一種溶解包涵體蛋白的方法
【專利摘要】本發(fā)明一種溶解包涵體蛋白的方法，將表達包涵體蛋白的菌體離心收集，離心菌體用PBS重懸，加入溶菌酶室溫1-3小時后經(jīng)超生破碎，然后離心棄掉上清得到包涵體蛋白沉淀；將所述的包涵體蛋白沉淀重懸于IBbuffer中，然后離心，棄掉上清，重復1-6次洗滌包涵體蛋白；用含有尿素的PBS重懸洗滌后的包涵體蛋白；然后將包涵體蛋白懸液冷凍；將冷凍的包涵體蛋白懸液置于室溫，緩慢溶解，然后離心，上清即為可溶的包涵體蛋白。本發(fā)明的方法操作簡單，得到的包涵體蛋白溶液含有較低濃度的變性劑，簡化了復性步驟，節(jié)約了時間，提高了蛋白復性效率。
【專利說明】一種溶解包涵體蛋白的方法
【技術領域】:
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術領域】，尤其涉及包涵體蛋白，特別是一種溶解包涵體蛋白的方法。
【背景技術】:
[0002]外源基因在原核細胞中表達時，尤其是在大腸桿菌中高效表達時，經(jīng)常聚集形成蛋白的聚集體，即包涵體。傳統(tǒng)觀點認為包涵體是蛋白錯誤折疊所形成的無活性的、不可溶的蛋白形式，要溶解包涵體蛋白一般需要用強變性劑，如8M的尿素或6M的鹽酸胍，通過離子間的相互作用，打斷包涵體蛋白質分子內和分子間的各種化學鍵，使多肽伸展而可溶。變性的蛋白通過緩慢去除變性劑使目標蛋白從變性的伸展狀態(tài)恢復到正確的高級結構。而最近研究發(fā)現(xiàn)包涵體蛋白具有一定的二級結構，如果在溶解包涵體的過程中能夠保留原有的二級結構可以啟動蛋白的復性階段，大大提高蛋白的復性效率。由于強變性劑使多肽完全伸展，破壞了原有的二級結構，復性過程中蛋白聚集沉淀，導致復性蛋白濃度低，效率低，而且需要大體積的緩沖液，長時間的復性過程等。因此，采用溫和的變性方法溶解包涵體蛋白，保護包涵體蛋白中原有的二級結構不被破壞將大大有利于包涵體蛋白的復性，簡化復性過程提高復性效率。
【發(fā)明內容】
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[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種溶解包涵體蛋白的方法，所述的這種溶解包涵體蛋白的方法要解決現(xiàn)有技術中蛋白復性的過程中，需要消耗大量的緩沖液、復性時間長而且復性效率不高的技術問題。
[0004]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種溶解包涵體蛋白的方法，包括一個收集包涵體蛋白的步驟，一個洗滌包涵體蛋白的步驟，一個將包涵體蛋白重懸于含有尿素的PBS溶液的步驟，一個冷凍包涵體蛋白的步驟，一個室溫溶解包涵體蛋白的步驟；在一個收集包涵體蛋白的步驟中，將表達包涵體蛋白的菌體離心收集，離心菌體用PBS重懸，加入溶菌酶室溫1-3小時后經(jīng)超生破碎，然后離心棄掉上清得到包涵體蛋白沉淀；在一個洗滌包涵體蛋白的步驟中，將所述的包涵體蛋白沉淀重懸于IB buffer中，然后離心，棄掉上清，重復1_6次洗漆包涵體蛋白；在一個將包涵體蛋白重懸于含有尿素的PBS溶液的步驟中，用含有尿素的PBS重懸洗滌后的包涵體蛋白；在一個冷凍包涵體蛋白的步驟中，將包涵體蛋白懸液冷凍；在一個室溫溶解包涵體蛋白的步驟中，將冷凍的包涵體蛋白懸液置于室溫，緩慢溶解，然后離心，上清即為可溶的包涵體蛋白。
[0005]其中，溶菌酶的終濃度為10ug/ml ；PBS的組成為:137mM的NaCl、2.7mM的KC1、IOmM 的 NaHPO4.12H20、2mM 的 KH2PO4 ；IB buffer 的組成為:20mM 的 Tris - base (ρΗ8.0)、300mM 的 NaCl、lmM 的 EDTA、1M 的尿素和 1% 的 Triton-100。
[0006]進一步的，在一個收集包涵體蛋白的步驟中，離心溫度為2_8°C，離心轉速為10000-15000r/min,離心時間為 10_20min。[0007]進一步的，在一個洗滌包涵體蛋白的步驟中，離心溫度為2_8°C，離心轉速為10000-15000r/min,離心時間為 10_20min。
[0008]進一步的，在一個室溫溶解包涵體蛋白的步驟中，離心溫度為2_8°C，離心轉速為10000-15000r/min,離心時間為 10_20min。
[0009]進一步的,在一個將包涵體蛋白重懸于含有尿素的PBS溶液的步驟中，在含有尿素的PBS溶液中，尿素的濃度為1-2M。
[0010]進一步的，在一個將包涵體蛋白重懸于含有尿素的PBS溶液的步驟中，PBS溶液的pH值在7-10之間。
[0011]進一步的，在一個冷凍包涵體蛋白的步驟中，冷凍溫度在-80°c~-20°c之間。
[0012]進一步的，室溫的溫度在10°C~30°C之間。
[0013]上述方法中，為了使菌體充分裂解，較好的利用溶菌酶和超生破碎結合的方法對菌體進行破碎。
[0014]優(yōu)選的，為了保持溶 菌酶的活性，pH值一般為8。
[0015]優(yōu)選的，為了得到比較純凈的包涵體蛋白，用IB buffer洗滌時，洗滌次數(shù)一般為3次。
[0016]優(yōu)選的，為了使包涵體蛋白充分溶解，PBS中尿素濃度一般為2M。
[0017]優(yōu)選的，為了使包涵體充分溶解，PBS的pH值一般在8-10。
[0018]優(yōu)選的，為了使包涵體充分溶解，包涵體蛋白的冷凍溫度一般選擇_20°C。
[0019]上述方法中，為了使包涵體充分溶解，冷凍的包涵體蛋白溶液一般置于室溫緩慢溶解。
[0020]為了得到?jīng)]有任何雜質的，澄清的可溶的蛋白溶液，一般選擇離心后取上清，離心條件為:4°C, 12000r/min, 15min。
[0021]本發(fā)明的原理是:首先利用溶菌酶和超生破碎結合的方法對菌體進行破碎，使菌體充分裂解，然后通過低溫高速離心獲得包涵體蛋白，再將包涵體蛋白重懸于IB緩沖液中，通過多次的洗滌，獲得高純度的包涵體蛋白，然后將包涵體蛋白重懸于含有尿素的PH值在8-10PBS溶液中，讓包涵體充分溶解，最后再通過冷凍，室溫溶解，離心后的上清液即為可溶的包涵體蛋白。通過本發(fā)明方法獲得的可溶包涵體蛋白含有較低濃度的變性劑，此變性劑的濃度甚至不會影響蛋白的活性，研究發(fā)現(xiàn)變性蛋白復性過程中，當尿素濃度降低到2M時蛋白復性過程就已經(jīng)開始。短時間的低溫冷凍對蛋白活性的影響也非常小，因為一般短時間保存蛋白溶液通常置于4°C或-20°C保存。因此，本發(fā)明將低濃度的變性劑與低溫冷凍相結合的方法來溶解包涵體蛋白，變性條件溫和，不會破壞包涵體蛋白的類二級結構。關于此方法溶解包涵體蛋白的原理是由于溫度的變化改變了包涵體蛋白的微環(huán)境，如pH值或離子濃度,有利于包涵體蛋白的重新折疊；而低濃度的變性劑則有利于維持蛋白結構的穩(wěn)定，防止蛋白聚集體的形成。
[0022]本發(fā)明和已有技術相比較，其效果是積極和明顯的。本發(fā)明方法操作簡單，得到的包涵體蛋白溶液含有較低濃度的變性劑，變性條件溫和，為后續(xù)的蛋白復性過程簡化了操作步驟，節(jié)約了時間，能高效率的復性并得到有生物活性的蛋白。
【專利附圖】

【附圖說明】:[0023]圖1為EGFP蛋白的SDS-PAGE電泳圖，其中A圖為EGFP包涵體蛋白重懸于含有2M尿素的PBS (pH8)在不同的冷凍時間和溫度下的溶解性分析,M為蛋白marker, I為冷凍溶解前的包涵體蛋白(總包涵體蛋白)，2為表一中的1#樣品,3為表一中的2#樣品,4為表一中的3#樣品，5為表一中的4#樣品。B圖為EGFP包涵體蛋白重懸于含有2M尿素的不同pH值的PBS中，_20°C下冷凍過夜后室溫溶解的包涵體蛋白上清分析，I為表一中的5#樣品，2為表一中的6#樣品，3為表一中的2#樣品,4為表一中的7#樣品，5為表一中的8#樣品。C圖EGFP包涵體蛋白重懸于含有不同尿素濃度的PBS (pH8)中，_20°C下冷凍過夜后室溫溶解的包涵體蛋白上清分析，I為表一中的9#樣品，2為表一中的10#樣品，3為表一中的2#樣品。
[0024]圖2為重組鼠CRT蛋白1-180位氨基酸(r-mCRT/l_180)的SDS-PAGE電泳圖，A圖為r-mCRT/1-180包涵體蛋白重懸于含有不同尿素濃度的PBS (pH8)中，-20°C下冷凍過夜后室溫溶解的包涵體蛋白上清分析，M為蛋白marker, I為冷凍溶解前的包涵體蛋白(總包涵體蛋白)，2為表二中的2#樣品，3為表二中的9#樣品，4為表二中的10#樣品。B圖為r-mCRT/1-180包涵體蛋白重懸于含有2M尿素的PBS (pH8)在不同的冷凍時間和溫度下的溶解性分析，I為冷凍溶解前的包涵體蛋白(總包涵體蛋白)，2為表二中的1#樣品，3為表二中的2#樣品，4為表二中的4#樣品，5為表二中的3#樣品。C圖為EGFP包涵體蛋白重懸于含有2M尿素的不同pH值的PBS中，-20°C下冷凍過夜后室溫溶解的包涵體蛋白上清分析，I為表二中的5#樣品，2為表二中的6#樣品，3為表二中的2#樣品，4為表二中的7#樣品，5為表二中的8#樣品。
[0025]圖3為利用蛋白質的天然熒光檢測蛋白質構象變化的方法，比較本發(fā)明方法得到的EGFP包涵體蛋白和SM尿素變性得到的包涵體蛋白復性前后的活性比較，并與非變性條件下純化的EGFP蛋白的活性進行比較。EGFP吸收光譜的最大峰值為509nm。
[0026]圖4是本發(fā)明一種溶解包涵體蛋白的方法的流程示意圖。
【具體實施方式】
[0027]結合以下實施例對本發(fā)明做進一步的解釋說明，但本發(fā)明的保護范圍并不限于此。
[0028]實施例1
[0029]將EGFP蛋白基因序列通過分子克隆的方法連接原核表達載體pET_28a，轉化大腸桿菌BL21，經(jīng)37°C誘導表達后EGFP蛋白以包涵體的形式表達，應用本發(fā)明方法溶解EGFP包涵體蛋白，其具體操作如下:
[0030](l)誘導表達重組菌株pET-28a-EGFP500ml，4°C，12000r離心15min收集菌體，然后20ml的PBS重懸，加入200ullmg/ml的溶菌酶室溫孵育2h，然后用超聲波破碎；
[0031](2)將上一步破碎的菌體在4°C，12000r離心15min，棄上清；
[0032](3)用 IB buffer 洗漆沉淀 3 次；
[0033](4)最后一遍用IB buffer重懸之后,取樣50ul作為冷凍溶解前的包涵體蛋白樣品，然后等體積分裝為10管，4°C，12000r離心15min，棄上清；
[0034](5)將10管(1#_10#)包涵體蛋白沉淀用相同體積的PBS重懸，檢測不同的尿素濃度，不同冷凍時間，冷凍溫度以及不同pH值的PBS條件下的包涵體蛋白的溶解性。每管包涵體蛋白的冷凍條件如表一所示:
[0035]表一:
【權利要求】
1.一種溶解包涵體蛋白的方法，其特征在于:包括一個收集包涵體蛋白的步驟、一個洗滌包涵體蛋白的步驟、一個將包涵體蛋白重懸于含有尿素的PBS溶液的步驟、一個冷凍包涵體蛋白的步驟和一個室溫溶解包涵體蛋白的步驟；在所述的收集包涵體蛋白的步驟中，將表達包涵體蛋白的菌體離心收集，離心菌體用PBS重懸，加入溶菌酶室溫1-3小時后經(jīng)超生破碎，然后離心棄掉上清得到包涵體蛋白沉淀；在所述的洗滌包涵體蛋白的步驟中，將所述的包涵體蛋白沉淀重懸于IB buffer中，然后離心，棄掉上清，重復1_6次洗滌包涵體蛋白；在所述的將包涵體蛋白重懸于含有尿素的PBS溶液的步驟中，用含有尿素的PBS重懸洗滌后的包涵體蛋白；在所述的冷凍包涵體蛋白的步驟中，將包涵體蛋白懸液冷凍；在所述的室溫溶解包涵體蛋白的步驟中，將冷凍的包涵體蛋白懸液置于室溫，緩慢溶解，然后離心，上清即為可溶的包涵體蛋白。
2.如權利要求1所述的溶解包涵體蛋白的方法，其特征在于:所述的溶菌酶的終濃度為 10ug/mlο
3.如權利要求1所述的溶解包涵體蛋白的方法，其特征在于:在所述的收集包涵體蛋白的步驟中，離心溫度為2-8°C，離心轉速為10000-15000r/min，離心時間為10_20min。
4.如權利要求1所述的溶解包涵體蛋白的方法，其特征在于:在所述的洗滌包涵體蛋白的步驟中，離心溫度為2-8°C，離心轉速為10000-15000r/min，離心時間為10_20min。
5.如權利要求1所述的溶解包涵體蛋白的方法，其特征在于:在所述的室溫溶解包涵體蛋白的步驟中，離心溫度為2-8 °C，離心轉速為10000-15000r/min，離心時間為10_20min。
6.如權利要求1所述的溶解包涵體蛋白的方法，其特征在于:在所述的將包涵體蛋白重懸于含有尿素的PBS溶液的步驟中，在含有尿素的PBS溶液中，尿素的濃度為1-2M。
7.如權利要求1所述的溶解包涵體蛋白的方法，其特征在于:在所述的將包涵體蛋白重懸于含有尿素的PBS溶液的步驟中，PBS溶液的pH值在8-10之間。
8.如權利要求1所述的溶解包涵體蛋白的方法，其特征在于:在所述的冷凍包涵體蛋白的步驟中，冷凍溫度在_80°C~-20°C之間。
9.如權利要求1所述的溶解包涵體蛋白的方法，其特征在于:室溫的溫度在IO0C~30°C之間。
【文檔編號】C07K1/14GK103833824SQ201410070556
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年2月28日 優(yōu)先權日:2014年2月28日
【發(fā)明者】熊思東, 齊興梅 申請人:蘇州大學