高抗氧化活性復(fù)合寡肽及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種高抗氧化活性復(fù)合寡肽及其制備方法，本發(fā)明的一種高抗氧化活性復(fù)合寡肽的制備方法，包括以下步驟：(1)用胃蛋白酶和堿性蛋白酶以單酶或有次序的雙酶分別對(duì)雞蛋清蛋白和大豆蛋白進(jìn)行水解，取上述雞蛋清蛋白水解液的一種和上述大豆蛋白水解液的一種；(2)采用超濾和樹(shù)脂富集上述兩種蛋白來(lái)源水解液中的強(qiáng)疏水性抗氧化肽，通過(guò)梯度洗脫獲得目標(biāo)肽，即為樹(shù)脂粗分離組分；(3)將步驟(1)中得到的兩種蛋白來(lái)源水解液或/和步驟(2)中得到的兩種蛋白來(lái)源水解液的樹(shù)脂粗分離組分分別進(jìn)行兩兩復(fù)配，得到復(fù)合寡肽。本發(fā)明復(fù)合寡肽抗氧化活性強(qiáng)，制備方法簡(jiǎn)單。
【專利說(shuō)明】高抗氧化活性復(fù)合寡肽及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及食品【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種高抗氧化活性復(fù)合寡肽及其制備方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002] 動(dòng)植物蛋白、海洋蛋白、廢棄蛋白資源等酶解產(chǎn)生的抗氧化肽因其分子量小、易吸 收、活性強(qiáng)、安全性高等特點(diǎn)，并能有效地清除體內(nèi)過(guò)剩的活性氧自由基，保護(hù)細(xì)胞和線粒 體的正常結(jié)構(gòu)和功能，防止脂質(zhì)過(guò)氧化的發(fā)生，在醫(yī)藥、化妝品、保健品和食品與飼料添加 劑等方面有廣闊的應(yīng)用前景。大豆蛋白和雞蛋蛋白具有較高的生物效價(jià)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，水解 后制備成的具有生理活性的大豆肽和雞蛋肽的生物效價(jià)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值也都很高，其中有關(guān)這 兩類(lèi)蛋白來(lái)源酶解肽的抗氧化活性研究的報(bào)道也較多，近年來(lái)受關(guān)注程度呈遞增趨勢(shì)。此 夕卜，許多研究發(fā)現(xiàn)多種功效因子聯(lián)合作用比單一組分具有更好的效果，即呈現(xiàn)協(xié)同作用，這 種作用可能源于具有不同作用機(jī)制的功效因子之間存在互補(bǔ)作用或相互修復(fù)作用。已有研 究證實(shí)，肽與肽之間及肽與非肽類(lèi)抗氧化成分之間存在協(xié)同作用效果，且這種協(xié)同作用在 不同的抗氧化評(píng)價(jià)體系中存在顯著差異。
[0003] 盡管部分抗氧化肽被證實(shí)具有強(qiáng)效的抗氧化活性，但其分離純化過(guò)程一般較繁 瑣，成本較高。相對(duì)于純肽，蛋白水解母液或粗分離組分從產(chǎn)品開(kāi)發(fā)方面更具有可行性。因 此，如何提高蛋白水解液的生物活性顯得尤為重要。許多研究顯示堿性蛋白酶和胃蛋白酶 對(duì)于蛋白原料中的高活性功能肽的釋放具有顯著效果。除了通過(guò)蛋白原料與蛋白酶的雙向 篩選外，將活性較高的不同水解液或粗分離組分進(jìn)行復(fù)配以發(fā)揮其協(xié)同效應(yīng)，也是提高目 標(biāo)產(chǎn)品生物活性較好的一種方式。
[0004] 目前，缺乏一種具有抗氧化活性強(qiáng)的高抗氧化活性復(fù)合寡肽及其制備方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種抗氧化活性強(qiáng)的高抗氧化活性復(fù)合寡肽及其制備方法。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：本發(fā)明提供了一種高抗氧化活性復(fù)合寡肽的制備方法， 包括以下步驟：
[0007] (1)用胃蛋白酶和堿性蛋白酶以單酶或有次序的雙酶分別對(duì)雞蛋清蛋白和大豆蛋 白進(jìn)行水解，取上述雞蛋清蛋白水解液的一種和上述大豆蛋白水解液的一種；
[0008] (2)采用超濾和樹(shù)脂富集上述兩種蛋白來(lái)源水解液中的強(qiáng)疏水性抗氧化肽，通過(guò) 梯度洗脫獲得目標(biāo)肽，即為樹(shù)脂粗分離組分；
[0009] (3)將步驟（1)中得到的兩種蛋白來(lái)源水解液或/和步驟（2)中得到的兩種蛋白 來(lái)源水解液的樹(shù)脂粗分離組分分別進(jìn)行兩兩復(fù)配，得到復(fù)合寡肽。
[0010] 進(jìn)一步地，在步驟（1)中，分別以雞蛋清蛋白粉和大豆蛋白粉為原料，加水配置 成蛋白懸濁液，在85°C-95°C保持lOmin，并不斷攪拌使蛋白變性，冷卻至室溫，加入堿性 蛋白酶進(jìn)行水解；酶解結(jié)束后，加入胃蛋白酶水解，反應(yīng)后滅酶，冷卻至室溫后調(diào)PH值至 5. 0-6.0,離心并收集上清液；
[0011] 在步驟（2)中，對(duì)步驟（1)所得上清液進(jìn)行超濾，收集濾過(guò)液，真空濃縮后冷凍干 燥雞蛋清蛋白抗氧化肽和大豆蛋白抗氧化肽粗品；所得上述粗品用DA201-C大孔吸附樹(shù)脂 吸附，然后用乙醇梯度洗脫，收集、真空濃縮并冷凍干燥洗脫組分，即可獲得兩種蛋白的高 抗氧化活性樹(shù)脂粗分離組分；
[0012] 在步驟（3)中，雞蛋清蛋白酶解肽和大豆蛋白酶解肽的水解液的肽濃度比為1 : 3-3 :1進(jìn)行復(fù)配；所述兩種水解液來(lái)源的粗分離組分的肽濃度比為I:3-3 :1進(jìn)行復(fù)配。
[0013] 進(jìn)一步地，在步驟（1)中，雞蛋清蛋白或大豆蛋白懸濁液的質(zhì)量濃度為1% -6%。
[0014] 更進(jìn)一步地，在步驟⑴中，堿性蛋白酶酶解條件為：酶的添加量為 600(^-1200(^/18蛋白巾!1值為6.5-11.0;水解溫度為501：-701：，酶解時(shí)間為1-611。
[0015] 進(jìn)一步地，在步驟（1)中，胃蛋白酶酶解條件為：酶的添加量為8000U-25000U/lg 蛋白；pH值為L(zhǎng)0-2. 5 ;溫度為35-40°C，水解時(shí)間為l_6h。
[0016] 進(jìn)一步地，在步驟（1)中，胃蛋白酶和堿性蛋白酶的水解順序可以顛倒，或用上述 兩種酶的一種進(jìn)行雞蛋清蛋白水解液和大豆蛋白水解液的制備。
[0017] 更進(jìn)一步地，在步驟⑴中，滅酶條件為：95°C保持15min，冷卻至室溫后在轉(zhuǎn)速 4000r/min離心 15min。
[0018] 進(jìn)一步地，在步驟⑵中，超濾的膜截留分子量為3kDa;超濾操作前超濾膜要先后 用乙醇、pH值為1-2的酸液、pH值為11-12的堿液和去離子水各循環(huán)清洗20min,操作壓為 0.I-O. 2MPa〇
[0019] 進(jìn)一步地，步驟（2)中，取步驟（1)中所得抗氧化肽粗品溶于pH值為5. 0-6.0的 PBS緩沖液中，加入DA201-C大孔吸附樹(shù)脂靜態(tài)吸附l-3h，用體積分?jǐn)?shù)為10-50%的乙醇洗 滌后，再用體積分?jǐn)?shù)為50-100%的乙醇洗脫，洗脫時(shí)間0. 5-3h，收集、真空濃縮及冷凍干燥 75%的乙醇洗脫組分，實(shí)現(xiàn)強(qiáng)疏水高活性抗氧化肽的富集。
[0020] 本發(fā)明所述的高抗氧化活性復(fù)合寡肽的制備方法制得的復(fù)合寡肽。
[0021] 有益效果：本發(fā)明復(fù)合寡肽抗氧化活性強(qiáng)，制備方法簡(jiǎn)單，參數(shù)容易控制，重復(fù)性 好，所得產(chǎn)品安全、無(wú)毒副作用，質(zhì)量穩(wěn)定；所用雞蛋清蛋白和大豆蛋白原料利用率高，所用 設(shè)備和試劑價(jià)格便宜，所得寡肽產(chǎn)品生產(chǎn)成本低，便于工業(yè)化生產(chǎn)；相對(duì)于單一蛋白來(lái)源活 性肽產(chǎn)品，本發(fā)明所得復(fù)合寡肽營(yíng)養(yǎng)更豐富、抗氧化活性更強(qiáng)，有效發(fā)揮了不同蛋白來(lái)源活 性肽的協(xié)同作用，可直接應(yīng)用于食品、化妝品和醫(yī)藥等領(lǐng)域。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖1為本發(fā)明的蛋清蛋白酶解液和大?蛋白酶解液的總還原能力的不意圖；
[0023] 圖2為本發(fā)明的蛋清蛋白酶解液和大豆蛋白酶解液的DPPH自由基清除活性的示 意圖；
[0024] 圖3為本發(fā)明的蛋清蛋白酶解液和大豆蛋白酶解液的羥自由基清除活性的示意 圖；
[0025] 圖4為本發(fā)明的單一酶解液和復(fù)配酶解液的總還原能力的示意圖；
[0026] 圖5為本發(fā)明的單一酶解液和復(fù)配酶解液的DPPH·清除活性的示意圖；
[0027] 圖6為本發(fā)明的單一酶解液和復(fù)配酶解液的OH·清除活性的示意圖；
[0028] 圖7為本發(fā)明的單一分離組分和復(fù)配分離組分的總還原能力的示意圖；
[0029] 圖8為本發(fā)明的單一分離組分和復(fù)配分離組分的DPPH·清除活性的示意圖；
[0030] 圖9為本發(fā)明的單一分離組分和復(fù)配分離組分的OH·清除活性的示意圖。

【具體實(shí)施方式】
[0031] 下面將通過(guò)附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的具體描述，但不能理解為是對(duì) 本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。
[0032] 實(shí)施例1
[0033] 本發(fā)明的蛋白酶解液的制備，單酶及雙酶分步酶解條件如表1所示，
[0034] 表 1
[0035]

【權(quán)利要求】
1. 一種高抗氧化活性復(fù)合寡肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 用胃蛋白酶和堿性蛋白酶以單酶或有次序的雙酶分別對(duì)雞蛋清蛋白和大豆蛋白進(jìn) 行水解，取上述雞蛋清蛋白水解液的一種和上述大豆蛋白水解液的一種； (2) 采用超濾和樹(shù)脂富集上述兩種蛋白來(lái)源水解液中的強(qiáng)疏水性抗氧化肽，通過(guò)梯度 洗脫獲得目標(biāo)肽，即為樹(shù)脂粗分離組分； (3) 將步驟⑴中得到的兩種蛋白來(lái)源水解液或/和步驟⑵中得到的兩種蛋白來(lái)源 水解液的樹(shù)脂粗分離組分分別進(jìn)行兩兩復(fù)配，得到復(fù)合寡肽。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高抗氧化活性復(fù)合寡肽的制備方法，其特征在于：在步驟（1) 中，分別以雞蛋清蛋白粉和大豆蛋白粉為原料，加水配置成蛋白懸濁液，在85°C _95°C保持 lOmin，并不斷攪拌使蛋白變性，冷卻至室溫，加入堿性蛋白酶進(jìn)行水解；酶解結(jié)束后，加入 胃蛋白酶水解，反應(yīng)后滅酶，冷卻至室溫后調(diào)pH值至5. 0-6. 0,離心并收集上清液； 在步驟（2)中，對(duì)步驟（1)所得上清液進(jìn)行超濾，收集濾過(guò)液，真空濃縮后冷凍干燥雞 蛋清蛋白抗氧化肽和大豆蛋白抗氧化肽粗品；所得上述粗品用DA201-C大孔吸附樹(shù)脂吸 附，然后用乙醇梯度洗脫，收集、真空濃縮并冷凍干燥洗脫組分，即可獲得兩種蛋白的高抗 氧化活性樹(shù)脂粗分離組分； 在步驟（3)中，雞蛋清蛋白酶解肽和大豆蛋白酶解肽的水解液的肽濃度比為1 :3-3 :1 進(jìn)行復(fù)配；所述兩種水解液來(lái)源的粗分離組分的肽濃度比為1 :3_3 :1進(jìn)行復(fù)配。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高抗氧化活性復(fù)合寡肽的制備方法，其特征在于：在步驟（1) 中，雞蛋清蛋白或大豆蛋白懸濁液的質(zhì)量濃度為1% -6%。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的高抗氧化活性復(fù)合寡肽的制備方法，其特征在于：在步驟（1) 中，堿性蛋白酶酶解條件為：酶的添加量為6000U-12000U/lg蛋白；pH值為6. 5-11. 0 ;水解 溫度為50°C -70°C，酶解時(shí)間為l_6h。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高抗氧化活性復(fù)合寡肽的制備方法，其特征在于：在步驟（1) 中，胃蛋白酶酶解條件為：酶的添加量為8000U-25000U/lg蛋白；pH值為1. 0-2. 5 ;溫度為 35-40°C，水解時(shí)間為l_6h。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的高抗氧化活性復(fù)合寡肽的制備方法，其特征在于：在步驟（1) 中，胃蛋白酶和堿性蛋白酶的水解順序可以顛倒，或用上述兩種酶的一種進(jìn)行雞蛋清蛋白 水解液和大豆蛋白水解液的制備。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的高抗氧化活性復(fù)合寡肽的制備方法，其特征在于：在步驟（1) 中，滅酶條件為：95°C保持15min，冷卻至室溫后在轉(zhuǎn)速4000r/min離心15min。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高抗氧化活性復(fù)合寡肽的制備方法，其特征在于：在步驟（2) 中，超濾的膜截留分子量為3kDa ;超濾操作前超濾膜要先后用乙醇、pH值為1-2的酸液、pH 值為11-12的堿液和去離子水各循環(huán)清洗20min，操作壓為0. 1-0. 2MPa。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的高抗氧化活性復(fù)合寡肽的制備方法，其特征在于：步驟（2) 中，取步驟（1)中所得抗氧化肽粗品溶于pH值為5. 0-6. 0的PBS緩沖液中，加入DA201-C 大孔吸附樹(shù)脂靜態(tài)吸附l_3h，用體積分?jǐn)?shù)為10-50%的乙醇洗滌后，再用體積分?jǐn)?shù)為 50-100%的乙醇洗脫，洗脫時(shí)間0. 5-3h，收集、真空濃縮及冷凍干燥75%的乙醇洗脫組分， 實(shí)現(xiàn)強(qiáng)疏水高活性抗氧化肽的富集。
10. 權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)所述的高抗氧化活性復(fù)合寡肽的制備方法制得的復(fù)合寡肽。
【文檔編號(hào)】C07K1/34GK104357523SQ201410710613
【公開(kāi)日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年11月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月28日
【發(fā)明者】饒勝其, 方維明, 黃阿根, 高璐, 楊振泉, 尹永祺 申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)