù)偶聯(lián)殘基并分離多肽Ld-[G-L]m-F-[L-G]n-Le (Ⅴ)
16.如權(quán)利要求1-6中任一項所述的方法，其中多肽包括反相一倒置氨基酸。
17.如權(quán)利要求1至6中任一項所述的方法，其中多肽包括權(quán)利要求1-6中任一項之多肽的抗原有效亞片段或其變異物。
18.如權(quán)利要求1-6中任一項所述的方法，其中多肽另外還包括至少一種F細(xì)胞抗原決定基。
19.如權(quán)利要求1-6中任一項所述的方法，它另外還包括將多肽與疫苗載體相連接。
20.一種制備疫苗的方法，其中如權(quán)利要求1-19中任一項所定義的、能夠有效促進(jìn)對至少一株HIV的免疫作用的合成多肽是與一種或多種可作藥用的佐劑、載體和/或賦形劑相混合。
21.一種用于檢測HIV或HIV抗體的藥盒，它包括至少一種如權(quán)利要求1-18之任一定義的合成多肽。
22.如權(quán)利要求1-6中任一項所述的方法，其中使用了重組DNA技術(shù)。
23.一種藥用組合物的制備方法，它包括將權(quán)利要求1-19之任一項所定義至少一種多肽作為活性成分與可作藥用的佐劑、載體和/或賦形劑相連。
24.將權(quán)利要求1-6中任一項所定義的合成多肽用于合成一種藥劑，以治療或預(yù)防哺乳動物HIV感染和/或刺激哺乳動物的免疫系統(tǒng)和/或阻斷細(xì)胞上的HIV病毒受體。
25.與權(quán)利要求1-13中任一項所定義的合成多肽特異結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段的制備方法，其中該方法包括用權(quán)利要求1-20中任一項所定義的合成多肽免疫哺乳動物，并分離所形成的抗體。
26.一種用于檢測HIV或HIV抗體的診斷盒，它含有與權(quán)利要求1-13中任一項所定義的合成多肽特異結(jié)合的至少一種抗體或抗原結(jié)合片段。
27.一種制備藥用組合物的方法，它包括將作為活性成分的、與權(quán)利要求1-13中任一項所述的合成多肽特異結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段與一種或多種可作藥用的佐劑、載體和/或賦形劑相連。
28.如權(quán)利要求23或27所述的方法，它包括將AZT和/或HIV蛋白酶抑制劑與合成多肽或抗體或其抗原結(jié)合片段相連。
29.一種診斷哺乳動物HIV感染的方法，它包括將哺乳動物的組織液或體液樣品和與權(quán)利要求1-13中任一項所述的合成多肽特異結(jié)合的有效量的抗體或其抗原結(jié)合片段一起保溫，并測定所說樣品和所說抗體之間是否發(fā)生交叉反應(yīng)，并根據(jù)需要測定交叉反應(yīng)的程度和/或速率。
30.一種檢測HIV或HIV抗體或其抗原結(jié)合片段的方法，它包括將樣品與權(quán)利要求1-19中任一項所述的至少一種多肽一起保溫。
全文摘要
本發(fā)明所公開的合成多肽具有至少一株人免疫缺陷病毒(HIV)的至一種抗原性質(zhì)，優(yōu)選的序列為X-Asp-Gln-Ser-Leu-Lys-Gly-Ile-Trp-Gly-Cys-Ser-Gly-Lys-Leu-Ala-Cys-Y其中x和Y各自可不存在或各自為一個或多個附加氨基酸殘基，且10和16位的Cys殘基可通過分子內(nèi)二硫橋鍵相連。該多肽可用于診斷、治療和預(yù)防HIV感染。還涉及與該肽特異結(jié)合的抗體及其結(jié)合片段。
文檔編號C07K16/00GK1054772SQ91101549
公開日1991年9月25日 申請日期1991年3月15日 優(yōu)先權(quán)日1990年3月15日
發(fā)明者羅伯特·V·非什利夫, 貝利·羅伯遜 申請人:普羅托斯分子設(shè)計有限公司