調(diào)控水稻花期的蛋白OsEFL1及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了調(diào)控水稻花期的蛋白OsEFL1及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供了抑制OsEFL1蛋白編碼基因表達(dá)的物質(zhì)在調(diào)控植物花期中的應(yīng)用；所述OsEFL1蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2。本發(fā)明利用反義核酸沉默水稻體內(nèi)OsEFL1基因表達(dá)，得到不育水稻，從而證明OsEFL1基因可以調(diào)控水稻花期，創(chuàng)建不同生育期的育種材料，對(duì)水稻的遺傳改良具有深遠(yuǎn)的實(shí)際應(yīng)用意義。
【專利說明】調(diào)控水稻花期的蛋白OsEFU及其編碼基因與應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[OOOU 本發(fā)明設(shè)及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其設(shè)及調(diào)控水稻花期的蛋白化EFL1及其編碼基因 與應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 抽穗期是決定水稻品種的地區(qū)和季節(jié)適應(yīng)性的重要農(nóng)藝性狀，抽穗期遺傳研究對(duì) 指導(dǎo)育種實(shí)踐、品種改良和品種推廣均具有重要的意義。抽穗期是水稻育種家在育種過程 中重點(diǎn)關(guān)注的農(nóng)藝性狀，該性狀受主效基因位點(diǎn)和微效多基因位點(diǎn)的共同控制。因此，水稻 抽穗期的遺傳方式既有質(zhì)量性狀遺傳特性，也有數(shù)量性狀遺傳特點(diǎn)。同時(shí)，不同類型品種由 于遺傳背景不同會(huì)表現(xiàn)出不同的遺傳特性，而同一品種的抽穗期也會(huì)由于光溫條件的不同 而表現(xiàn)各異。
[0003] 對(duì)于水稻抽穗期遺傳的分子機(jī)制已有較深入的研究。目前的研究表明水稻的 抽穗由化ading date 3a 出d3a，主要的 short-day (SD)成花素]和 Flowering locus T1[RFT1，Hd3a 最近的同源物，主要的 long-day(LD)成花素]促進(jìn)（Tamaki et al. , 2007 ; Komiya2009)。在該些成花素基因的上游基因中，Heading date l(Hdl)和Early heading date UEhdl)作為兩個(gè)主要的開花信號(hào)集成者，接受來自其它基因的多種信號(hào)，如 OsGIGANTEA(OsGI), Rice IndeterminateKRIDl,也即 0sIDl/Ehd2), Early heading date 3 (Ehd3), OsMADSSO, OsMADSSl, Ghd7(for Grain number, plant height and heading date 7),和DT服（for days to heading on c虹omosome 8,也即化d8)，來調(diào)控成花素基因的 表達(dá)（Tsuj i et al. , 2011 ;Yano et al. , 2000 ;Doi et al. , 2004 ;化yama et al. , 2003 ; Wu et al. , 2008 ；Park et al. , 2008 ；Matsubara et al. , 2008 ；Matsubara et al. , 2011 ； Lee et al. , 2004 ;Kim et al. , 2007 ;Xue et al. , 2008 ;Wei et al. , 2010b ;Yan et al.，2010)。分析該些開花時(shí)間基因?qū)τ谘芯克镜牡貐^(qū)適應(yīng)提出了許多借鑒。例如，有研 究表明，Hdl和化dl等位基因的組合對(duì)水稻的開花性狀是十分重要的（Izawa，2007)。另外 化d7等位變異的序列分析表明該位點(diǎn)對(duì)于栽培稻在全球范圍的適應(yīng)性起重要作用狂ue et al.，2008)。然而，根據(jù)該些基因的等位基因?qū)Φ貐^(qū)適應(yīng)性的不同表型，栽培稻的開花時(shí)間 表型和大多數(shù)開花時(shí)間基因單倍型之間的關(guān)聯(lián)需要深入研究。
[0004] 通過對(duì)水稻突變體庫進(jìn)行細(xì)致的篩選，獲得一個(gè)花期提前的水稻突變體efll，研 究證實(shí)了突變體efll是由于水稻逆轉(zhuǎn)座子Tosl7插入到L0C_0s02巧5080基因3' UTR區(qū) 域所致（TIGR:ht1:p://;rice. plan憂iology. msu. edu)，OsEFLl基因在突變體植株中的正常 mRNA表達(dá)量比對(duì)照顯著降低，導(dǎo)致該基因編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)明顯降低。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明一個(gè)目的是提供抑制化E化1蛋白編碼基因表達(dá)的物質(zhì)的用途。
[0006] 本發(fā)明提供的抑制化E化1蛋白編碼基因表達(dá)的物質(zhì)在調(diào)控植物花期中的應(yīng)用；
[0007] 所述化EFL1蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2。
[000引上述應(yīng)用中，所述調(diào)控植物花期為提前植物花期或促進(jìn)植物開花。
[0009] 上述應(yīng)用中，所述調(diào)控植物花期為促進(jìn)植物開花和/或抽穗。
[0010] 上述應(yīng)用中，所述抑制化E化1編碼基因表達(dá)的物質(zhì)為DNA分子A，所述DNA分子A 的序列為序列表中序列1自5'末端第78-1074位核巧酸的反向互補(bǔ)序列或含有所述DM 分子A的重組載體或含有所述DM分子A的重組菌。
[001U 上述應(yīng)用中，所述重組載體為將所述DNA分子A插入表達(dá)載體pCambial390-化i 中得到的重組載體；
[0012] 所述重組菌為將所述重組載體導(dǎo)入目的菌中得到的重組菌。
[0013] 上述應(yīng)用中，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物具體為水稻。
[0014] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。
[0015] 本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：將抑制化E化1編碼基因表達(dá)的物質(zhì)導(dǎo)入目的 植物中，得到轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的開花時(shí)間早于所述目的植物；
[0016] 上述方法中，所述抑制化E化1編碼基因表達(dá)的物質(zhì)為DNA分子A，所述DNA分子A 的序列為序列表中序列1自5'末端第78-1074位核巧酸的反向互補(bǔ)序列；
[0017] 所述DNA分子A具體通過上述重組載體中導(dǎo)入目的植物中。
[0018] 上述方法中，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物具體為水稻。
[0019] 本發(fā)明第S個(gè)目的是提供一種DNA分子A。
[0020] 本發(fā)明提供的DNA分子A，為如下1)或2):
[0021] 1)序列為序列表中序列1自5'末端第78-1074位核巧酸的反向互補(bǔ)序列的DNA 分子；
[002引 2)在嚴(yán)格條件下與1)雜交且編碼相同蛋白的DNA分子。
[002引 上述嚴(yán)格條件可為用0. 1XSS陽（或0. 1XSSC)，0. 1%SDS的溶液，在DNA或者RNA 雜交實(shí)驗(yàn)中65°C下雜交并洗膜。
[0024] 本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明利用反義核酸沉默水稻體內(nèi)化EFL1基因表達(dá)，得到不 育水稻，從而證明化EFL1基因可W調(diào)控水稻花期，創(chuàng)建不同生育期的育種材料，對(duì)水稻的 遺傳改良具有深遠(yuǎn)的實(shí)際應(yīng)用意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 圖1為野生型與突變體efll的植株與開花期比較圖
[0026] 圖la ;成熟期野生型植株與突變體efll植株形態(tài)比較：左為野生型，右為突變體 efll ;圖化：不同光周期下野生型與突變體的開花時(shí)間比較。
[0027] 圖2為化EFL1基因的結(jié)構(gòu)和Tosl7插入位點(diǎn)分析及化EFL1在突變體efll中的 表達(dá)
[002引 圖2a為化EFL1基因的結(jié)構(gòu)和Tosl7插入位點(diǎn)分析，起始密碼（ATG)和終止密碼 (TGA)已經(jīng)標(biāo)出，黑色方框表示化EFL1基因的外顯子，白色方框表示基因的內(nèi)含子；兩個(gè)倒 S角形分別表示efll中Tosl7插入的位置。P1，P2,表示位于兩個(gè)外顯子的引物；
[0029] 圖化為是RT-PCR分析化E化1在野生型（WT)和突變體ef 11中的表達(dá)
[0030] 圖3為互補(bǔ)試驗(yàn)圖
[003U 圖4為利用RNAi技術(shù)抑制野生型水稻內(nèi)源化EFL1的表達(dá)可W提高水稻開花期
[003引 圖5為干設(shè)載體0sEFLli-pCambial390-UBI的示意圖 [003引 圖6為干設(shè)株系中化E化1基因的定量表達(dá)分析

【具體實(shí)施方式】
[0034] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0035] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0036] 實(shí)施例1、化E化1基因突變體ef 11獲得及表型
[0037] 一、ef 11突變體的獲得
[003引 l、efll突變體的獲得
[0039] 所用的水稻T-DNA插入突變體庫由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)陸軍生物技術(shù)研究所利用載 體炸X-E24. 2-15R構(gòu)建而成（突變體庫的創(chuàng)建方法已經(jīng)公開發(fā)表論文，見等見Wan等， Activation tagging，an efficient tool for functional analysis of the rice genome。Plant Mol Biol. 2009Jan;69(l-2):69-80).挑選出 10000 份水稻轉(zhuǎn)基因品種"日 本晴（為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)所保持的梗稻測(cè)序品種，W下也稱為野生型水稻）"的種 子，經(jīng)浸種、催芽后播于秩田，35天后移栽至大田。每份材料種兩行，每行10株，為一個(gè)家 系，種植地點(diǎn)為河北廊坊萬莊中國(guó)農(nóng)科院高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)園內(nèi)的試驗(yàn)田，按常規(guī)的水稻種植 方法進(jìn)行田間管理。經(jīng)過大田篩選共獲到100個(gè)花期提前的突變株系。其中，一個(gè)原始編 號(hào)為E78的突變體表型為抽穗期顯著提前（如圖la),將突變體命名為efll。
[0040] 北京自然光照條件ND每年4月下旬播種，1個(gè)月后插秩，田間管理同大田生產(chǎn)。光 照培養(yǎng)箱控制的短日照條件（S化1化光，30°C /I化暗，25°C )，光照培養(yǎng)箱控制的長(zhǎng)日照條 件（LD，1化光，30°C /I化暗，25°C )。光照培養(yǎng)箱用巧光燈照明（300 y mol m-2s-i)，濕度為 70%。圖化顯示各個(gè)材料的開花時(shí)間。
[0041] 2、分離efll突變體T-DNA插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列
[0042] 利用 PCR Wa化ing 方法（Siebe;rt 等，An improved PCR method for wa化ing in uncloned genomic DNA. Nucleic Acids Res, 1995, 23:1087-1088),分離了該個(gè)突變體的側(cè) 翼序列。根據(jù)側(cè)翼序列與水稻基因組的匹配位置確定插入位點(diǎn)，結(jié)果顯示該側(cè)翼序列位于 水稻的第2染色體上，插入位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于水稻基因組注釋網(wǎng)站化ttp://;rice. plan憂iology. msu.e化/)上的一個(gè)基因命名為Os邸Ll，其核巧酸序列為序列表中序列1，編碼區(qū)為序列表 中序列1自5'末端第292至921位脫氧核糖核巧酸，該基因編碼的蛋白命名為化EFL1，該 蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2。Tosl7插入到該基因的第3' -UTR區(qū)域（見圖2a)。
[0043] PCR Wa化ing方法分離得到的efll突變體Tosl7插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列如序列3所 /J、- 〇
[0044] 3、0sEFLl基因在突變體的表達(dá)檢測(cè)
[0045] 為了證實(shí)花期提前的突變表型是由于化EFL1基因內(nèi)的Tosl7插入引起，對(duì)3個(gè)突 變體和野生型同時(shí)進(jìn)行半定量分析，檢測(cè)的具體步驟為；（1)在化EFL1基因Tosl7插入位 點(diǎn)上游設(shè)計(jì)一對(duì)基因組引物PU5' ATT TGG GAC CTC AGC GAA GC 3')和P2巧'TGA CTC AAG GGC TCT GTT GC 3')，提取突變體和野生型的RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，結(jié)果表明化E化1基 因在突變體efll中表達(dá)量顯著降低（圖化）。
[0046] 二、OsEFLl基因的互補(bǔ)突變體驗(yàn)證功能
[0047] 根據(jù)預(yù)測(cè)基因的編碼框，從起始密碼子與終止密碼子兩側(cè)設(shè)計(jì)引物：
[0048] 正向引物：5-GG GCC CCT CTC TTC TCG CCG TCC TAG，
[0049] 反向引物：5-TCT AGA CAG CAA ACA GAA CCC CTT CA ;下劃線所示為 Smal 和甜al 酶切位點(diǎn)。
[0化0] 提取野生型水稻日本晴葉片RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，用上述正向引物和反向引 物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到95化pPCR產(chǎn)物，即為化E化1基因。
[0化^ 將該P(yáng)CR產(chǎn)物連入祀ASY-Tlsimple載體，經(jīng)測(cè)序正確后，再用Smal和甜al酶 切，得到的酶切產(chǎn)物連入pCambia23A植物雙元表達(dá)載體，構(gòu)建成互補(bǔ)重組載體，命名為 化E化l-l-Pcambia2300A，經(jīng)過測(cè)序，該重組載體為將序列表中序列1所示的化E化1基因插 入pCambia23A載體的Smal和甜al酶切位點(diǎn)，得到的載體。
[0化引 將化E化l-l-Pcambia2300A導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105菌株，轉(zhuǎn)化水稻突變體efll，經(jīng)過 一系列的組培過程，獲得再生的轉(zhuǎn)基因植株，即轉(zhuǎn)化EFLl-l-Pcambia2300A水稻（回補(bǔ)），通 過鑒定轉(zhuǎn)OsE化l-l-Pcambia2300A水稻（回補(bǔ)）。
[0化引 播種轉(zhuǎn)化EFLl-l-Pcambia2300A水稻（回補(bǔ)）株系#1、#4、水稻突變體efll、野生 型水稻（WT)，培育，在播種第120天觀察生長(zhǎng)表型，統(tǒng)計(jì)開花時(shí)間。
[0化4] 結(jié)果如圖3所示，圖3a為種第120天觀察生長(zhǎng)表型，看出，與野生型水稻相比，水 稻突變體efll抽穗時(shí)間早，而回補(bǔ)得到的轉(zhuǎn)化EFLl-l-Pcambia2300A水稻（回補(bǔ)）與野生 型表型無顯著差異；
[005引圖3b為開花時(shí)間統(tǒng)計(jì)，ND、SD、LD分別代表自然生長(zhǎng)狀態(tài)、短日照條件、長(zhǎng)日照條 件?？蒞看出在自然生長(zhǎng)狀況下，互補(bǔ)系#1、#4開花期恢復(fù)到了野生型狀況。在SD短日照 下，差異不顯著。在LD條件下，開花期與在自然生長(zhǎng)狀況下相似。
[0056] 上述結(jié)果表明，化邸L1基因能夠互補(bǔ)突變體efll的突變表型。
[0057] 實(shí)施例2、抑制化EFL1基因的物質(zhì)在培育花期提前水稻中的應(yīng)用
[0化引 1、DNA分子的制備
[0059] 根據(jù)OsE化1基因的CDS序列（序列1)設(shè)計(jì)引物，如下正向引物：5-ACT AGT CAG CAA ACA GAA CCC CTT CA，反向引物：5-GGA TCC CTC TCT TCT CGC CGT CCT AG。
[0060] 提取野生型日本晴水稻總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄合成cDNA作為模板，用上述正 向引物和反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到99化pPCR產(chǎn)物，與預(yù)期結(jié)果相符。將上述PCR產(chǎn)物與 PMD19-T Simple(Takara)連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌D冊(cè)a感受態(tài)細(xì)胞，根據(jù)PMD19-T Simple載體上的駿卞青霉素抗性標(biāo)記篩選陽性克隆，得到含有回收片段的重組質(zhì)粒。W該 重組質(zhì)粒載體上的通用引物M13對(duì)其進(jìn)行核巧酸序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果表明，上述PCR產(chǎn)物為 序列表中序列1自5 ^末端第78至1074位脫氧核糖核巧酸，為化EFL1基因的部分片段。
[0061] 2、化iquitin啟動(dòng)子的獲得
[0062] W玉米基因組 DNA 為模板 5'-AAG CTT TCT AGT GCA GTG CAG CGT GAC-3' 和 5'-CTG CAG CCT CTA GTG CAG AAG TAA CACCA-3'為引物，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，得到 2肺P 的 PCR 產(chǎn)物即為化iquitin啟動(dòng)子，核巧酸序列為序列表中序列4。
[006引 3、抑制化E化1基因表達(dá)的重組載體的獲得
[0064] 將上述2得到的序列表中序列4所示的化iquitin啟動(dòng)子插入植物雙元表達(dá)載體 pCambial390 (該載體可購自 Gambia, Queensland. Australia)的 Hindlll 和 PstI 位點(diǎn)間， 構(gòu)成中間載體pCambial39〇-Ubi ;
[00化]再將上述1得到的序列表中序列1自5 ^末端第78-1074位核巧酸的反向互補(bǔ)片 段（OsE化li)替換中間載體pCambial390-化i的Spel和BamHI位點(diǎn)間的片段，得到重組載 體，命名為 OsE化li-pCambial390-UBI (圖 5)。
[0066] 4、干擾化EFL1基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因水稻的獲得
[0067] 構(gòu)建好的OsE化li-pCambial390-UBI重組載體電轉(zhuǎn)入（電轉(zhuǎn)化儀為 eppendo計(jì)公司產(chǎn)品，本發(fā)明所用電壓為1800V，具體操作參考該儀器的使用說明 書）農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105，轉(zhuǎn)化后的菌株命名為 OsEFLli-pCambialSgO-UBI。
[0068] 將〇3邸1^1-口〔3111扣3139〇-冊(cè)1轉(zhuǎn)入水稻梗稻品種日本晴（4 0^^ Sequence of the Rice Genome(Oryza sativa L. ssp. japonica)Stephen A. Goff, et al. Science296, 92(2002)，W下也稱為野生型水稻）種子誘導(dǎo)的愈傷組織中，得到再生株 系。具體如下：
[0069] 1)種子愈傷組織誘導(dǎo)如下；選取飽滿、無霉變成熟水稻種子，用手工脫去谷殼（注 意保持胚完整），將脫谷殼米粒轉(zhuǎn)到50mL無菌S角瓶一加適量無菌水洗一次一棄水，倒入 75%酒精適量，搖動(dòng)攬拌，放置30秒（過程中適當(dāng)輕搖動(dòng)混勻）一棄酒精一加適量無菌水 洗一次一棄水一倒入適量2%化化0,不時(shí)搖動(dòng)攬拌，共處理30分鐘一棄化化0 -用無菌水 洗3次，每次停留1分鐘一倒去無菌水，將種子從=角瓶轉(zhuǎn)到帶無菌濾紙的無菌培養(yǎng)皿中吸 干。誘導(dǎo)培養(yǎng)基；MS+2, 4-D 2mg/L+庶糖30g/L+3. 6g/L植物凝膠（P冊(cè).8)。
[0070] 2)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化
[0071] (1)挑選繼代約7天的胚性愈傷組織作為轉(zhuǎn)化受體材料。
[0072] (2)收集上述農(nóng)桿菌重組菌體化EFLli-pCambial390-UBI，重懸于液體共培養(yǎng)培 養(yǎng)基（在YEP液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加終濃度為lOOmg/L AS (己酷了香酬），調(diào)P冊(cè).2得到 的液體培養(yǎng)基）中，28°C，200巧m震蕩培養(yǎng)1-2小時(shí)；調(diào)整0D值至0. 2。
[0073] (3)將步驟（2)獲得的胚性愈傷組織浸泡步驟2)獲得的農(nóng)桿菌菌液，然后進(jìn)行菌 液浸泡，處理30min。
[0074] (4)將愈傷組織在無菌濾紙上吸干，轉(zhuǎn)移到鋪有一層滅菌濾紙的固體共培養(yǎng)培 養(yǎng)基（在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加5mg/L 2,4-D、0. 4g/L CH(水解酢酪素）、0. Img/ L6-節(jié)氨基腺嚷嶺化-BA)、10g/L葡萄糖、20mg/L As (己酷了香酬）和3.6g/L植物凝膠 (地^agel)，調(diào)PH至5. 2滅菌得到的固體培養(yǎng)基）上，19°C暗培養(yǎng)2-3天。
[007引 （5)將步驟（4)培養(yǎng)得到的愈傷組織轉(zhuǎn)出，無菌水漂洗3-4次，再用含50mg/L Cef (頭胞唾響霉素）的無菌水漂洗，然后將愈傷組織放到滅菌的濾紙上。
[0076] (6)將步驟（5)得到的用無菌濾紙吸干的愈傷組織轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基（在MS基 本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加5mg/L 2,4-D、0.4g/L CH (水解酢酪素）、250mg/L Cef (頭胞唾響霉 素）、50mg/L HPT和3. 6g/L植物凝膠（phytagel)，調(diào)PH至5. 8滅菌得到的固體培養(yǎng)基） 上，25°C暗培養(yǎng)，每?jī)芍苻D(zhuǎn)至繼代培養(yǎng)基上繼代一次。
[0077] (7)經(jīng)步驟（6)所述3次繼代培養(yǎng)后，將生長(zhǎng)旺盛的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng) 基（在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加Img/L 6-節(jié)氨基腺嚷嶺化-BA)、0. Ig/L CH(水解酢酪 素）、250mg/L Cef (頭胞唾響霉素）、50mg/L HPT 和 3. 6g/L 植物凝膠（phytagel)，調(diào) PH 至 5. 8滅菌得到的固體培養(yǎng)基）上，25°C、1化、2000LX光照培養(yǎng)，兩周左右新鮮的愈傷組織上 開始有綠色芽點(diǎn)出現(xiàn)，每15天繼代一次，兩次繼代后，長(zhǎng)出小苗，轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基（在MS 基本培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加3g/L植物凝膠（phytagel)，調(diào)PH至5. 8滅菌得到的固體培養(yǎng)基） 進(jìn)行生根培養(yǎng)。
[007引 （8)待生根培養(yǎng)長(zhǎng)出完整小苗，將小苗轉(zhuǎn)入到壯苗培養(yǎng)基（1/2MS基本培養(yǎng)基的添 加3g/L植物凝膠（phytagel)，調(diào)PH至5. 8滅菌得到的固體培養(yǎng)基）上培養(yǎng)獲得到幼苗。
[0079] (9)將步驟（8)壯苗培養(yǎng)基上的幼苗，煉苗一周，在清水中將培養(yǎng)基漂洗干凈，先 移栽到溫室，再移栽到大田中得到轉(zhuǎn)化EFLl-pCambial390-UBI TO代植株。共得到60株獨(dú) 立轉(zhuǎn)化苗。
[0080] 表1為所用培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基添加不同成分，具體如下：
[0081]

【權(quán)利要求】
1. 抑制OsEFLl蛋白編碼基因表達(dá)的物質(zhì)在調(diào)控植物花期中的應(yīng)用； 所述OsEFLl蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于： 所述調(diào)控植物花期為提前植物花期或促進(jìn)植物開花。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于： 所述調(diào)控植物花期為促進(jìn)植物開花和/或抽穗。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的應(yīng)用，其特征在于： 所述抑制OsEFLl編碼基因表達(dá)的物質(zhì)為DNA分子A，所述DNA分子A的序列為序列表 中序列1自5'末端第78-1074位核苷酸的反向互補(bǔ)序列或含有所述DNA分子A的重組載 體或含有所述DNA分子A的重組菌。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于： 所述重組載體為將所述DNA分子A插入表達(dá)載體pCambial390-Ubi中得到的重組載 體； 所述重組菌為將所述重組載體導(dǎo)入目的菌中得到的重組菌。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的應(yīng)用，其特征在于： 所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物具體為水稻。
7. -種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟：將抑制OsEFLl編碼基因表達(dá)的物質(zhì)導(dǎo) 入目的植物中，得到轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的開花和/或抽穗時(shí)間早于所述目的植 物。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于：所述抑制OsEFLl編碼基因表達(dá)的物質(zhì)為 DNA分子A，所述DNA分子A的序列為序列表中序列1自5'末端第78-1074位核苷酸的反 向互補(bǔ)序列； 所述DNA分子A具體通過權(quán)利要求5中的所述重組載體中導(dǎo)入目的植物中。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7-8中任一所述的應(yīng)用，其特征在于： 所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物具體為水稻。
10. 一種DNA分子A，為如下1)或2): 1) 序列為序列表中序列1自5'末端第78-1074位核苷酸的反向互補(bǔ)序列的DNA分子； 2) 在嚴(yán)格條件下與1)雜交且編碼相同蛋白的DNA分子。
【文檔編號(hào)】C07K14/415GK104447970SQ201410645279
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年11月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月11日
【發(fā)明者】吳金霞, 孫學(xué)輝, 張治國(guó), 路鐵剛 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所