新抗體抗-sPLA2-IIA及其用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及抗體抗-sPLA2-IIA及其用途。CNCM I - 458720111213CNCM I - 458820111213
【專利說明】新抗體抗-SPLA2-IIA及其用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及抗人IIA組分泌型磷脂酶A2(sPLA2-IIA)的新抗體及其在診斷和治療 方法中的用途。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 分泌型磷脂酶A2(sPLA2)形成結(jié)構(gòu)上相關(guān)的、催化磷脂的sn-2脂酰鍵的水解以 釋放游離脂肪酸和溶血磷脂的酶家族。通過催化此反應(yīng)，sPLA2酶在多個(gè)生物學(xué)過程中起 關(guān)鍵作用，所述生物學(xué)過程包括細(xì)胞膜的穩(wěn)態(tài)、脂質(zhì)消化、宿主防御、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和脂質(zhì)介質(zhì) 諸如類花生酸和溶血磷脂衍生物的生成（Valentin等人2000, Bioch. Biophys. Act. 59-70 ; Lambeau, G.，和 Gelb, M. H. 2008, Annu. Rev. Biochem. 77, 495-520)。此家族包括 11 個(gè)成員 / 同工型，它們被命名為 sPLA2-IB, sPLA2-IIA, sPLA2-IIC, sPLA2-IID, sPLA2-IIE, sPLA2-I IF, SPLA2-III, SPLA2-V, SPLA2-X, SPLA2-XIIA 和 sPLA2-XIIB〇
[0004] 已經(jīng)證明難以在蛋白水平對(duì)特定同工型定量，因?yàn)槊富钚韵嗨魄胰鄙偻ば吞禺?性sPLA2抗體。
[0005] Nevalainen等人（Biochimica et Biophysica Acta 1733 (2005) 210-223)開發(fā)了 一種用于時(shí)間分辨熒光免疫分析（TR-FIA)中的抗sPLA2-IIA抗體。此多克隆抗體通過用 重組人SPLA2-IIA蛋白免疫兔子獲得。TR-FIA的分析靈敏度被記載為lng/ml。
[0006] Cayman chemical提供了一種參考號(hào)SCACC353的單克隆抗體。根據(jù)該發(fā)明人獲得 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，SCACC353抗體結(jié)合人SPLA2-IIA的Kd為約InM(參見實(shí)施例）。
[0007] 目前存在著對(duì)能夠更準(zhǔn)確和靈敏地檢測(cè)生物學(xué)樣品諸如血清樣品中SPLA2-IIA 的抗SPLA2-IIA的抗體的需求。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明由此涉及一種抗人SPLA2-IIA的分離的抗體，其中所述抗體的結(jié)合人 SPLA2-IIA 的 Kd 小于 9. 1(T10M。
[0009] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，重鏈的可變區(qū)包含下面⑶R中的至少一種：
[0010] VH-CDR1:GYTFTS(SEQ ID N0:1);
[0011] VH-CDR2:WIFP⑶GSTE(SEQ ID N0:2);和
[0012] VH-CDR3:WGITAFPLFDY(SEQ ID N0:3)，
[0013] 或具有與所述SEQ ID NO: 1-3具有至少60%同一性的氨基酸序列的任何⑶R，或 輕鏈的可變區(qū)包含下面⑶R中的至少一種：
[0014] VL-CDR1:RASESVDYD⑶SYMN(SEQ ID N0:4);
[0015] VL-CDR2:AASNLES(SEQ ID N0:5);和
[0016] VL-CDR3:LQSNEAPWT(SEQ ID N0:6)，
[0017] 或具有與所述SEQ ID NO: 4-6具有至少60%同一性的氨基酸序列的任何⑶R。
[0018] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，重鏈的可變區(qū)包含如上文所定義的⑶R中的至少一 種，并且輕鏈的可變區(qū)包含如上文所定義的⑶R中的至少一種。
[0019] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，重鏈的可變區(qū)包含下列CDR:GYTFTS(SEQ ID NO:l)，WIFP⑶GSTE(SEQ ID NO:2)和 WGITAFPLFDY(SEQ ID NO:3)，并且輕鏈的可變區(qū)包含 下列 CDR:RASESVDYD⑶SYMN(SEQ ID N0:4)，AASNLES(SEQ ID NO:5)和 LQSNEAPWT(SEQ ID NO:6)或具有與所述SEQ ID NO: 1-6具有至少60%同一性的氨基酸序列的任何⑶R。
[0020] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，編碼重鏈可變區(qū)的氨基酸序列是SEQ ID NO: 13并且 編碼輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列是SEQ ID NO: 14,或具有與所述SEQ ID NO: 13-14具有至少 60 %同一性的氨基酸序列的任何序列。
[0021] 本發(fā)明還涉及包含如上文所述的抗人SPLA2-IIA的抗體的組合物。
[0022] 本發(fā)明還涉及如上文所述的抗人SPLA2-IIA的抗體，其用于治療SPLA2-IIA相關(guān) 的病癥。
[0023] 本發(fā)明還涉及如上文所述的抗人SPLA2-IIA的抗體，其用于檢測(cè)生物學(xué)樣品中的 sPLA2-IIA〇
[0024] 本發(fā)明還涉及一種體外診斷或預(yù)后分析法，其用于使用本發(fā)明的抗人SPLA2-IIA 的抗體確定生物學(xué)樣品中SPLA2-IIA的存在。
[0025] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述分析法是夾心ELISA，所述夾心ELISA使用如上 文所述的抗體作為包被抗體并且使用如下的抗體作為顯示抗體，其中：
[0026]-重鏈的可變區(qū)包含下面⑶R中的至少一種：
[0027] VH-CDR1:GFTFSS(SEQ ID N0:7);
[0028] VH-CDR2:AINSNGGSTY(SEQ ID N0:8);和
[0029] VH-CDR3:QGYGNFFDY(SEQ ID N0:9)，
[0030] 或具有與所述SEQ ID N0:7-9具有至少60%同一性的氨基酸序列的任何⑶R，或
[0031] -輕鏈的可變區(qū)包含下面⑶R中的至少一種：
[0032] VL-CDR1:RSSQSIVHSNGNTYLY(SEQ ID N0:10);
[0033] VL-CDR2:RVSNRFS(SEQ ID N0:11);和
[0034] VL-CDR3:FQGTHVPRT(SEQ ID N0:12)，
[0035] 或具有與所述SEQ ID NO: 10-12具有至少60%同一性的氨基酸序列的任何CDR。
[0036] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，顯示抗體的重鏈可變區(qū)包含如上文所定義的CDR中 的至少一種（SEQ ID N0:7-SEQ ID N0:9)且顯示抗體的輕鏈可變區(qū)包含如上文所定義的 CDR 中的至少一種（SEQ ID N0:10-SEQ ID N0:12)。
[0037] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，顯示抗體的重鏈可變區(qū)包含下列⑶R:GFTFSS(SEQ ID N0:7)、AINSNGGSTY(SEQ ID N0:8)和 QGYGNFFDY(SEQ ID N0:9)并且顯示抗體的輕 鏈可變區(qū)包含下列 CDR:RSSQSIVHSNGNTYLY(SEQ ID N0:10)、RVSNRFS(SEQ ID N0:11)和 FQGTHVPRT (SEQ ID NO: 12)或具有與所述SEQ ID NO: 7-12具有至少60%同一性的氨基酸 序列的任何CDR。
[0038] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，編碼顯示抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列是SEQ ID NO: 15并且編碼顯示抗體輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列是SEQ ID NO: 16,或是具有與所述SEQ ID NO: 15-16具有至少60%同一性的氨基酸序列的任何序列。
[0039] 本發(fā)明還涉及一種試劑盒，其包含至少一種本發(fā)明的抗人SPLA2-IIA的抗體。
[0040] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒包含本發(fā)明的抗體和本發(fā)明的顯示抗體。
[0041] 本發(fā)明還涉及一種表達(dá)載體，其包含SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19 和SEQ ID N0:20中的至少一種，或包含具有與所述SEQ ID NO: 17-20具有至少60%同一性 的核酸序列的任何序列。
[0042] 本發(fā)明還涉及保藏號(hào)為CNCM 1-4587和CNCM 1-4588的產(chǎn)生抗人SPLA2-IIA的抗 體的雜交瘤細(xì)胞系。

【具體實(shí)施方式】
[0043] 本發(fā)明人開發(fā)出了抗人SPLA2-IIA的新抗體，如實(shí)施例中所示，其顯示出比現(xiàn) 有抗體更高的對(duì)SPLA2-IIA的親和性，并且能夠更準(zhǔn)確和靈敏地檢測(cè)生物學(xué)樣品中的 sPLA2-IIA〇
[0044] 另外，本發(fā)明人提供了抗人SPLA2-IIA的單克隆抗體，其表現(xiàn)出以下的優(yōu)勢(shì)：（i) 比多克隆抗體更特異，和（ii)由于具有與其單克隆性質(zhì)相關(guān)的結(jié)果可重復(fù)性，所述抗體能 夠工業(yè)應(yīng)用。
[0045] 定義
[0046] SPLA2-IIA是sPLA2家族的一個(gè)同工型。人SPLA2-IIA蛋白的完整氨基酸序列 (SEQ ID N0:21) (GenBank 登錄號(hào) NP_000291)為：
[0047] MKTLLLLAVMIFGLLQAHG (信號(hào)肽）
[0048] NLVNFHRMIKLTTGKEAALSYGFYGCHCGVGGRGSPKDATDRCCVTHDCCYKRLEKRGCGTKFLSYKFS NSGSRITCAKQDSCRSQLCECDKAAATCFARNKITYNKKYQYYSNKHCRGSTPRC(成熟蛋白）。
[0049] 在一個(gè)實(shí)施方案中，SPLA2-IIA是突變體SPLA2-IIA,優(yōu)選N1A SPLA2-IIA突變體， 其具有序列SEQ ID NO:22:
[0050] MKTLLLLAVMIFGLLQAHG (信號(hào)肽）
[0051] ALVNFHRMIKLTTGKEAALSYGFYGCHCGVGGRGSPKDATDRCCVTHDCCYKRLEKRGCGTKFLSYKFS NSGSRITCAKQDSCRSQLCECDKAAATCFARNKITYNKKYQYYSNKHCRGSTPRC(成熟蛋白）。
[0052] 如本文所用的術(shù)語"抗體"（Ab)包括單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體（例 如，雙特異性抗體）、和抗體片段，只要它們表現(xiàn)出所需的生物學(xué)活性即可。在本文中術(shù)語 "免疫球蛋白"（Ig)與"抗體"可互換使用。
[0053] "分離的抗體"是已經(jīng)從其天然環(huán)境的成分分離和/或回收的抗體。其天然環(huán)境的 污染成分是會(huì)干擾抗體的診斷或治療用途的物質(zhì)，并且可以包括酶、激素、和其他蛋白質(zhì)或 非蛋白質(zhì)成分。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體：（1)如通過Lowry法測(cè)定被純化至抗體的大于 95%重量比，最優(yōu)選大于99%重量比；（2)通過使用轉(zhuǎn)杯式測(cè)序儀被純化至足以獲得N-末 端或內(nèi)部氨基酸序列的至少15個(gè)殘基的程度；或（3)如通過SDS-PAGE在還原或非還原條 件下并使用考馬斯藍(lán)（或優(yōu)選地，通過銀染色）顯示被純化至均一。分離的抗體包括在重 組細(xì)胞內(nèi)的原位抗體，因?yàn)榭贵w的天然環(huán)境的至少一個(gè)成分將不存在。然而，一般地，分離 的抗體將通過至少一個(gè)純化步驟制備。
[0054] 基本的四鏈抗體單元是由兩個(gè)相同的輕鏈（L)和兩個(gè)相同的重鏈（H)組成的異 四聚糖蛋白。來自任何脊椎動(dòng)物物種的L鏈可以基于它們的恒定區(qū)（CL)的氨基酸序列歸 屬于稱為kappa([K])和lambda([A])的兩種明顯不同的類型之一。取決于它們的重鏈 的恒定區(qū)（CH)的氨基酸序列，免疫球蛋白可以歸屬于不同的類型或同種型。存在五種類型 的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM，重鏈分別被命名為alpha ([ a ])、delta ([ A ])、 epsilon([ e ])、gamma([ y ])和mu([ y ])。[ y ]和[a ]類型基于CH序列和功能的相對(duì) 微小差異進(jìn)一步分成亞類，例如，人表達(dá)下列亞類：IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。 每個(gè)L鏈通過一個(gè)共價(jià)二硫鍵與H鏈連接，而兩個(gè)H鏈通過一個(gè)或多個(gè)二硫鍵彼此連接，這 取決于H鏈同種型。每個(gè)H和L鏈還具有規(guī)則隔開的鏈內(nèi)二硫鍵橋。每個(gè)H鏈在N-末端 處具有可變結(jié)構(gòu)域（VH)，對(duì)于[a]和[Y]鏈中的每一個(gè)緊接著三個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域（CH)，而 對(duì)于[U ]和[e ]同種型則緊接著4個(gè)CH結(jié)構(gòu)域。每個(gè)L鏈在N-末端處具有可變結(jié)構(gòu)域 (VL)，在其另一端緊接著恒定結(jié)構(gòu)域（CL)。VL與VH對(duì)齊，而CL與重鏈的第一個(gè)恒定結(jié)構(gòu) 域（CH1)對(duì)齊。據(jù)信特定的氨基酸殘基形成輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域之間的界面。VH和VL 的配對(duì)一起形成單一抗原結(jié)合位點(diǎn)。IgM抗體由5個(gè)基本異四聚體單元以及稱為J鏈的額 外多肽組成，并且因此含有10個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，而分泌型IgA抗體可以聚合形成多價(jià)組裝 體，其包含2-5個(gè)基本4鏈單元以及J鏈。在IgG的情況下，4鏈單元通常約150, 000道爾 頓。對(duì)于不同類型的抗體的結(jié)構(gòu)和特性，參見，例如，Basic and Clinical Immunology(基 礎(chǔ)和臨床免疫學(xué)），第8版，〇311161?.31：；^68,41^3 1.161'1'和1'1'181：四1116.?3181〇￥(編）， Appleton&Lange, Norwalk, Conn.，1994，第 71 頁，和第 6 章。
[0055] 術(shù)語"可變的"是指V結(jié)構(gòu)域的某些節(jié)段的序列在抗體與抗體之間存在廣泛差異。 V結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)抗原結(jié)合并且限定特定抗體對(duì)其特定抗原的特異性。然而，在可變結(jié)構(gòu)域的 110個(gè)氨基酸范圍內(nèi)可變性并不是均勻分布的。而是，V區(qū)由被稱為"高變區(qū)"的具有高度 可變性的較短區(qū)域分開的相對(duì)不變的15-30個(gè)氨基酸的稱為框架區(qū)（FR)的序列段組成，所 述高變區(qū)每個(gè)的長(zhǎng)度為9-12個(gè)氨基酸。天然重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域各自包含4個(gè)FR， 大部分采取[0 ]_折疊構(gòu)型，由三個(gè)高變區(qū)連接，形成環(huán)連接，并且在一些情況下，形成部 分的[0]_折疊結(jié)構(gòu)。每條鏈中的高變區(qū)通過FR與來自另一條鏈的高變區(qū)一起緊密地保 持靠近，促成了抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的形成（參見Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫學(xué)感興趣的蛋白的序列），第5版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda，Md. (1991))。恒定結(jié)構(gòu)域不直接參與 抗體與抗原的結(jié)合，但表現(xiàn)出多種效應(yīng)器功能，諸如抗體參與抗體依賴性細(xì)胞毒性（ADCC)。
[0056] 術(shù)語"高變區(qū)"當(dāng)在本文中使用時(shí)是指負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的抗體氨基酸序列。高 變區(qū)通常包含來自"互補(bǔ)決定區(qū)"或"CDR"的氨基酸殘基（例如，當(dāng)根據(jù)Kabat編號(hào) 系統(tǒng)編號(hào)時(shí)在VL中的約殘基24-34 (L1)、50-56 (L2)和89-97 (L3)周圍，和在VH中的 約 31-35(H1)、50_65(H2)和 95-102(H3)周圍；Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest (免疫學(xué)感興趣的蛋白的序列），第5版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda，Md. (1991));和 / 或來自"高變 環(huán)"的那些殘基（例如，當(dāng)根據(jù)Chothia編號(hào)系統(tǒng)編號(hào)時(shí)在VL中的殘基24-34(LI)、 50-56 (L2)和 89-97 (L3)，和在 VH 中的 26-32(H1)、52-56(H2)和 95-101(H3) ;Chothia 和 Lesk，J. Mol. Biol. 196:901-917(1987));和 / 或來自"高變環(huán)"/CDR 的那些殘基（例 如，當(dāng)根據(jù)頂GT編號(hào)系統(tǒng)編號(hào)時(shí)在VL中的殘基27-38(Ll)、56-65(L2)和105-120(L3)， 和 VH 中的殘基 27-38 (HI)、56-65 (H2)和 105-120 (H3) ;Lefranc, M. P?等人 Nucl. Acids Res. 27:209-212 (1999), Ruiz, M?等人 Nucl. Acids Res. 28:219-221 (2000))。任選地，抗體 在下列點(diǎn)中的一個(gè)或多個(gè)處具有勻稱的插入：當(dāng)根據(jù)AHo編號(hào)時(shí)在VL中的28、36(L1)、63、 74-75(L2)和 123(L3)，以及 VH 中的 28、36(H1)、63、74-75(H2)和 123(H3) (Honneger, A?和 Plunkthun, A. J. Mol. Biol. 309:657-670 (2001)) 〇
[0057] 術(shù)語"單克隆抗體"當(dāng)在本文中使用時(shí)是指從基本上同質(zhì)的抗體群體獲得的抗體， SP，該群體中包含的單個(gè)抗體是相同的，除了可能微量存在的可能的天然發(fā)生的突變以外。 單克隆抗體是高度特異性的，其針對(duì)單個(gè)抗原位點(diǎn)。此外，與包含針對(duì)不同的決定簇（表 位）的不同抗體的多克隆抗體相反，每個(gè)單克隆抗體針對(duì)抗原上的單個(gè)決定簇。除了它們 的特異性，單克隆抗體是有優(yōu)勢(shì)的，在于它們可以不受其他抗體污染地合成。修飾語"單克 隆"不應(yīng)被解釋為需要通過任何特定的方法產(chǎn)生所述抗體。例如，可用于本發(fā)明中的單克 隆抗體可以通過由Kohler等人，Nature, 256:495(1975)首先描述的雜交瘤方法來制備， 或可以使用在細(xì)菌、真核動(dòng)物或植物細(xì)胞中的重組DNA法來制備（參見，例如，美國專利號(hào) 4, 816, 567)。"單克隆抗體"還可以使用例如在 Clackson 等人，Nature, 352:624-628 (1991) 和Marks等人，J. Mol. Biol. ,222:581-597(1991)中記述的技術(shù)從噬菌體抗體文庫中分離。
[0058] 在本文中單克隆抗體包括"嵌合抗體"，在嵌合抗體中重和/或輕鏈的一部分與 衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類型或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而剩余的 鏈與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類型或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，以及 此類抗體的片段，只要它們表現(xiàn)出所需的生物學(xué)活性即可（參見，美國專利號(hào)4, 816, 567 ; 和 Morrison 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))。本發(fā)明提供了衍生 自人抗體的可變結(jié)構(gòu)域抗原結(jié)合序列。因此，本文中主要感興趣的嵌合抗體包括具有一條 或多條人抗原結(jié)合序列（例如，⑶R)并且包含衍生自非人抗體的一條或多條序列，例如， FR或C區(qū)序列的抗體。另外，本文中主要感興趣的嵌合抗體包括包含一種抗體類型或亞類 的人可變結(jié)構(gòu)域抗原結(jié)合序列和衍生自另一抗體類型或亞類的另一序列，例如，F(xiàn)R或C區(qū) 序列的那些。本文中感興趣的嵌合抗體還包括含有與本文中所述的或衍生自不同的物種， 諸如非人靈長(zhǎng)目動(dòng)物（例如，舊大陸猴（Old World Monkey)、猿等）的那些相關(guān)的可變結(jié) 構(gòu)域抗原結(jié)合序列的那些。嵌合抗體還包括靈長(zhǎng)類源化和人源化抗體。此外，嵌合抗體可 以包含在受體抗體或在供體抗體中不存在的殘基。做出這些修飾以進(jìn)一步改善抗體性能。 對(duì)于進(jìn)一步細(xì)節(jié)，參見 Jones 等人，Nature 321:522-525 (1986) ;Riechmann 等人，Nature 332:323-329(1988);和 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)。
[0059]"抗體片段"包括完整抗體的一部分，優(yōu)選完整抗體的抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？?體片段的實(shí)例包括Fab、Fab'、F(ab'）2和Fv片段；雙價(jià)抗體；線性抗體（參見美國專利號(hào) 5, 641，870 ;Zapata 等人，Protein Eng. 8 (10) : 1057-1062 [1995]);單鏈抗體分子；和由抗 體片段形成的多特異性抗體。短語抗體的"功能片段或類似物"是具有在性質(zhì)上與全長(zhǎng)抗 體一樣的生物學(xué)活性的化合物。例如，抗IgE抗體的功能片段或類似物是這樣的一種功能 片段或類似物，即其可以以阻止或基本上降低此類分子結(jié)合高親和力受體Fc[ e ]RI的能 力的方式結(jié)合IgE免疫球蛋白?？贵w經(jīng)木瓜蛋白酶消化產(chǎn)生兩個(gè)相同的抗原結(jié)合片段（稱 為"Fab〃片段）和剩余的〃Fc〃片段（這是反映出容易結(jié)晶能力的名稱）。Fab片段由整個(gè) L鏈連同H鏈的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域（VH)，以及一條重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域（CH1)組成。在抗原 結(jié)合方面，每個(gè)Fab片段是單價(jià)的，S卩，它具有單個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)?？贵w經(jīng)胃蛋白酶處理得 到單個(gè)大的F(ab'）2片段，其大致對(duì)應(yīng)于具有二價(jià)抗原結(jié)合活性的兩個(gè)通過二硫鍵連接的 Fab片段并且仍然能夠交聯(lián)抗原。Fab'片段與Fab片段的不同之處在于在CH1結(jié)構(gòu)域的羧 基末端處具有額外的少量殘基，包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸。Fab' -SH在 本文中是用于其中恒定結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基攜帶游離巰基的Fab'的名稱。 F(ab'）2抗體片段最初作為Fab'片段對(duì)產(chǎn)生，在Fab'片段對(duì)之間具有鉸鏈半胱氨酸。抗體 片段的其他化學(xué)偶聯(lián)也是已知的。
[0060] "人源化"或"人"抗體是指其中一個(gè)或多個(gè)人免疫球蛋白的恒定和可變框架區(qū)與 動(dòng)物免疫球蛋白的結(jié)合區(qū)，例如，CDR融合的抗體。此類抗體被設(shè)計(jì)成保持從其獲得結(jié)合區(qū) 的非人抗體的結(jié)合特異性，但避免針對(duì)該非人抗體的免疫反應(yīng)。此類抗體可以獲自轉(zhuǎn)基因 小鼠或其他動(dòng)物，所述轉(zhuǎn)基因小鼠或其他動(dòng)物已經(jīng)被"工程化"以響應(yīng)于抗原激發(fā)產(chǎn)生特異 性人抗體（參見，例如，Green 等人（1994)Nature Genet 7:13 ;Lonberg 等人（1994)Nature 368:856 ;Taylor等人（1994) Int Immun 6:579，它們的全部教導(dǎo)內(nèi)容通過引用合并于本文 中）。完全人抗體也可以通過基因或染色體轉(zhuǎn)染法，以及噬菌體展示技術(shù)來構(gòu)建，它們都是 本領(lǐng)域中已知的（參見，例如，McCafferty等人（1990)Nature 348:552-553)。人抗體也可 以通過體外激活的B細(xì)胞來產(chǎn)生（參加，例如，美國專利號(hào)5, 567, 610和5, 229, 275,它們 整體地通過引用并入）。因此，"靈長(zhǎng)類源化"抗體是指其中一個(gè)或多個(gè)靈長(zhǎng)類動(dòng)物免疫球 蛋白的恒定和可變框架區(qū)與非靈長(zhǎng)類動(dòng)物免疫球蛋白的結(jié)合區(qū)，例如，CDR融合的抗體。
[0061] "嵌合抗體"是這樣的抗體分子，其中（a)恒定區(qū)或其部分被改變、替換或交換使得 抗原結(jié)合位點(diǎn)（可變區(qū)）連接至不同或改變的類型、效應(yīng)器功能和/或物種的恒定區(qū)，或連 接至賦予所述嵌合抗體以新特性的完全不同的分子，例如，酶、毒素、激素、生長(zhǎng)因子、藥物， 等；或（b)可變區(qū)或其部分被具有不同的或改變的抗原特異性的可變區(qū)改變、替換或交換。
[0062] "Fc"片段包括由二硫鍵連在一起的兩條H鏈的羧基-末端部分?？贵w的效應(yīng)器功 能由Fc區(qū)中的序列決定，該區(qū)也是由某些類型細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的Fc受體（FcR)所識(shí)別的部分。
[0063] "Fv"是含有完整的抗原識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。此片段由一個(gè)重鏈可變 區(qū)結(jié)構(gòu)域和一個(gè)輕鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域的二聚體以緊密的、非共價(jià)締合的方式組成。從這兩個(gè) 結(jié)構(gòu)域的折疊產(chǎn)生6個(gè)高變環(huán)（3個(gè)環(huán)各自來自于H鏈和L鏈），其促成用于抗原結(jié)合的氨 基酸殘基并且賦予抗體以抗原結(jié)合特異性。然而，甚至單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域（或包含僅三個(gè)對(duì) 抗原特異的CFR的Fv的一半）就具有識(shí)別并結(jié)合抗原的能力，盡管親和性比完整的結(jié)合位 點(diǎn)低。
[0064] "單鏈Fv"也縮寫為"sFv〃或"scFv"，其是包含連接形成單條多肽鏈的VH 和VL抗體結(jié)構(gòu)域的抗體片段。優(yōu)選地，sFv多肽在VH和VL結(jié)構(gòu)域之間進(jìn)一步包含 多肽接頭，其使得sFv能夠形成用于抗原結(jié)合的所需結(jié)構(gòu)。對(duì)于sFv的綜述，參見， Pluckthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113,Rosenburg 和 Moore 編，Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994) ;Borrebaeck 1995，見上。
[0065] 術(shù)語"雙價(jià)抗體（diabody) "是指通過下述方式制備的小抗體片段：構(gòu)建在VH和 VL結(jié)構(gòu)域之間具有短接頭（約5-10個(gè)殘基）的sFv片段（參見上一段），從而獲得V結(jié)構(gòu) 域的鏈間配對(duì)而非鏈內(nèi)配對(duì)，得到二價(jià)片段（即，具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的片段）。雙特異 性雙價(jià)抗體是兩個(gè)"交叉" sFv片段的異二聚體，其中兩個(gè)抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域存在于不 同的多肽鏈上。雙價(jià)抗體更詳細(xì)地描述于，例如，EP 404,097 ;W0 93/11161 ;和Holliger等 人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) 〇
[0066] 當(dāng)在本文中使用時(shí)，如果抗體以可檢測(cè)的水平與抗原反應(yīng)，優(yōu)選地以大于或等于 約⑴言1，或大于或等于約lo5]^1，大于或等于約lo 6]^1，大于或等于約lOl1，或大于或等 于108M'，或大于或等于KAT1，或大于或等于lO^T1的親合常數(shù)Ka反應(yīng)，則該抗體被稱 為對(duì)該抗原"是免疫特異的"、"特異的"或與該抗原"特異性結(jié)合"?？贵w對(duì)其同族抗原的親 和性也通常表示為解離常數(shù)Kd，并且在某些實(shí)施方案中，如果抗體以小于或等于1(T 4M，小 于或等于約1(T5M，小于或等于約1(T6M，小于或等于1(T 7M，或小于或等于1(T8M，或小于或 等于5. 10_9M，或小于或等于10_9M，或小于或等于5. 10_、，或小于或等于10_、的Kd結(jié)合， 則該抗體與該抗原特異性結(jié)合?？贵w的親合力可以容易地使用常規(guī)技術(shù)來確定，例如，由 Scatchard等人（Ann. N. Y. Acad. Sci. USA 51:660(1949))所述的那些?？贵w與抗原、細(xì)胞或 其組織的結(jié)合特性通?？梢允褂妹庖邫z測(cè)法來測(cè)定和評(píng)估，所述免疫檢測(cè)法包括，例如，基 于免疫熒光的測(cè)定，諸如免疫組織化學(xué)（IHC)和/或熒光激活細(xì)胞分選（FACS)。
[0067] "分離的核酸"是與其他基因組DNA序列以及蛋白或復(fù)合物諸如核糖體和聚合酶 (它們天然地伴隨天然序列）基本上分離的核酸。該術(shù)語包括已經(jīng)從其天然存在的環(huán)境移 出的核酸序列，并且包括重組或克隆的DNA分離物，和化學(xué)合成的類似物或通過異源系統(tǒng) 生物學(xué)合成的類似物?；旧霞兊暮怂岚ê怂岬姆蛛x形式。當(dāng)然，這是指如最初分離的 核酸并且不排除以后通過人工添加至分離的核酸的基因或序列。術(shù)語"多肽"以其常規(guī)含 義使用，即，作為氨基酸序列使用。多肽不限于特定長(zhǎng)度的產(chǎn)品。肽、寡肽和蛋白質(zhì)包括在 多肽的定義內(nèi)，并且此類術(shù)語可以在本文中互換使用，除非以其他方式具體指明。此術(shù)語也 不是指或排除多肽的表達(dá)后修飾，例如，糖基化、乙?；⒘姿峄?，以及本領(lǐng)域中已知的其 他修飾，兩者均為天然存在的和非天然存在的。多肽可以是完整蛋白，或其子序列。在本發(fā) 明的語境中感興趣的特定多肽是包含CFR并且能夠結(jié)合抗原的氨基酸子序列。"分離的多 肽"是已經(jīng)被鑒定和從其天然環(huán)境的成分中分離和/或回收的多肽。在優(yōu)選的實(shí)施方案中， 分離的多肽將（1)如通過Lowry法測(cè)定被純化至多肽的大于95%重量比，最優(yōu)選大于99% 重量比；（2)通過使用轉(zhuǎn)杯式測(cè)序儀被純化至足以獲得N-末端或內(nèi)部氨基酸序列的至少15 個(gè)殘基的程度；或（3)如通過SDS-PAGE在還原或非還原條件下使用考馬斯藍(lán)（或優(yōu)選地， 通過銀染色）被純化至均一。分離的多肽包括重組細(xì)胞內(nèi)的原位多肽，因?yàn)槎嚯牡奶烊画h(huán) 境的至少一種成分將不存在。然而，一般地，分離的多肽將通過至少一個(gè)純化步驟制備。
[0068] "天然序列"多核苷酸是具有與來源于自然的多核苷酸相同的核苷酸序列的多核 苷酸。"天然序列"多肽是具有與來源于自然（例如，來源于任何物種）的多肽（例如，抗 體）相同的氨基酸序列的多肽。此類天然序列多核苷酸和多肽可以從自然分離或可以通 過重組或合成手段產(chǎn)生。多核苷酸"變體"，當(dāng)該術(shù)語在本文中使用時(shí)，是與在本文中具體 公開的多核苷酸典型地有一個(gè)或多個(gè)置換、缺失、添加和/或插入的不同的多核苷酸。此類 變體可以是天然存在的或可以合成產(chǎn)生，例如，通過修飾本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)多核苷酸序 列，并如本文所述評(píng)價(jià)所編碼的多肽的一種或多種生物學(xué)活性和/或使用本領(lǐng)域中熟知的 多種技術(shù)中的任一種。多肽"變體"，當(dāng)該術(shù)語在本文中使用時(shí)，是與在本文中具體公開的 多肽典型地有一個(gè)或多個(gè)置換、缺失、添加和/或插入的不同的多肽。此類變體可以是天然 存在的或可以合成產(chǎn)生，例如，通過修飾本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)上述多肽序列，并如本文所述 評(píng)價(jià)所述多肽的一種或多種生物學(xué)活性和/或使用本領(lǐng)域中熟知的多種技術(shù)中的任一種。 修飾可以在本發(fā)明的多核苷酸和多肽的結(jié)構(gòu)中做出，并且仍然可以獲得編碼具有所需特征 的變體或衍生多肽的功能分子。當(dāng)需要改變多肽的氨基酸序列以形成本發(fā)明的多肽的變 體或部分的等效物，或甚至改良的本發(fā)明的多肽的變體或部分時(shí)，本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員將 典型地改變一個(gè)或多個(gè)編碼DNA序列的密碼子。例如，在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中某些氨基酸可以被 置換為其他的氨基酸而不顯著地喪失其結(jié)合其他多肽（例如，抗原）或細(xì)胞的能力。由于 限定蛋白質(zhì)生物學(xué)功能活性的是蛋白質(zhì)的結(jié)合能力和性質(zhì)，因此可以在蛋白質(zhì)序列中（并 且當(dāng)然可以在其基礎(chǔ)的DNA編碼序列中）做出某些氨基酸序列置換，并且盡管如此仍獲得 具有相似性質(zhì)的蛋白質(zhì)。因此考慮可以在公開的組合物的肽序列中，或編碼所述肽的相應(yīng) DNA序列中做出多種變化，而不顯著地喪失它們的生物學(xué)效用或活性。在許多情況下，多肽 變體將含有一個(gè)或多個(gè)保守置換。"保守置換"是其中氨基酸被置換為具有相似性質(zhì)的另 一氨基酸，使得肽化學(xué)領(lǐng)域中的專業(yè)技術(shù)人員將預(yù)期所述多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)和疏水性質(zhì)將基 本上不會(huì)改變的置換。如上所述，氨基酸置換因此通常基于氨基酸側(cè)鏈取代基的相對(duì)相似 性，例如，它們的疏水性、親水性、電荷、尺寸等?？紤]到多種前述特征的示例性置換是本領(lǐng) 域技術(shù)人員所熟知的并且包括：精氨酸和賴氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；谷 氨酰胺和天冬酰胺；以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。氨基酸置換可以進(jìn)一步基于殘基的極 性、電荷、溶解度、疏水性、親水性和/或兩親性質(zhì)的相似性做出。例如，帶負(fù)電荷的氨基酸 包括天冬氨酸和谷氨酸；帶正電荷的氨基酸包括賴氨酸和精氨酸；和具有相似的親水性值 的帶有不帶電荷的極性頭基的氨基酸包括亮氨酸，異亮氨酸和纈氨酸；甘氨酸和丙氨酸； 天冬酰胺和谷氨酰胺；以及絲氨酸，蘇氨酸，苯丙氨酸和酪氨酸?？梢源肀Ｊ刈兓钠?他組氨基酸包括：（1) ala, pro, gly, glu, asp, gin, asn, ser, thr ; (2) cys, ser, tyr, thr ; (3) val，ile，leu, met, ala, phe ; (4) lys，arg，his ;和（5)phe，tyr，trp，his〇 變體還可以，或可 選地，含有非保守變化。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，變體多肽與天然序列的不同為置換、缺失或 添加5個(gè)或更少的氨基酸。變體還可以（或可選地）通過，例如，缺失或添加對(duì)多肽的免疫 原性、二級(jí)結(jié)構(gòu)和疏水性質(zhì)具有最小影響的氨基酸來修飾。
[0069] 術(shù)語"同一性"或"相同的"，當(dāng)用于兩個(gè)或多個(gè)多肽的序列之間的關(guān)系時(shí)，是 指多肽之間的序列關(guān)聯(lián)性程度，如通過多串兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基之間的匹配數(shù)目 來確定。"同一性"測(cè)量?jī)蓚€(gè)或多個(gè)序列中的較小者與由特定數(shù)學(xué)模型或計(jì)算機(jī)程序 (即，"算法"）所找到的空位比對(duì)（如果有的話）之間的相同匹配的百分比。相關(guān)多肽 的同一性可以容易地通過已知方法計(jì)算。此類方法包括，但不限于，在Computational Molecular Biology (計(jì)算分子生物學(xué)），Lesk, A. M.，編輯，Oxford University Press, New York, 1988 ;Biocomputing:Informatics and Genome Projects(生物計(jì)算：信息學(xué)和基 因組計(jì)劃），Smith, D.W.,編輯，Academic Press, New York, 1993 ;Computer Analysis of Sequence Data (序列的計(jì)算機(jī)分析），第 1 部分，Griff in, A. M?，和 Griff in, H.G.,編輯， Humana Press, New Jersey, 1994 ；Sequence Analysis in Molecular Biology (分子生物 學(xué)中的序列分析），von Heinje，G.，Academic Press，1987;Sequence Analysis Primer (序 列分析引物），Gribskov，M?和 Devereux，J.，編輯，M.Stockton Press，New York，1991 ;和 Carillo等人，SIAM J. Applied Math. 48,1073(1988)中描述的那些。優(yōu)選的用于確定同 一性的方法被設(shè)計(jì)為給出所測(cè)試的序列之間的最大匹配。確定同一性的方法記述于可公 共獲得的計(jì)算機(jī)程序中。優(yōu)選的用于確定兩條序列之間的同一性的計(jì)算機(jī)程序方法包括 GCG 程序包，包括 GAP (Devereux 等人，Nucl. Acid. Res. \2, 387 (1984) ;Genetics Computer Group，University of Wisconsin，Madison，Wis.)、BLASTP、BLASTN，和 FASTA(Altschul 等 人，J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990))。BLASTX程序可從國家生物技術(shù)信息中心（NCBI)和 其他來源（BLAST Manual, Altschul 等人 NCB/NLM/NIH Bethesda，Md. 20894 ;Altschul 等 人，見上）公開獲得。熟知的Smith Waterman算法也可以用于確定同一*性。
[0070]"哺乳動(dòng)物"當(dāng)在本文中使用時(shí)，是指任何哺乳動(dòng)物，包括人、家畜和農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物，以 及動(dòng)物園動(dòng)物、運(yùn)動(dòng)動(dòng)物或?qū)櫸飫?dòng)物，諸如犬、貓、牛、馬、綿羊、豬、山羊、兔，等。優(yōu)選地，哺 乳動(dòng)物是人。在一個(gè)實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物是雄性的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物是雌 性的。
[0071]"治療"或"緩解"是指治療性治療和預(yù)防或預(yù)后性措施兩者；其中目的是防止或減 緩（減輕）目標(biāo)的病理狀況或病癥。需要治療的那些包括已經(jīng)患有病癥的那些以及易于患 有病癥的那些或待預(yù)防病癥的那些。如果根據(jù)本發(fā)明的方法在接受治療量的抗體后，患者 顯示出可觀察到的和/或可測(cè)量到的下列一項(xiàng)或多項(xiàng)的減少或缺少下列一項(xiàng)或多項(xiàng)，則成 功地"治療"了受試者或哺乳動(dòng)物的感染：致病細(xì)胞數(shù)目的減少；總細(xì)胞中致病性細(xì)胞百分 比減少；和/或與具體疾病或病況相關(guān)的一種或多種癥狀一定程度地緩解；降低的發(fā)病率 和死亡率，以及生活質(zhì)量問題的改善。用于評(píng)估成功治療和改善疾病的上述參數(shù)容易通過 臨床醫(yī)生熟悉的常規(guī)規(guī)程來測(cè)量。
[0072] 術(shù)語"治療有效量"是指有效"治療"受試者或哺乳動(dòng)物中的疾病或病癥的抗體或 藥物的量。
[0073] 發(fā)明
[0074] 本發(fā)明涉及分離的抗SPLA2-IIA的抗體。
[0075]抗體抗-SPLA2-IIA
[0076] 本發(fā)明的一個(gè)目的是抗人SPLA2-IIA的抗體，其中所述抗體的結(jié)合人SPLA2-IIA 的 Kd 小于 9. lO'M,優(yōu)選小于 8. lO'M, 7. lO'M, 6. lO'M, 5. lO'M, 4. lO'M,更優(yōu)選小于 3. 10_、且甚至更優(yōu)選小于2. l〇-1QM。
[0077] Kd可以在試驗(yàn)A的條件下測(cè)定：
[0078] 微板孔用PBS pH 7. 5中的50ng重組人SPLA2-IIA在室溫下包被過夜。然后用含 有0. 05% Tween 20的PBS洗滌樣品孔三次。在最后的洗滌后，用含有在PBS緩沖液中的 1%牛血清白蛋白（BSA)的封閉溶液在室溫下處理樣品孔60分鐘。在用含有0.05% Tween 20的PBS洗滌后，將增加量（0. Ing/mL直達(dá)10 y g/mL)的抗人PLA2-IIA的mAb添加至抗 原包被的孔，并且在室溫下孵育120min。在用含有0. 05% Tween 20的PBS洗滌后，通過用 HRP-綴合的多克隆山羊抗鼠IgG(Abcam ab7068)在室溫下處理60min來檢測(cè)mAb的結(jié)合。 添加TMB，通過添加HC1終止反應(yīng)，并在450nm測(cè)定吸光度。數(shù)據(jù)用單址飽和模型擬合，并從 該模型估算相對(duì)Kd值。
[0079] 本發(fā)明的一個(gè)目的是抗人SPLA2-IIA的抗體，其中重鏈可變區(qū)包含下列⑶R中的 至少一種：
[0080] VH-CDR1:GYTFTS(SEQ IDN0:1)或 GFTFSS(SEQ IDN0:7);
[0081] VH-CDR2:WIFP⑶GSTE(SEQIDN0:2)或AINSNGGSTY(SEQIDN0:8);和
[0082] VH-CDR3:WGITAFPLFDY(SEQ ID NO:3)或 QGYGNFFDY(SEQ ID NO:9)。
[0083] ⑶R編號(hào)和定義依照Chothia定義。
[0084] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是抗人sPLA2-IIA的抗體，其中輕鏈可變區(qū)包含下列CDR中 的至少一種：
[0085] VL-CDR1:RASESVDYD⑶SYMN(SEQ ID N0:4)或 RSSQSIVHSNGNTYLY(SEQ ID N0:10);
[0086] VL-CDR2:AASNLES(SEQ ID NO:5)或 RVSNRFS(SEQ ID NO:ll);和
[0087] VL-CDR3:LQSNEAPWT(SEQ ID NO:6)或 FQGTHVPRT(SEQ ID NO:12)。
[0088] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，抗體抗-SPLA2-IIA在其重鏈中包含GYTFTS(SEQ ID NO:l)或 GFTFSS(SEQ ID NO:7)中的一個(gè) VH-CDR1，WIFP ⑶ GSTE(SEQ ID NO:2) 或 AINSNGGSTY(SEQ ID NO:8)中的一個(gè)VH-CDR2 和 WGITAFPLFDY(SEQ ID NO:3)或 QGYGNFFDY(SEQ ID N0:9)中的一個(gè) VH-CDR3。
[0089] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體抗-SPLA2-IIA在其輕鏈中包含 RASESVDYD⑶SYMN(SEQ ID N0:4)或 RSSQSIVHSNGNTYLY(SEQ ID N0:10)中的一個(gè) VL-CDR1， AASNLES(SEQ ID N0:5)或RVSNRFS(SEQ ID N0:11)中的一個(gè)VL-CDR2和LQSNEAPWT(SEQ ID N0:6)或 FQGTHVPRT(SEQ ID N0:12)中的一個(gè) VL-CDR3。
[0090] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體抗-SPLA2-IIA在其重鏈中包含3個(gè)⑶R :SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2 和 SEQ ID NO:3。
[0091] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體抗-SPLA2-IIA在其重鏈中包含3個(gè)⑶R :SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8 和 SEQ ID NO:9。
[0092] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體抗-SPLA2-IIA在其輕鏈中包含3個(gè)⑶R :SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6。
[0093] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體抗-SPLA2-IIA在其輕鏈中包含3個(gè)⑶R :SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11 和 EQ ID NO:12。
[0094] 根據(jù)本發(fā)明，重鏈和輕鏈的CDR 1、2和3中的任一個(gè)可以表征為具有與在相應(yīng)的 SEQ ID NO 中列舉的特定的CDR或CDR組共享至少60%、70%、75%、80%、90%、95%、96%、 97%、98%、99%的同一性的氨基酸序列。
[0095] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體抗-SPLA2-IIA選自由下列各項(xiàng)組成的組：
[0096] -具有⑴分別如SEQ ID N0:l、2和3中所示的重鏈CDR 1、2和3(VH-CDR1、 VH-⑶R2、VH-⑶R3)氨基酸序列和（ii)分別如SEQ ID N0:4、5和6中所示的輕鏈⑶R 1、2 和3(VL-CDR1、VL-CDR2、VL-CDR3)氨基酸序列的抗體；
[0097] -具有⑴分別如SEQ ID N0:7、8和9中所示的重鏈CDR 1、2和3(VH-CDR1、 VH-⑶R2、VH-⑶R3)氨基酸序列和（ii)分別如SEQ ID N0:10、ll和12中所示的輕鏈⑶R 1、2 和 3(VL-CDR1、VL-CDR2、VL-CDR3)氨基酸序列的抗體；
[0098] 任選地，其中所述序列中任一個(gè)中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被不同 的氨基酸置換。
[0099] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體抗-sPLA2-IIA(6G2抗體）包含序列SEQ ID NO: 13的重鏈可變區(qū)和序列SEQ ID NO: 14的輕鏈可變區(qū)。
[0100] (SEQ ID NO: 13)
[0101] QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYDINWVRQRPEQGLEWIGWIFP⑶GSTEYNEKFKGKAT LTTDKSSSTAYMQLSRLTSEDSAVYFCARWGITAFPLFDYWGQGTALTVSS
[0102] (SEQ ID NO: 14)
[0103] DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDYD⑶SYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGIPARFSGS GSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCLQSNEAPWTFGGGTKLEIKR
[0104] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，抗-SPLA2-IIA抗體（9C8抗體）包含序列SEQ ID NO: 15的重鏈可變區(qū)和序列SEQ ID NO: 16的輕鏈可變區(qū)。
[0105] (SEQ ID NO: 15)
[0106] DVELVESGGGLVKLGGSLKLSCAASGFTFSSYYMSWVRQTPEKRLELVAAINSNGGSTYYPDTVKGRFT ISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTALYYCARQGYGNFFDYWGQGTTLTVSS
[0107] (SEQIDNO: 16)
[0108] DWMTQTPLSLPVSL⑶QASISCRSSQSIVHSNGNTYLYWYLQKPGQSPKLLIYRVSNRFSGVPDRFSG SGSGTDFTLKISRVEAEDMGVYYCFQGTHVPRTFGGGTNLEIKR
[0109] 根據(jù)本發(fā)明，重鏈或輕鏈可變區(qū)的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被不同的 氨基酸置換。
[0110] 根據(jù)本發(fā)明，重鏈可變區(qū)涵蓋與SEQ ID N0:13或15具有60%、70%、75%、80%、 90%、95%、96%、97%、98%、99% 的同一性的序列。
[0111] 根據(jù)本發(fā)明，輕鏈可變區(qū)涵蓋與SEQ ID勵(lì)：14或16具有60%、70%、75%、80%、 90%、95%、96%、97%、98%、99% 的同一性的序列。
[0112] 在本發(fā)明的任一抗體中，例如，6G2和9C8,指定的可變區(qū)和⑶R序列可以包含保守 序列修飾。保守序列修飾是指不顯著地影響或改變包含氨基酸序列的抗體的結(jié)合特性的氨 基酸修飾。這種保守修飾包括氨基酸置換、添加和缺失?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù) 將修飾引入至本發(fā)明的抗體中，諸如定向誘變和PCR介導(dǎo)的誘變。保守氨基酸置換典型地 是其中氨基酸殘基被帶有具有相似物理化學(xué)性質(zhì)的側(cè)鏈的氨基酸殘基替換的那些。指定的 可變區(qū)和CDR序列可以包含一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或更多個(gè)氨基酸插入、缺失或置換。在進(jìn) 行置換的情況下，優(yōu)選的置換將是保守修飾。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族在本領(lǐng)域 中已經(jīng)被定義。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸（例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸），具 有酸性側(cè)鏈的氨基酸（例如，天冬氨酸、谷氨酸），具有不帶電荷的極性側(cè)鏈的氨基酸（例 如，甘氨酸，天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸），具有非極性 側(cè)鏈的氨基酸（例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸），具有 0-分支的側(cè)鏈的氨基酸（例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸）和具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸 (例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸）。因此，本發(fā)明的抗體的CDR區(qū)內(nèi)的一個(gè)或多個(gè) 氨基酸殘基可以用來自相同側(cè)鏈家族的其他氨基酸殘基替換，并且可以使用本文所述的測(cè) 定法測(cè)試改變的抗體的保留功能（即，本文所給出的特性）。
[0113] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了一種抗體，其結(jié)合的表位與6G2或9C8抗體 基本上相同。在本發(fā)明中，結(jié)合與6G2或9C8抗體基本上相同的表位的抗體將分別稱為 6G2-樣或9C8-樣抗體。
[0114] 本發(fā)明的另一目的是一種分離的核酸序列，其編碼序列SEQ ID N0:13的重鏈可變 區(qū)。優(yōu)選地，所述核酸序列是 SEQ ID N0:17(CAG GIT CAG CTG CAG CAG TCT GGA GCT GAA CTG GTA MG CCT GGG GCT TCA GTG MG TTG TCC TGC AAG GCT TCT GGC TAC ACC TTC ACA AGC TAT GAT ATA MC TGG GTG AGG CAG AGG CCT GAA CAG GGA CTT GAG TGG ATT GGA TGG ATT TTT CCT GGA GAT GGT AGT ACT GAG TAC AAT GAG AAG TTC AAG GGC AAG GCC ACA CTG ACT ACA GAC AAA TCC TCC AGC ACA GCC TAC ATG CAG CTC AGC AGG CTG ACA TCT GAG GAC TCT GCT GTC TAT TTC TGT GCA AGG TGG GGT ATT ACG GCT TTC CCC CTT TTT GAC TAC TGG GGC CAA GGC ACC GCT CTC ACA GTC TCC TCA)〇
[0115] 本發(fā)明的另一目的是一種分離的核酸序列，其編碼序列SEQ ID N0:14的輕鏈可變 區(qū)。優(yōu)選地，所述核酸序列是 SEQ ID NO: 18 (GAC AIT GTG CTG ACC CAA TCT CCA GCT TCT TTG GCT GTG TCT CTA GGG CAG AGG GCC ACC ATC TCC TGC AGA GCC AGC GM AGT GTT GAT TAT GAT GGC GAT AGT TAT ATG MC TGG TAC CM CAG AM CCA GGA CAG CCA CCG AM CTC CTC ATC TAT GCT GCA TCC MT CTA GAA TCT GGG ATC CCT GCC AGG TTT AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC TTC ACC CTC MC ATT CAT CCT GTG GAG GAG GAG GAT GCT GCA ACC TAT TAC TGT CTG CAA AGT MT GAG GCT CCG TGG ACG TTC GGT GGA GGC ACC AAG CTG GM ATC AAA CGG)〇
[0116] 本發(fā)明的另一目的是一種分離的核酸序列，其編碼序列SEQ ID NO:15的重鏈可變 區(qū)。優(yōu)選地，所述核酸序列是 SEQ ID NO: 19 (GAC GTG GAG CTC GTG GAG TCT GGG GGA GGC TTA GTG MG CTT GGA GGG TCC CTA AAA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACT TTC AGT AGC TAT TAC ATG TCT TGG GTT CGC CAG ACT CCA GAG AAG AGG CTG GAG TTG GTC GCA GCC ATT MT AGT MT GGT GGT AGC ACC TAC TAT CCA GAC ACT GTG AAG GGC CGA TTC ACC ATC TCC AGA GAC MT GCC MG MC ACC CTG TAC CTG CM ATG AGC AGT CTG AAG TCT GAG GAC ACA GCC TTG TAT TAC TGT GCA AGA CAG GGG TAT GGT AAC TTC TTT GAC TAC TGG GGC CM GGC ACC ACT CTC ACA GTC TCC TCA)〇
[0117] 本發(fā)明的另一目的是一種分離的核酸序列，其編碼序列SEQ ID N0:16的輕鏈可變 區(qū)。優(yōu)選地，所述核酸序列是 SEQ ID NO: 20 (GAT GIT GTG ATG ACC CAA ACT CCA CTC TCC CTG CCT GTC AGT CTT GGA GAT CAA GCC TCC ATC TCT TGT AGA TCT AGT CAG AGC ATT GTA CAC AGT MT GGA MC ACC TAT TTA TAT TGG TAC CTG CAG AM CCA GGC CAG TCT CCA AAG CTC CTG ATC TAC AGG GTT TCC MC CGA TTT TCT GGG GTC CCA GAC AGG TTC AGT GGC AGT GGA TCA GGG ACA GAT TTC ACA CTC MG ATC AGC AGA GTG GAG GCT GAG GAT ATG GGA GTT TAT TAC TGC TTT CAA GGT ACA CAT GTT CCT CGG ACG TTC GGT GGA GGC ACC AAC TTG GM ATC AAA CGG)〇
[0118] 本發(fā)明的另一目的是包含編碼本發(fā)明的抗體抗-sPLA2-IIA的核酸序列的表達(dá)載 體。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的表達(dá)載體包含SEQ ID N0:17、SEQ ID N0:18、SEQ ID N0:19 和SEQ ID N0:20中的至少一個(gè)或具有與所述SEQ ID勵(lì)：17-20共享至少60%、70%、75%、 80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%的同一性的核酸序列的任何序列。
[0119] 本發(fā)明的另一目的是包含所述載體的分離的宿主細(xì)胞。所述宿主細(xì)胞可以用于重 組生產(chǎn)本發(fā)明的抗體。
[0120] 本發(fā)明的另一目的是產(chǎn)生本發(fā)明的所述抗體的雜交瘤細(xì)胞系。
[0121] 根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選雜交瘤細(xì)胞系保藏于法國國立微生物保藏中心（Collection Nationale de Culture de Microorganismes(CNCM))(Institut Pasteur, 25rue du Docteur Roux, 75014Paris):
[0122]

【權(quán)利要求】
1. 一種抗人SPLA2-IIA的分離的抗體，其中所述抗體的結(jié)合人SPLA2-IIA的Kd小于 9. KT10M0
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗人SPLA2-IIA的分離的抗體，其中重鏈的可變區(qū)包含下面 ⑶R中的至少一種： VH-CDRl:GYTFTS(SEQ ID NO:1); VH-CDR2:WIFP⑶GSTE(SEQ ID N0:2);和 VH-CDR3:WGITAFPLFDY(SEQ ID N0:3)， 或具有與SEQ ID NO: 1-3具有至少60%同一性的氨基酸序列的任何⑶R， 或其中輕鏈的可變區(qū)包含下面⑶R中的至少一種： VL-CDR1:RASESVDYD⑶SYMN(SEQ ID N0:4); VL-CDR2:AASNLES(SEQ ID N0:5);和 VL-CDR3:LQSNEAPWT(SEQ ID N0:6)， 或具有與SEQ ID N0:4-6具有至少60%同一性的氨基酸序列的任何⑶R。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的抗人SPLA2-IIA的分離的抗體，其中重鏈的可變 區(qū)包含如權(quán)利要求2中所定義的CDR中的至少一種且輕鏈的可變區(qū)包含如權(quán)利要求2中所 定義的⑶R中的至少一種。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的抗人SPLA2-IIA的分離的抗體，其中重鏈的可變 區(qū)包含下列 CDR:GYTFTS(SEQ ID N0:1)、WIFP⑶GSTE(SEQ ID N0:2)和WGITAFPLFDY(SEQ ID N0:3)并且輕鏈的可變區(qū)包含下列 CDR:RASESVDYD⑶SYMN(SEQ ID N0:4)、AASNLES(SEQ ID NO:5)和LQSNEAPWT (SEQ ID NO: 6)，或具有與所述SEQ ID NO:1-6具有至少60%同一性的 氨基酸序列的任何CDR。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的抗人SPLA2-IIA的分離的抗體，其中編碼重鏈可 變區(qū)的氨基酸序列是SEQ ID NO: 13且編碼輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列是SEQ ID NO: 14,或具 有與所述SEQ ID NO: 13-14具有至少60%同一性的氨基酸序列的任何⑶R。
6. 包含根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的抗人SPLA2-IIA的抗體的組合物。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的抗人SPLA2-IIA的抗體，其用于治療 SPLA2-IIA-相關(guān)的病況。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的抗人SPLA2-IIA的抗體用于檢測(cè)生物學(xué)樣品中的 SPLA2-IIA 的用途。
9. 一種體外診斷或預(yù)后分析法，其使用根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的抗人 SPLA2-IIA的抗體確定生物學(xué)樣品中SPLA2-IIA的存在。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的體外診斷或預(yù)后分析法，其中所述分析法是使用權(quán)利要求4 所述的抗體作為包被抗體并使用下列抗體作為顯示抗體的夾心ELISA，在作為顯示抗體的 抗體中： -重鏈的可變區(qū)包含下面⑶R中的至少一種： VH-CDRl:GFTFSS(SEQ ID NO:7); VH-CDR2:AINSNGGSTY(SEQ ID N0:8);和 VH-CDR3:QGYGNFFDY(SEQ ID N0:9)， 或具有與SEQ ID N0:7-9具有至少60%同一性的氨基酸序列的任何⑶R，或 -輕鏈的可變區(qū)包含下面⑶R中的至少一種： VL-CDRl:RSSQSIVHSNGNTYLY(SEQ ID NO:10); VL-CDR2:RVSNRFS(SEQ ID N0:11);和 VL-CDR3:FQGTHVPRT(SEQ ID N0:12), 或具有與SEQ ID NO: 10-12具有至少60%同一性的氨基酸序列的任何⑶R。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的體外診斷或預(yù)后分析法，其中所述顯示抗體的重鏈可變區(qū) 包含如權(quán)利要求10中所定義的CDR中的至少一種，并且所述顯示抗體的輕鏈可變區(qū)包含如 權(quán)利要求10中所定義的CDR中的至少一種。
12. 根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的體外診斷或預(yù)后分析法，其中所述顯示抗體的重鏈可 變區(qū)包含下列CDR:GFTFSS(SEQ ID N0:7)、AINSNGGSTY(SEQ ID N0:8)和QGYGNFFDY(SEQ ID N0:9)并且所述顯示抗體的輕鏈可變區(qū)包含下列CDR:RSSQSIVHSNGNTYLY(SEQ ID N0:10)、 RVSNRFS(SEQIDN0:ll)和FQGTHVPRT(SEQIDN0:12)，或具有與所述SEQIDN0:7-12具 有至少60%同一性的氨基酸序列的任何⑶R。
13. 根據(jù)權(quán)利要求10-12中任一項(xiàng)所述的體外診斷或預(yù)后分析法，其中編碼所述顯示 抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列是SEQ ID NO: 15,且編碼所述顯示抗體的輕鏈可變區(qū)的氨 基酸序列是SEQ ID NO: 16,或是具有與所述SEQ ID NO: 15-16具有至少60%同一性的氨基 酸序列的任何序列。
14. 一種試劑盒，其包含至少一種根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的抗人SPLA2-IIA的 抗體。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的試劑盒，其包含權(quán)利要求4所述的抗體和根據(jù)權(quán)利要求 10-12所述的顯示抗體。
16. -種表達(dá)載體，其包含SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO:20 中的至少一種，或包含具有與所述SEQ ID NO: 17-20具有至少60%同一性的核酸序列的任 何序列。
17. 保藏號(hào)為CNCM 1-4587和CNCM 1-4588的產(chǎn)生抗人SPLA2-IIA的抗體的雜交瘤細(xì) 胞系。
【文檔編號(hào)】C07K16/40GK104520332SQ201380026328
【公開日】2015年4月15日 申請(qǐng)日期:2013年3月22日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月23日
【發(fā)明者】G·朗博, E·瓦倫廷, M·雷恩諾 申請(qǐng)人:國家科學(xué)研究中心, 尼斯大學(xué)