一種羊棘球蚴亞單位疫苗及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種羊棘球蚴亞單位疫苗及其制備方法和應(yīng)用，該疫苗的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，氨基酸序列如SEQIDNO.所示，該疫苗可以激發(fā)細(xì)胞及體液免疫應(yīng)答，并有效預(yù)防羊棘球蚴病的感染，安全性好，為防控羊棘球蚴及人類感染棘球蚴病提供了理想的疫苗。
【專利說(shuō)明】一種羊棘球蚴亞單位疫苗及其制備方法和應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于免疫學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種羊棘球蝴亞單位疫苗，以及該疫苗的制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]棘球蝴病(Echinococosisgranulosis)又稱包蟲(chóng)病(Hydatidosis),是一種人獸共患的流行性寄生蟲(chóng)病，是廣大牧區(qū)所面臨的最嚴(yán)重的絳蟲(chóng)病之一，嚴(yán)重影響了畜牧業(yè)發(fā)展和人類健康。包蟲(chóng)病是由細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)(Echinococcus granulosus)的中期幼蟲(chóng)棘球蝴(Echinococcus)寄生在哺乳動(dòng)物臟器所引發(fā)。而犬類是主要的終末宿主，在感染細(xì)粒棘球蝴后，幼蟲(chóng)在其小腸內(nèi)發(fā)育成熟并產(chǎn)生蟲(chóng)卵。蟲(chóng)卵可隨糞便排放及犬的活動(dòng)污染自身皮毛、牧草、水源等區(qū)域。當(dāng)人及其他哺乳動(dòng)物接觸到蟲(chóng)卵后，蟲(chóng)卵會(huì)在小腸內(nèi)發(fā)育稱棘球蝴，且該幼蟲(chóng)可進(jìn)入血管隨血液循環(huán)而進(jìn)行轉(zhuǎn)移，最終多寄生于肝、肺等臟器，并形成包囊并引發(fā)疾病。目前我國(guó)畜牧養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中受到包蟲(chóng)病危害的家畜有11種之多，其主要危害表現(xiàn)為畜產(chǎn)品發(fā)育受阻、減產(chǎn)、及臟器廢棄等，其中以綿陽(yáng)及生豬感染情況尤為嚴(yán)重。在高發(fā)區(qū)，綿陽(yáng)感染率高于60%，其中肺臟廢棄率10 - 28%、肝臟廢棄率8 — 25%、減產(chǎn)量平均2kg/只。以2009年報(bào)道計(jì)算，我國(guó)畜牧業(yè)年直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)10億元，且呈現(xiàn)逐年遞增狀態(tài)。對(duì)家畜包蟲(chóng)病疫情的防控不徹底，不僅造成畜牧業(yè)的大量經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)也在危害著人類的健康。我國(guó)每年人感染包蟲(chóng)病的病例高于50萬(wàn)例，通過(guò)手術(shù)治療的病例也超過(guò)3000例。以我國(guó)新疆地區(qū)為代表，人患包蟲(chóng)病的感染率高達(dá)31 %，手術(shù)后復(fù)發(fā)率高達(dá)33 %，更有患者為治療包蟲(chóng)病反復(fù)手術(shù)而傾家蕩產(chǎn)。在治愈的患者中，仍然有38%的治愈著無(wú)法恢復(fù)勞動(dòng)能力。
[0003]疫苗是防控傳染病最有效的手段，但至今仍沒(méi)有一款用于預(yù)防棘球蝴病的產(chǎn)品。因此，急需一種用于預(yù)防棘球蝴病的疫苗。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種羊棘球蝴亞單位疫苗，本發(fā)明的目的之二在于提供羊棘球蝴亞單位疫苗的制備方法；本發(fā)明的目的之三在于提供羊棘球蝴亞單位疫苗的應(yīng)用。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，提供如下技術(shù)方案:
1、一種羊棘球蝴亞單位疫苗，所述疫苗的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0006]優(yōu)選的，所述疫苗的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0007]更優(yōu)選的，所述疫苗為無(wú)佐劑注射劑型疫苗或佐劑注射型疫苗。
[0008]最優(yōu)選的,所述佐劑注射劑型疫苗含3mg/3mL的佐劑和含2500Pg/3mL的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示的蛋白，所述佐劑為氫氧化鋁或磷酸鋁。
[0009]所述無(wú)佐劑注射 劑型疫苗含有濃度為250(^g/3mL氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示的蛋白。
[0010]2、所述疫苗的制備方法，包括如下步驟:構(gòu)建含SEQ ID N0.1所示核苷酸序列的重組原核表達(dá)載體，然后將重組原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化原核表達(dá)菌株，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后純化，得羊棘球蝴亞單位疫苗。
[0011]優(yōu)選的,所述原核表達(dá)菌株為大腸桿菌BL 21菌株。
[0012]優(yōu)選的，所述發(fā)酵培養(yǎng)為將原核表達(dá)菌株在37°C條件下震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，然后將培養(yǎng)液全部接種于種子罐，再在37°C條件下培養(yǎng)至OD值為1.0-1.5時(shí)，將培養(yǎng)液接種于二級(jí)種子罐培養(yǎng)，最后轉(zhuǎn)移至發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，當(dāng)菌體OD值達(dá)到40時(shí)，添加IPTG至終濃度為ImM誘導(dǎo)4-5小時(shí)。
[0013]優(yōu)選的，所述純化為將誘導(dǎo)后的培養(yǎng)液離心收集沉淀，經(jīng)洗液I重懸后進(jìn)行破碎，破碎后離心收集沉淀，再用洗液I重懸，并添加曲拉通至體積分?jǐn)?shù)為1%，攪拌2-3h，然后用孔徑為0.2Mffl的中空纖維柱超濾去除可溶性雜質(zhì)，再進(jìn)行濃縮，并加入與洗液I體積相等的洗液II，繼續(xù)攪拌2-3h，繼續(xù)用孔徑為0.2Mm中空纖維柱超濾，濃縮后收集沉淀，將沉淀用變性液溶解，37°C攪拌過(guò)夜，再用IOkD截留分子量的中空纖維柱超濾，至懸液體積減少一半時(shí)，緩慢補(bǔ)加等體積的復(fù)性液，繼續(xù)進(jìn)行超濾濃縮，將濃縮液離心去除雜質(zhì)，繼續(xù)用
0.45Mm的中空纖維柱超濾，向?yàn)V出液中添加相當(dāng)于濾出液2倍體積的變性液，然后超濾并收集濾出液，再用孔徑為0.22Mm的中空纖維柱超濾，收集濾出液，并向?yàn)V出液中添加相當(dāng)于濾出液2倍體積的變性液后繼續(xù)超濾收集濾出液，接著用IOkD中空纖維柱超濾，超濾至蛋白含量大于30mg/mL。
[0014]3、所述疫苗在制備預(yù)防羊棘球蝴感染的疫苗中的應(yīng)用。
[0015]本發(fā)明中發(fā)酵培養(yǎng)基為:蛋白胨5g/L;酵母提取物2.5g/L;甘油8 g/L ; KH2PO4
10.5g/L ； (NH4)2HPO4 6g/L ;檸檬酸 1.7g/L ；MgS04 1.68g/L ； ZnSO4.7H20 5.25g/L ；MnSO4.4H20 0.5g/L ； CaCl2 2.0g/L。補(bǔ)料液為:蛋白胨40g/L ;酵母提取物20g/L ;微量元素:FeSO4.7H2010 g/L ；Na2B4O7.IOH2O 0.23g/L ； (NH4)6Mo7O24 0.lg/L。
[0016]本發(fā)明中，洗液I的各組分及濃度如下:Tris 6.057g/L ；EDTA 0.146g/L ；NaCL
2.922g/L, DTT 0.77g/L，溶劑為水；洗液II的各組分濃度如下:Tris 6.057g/L ；EDTA
0.146g/L ；NaCL 2.922g/L ；DTT 0.77g/L;尿素 180.18g/L，溶劑為水。變性液:甘氨酸
11.25g/L ；NaOH 0.5g/L ；EDTA 0.37g/L ；DTT 0.77g/L ；Urea 540g/L，溶劑為水；復(fù)性液Tris 6.057g/L ；EDTA 0.146g/L ；NaCL 2.922g/L，溶劑為水。
[0017]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明涉及一種羊棘球蝴亞單位疫苗，由羊棘球蝴Eg95蛋白組成，也是主要的保護(hù)性抗原，可以激發(fā)良好雙重的細(xì)胞及體液免疫應(yīng)答，經(jīng)原核表達(dá)的Eg95蛋白加入或不加入佐劑制備的注射劑型免疫接種羊群后，可安全、有效預(yù)防羊棘球蝴病的感染，為防控羊棘球蝴及人類感染棘球蝴病提供了理想的疫苗。
[0018]本發(fā)明進(jìn)行了藥效實(shí)驗(yàn)，通過(guò)注射免疫羊群可產(chǎn)生好的體液免疫與細(xì)胞免疫應(yīng)答及天然免疫與獲得性免疫應(yīng)答以及黏膜免疫應(yīng)答效果，免疫動(dòng)物后，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)免疫損傷或由疫苗接種而導(dǎo)致的發(fā)病跡象，具有安全性；本發(fā)明羊棘球蝴亞單位疫苗免疫無(wú)免疫背景的羊群兩次，進(jìn)一步通過(guò)我國(guó)不同地區(qū)臨床分離的棘球蝴蟲(chóng)卵攻毒，有95%以上的免疫保護(hù)效果；用本發(fā)明羊棘球蝴亞單位疫苗接種不同地區(qū)、種群的羊群，0，21天免疫兩次，分別采用肌肉注射、皮下注射免疫，均沒(méi)有出現(xiàn)由疫苗接種引發(fā)的發(fā)病現(xiàn)象，具有安全性。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】[0019]圖1為Eg95表達(dá)菌種篩選(A: F2代隨機(jī)挑選10只菌種誘導(dǎo)表達(dá)；B: F3代隨機(jī)挑選10只菌種誘導(dǎo)表達(dá)；c: F4代隨機(jī)挑選10只菌種誘導(dǎo)表達(dá)；D: F3隨機(jī)挑選代10只菌種誘導(dǎo)表達(dá))。
[0020]圖2為菌種表達(dá)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)(f 4泳道分別為Eg95表達(dá)菌株傳代10、20、30、40代進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)鑒定)。
[0021]圖3為Eg95純化鑒定(泳道1:純化前Eg95 ;泳道2:純化后Eg95)。
[0022]圖4為抗體應(yīng)答檢測(cè)結(jié)果(實(shí)驗(yàn)羊經(jīng)0、21天兩次免疫后14天采外周血檢測(cè)抗體滴度；其中PBS組、未免疫組(Netative control)無(wú)抗體效價(jià)；招佐劑(Aluminumadjuvant)組抗體效價(jià)為陰性；疫苗組(Vaccine)抗體效價(jià)達(dá)到6400)。
[0023]圖5為細(xì)胞因子應(yīng)答檢測(cè)(實(shí)驗(yàn)羊經(jīng)0、21天兩次免疫后14天檢測(cè)INF-gamma、IL-4陽(yáng)性T細(xì)胞，其中PBS組、未免疫組(Netative control)無(wú)陽(yáng)性T細(xì)胞；鋁佐劑(Aluminum adjuvant)細(xì)胞因子應(yīng)答為陰性；疫苗組(Vaccine)有高水平陽(yáng)性T細(xì)胞應(yīng)答)。具體實(shí)施例
[0024]下面將結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版，J-薩姆布魯克等著)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0025]實(shí)施例1構(gòu)建羊棘球蝴亞單位疫苗的表達(dá)載體
以來(lái)自羊棘球蝴Eg95蛋白的核酸序列為模版(Genebank:AY421719.1)，以5’ -gctacgtctctctagaatggcattccagttatgtc-3?為上游引物，下劃線為 Xba I 酶切位點(diǎn)；5’-ctcgagtcaagtaaggacagcc-3?為下游引物,下劃線為Xho I酶切位點(diǎn)，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性45s ;94°C變性30s、58°C退火45s、74°C延伸45s，30個(gè)循環(huán)；最后74°C后延伸2min，擴(kuò)增獲得如SEQ ID N0.1所示核苷酸序列，其編碼的氨基酸如SEQ IDN0.2所示。獲產(chǎn)物用Xba I和Xho I雙酶切后連入經(jīng)同樣酶切的pGEX表達(dá)載體，獲得重組pGEX-Eg95表達(dá)載體，所得載體中包含Xba I和Xho I酶切位點(diǎn)。
[0026]實(shí)施例2質(zhì)粒穩(wěn)定性鑒定
選用E.coli B121細(xì)胞為靶細(xì)胞，采用熱激法將實(shí)施例1構(gòu)建的重組pGEX-Eg95表達(dá)載體轉(zhuǎn)化E.coli B121感受態(tài)細(xì)胞，然后篩選穩(wěn)定高表達(dá)EG95蛋白的菌株。具體步驟如下:①在冰上解凍制備好的感受態(tài)E.coli B121細(xì)胞100μL，然后加入制備好的pGEX-Eg95載體
1.5μg 混勻后，冰上放置30min，45°C水浴90s ;③冰上放置3min，添加700μL LB培養(yǎng)基，37°C活化Ih ;④將活化好的菌液涂布于Amp濃度為lOOPg/mL的LB固體平板中，于37°C倒置培養(yǎng)過(guò)夜；⑤隨機(jī)挑選飽滿的單菌落，編號(hào)后接種于Amp濃度為lOOPg/mL的5mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)，6h后加IPTG至終濃度為ImM誘導(dǎo)表達(dá)4h。然后將表達(dá)EG95蛋白的菌株劃線傳代培養(yǎng)40代，每一代隨機(jī)挑選10個(gè)單菌落培養(yǎng)并誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，其中2飛代的表達(dá)結(jié)果如圖1所示。結(jié)果顯示，E.coli B121細(xì)胞5代內(nèi)篩選到穩(wěn)定高表達(dá)EG95的菌株。檢測(cè)第10代、20代、30代和40代誘導(dǎo)表達(dá)E.coli B121細(xì)胞的表達(dá)情況，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示，菌株傳代40代后任能穩(wěn)定表達(dá)。因此，建立了穩(wěn)定高表達(dá)EG95的E.coliB121菌株。進(jìn)一步建立具有Eg95的三級(jí)種子庫(kù)，經(jīng)對(duì)全面檢定符合疫苗生產(chǎn)要求，放置液氣中保存?zhèn)溆?。[0027]實(shí)施例3種子庫(kù)建立
原始種子庫(kù)建立:取實(shí)施例2制備的種子按接著量為1%接入Amp濃度為lOOPg/mL的
1.5mL LB培養(yǎng)基中，于37°C進(jìn)行震蕩培養(yǎng)至0D_達(dá)到0.8左右。然后將培養(yǎng)液用劃線法接種于Amp濃度為lOOPg/mL的LB固體平板中，于37°C倒置培養(yǎng)過(guò)夜。隨機(jī)挑選飽滿的單菌落，編號(hào)后接種于5mL Amp濃度為lOOPg/mL的LB培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的種子分別在無(wú)菌條件下取0.5mL于無(wú)菌EP管中，加等量無(wú)菌體積分?jǐn)?shù)為80%的甘油，-20C°保存?zhèn)溆?。將剩余的菌液分別取1.5mL經(jīng)12000rmp離心收集菌體，按堿裂解法或試劑盒提取質(zhì)粒DNA。剩余加IPTG至終濃度為ImM誘導(dǎo)表達(dá)，并進(jìn)行蛋白電泳鑒定。將提取的質(zhì)粒DNA經(jīng)核酸電泳檢測(cè)后，分別進(jìn)行PCR鑒定、雙酶切鑒定。將經(jīng)過(guò)核酸電泳檢測(cè)、蛋白電泳檢測(cè)、PCR鑒定、雙酶切鑒定都成功的種子樣品送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。返回的序列于NCBI進(jìn)行Blast比對(duì)，同時(shí)與本地保存的序列做比對(duì)。
[0028]主種子庫(kù)建立:原始種子樣品經(jīng)過(guò)核酸電泳檢測(cè)、蛋白電泳檢測(cè)、PCR鑒定、雙酶切鑒定、序列比對(duì)后，與原始序列相同則為合格種子。將鑒定成功的種子編號(hào)相對(duì)應(yīng)的保存樣品取出，按接種量為1%接種于50mL Amp濃度為lOOPg/mL的LB培養(yǎng)基中，37°C度震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的種子加甘油至體積分?jǐn)?shù)為30%，混勻后按ImL/支進(jìn)行無(wú)菌分裝，于_80C°保存，并命名為主種子批。
[0029]工作種子庫(kù)建立:取主種子批種子，37C°活化后用劃線法篩選單菌落，隨機(jī)挑選飽滿的單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的菌液分別在無(wú)菌條件下取出0.5mL進(jìn)行甘油保種，剩余的一部分做質(zhì)粒提取，并進(jìn)行核酸電泳檢測(cè)、PCR鑒定、雙酶切鑒定、并測(cè)序。另一部分做誘導(dǎo)表達(dá)，并進(jìn)行蛋白電泳檢測(cè)。將檢測(cè)合格的樣品進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，加甘油后進(jìn)行分裝保種。為保證生產(chǎn)批次間穩(wěn)定，生產(chǎn)時(shí)每次取一只工作種子，直接活化后用于生產(chǎn)。
[0030]實(shí)施例4羊棘球蝴EG95蛋白工程菌株的高密度發(fā)酵
取-80C°保存的工作種子，按接種量為0.1%接種于IL Amp濃度為lOOPg/mL的LB培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，將培養(yǎng)液全部接種于20L種子罐，用Amp濃度為lOOPg/mL的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)至OD值為1.0-1.5后全部接種于200L 二級(jí)種子罐。在正式發(fā)酵前，1500L發(fā)酵罐中灌裝900L培養(yǎng)基，并進(jìn)行在位滅菌。同時(shí)按比例分別加入微量元素(各微量元素的加入量如下=MgSO4 1.68g/L；ZnS04*7H20 5.25g/L ；MnS04.4H20 0.5g/L ；CaCl2
2.0g/L ；FeS04.7H20 10 g/L ;Na2B407.IOH2O 0.23g/L ； (NH4) 6Mo7024 0.lg/L)，攪拌均勻后將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的的二級(jí)種子加入發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵。同時(shí)監(jiān)控pH值、DO值，并控制pH在6.5-8.5之間；D0在30-50之間，每小時(shí)記錄一次。通過(guò)檢測(cè)發(fā)酵液中OD值來(lái)判斷菌體生長(zhǎng)情況，通過(guò)控制溶解氧、攪拌和補(bǔ)料速率，維持恒定的溶解氧，控制減少有機(jī)酸的生成。當(dāng)OD值開(kāi)始緩慢增加時(shí)，通過(guò)補(bǔ)加補(bǔ)料液及調(diào)節(jié)通氣量來(lái)刺激細(xì)菌快速生長(zhǎng)。當(dāng)OD值增加過(guò)快、或溶氧下降過(guò)快時(shí)，通過(guò)增加通氣量，同時(shí)停止添加補(bǔ)料液，以便調(diào)節(jié)溶解氧濃度到正常值。當(dāng)菌體OD值達(dá)到40左右時(shí)，開(kāi)始添加終濃度為ImM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)時(shí)間應(yīng)在4-5小時(shí)內(nèi)。
[0031 ] 實(shí)施例5羊棘球蝴EG95蛋白的純化
將培養(yǎng)后菌體離心收集并用適量洗液I重懸，通過(guò)高壓均質(zhì)機(jī)進(jìn)行破碎。破碎后離心收集沉淀,加入相當(dāng)于洗液I體積3-5倍體積的洗液I重懸，并添加曲拉通至體積分?jǐn)?shù)為1%，在溫度為4-8°C條件下攪拌2-3小時(shí)。用0.2Mm孔徑的中空纖維柱超濾去除可溶性雜質(zhì)。當(dāng)懸液體積濃縮至20L左右時(shí)加入與洗液I用量相等的洗液II，繼續(xù)攪拌2-3h。繼續(xù)用中空纖維柱超濾，直至懸液體積縮小至20L，然后離心收集沉淀。將沉淀溶解相當(dāng)于沉淀體積20倍體積變性液，37°C溫和攪拌過(guò)夜。用IOkD截留分子量中空纖維柱超濾，至懸液體積減少一半時(shí)，緩慢補(bǔ)加相應(yīng)體積的復(fù)性液，繼續(xù)進(jìn)行超濾濃縮。當(dāng)懸液體積縮小到20-30L，離心機(jī)離心去除雜質(zhì)。連接0.45Mm孔徑的中空纖維柱進(jìn)行超濾，收集濾出液，向?yàn)V出液中加入相當(dāng)于濾出液2倍體積的變性液后繼續(xù)超濾并收集濾出液。將0.45Mm濾出液連接0.22Mm孔徑中空纖維柱進(jìn)行超濾，收集濾出液，在向?yàn)V出液中加入相當(dāng)于濾出液兩倍體積變性液，繼續(xù)超濾收集濾出液。將0.22Mm濾出液連接IOkD中空纖維柱，超濾濃縮至目的蛋白含量達(dá)到30mg/mL以上。
[0032]經(jīng)純化后，目的蛋白可達(dá)75%以上，并將此液體作為為羊棘球蝴亞單位疫苗原液。疫苗原液的外觀為淡黃色澄清液體，PH值為7.0-7.2，通過(guò)血平板進(jìn)行雜菌鑒定結(jié)果為陰性，通過(guò)半流體和肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)進(jìn)行支原體鑒定結(jié)果為陰性，通過(guò)PAGE-SDS電泳檢測(cè)結(jié)果顯示目的條帶清晰、無(wú)其他雜帶(圖3),采用Reed & Muench法計(jì)算抗血清中和效價(jià)均高于 1:2800。
[0033]實(shí)施例6羊棘球蝴亞單位疫苗劑型配制
注射劑型配制:分別將純化的羊棘球蝴疫苗原液不加佐劑，用復(fù)性液配制成Eg95濃度為250(^g/3mL的無(wú)佐劑注射劑型；分別將純化的羊棘球蝴疫苗原液加入氫氧化鋁或磷酸鋁，用復(fù)性液配置成Eg95濃度為250(^g/3mL，氫氧化鋁或磷酸鋁為3mg/3mL的有佐劑注射型疫苗。將以上注射疫苗溶液按3mL/瓶分裝于西林瓶，于冷凍干燥設(shè)備凍干并封口包裝。最終成品為淡黃色疏松固體，并含有50頭份5(^g/頭份的Eg95抗原。放2-8°C備用。
[0034]實(shí)驗(yàn)例7羊棘球蝴亞單位疫苗檢定實(shí)驗(yàn)
利用實(shí)施例6制備的羊棘球蝴亞單位疫苗注射劑型外觀見(jiàn)均一，無(wú)異味和染菌；通過(guò)豚鼠、家兔試驗(yàn)無(wú)熱原、異常毒性和急性毒性反應(yīng)；通過(guò)3日齡乳鼠腦內(nèi)接種，以及小羊頸部肌肉注射試驗(yàn)無(wú)發(fā)病現(xiàn)象；通過(guò)Lor`ry法測(cè)定蛋白含量均在劑量范圍；ELISA測(cè)定DNA含量均在50EU以下；通過(guò)SDS-PAGE和WB檢測(cè)抗原蛋白成分存在；通過(guò)免疫Balb/C小鼠I次血清中和抗體效價(jià)在3200以上。
[0035]實(shí)驗(yàn)例8羊棘球蝴亞單位疫苗對(duì)實(shí)驗(yàn)羊群體內(nèi)的免疫應(yīng)答效果實(shí)驗(yàn)
利用實(shí)施例6制備的羊棘球蝴疫苗的注射劑型，并用等量PBS、鋁鹽為對(duì)照組，分別免疫出生一年內(nèi)、無(wú)免疫背景的羊群，按5(^g/頭份，皮下注射兩次(0，21天)；末次免疫后14天采集各組羊群的外周血、分離血清，采集脾淋巴細(xì)胞；通過(guò)ELISA法測(cè)定血清抗體效價(jià)在6400以上，采用FFIT法測(cè)定中和抗體效價(jià)在3200以上，采用ELISP0T儀測(cè)定免疫細(xì)胞水平，INF-G及IL-4陽(yáng)性細(xì)胞證明TH2/Thl應(yīng)答平衡(圖4和圖5)。結(jié)果顯示，本發(fā)明羊棘球蝴亞單位疫苗不管是加入佐劑與沒(méi)有佐劑均都能產(chǎn)生滿意的雙重免疫應(yīng)答，且試驗(yàn)組有佐劑組好于無(wú)佐劑組，而對(duì)照組沒(méi)有產(chǎn)生雙重免疫應(yīng)答；制備的羊棘球蝴疫苗不管是注射還是滴鼻、飲水劑型均能產(chǎn)生滿意的雙重免疫應(yīng)答。
[0036]實(shí)驗(yàn)例9羊棘球蝴亞單位疫苗對(duì)實(shí)驗(yàn)羊群體內(nèi)的免疫保護(hù)效果實(shí)驗(yàn)
利用實(shí)施例6制備的羊棘球蝴亞單位疫苗的注射劑型為實(shí)驗(yàn)組，并用PBS、鋁鹽為對(duì)照組，分別免疫無(wú)免疫背景羊群，其免疫劑量按50μ8/頭份免疫兩次(0，21天)，末次免疫后14天，各試驗(yàn)組、對(duì)照組用200個(gè)/頭實(shí)驗(yàn)狗體內(nèi)分離的蟲(chóng)卵喂食攻毒，觀察保護(hù)效果。結(jié)果顯示，本發(fā)明羊棘球蝴疫苗能產(chǎn)生高水平的保護(hù)效果，免疫保護(hù)率在90%以上，而其他各對(duì)照組保護(hù)率為0%。因此，本發(fā)明制備的羊棘球蝴疫苗在羊群體內(nèi)具有高效的免疫保護(hù)效果。
[0037]實(shí)驗(yàn)例10羊棘球蝴疫苗的安全性實(shí)驗(yàn)
(I)無(wú)菌、支原體試驗(yàn):將實(shí)施例6制備的羊棘球蝴亞單位疫苗分別接種硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基培養(yǎng)14d，并以無(wú)菌生理鹽水做陰性對(duì)照，培養(yǎng)溫度為25°C、35°C。結(jié)果顯示，羊棘球蝴亞單位疫苗都未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)。分別將羊棘球蝴亞單位疫苗用半流體和肉湯培養(yǎng)基，37°C初代培養(yǎng)21天，次代培養(yǎng)21天，無(wú)菌生理鹽水做陰性對(duì)照，結(jié)果顯示羊棘球蝴亞單位疫苗無(wú)支原體生長(zhǎng)；用DNA染色法將毒種接種VeiO細(xì)胞培養(yǎng)3天，傳代一次，用二苯甲酰胺熒光染料染色。結(jié)果顯示，羊棘球蝴亞單位疫苗均無(wú)支原體生長(zhǎng)。
[0038](2)溶血性試驗(yàn):選取體重為350g左右的豚鼠，采集新鮮豚鼠血lmL，用PBS洗滌3次，再將血細(xì)胞體積恢復(fù)并稀釋10倍。生理鹽水稀釋羊棘球蝴亞單位疫苗(由實(shí)施例6制備)，分別為2倍、4倍、8倍，將豚鼠血細(xì)胞加入到稀釋的待檢佐劑中，8小時(shí)后，評(píng)價(jià)血球溶解以目測(cè)或者上清濃度檢測(cè)為準(zhǔn)，并在570nm處檢測(cè)吸光度。結(jié)果顯示，沒(méi)有發(fā)生血球破裂，無(wú)溶血現(xiàn)象。說(shuō)明羊棘球蝴亞單位疫苗中的成分不能使紅細(xì)胞裂解。因此，羊棘球蝴亞單位疫苗均無(wú)溶血反應(yīng)。
[0039](3)急性毒性試驗(yàn):①取實(shí)施例6制備的羊棘球蝴亞單位疫苗0.5mL腹腔注射體重為12~18g Balb/C小鼠，每組10只，同時(shí)設(shè)PBS陰性對(duì)照組，連續(xù)2周觀察小鼠的活動(dòng)狀態(tài)、體重變化和存活率。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)小鼠全部存活，沒(méi)有出現(xiàn)豎毛、精神萎靡、行動(dòng)遲緩等不良癥狀，而體重呈現(xiàn)增加，由此證明羊棘球蝴亞單位疫苗在試驗(yàn)的濃度下對(duì)動(dòng)物是安全的，且14天后處死進(jìn)行大體解剖檢查，未見(jiàn)臟器有病理改變。②在體重為8~10kg的Beagle狗體內(nèi)的急性毒性結(jié)果:取實(shí)施例6制備的羊棘球蝴亞單位疫苗肌肉注射15mL，每組10只，同時(shí)設(shè)PBS陰性對(duì)照組，連續(xù)2周觀察行為、體重和存活率變化。結(jié)果可見(jiàn)，Beagle狗未見(jiàn)毒性反應(yīng)，行為正常，沒(méi)有死亡，與對(duì)照組狗比較無(wú)差異，各狗體重有所增加，并處死大體解剖未見(jiàn)臟器有明顯的病理改變。因此，羊棘球蝴亞單位疫苗均無(wú)急性毒性反應(yīng)，使用是安全的。
[0040](4)過(guò)敏試驗(yàn)研究:取實(shí)施例6制備的羊棘球蝴亞單位疫苗皮下接種體重為250~350g Hartley豚鼠，每個(gè)樣品接種豚鼠5只，每只接種0.5mL，隔日一次，共3次。第3次注射后21天，耳靜脈分別給予相同羊棘球蝴亞單位疫苗0.5mL，并用人血白蛋白和生理鹽水以同樣的方法分別接種3只豚鼠作為陽(yáng)性、陰性對(duì)照。注射后30分鐘及3天觀察動(dòng)物，陽(yáng)性、陰性對(duì)照均成立，羊棘球蝴亞單位疫苗組豚鼠無(wú)死亡，且無(wú)鼻癢、噴嚏、煩躁不安、呼吸困難、休克、痙攣等過(guò)敏癥狀。因此，羊棘球蝴亞單位疫苗在動(dòng)物體內(nèi)均無(wú)過(guò)敏反應(yīng)。
[0041](5)兔熱源質(zhì)試驗(yàn):取預(yù)檢合格的體重為2~3kg家兔3只固定,30分鐘后測(cè)量體溫，共測(cè)2次，間隔30分鐘，要求2次溫差不大于0.2°C，各家兔2次平均溫度在38.6-39.50C。將實(shí)施例6制備的羊棘球蝴亞單位疫苗預(yù)熱至38°C，于第2次測(cè)溫后15分鐘內(nèi)，自家兔耳邊靜脈分別緩緩注入0.5mL/只。注射后每隔30分鐘測(cè)量體溫I次，連測(cè)6次。結(jié)果顯示:羊棘球蝴亞單位疫苗給予家兔個(gè)體升溫均未超過(guò)0.2°C，沒(méi)有引起家兔的發(fā)熱反應(yīng)。因此，制備的羊棘球蝴亞單位疫苗均無(wú)熱源質(zhì)。
[0042]實(shí)驗(yàn)例11羊棘球蝴亞單位疫苗穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)將實(shí)施例6制備的羊棘球蝴亞單位疫苗，分別置于2-81:、室溫(20-25°0、371: I周、2周、I個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、12個(gè)月、18個(gè)月和24個(gè)月，取樣觀察外觀、pH值、無(wú)菌、免疫動(dòng)物觀察安全性。結(jié)果顯示:羊棘球蝴亞單位疫苗放置2-8°C 24個(gè)月內(nèi)均無(wú)變色分層等現(xiàn)象，pH值在7.0-7.2之間無(wú)變化，且注射或滴鼻給小鼠或?qū)嶒?yàn)豬，均表現(xiàn)正常；羊棘球蝴亞單位疫苗放置室溫25°C 3個(gè)月內(nèi)均有好的穩(wěn)定性；羊棘球蝴亞單位疫苗放置室溫37°C I個(gè)月內(nèi)均有好的穩(wěn)定性效果。由結(jié)果說(shuō)明，羊棘球蝴亞單位疫苗放置2-8 °C，理化性質(zhì)、生物學(xué)性能穩(wěn)定，有效期至少24個(gè)月。
[0043]最后說(shuō)明的是，以上優(yōu)選實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過(guò)上述優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣`的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種羊棘球蝴亞單位疫苗，其特征在于:所述疫苗的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征在于:所述疫苗的氨基酸序列如SEQID N0.2所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的疫苗，其特征在于:所述疫苗為無(wú)佐劑注射劑型疫苗或佐劑注射型疫苗。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的疫苗，其特征在于:所述佐劑注射劑型疫苗含3mg/3mL的佐劑和含250(^g/3mL的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示的蛋白，所述佐劑為氫氧化鋁或磷酸招。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的疫苗，其特征在于:所述無(wú)佐劑注射劑型疫苗含有濃度為250(^g/3mL的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示的蛋白。
6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述疫苗的制備方法，其特征在于，包括如下步驟:構(gòu)建含SEQID N0.1所示核苷酸序列的重組原核表達(dá)載體，然后將重組原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化原核表達(dá)菌株，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后純化，得羊棘球蝴亞單位疫苗。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于:所述原核表達(dá)菌株為大腸桿菌BL21菌株。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于:所述發(fā)酵培養(yǎng)為將原核表達(dá)菌株在37°C條件下震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，然后將培養(yǎng)液全部接種于種子罐，再在37°C條件下培養(yǎng)至OD值為1.0-1.5時(shí)，將培養(yǎng)液接種于二級(jí)種子罐培養(yǎng)，最后轉(zhuǎn)移至發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，當(dāng)菌體OD值達(dá)到40時(shí)，添加IPTG至終濃度為ImM誘導(dǎo)4_5小時(shí)。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于:所述純化為將誘導(dǎo)后的培養(yǎng)液離心收集沉淀，經(jīng)洗液I重懸后進(jìn)行破碎，破碎后離心收集沉淀，再用洗液I重懸，并添加曲拉通至體積分?jǐn)?shù)為1%，攪拌2-3h，然后用孔徑為0.2Mffl的中空纖維柱超濾去除可溶性雜質(zhì)，再進(jìn)行濃縮，并加入與洗液I體積相等的洗液II，繼續(xù)攪拌2-3h，繼續(xù)用孔徑為0.2Mffl中空纖維柱超濾，濃縮后收集沉淀，將沉淀用變性液溶解，37°C攪拌過(guò)夜，再用IOkD截留分子量的中空纖維柱超濾，至懸液體積減少一半時(shí)，緩慢補(bǔ)加等體積的復(fù)性液，繼續(xù)進(jìn)行超濾濃縮，將濃縮液離心去除雜質(zhì)，繼續(xù)用0.45Mm的中空纖維柱進(jìn)行超濾，向?yàn)V出液中添加相當(dāng)于濾出液2倍體積的變性液，然后超濾并收集濾出液,再用孔徑為0.22Mm的中空纖維柱超濾，收集濾出液，并向?yàn)V出液中添加相當(dāng)于濾出液2倍體積的變性液后繼續(xù)超濾收集濾出液，接著用IOkD中空纖維柱超濾,超濾至蛋白含量大于30mg/mL。
10.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述疫苗在制備預(yù)防羊棘球蝴感染的疫苗中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C07K1/34GK103861093SQ201410107227
【公開(kāi)日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2014年3月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月21日
【發(fā)明者】李陽(yáng)春, 曹政, 郭建華, 李春燕, 何丹 申請(qǐng)人:重慶澳龍生物制品有限公司