一種化學(xué)法合并酶法制備糖苷類化合物的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，公開了化學(xué)法合并酶法聯(lián)合應(yīng)用制備kinsenoside((3R)-3-(β-D-吡喃葡萄糖基)－γ-丁內(nèi)酯苷)和goodyeroside A((3S)-3-(β-D-吡喃葡萄糖基)－γ-丁內(nèi)酯苷)的方法，包括：(1)應(yīng)用化學(xué)法由D-蘋果酸和L-蘋果酸分別合成苷元(R)-3-羥基-γ-丁內(nèi)酯和(S)-3-羥基-γ-丁內(nèi)酯；(2)應(yīng)用酶法由(R)-3-羥基-γ-丁內(nèi)酯和(S)-3-羥基-γ-丁內(nèi)酯分別合成糖苷kinsenoside和goodyeroside A。
【專利說明】一種化學(xué)法合并酶法制備糖苷類化合物的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及糖苷類化合物的制備方法，具體涉及兩個具有良 好生物活性的糖苷類化合物kinsen〇Side((3R)-3-(i3-D-吡喃葡萄糖基）一 Y-丁內(nèi)酯 苷）和goodyeroside A((3S)-3-(P_D-批喃葡萄糖基）一 γ-丁內(nèi)酯苷）的制備方法。 具體是以D-蘋果酸和L-蘋果酸分別化學(xué)合成苷元（R)-3-羥基-Y-丁內(nèi)酯和（S)-3-羥 基-Y-丁內(nèi)酯的方法，后二者再分別用葡萄糖苷酶催化生成相應(yīng)苷元的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] Kinsenoside由Ito等在1993年從蘭科植物恒春金線蓮（Anoectochilus koshunensis)中首次分離得到。隨后在同屬植物臺灣金線蓮（Anoectochilus formosanus) 和福建金線蓮（Anoectochilus roxburghii)中也發(fā)現(xiàn)了 kinsenoside。Goodyeroside A 是kinsenoside的差向異構(gòu)體，由Gao等在1999年從鸞尾科植物番紅花（Crocus sativus) 中首次分離得到，隨后蘭科斑葉蘭屬（Goodyera species)的三種植物中也報道了有 goodyeroside A存在。體外初步藥理實驗表明kinsenoside和goodyeroside A都對CCl4 損傷的大鼠原代肝細胞有保護作用。此外，化合物kinsenoside具有抗氧化、抗炎、降血脂、 降血糖、預(yù)防骨質(zhì)疏松和保護心血管等生物活性。
[0003] 近年來，隨著對kinsenoside和goodyeroside A深入研究，二者在醫(yī)學(xué)、保健品和 食品方面越來越受到人們的重視，尤其是kinsenoside。雖然這兩個化合物在植物中的含 量很高，但是受到植物生長環(huán)境等因素的影響，從植物中提取分離得到這兩個化合物的費 用比較昂貴，滿足不了人們的需求。因此，通過人工合成這兩個化合物近年來引起學(xué)者的重 視。目前，文獻中已報道的kinsenoside和goodyeroside A的全合成方法有四種。
[0004] 第一種方法是由日本科學(xué)家Katsuhiko Suzuki等在2003年提出，首先以 1，2, 4- 丁三醇為原料，選擇性保護1，4位的兩個羥基后作為苷元；然后以2, 3, 4, 6-四苯 甲?；咸烟侨纫阴啺孵プ鳛樘枪w進行苷化反應(yīng)；最終脫除羥基上的保護基，環(huán)合 成內(nèi)酯。經(jīng)過九步反應(yīng)，得到了 kinsenoside和goodyeroside A的混合物。整個反應(yīng)過 程中，大部分步驟的產(chǎn)率都不算低，但由于合成步驟太長，目標(biāo)產(chǎn)物的總產(chǎn)率并不理想。以 1，2, 4- 丁三醇為原料，最終得到一對差向異構(gòu)體，分離純化時需要對異構(gòu)體進行拆分，比較 困難。此外，實驗過程中還多次使用了 PdCl2和RuCl3等貴金屬試劑，成本較高，反應(yīng)條件要 求苛刻，后處理也會比較麻煩。
[0005] 第二種方法是由我國學(xué)者張翔等在2004年提出，以糠醛為原料，先合成手性的 3-羥基-γ - 丁內(nèi)酯，后與糖供體2, 3, 4, 6-四芐基葡萄糖三氯乙酰亞胺酯進行苷化反應(yīng)，最 后脫去芐基得到目標(biāo)產(chǎn)物。相比第一種方法，此方法的路線較短，原料和試劑都比較便宜， 反應(yīng)成本較低。但該種方法中，多步反應(yīng)的產(chǎn)率都比較低，苷元3-羥基-γ - 丁內(nèi)酯的總產(chǎn) 率只有9. 2%。此外，苷化時得到了 α、β兩種構(gòu)型的產(chǎn)物，后續(xù)的分離純化比較困難。
[0006] 第三種方法是由我國學(xué)者張峰等在2009年提出的，以S-蘋果酸為原料， 2, 3, 4, 6-四苯甲?；咸烟侨纫阴啺孵樘枪w，先苷化，脫保護，再成酯關(guān)環(huán)得到目 標(biāo)產(chǎn)物goodyeroside A。此方法步驟較少，產(chǎn)率也比較高，反應(yīng)試劑也都便宜易得，但是在 形成糖苷鍵的過程中仍然要涉及到保護和脫保護的麻煩過程。
[0007] 第四種方法是由唐菲2011年學(xué)位論文介紹的，先以蘋果酸合成苷元（R)-3-羥 基-Y - 丁內(nèi)酯；然后與2, 3, 4, 6-四芐基葡萄糖三氯乙酰亞胺酯糖供體進行苷化反應(yīng)；最 后Pd-C氫解脫除芐基，得到目標(biāo)產(chǎn)物kinsenoside。該方法中，3-羥基-γ - 丁內(nèi)酯的合成 采用了蘋果酸還原法，經(jīng)歷三步反應(yīng)，產(chǎn)率較高。但是苷化反應(yīng)和脫芐基的反應(yīng)產(chǎn)率都比較 低，其中苷化反應(yīng)后得到了 α、β兩種構(gòu)型的產(chǎn)物，比例接近1:1，對產(chǎn)率有較大影響。
[0008] 1985年以來，就有報道證實酶在有機溶劑中也有較好的活性。首先，相對于水溶 液，多數(shù)底物更易溶于有機溶劑，有利于擴大反應(yīng)規(guī)模；其次，有機溶劑能夠改變水解酶催 化反應(yīng)的平衡狀態(tài)，更有利于糖苷的生成；再者，酶在有機溶劑中的穩(wěn)定性更強，且專一性 可能改變。常見的用于酶催化的有機溶劑有乙腈、叔丁醇、1，4-二氧六環(huán)等。除了選取合 適的有機溶劑外，水活度對酶的催化效率也有很大影響，無水時，酶幾乎無活性，水過多時， 更有利于水解反應(yīng)，不利于目標(biāo)產(chǎn)物的生成。β-D-葡萄糖苷酶能催化糖苷鍵水解，但在保 持一定水活度的有機溶劑中卻可表現(xiàn)出催化糖苷鍵生成的活力。
[0009] 綜上所述，研究探索出一條原料易得、簡單易行的制備kinsenoside和 goodyeroside A的方法仍然具有重要意義。在綜合研究文獻的基礎(chǔ)上，我們建立了化學(xué)合 成和酶催化聯(lián)合應(yīng)用的方法制備kinsenoside和goodyeroside A。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的任務(wù)是提供一種化學(xué)法合并酶法制備糖苷類化合物的方法，以解決背景 技術(shù)中提到的糖苷化過程中需要保護和脫保護的技術(shù)難題和產(chǎn)物中存在差向異構(gòu)體的雜 質(zhì)等技術(shù)問題，且使其具有反應(yīng)過程和后處理簡單，化學(xué)合成得到的苷元可以重復(fù)利用等 特點。
[0011] 實現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案是：
[0012] 化學(xué)法合并酶法制備kinsenoside ((3R)-3-( β-D-批喃葡萄糖基）一 Y - 丁內(nèi)酯 苷）和goodyeroside A ((3S)-3-( β-D-批喃葡萄糖基）一 γ-丁內(nèi)酯苷）的方法包括以 下步驟：
[0013] 步驟一、化學(xué)合成步驟：取13. 4g(0. lmol)D_蘋果酸于三口瓶內(nèi)，加入重蒸的乙酰 氯60mL，在40°C下反應(yīng)，得白色固體0-乙?；?D-蘋果酸酐約15. 6g ;所得產(chǎn)物溶于120mL 甲醇中，室溫下攪拌30min后；減壓蒸餾旋干溶劑，得到18. 6g淡黃色液體0-乙?；?D-蘋 果酸單甲酯；9. 27g(0. 245mol)硼氫化鈉和125mL叔丁醇在85°C的油浴中回流2h，然后緩 慢滴加由上一步得到的〇-乙?；?D-蘋果酸單甲酯，150mL叔丁醇和IOmL甲醇組成的溶 液，反應(yīng)完全后得到（R)-3-乙酰氧基-4-羥基丁酸，向上步反應(yīng)得到的產(chǎn)物中加入ISOmL 1，4_二氧六環(huán)，IOOmL H20,35mL 12mol/L的鹽酸溶液中，加熱到70°C，待反應(yīng)完成后再加 入150mL THF。反應(yīng)液經(jīng)硅膠柱層析得到7. 67g(R) -3-羥基-γ - 丁內(nèi)酯；
[0014] 步驟二、酶合成步驟：在ImL反應(yīng)體系中加入1，4_二氧六環(huán)900 μ L，磷酸鹽緩沖 液 100 μ L (Na2HPO4-KH2PO4, pH 6. 0)，β -D-葡萄糖（0· 25mmol)，（R) -3-羥基-Y - 丁內(nèi)酯 (2. 5mmol)以及β-D-葡萄糖苷酶（5mg)，在50°C恒溫搖床（120r/min)中反應(yīng)56h，停止反 應(yīng)時，將反應(yīng)瓶在90°C水浴中加熱IOmin,使酶失活，娃膠柱層析得到kinsenoside。
[0015] 化學(xué)法合并酶法制備goodyeroside A的方法包括以下步驟：
[0016] 步驟一、化學(xué)合成步驟：取13. 4g(0. lmol)L_蘋果酸于三口瓶內(nèi)，加入重蒸的乙酰 氯60mL，在40°C下反應(yīng)，得白色固體0-乙?；?D-蘋果酸酐約15. 6g，所得產(chǎn)物溶于120mL 甲醇中，室溫下攪拌30min后，減壓蒸餾旋干溶劑，得到18. 6g淡黃色液體0-乙?；?D-蘋 果酸單甲酯；9. 27g(0. 245mol)硼氫化鈉和125mL叔丁醇在85°C的油浴中回流2h，然后緩 慢滴加由上一步得到的〇-乙?；?D-蘋果酸單甲酯，150mL叔丁醇和IOmL甲醇組成的溶 液，反應(yīng)完全后得到（R)-3-乙酰氧基-4-羥基丁酸；向上步反應(yīng)得到的產(chǎn)物中加入ISOmL 1，4-二氧六環(huán)，IOOmL H20, 35mL 12mol/L的鹽酸溶液中，加熱到70°C，待反應(yīng)完成后再加 入150mL THF。反應(yīng)液經(jīng)硅膠柱層析得到7. 67g(R) -3-羥基-γ - 丁內(nèi)酯；
[0017] 步驟二、酶合成步驟：在ImL反應(yīng)體系中加入1，4_二氧六環(huán)900 μ L，磷酸鹽緩沖 液1〇(^1^(恥2冊〇4-腿2?〇4，口!16.〇)，0-〇-葡萄糖（〇.25臟〇1)，（1〇-3-羥基-￥-丁內(nèi)酯 (2. 5mmol)以及β-D-葡萄糖苷酶（5mg)，在50°C恒溫搖床（120r/min)中反應(yīng)56h，停止反 應(yīng)時，將反應(yīng)瓶在90°C水浴中加熱IOmin,使酶失活，娃膠柱層析得到goodyeroside A。
[0018] 本發(fā)明提供了以D-蘋果酸和L-蘋果酸為原料，聯(lián)合應(yīng)用化學(xué)合成和酶催化獲得 化合物kinsenoside和goodyeroside A的方法。解決了技術(shù)背景中糖苷化過程中需要保 護和脫保護的技術(shù)難題，以及產(chǎn)物中差向異構(gòu)體的雜質(zhì)的存在，反應(yīng)過程和后處理簡單，化 學(xué)合成得到的苷元可以重復(fù)利用。
[0019] 該方法的原理是：蘋果酸經(jīng)脫水縮合乙?；幚淼玫?-乙?；?蘋果酸酐，然 后在甲醇中得到O-乙酰基-蘋果酸單甲酯，再經(jīng)硼氫化鈉還原并在鹽酸中環(huán)合得到3-羥 基 -Y _ 丁內(nèi)酉旨?；瘜W(xué)方法得到的3-輕基-γ - 丁內(nèi)酯在1，4-二氧六環(huán)和憐酸鹽緩沖液組 成的單一體系中由β-D-葡萄糖苷酶催化直接和D型葡萄糖反應(yīng)生成糖苷化合物。反應(yīng)式 如式1和2 :
[0020]

【權(quán)利要求】
1. 化學(xué)法合并酶法制備kinsenoside((3R)-3-(0-D-批喃葡萄糖基）一 丁內(nèi)酯 苷）和8〇〇(^61'〇81(16 4((35)-3-(0-〇-批喃葡萄糖基）一￥-丁內(nèi)酯苷）的方法，其特征 在于，該方法包括以下步驟： 步驟一、化學(xué)合成步驟：取13. 4g(0. lmol)D-蘋果酸于三口瓶內(nèi)，加入重蒸的乙酰氯 60mL，在40°C下反應(yīng)，得白色固體0-乙?；?D-蘋果酸酐約15. 6g ;所得產(chǎn)物溶于120mL甲 醇中，室溫下攪拌30min后；減壓蒸餾旋干溶劑，得到18. 6g淡黃色液體0-乙酰基-D-蘋 果酸單甲酯；9. 27g(0. 245mol)硼氫化鈉和125mL叔丁醇在85°C的油浴中回流2h，然后緩 慢滴加由上一步得到的〇-乙?；?D-蘋果酸單甲酯，150mL叔丁醇和10mL甲醇組成的溶 液，反應(yīng)完全后得到（R)-3-乙酰氧基-4-羥基丁酸，向上步反應(yīng)得到的產(chǎn)物中加入180mL 1，4_二氧六環(huán)，100mL H20,35mL 12mol/L的鹽酸溶液中，加熱到70°C，待反應(yīng)完成后再加 入150mL THF。反應(yīng)液經(jīng)硅膠柱層析得到7. 67g(R) -3-羥基-Y _ 丁內(nèi)酯； 步驟二、酶合成步驟：在lmL反應(yīng)體系中加入1，4_二氧六環(huán)900 iiL，磷酸鹽緩沖 液 100 ii L (Na2HP04-KH2P04, pH 6. 0)，P -D-葡萄糖（0? 25mmol)，（R) -3-羥基 1 - 丁內(nèi)酯 (2. 5mmol)以及@-D-葡萄糖苷酶（5mg)，在50°C恒溫搖床（120r/min)中反應(yīng)56h，停止反 應(yīng)時，將反應(yīng)瓶在90°C水浴中加熱lOmin，使酶失活，娃膠柱層析得到kinsenoside。
2. 化學(xué)法合并酶法制備goodyeroside A的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟： 步驟一、化學(xué)合成步驟：取13. 4g(0. lmol)L-蘋果酸于三口瓶內(nèi)，加入重蒸的乙酰氯 60mL，在40°C下反應(yīng)，得白色固體0-乙?；?D-蘋果酸酐約15. 6g，所得產(chǎn)物溶于120mL甲 醇中，室溫下攪拌30min后，減壓蒸餾旋干溶劑，得到18. 6g淡黃色液體0-乙?；?D-蘋 果酸單甲酯；9. 27g(0. 245mol)硼氫化鈉和125mL叔丁醇在85°C的油浴中回流2h，然后緩 慢滴加由上一步得到的〇-乙?；?D-蘋果酸單甲酯，150mL叔丁醇和10mL甲醇組成的溶 液，反應(yīng)完全后得到（R)-3-乙酰氧基-4-羥基丁酸；向上步反應(yīng)得到的產(chǎn)物中加入180mL 1，4-二氧六環(huán)，100mL H20, 35mL 12mol/L的鹽酸溶液中，加熱到70°C，待反應(yīng)完成后再加 入150mL THF。反應(yīng)液經(jīng)硅膠柱層析得到7. 67g(R) -3-羥基-Y _ 丁內(nèi)酯； 步驟二、酶合成步驟：在lmL反應(yīng)體系中加入1，4-二氧六環(huán)900 ii L，磷酸鹽緩沖液 100 ii L (Na2HP04-KH2P04, pH 6. 0)，P -D-葡萄糖（0? 25mmol)，（R) -3-羥基-Y - 丁內(nèi)酯 (2. 5mmol)以及@-D-葡萄糖苷酶（5mg)，在50°C恒溫搖床（120r/min)中反應(yīng)56h，停止反 應(yīng)時，將反應(yīng)瓶在90°C水浴中加熱10min，使酶失活，娃膠柱層析得到goodyeroside A。
【文檔編號】C07D307/33GK104372052SQ201410553673
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年10月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月17日
【發(fā)明者】張勇慧, 賴永繼, 羅增偉, 張錦文 申請人:華中科技大學(xué)