重組融合蛋白的kex2剪切區(qū)域的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及含有KEX2區(qū)域的融合DNA構(gòu)建體，所述區(qū)域包含KEX2位點(diǎn)和緊鄰所述KEX2位點(diǎn)5′端的KEX2位點(diǎn)前序列；融合多肽；含有所述融合DNA構(gòu)建體的載體和細(xì)胞；用于從絲狀真菌細(xì)胞生產(chǎn)所需目標(biāo)蛋白的方法；和用于增強(qiáng)目標(biāo)蛋白從細(xì)胞的分泌和/或剪切的方法。
【專利說(shuō)明】重組融合蛋白的KEX2剪切區(qū)域
[0001 ] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2007年6月21日的、發(fā)明名稱為“重組融合蛋白的KEX2剪切區(qū)域”的中國(guó)專利申請(qǐng)200780025987.0 (PCT/US2007/014476)的分案申請(qǐng)。
[0002]對(duì)在聯(lián)邦政府資助的研究和開(kāi)發(fā)下所作發(fā)明的權(quán)利的聲明
[0003]本工作的一部分由美國(guó)國(guó)防高級(jí)研究計(jì)劃局(Defense Advanced ResearchProjects Agency, DARPA)合同號(hào)W911NF-05-C-0072資助。因此，美國(guó)政府可享有本發(fā)明中的某些權(quán)利。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0004]本發(fā)明涉及目標(biāo)蛋白，例如功能性抗體蛋白和工業(yè)酶從絲狀真菌的增強(qiáng)的分泌和剪切。本發(fā)明公開(kāi)了并入用于蛋白剪切(切割，cleavage)的KEX2區(qū)域的融合DNA構(gòu)建體、載體和融合多肽，以及生產(chǎn)目標(biāo)蛋白的方法。
【背景技術(shù)】
[0005]在真菌細(xì)胞中的蛋白質(zhì)分泌過(guò)程中，某些蛋白質(zhì)被KEX2剪切，KEX2是KEX2或” kexin”家族的絲氨酸肽酶的成員(EC3.4.21.61)。KEX2是高度特異的鈣依賴性內(nèi)肽酶，其在蛋白質(zhì)分泌的過(guò)程中剪切該蛋白質(zhì)底物中緊鄰一對(duì)堿性氨基酸(即，”KEX2位點(diǎn)”)C端的肽鍵。KEX2蛋白通常在其活性位點(diǎn)的組氨酸殘基附件包含半胱氨酸殘基并被對(duì)苯甲酸萊(p-mercuribenzoate)抑制。該組的最初成員，釀酒酵母(S.cerevisiae)的KEX2酶(Fuller 等 1989，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA86:1434-1438)在其分泌期間剪切 α -因子信息素和殺傷毒素前體。
[0006]融合多肽的生產(chǎn)已經(jīng)在包括大腸桿菌(E.coli)、酵母和絲狀真菌的多種生物中被報(bào)道。例如，牛凝乳酶已經(jīng)作為與全長(zhǎng)葡糖淀粉酶(GAI)的融合體在黑曲霉(Aspergillus niger)中生產(chǎn)(Ward 等 1990, Bio/technology8:435-440 ；USP6, 265, 204和USP6，590，078);人白細(xì)胞介素6 (hIL6)已經(jīng)作為與全長(zhǎng)黑曲霉(A.niger)葡糖淀粉酶(GAI)的融合體在構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)中生產(chǎn)(Contreras etal.，(1991)Biotechnology9:378-381);雞蛋白溶菌酶(Jeenes et al.，(1993)FEMSMicrobiol.Lett.107:267-273)和人乳鐵蛋白(Iactoferrin) (Ward et al., (1995)Bio/Technologyl3 =498-503)已經(jīng)作為與葡糖淀粉酶的1_498殘基的融合體在黑曲霉中生產(chǎn)；并且牛凝乳酶已經(jīng)作為與全長(zhǎng)天然α淀粉酶的融合體在黑曲霉中生產(chǎn)(Korman etal.， (1990) Curr.Genet.17:203-212),并作為與截短形式的米曲霉(A.0ryzae)葡糖淀粉酶的融合體在米曲霉(Aspergillus oryzae)中生產(chǎn)(Tsuchiya et al., (1994)Biosc1.Biotech.Biochem.58:895-899)。也參考 Shoemaker et al.,1981Bio/Technologyl:691-696 ；Nunberg et al.，(1984)Mol.Cell.Biol.4:2306-2315 和 Boel et al.，(1984)EMBO J.3:1097-1102。在這些融合蛋白的一些中，KEX2蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)(Lys-Arg)已經(jīng)被插入葡糖淀粉酶和目標(biāo)蛋白之間(例如，Contreras et al., 1991和Ward et al., 1995) ?本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn):當(dāng)KEX2識(shí)別位點(diǎn)已經(jīng)被操控為包含氨基酸KEX2位點(diǎn)前序列(pre-sequence)時(shí),蛋白分泌和/或蛋白剪切可能在融合蛋白中被增強(qiáng)。
[0007]具體的感興趣文獻(xiàn)包括:Wardet al., (2004) Appl.Environ.Microbiol.70:2567-2576 ；Goller et al.，(1998)Appl.Environ.Microbiol.64:3202-3208 ；La Grangeet al., (1996)Appl.Environ.Microbiol.62:1036-1044 ；Bergquist et al., (2002)Biochem.Biotechnol.100:165-176 ;Spencer et al., (1998)Eur.J.Biochem.258:107-112 ；Jalving et al., (2000)Appl.Environ.Microbiol.66:363-368) ；Brenner andFuller (1992)Proc.Natl.Acad.Sc1.89:922-926 ；Durand et al.，(1999)Appl.Microbiol.Biotechnol.52:208-214 ；Ahn et al.， (2004)Appl.Microbiol.Biotechnol.64:833-839 ；Gouka et al., (1997)Appl Microbiol Biotechnol.47:1-11 Broekhuijsen et al.,(1993)J.Biotechnol.31:135-145 ;MacKenzie et al., (1998)J.Biotechnol.63:137-146和公開(kāi)的專利申請(qǐng)20040018573和20050158825。美國(guó)專利號(hào)(USP) 4，816，567和美國(guó)專利號(hào)(USP)6，331，415也公開(kāi)了在重組宿主細(xì)胞中生產(chǎn)免疫球蛋白分子的方法。以上引用的文獻(xiàn)在此出于所有的目的被引入本文作為參考。
[0008]盡管有多種方法可用于工業(yè)酶和治療蛋白的生產(chǎn)，但仍然需求蛋白生產(chǎn)，特別是治療蛋白生產(chǎn)如抗體生產(chǎn)的可選方法，所述方法將產(chǎn)生相對(duì)快的工藝放大(scale up)時(shí)間和高水平的產(chǎn)生蛋白，具有有限的被病毒或其它外來(lái)試劑污染的風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明滿足了這一
需求。
[0009]發(fā)明概述
[0010]提供了融合DNA構(gòu)建體、載體、融合多肽、含有融合DNA構(gòu)建體的細(xì)胞，以及用于增強(qiáng)目標(biāo)蛋白從細(xì)胞中分泌和/或剪切的方法。更具體地，本發(fā)明包含的KEX2區(qū)域已經(jīng)被包括在融合多肽中，以提供用于從該融合多肽中剪切目標(biāo)蛋白。因此，本發(fā)明涉及用于蛋白剪切的KEX2區(qū)域。
[0011]在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及編碼融合多肽的融合DNA構(gòu)建體，其從所述構(gòu)建體的5'末端以可操作連接的方式包括:啟動(dòng)子；編碼信號(hào)序列的第一 DNA分子；編碼載體蛋白的第二 DNA分子；編碼KEX2區(qū)域的第三DNA分子，所述KEX2區(qū)域包含KEX2位點(diǎn)和緊鄰該KEX2位點(diǎn)5'端的KEX2位點(diǎn)前序列；和編碼目標(biāo)蛋白的第四DNA分子。在該實(shí)施方式的一些方面,本發(fā)明涉及載體,例如表達(dá)載體,其包含所述融合DNA構(gòu)建體，并且本發(fā)明的其它方面涉及用所述載體轉(zhuǎn)化或含有所述融合DNA構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。
[0012]在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及融合多肽，其從所述融合多肽的氨基端起包括:第一氨基酸序列，其包含發(fā)揮分泌序列功能的信號(hào)序列；包含載體蛋白的第二氨基酸序列；包含KEX2區(qū)域的第三氨基酸序列，所述KEX2區(qū)域包含KEX2位點(diǎn)和緊鄰所述KEX2位點(diǎn)N-端的KEX2位點(diǎn)前序列；和包含目標(biāo)蛋白的第四氨基酸序列。
[0013]在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及KEX2區(qū)域(X4X3X2X1B1B2),其包含KEX2位點(diǎn)(B1B2)和緊鄰所述KEX2位點(diǎn)N-端的KEX-2位點(diǎn)前序列(X4X3X2X1)。
[0014]而在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及在絲狀真菌宿主細(xì)胞中，特別是在木霉屬(Trichoderma)細(xì)胞中生產(chǎn)目標(biāo)蛋白的方法，包括:獲取含有依據(jù)本發(fā)明所述的融合DNA構(gòu)建體的絲狀真菌宿主細(xì)胞；和在允許目標(biāo)蛋白表達(dá)和分泌的適當(dāng)條件下培養(yǎng)所述絲狀真菌宿主細(xì)胞。在該實(shí)施方式的一些方面，目標(biāo)蛋白將被回收。在該實(shí)施方式的其它方面，目標(biāo)蛋白從融合多肽的剪切將好于相同目標(biāo)蛋白從缺少KEX2位點(diǎn)前序列的等價(jià)融合多肽的剪切。在該實(shí)施方式的其它方面，目標(biāo)蛋白從融合多肽的分泌將好于相同目標(biāo)蛋白從缺少KEX2位點(diǎn)前序列的等價(jià)融合多肽的分泌。
[0015]在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及識(shí)別目標(biāo)蛋白的增強(qiáng)分泌和/或剪切的方法，包括:a)改變親代融合多肽的KEX2位點(diǎn)前序列，所述親代融合多肽包含:信號(hào)序列；KEX2區(qū)域，其包含KEX2位點(diǎn)和在所述KEX2位點(diǎn)N-端緊鄰位置的KEX2位點(diǎn)前序列；和含有目標(biāo)蛋白的氨基酸序列，以產(chǎn)生除所述KEX2位點(diǎn)前序列外與所述親代融合多肽相同的一組測(cè)試融合多肽山)評(píng)估所述測(cè)試融合多肽和所述親代融合多肽通過(guò)絲狀真菌細(xì)胞的分泌；c)識(shí)別與所述親代融合多肽相比，具有增強(qiáng)的分泌和/或剪切的測(cè)試融合多肽。
[0016]在該實(shí)施方式的進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及識(shí)別優(yōu)化KEX2位點(diǎn)前序列的方法，其包括:測(cè)試數(shù)個(gè)如上述獲得的不同的測(cè)試融合多肽；和確定所述不同的測(cè)試融合多肽中哪一個(gè)具有較高的分泌和/或蛋白剪切，其中所述優(yōu)化KEX2位點(diǎn)前序列是具有最高分泌和/或蛋白剪切的測(cè)試融合多肽的改變的KEX2位點(diǎn)前序列。
[0017]附圖簡(jiǎn)述
[0018]當(dāng)與附圖一起閱讀時(shí)，以下詳細(xì)描述的某些方面被最好地理解。應(yīng)該強(qiáng)調(diào)，根據(jù)慣例，附圖的各個(gè)特征不是按比例的。相反地，出于清楚的目的，各個(gè)特征的尺寸被任意擴(kuò)大或縮小。附圖中包含以下圖:
[0019]圖1示意性地示出了依據(jù)本發(fā)明的融合多肽的實(shí)施方式，其包括載體蛋白、KEX2區(qū)域和目標(biāo)蛋白，其中所述載體蛋白被圖解為纖維二糖水解酶I (cel1biohydrolase I)(CBHl)核心/接頭，其 包含CBHl蛋白的催化結(jié)構(gòu)域和部分接頭區(qū)域，并且目標(biāo)蛋白被圖解為抗體輕鏈或重鏈。
[0020]圖2示出了用于融合多肽表達(dá)的pTrex4_her2輕鏈DNA2.0質(zhì)粒的譜圖。該質(zhì)粒包含:里氏木霉(Trichoderma reesei) cbhl啟動(dòng)子；編碼CBHl信號(hào)序列和載體蛋白的多核苷酸；緊鄰SpeI位點(diǎn)之后插入的KEX2區(qū)域,編碼被圖解為抗體(曲妥珠單抗(trastuzumab))輕鏈的目標(biāo)蛋白的多核苷酸；里氏木霉纖維二糖水解酶(cbhl)終止子；和amdS構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶標(biāo)記。
[0021]圖3A-E提供圖2的pTrex4-her2輕鏈DNA2.0質(zhì)粒的核苷酸序列(SEQ ID NO:103)(10885bp)。
[0022]圖4顯示如實(shí)施例1、2、3和4中進(jìn)一步描述的，含有KEX2區(qū)域序列的培養(yǎng)的里氏木霉細(xì)胞的上清液的蛋白質(zhì)印跡。泳道I表示分子量標(biāo)記(參見(jiàn)Blue Plus2, Invitrogen)。泳道2和3表示GGGKR變體(SEQ ID NO:5);泳道4表示GGGKRGGG變體(SEQ ID NO:7);泳道5表示本發(fā)明包含的VAVEKR變體(SEQ ID NO:9)KEX2區(qū)域；并且泳道6和7表示KRGGG變體(SEQ ID NO:2) ο
[0023]圖5顯示了如實(shí)施例5中進(jìn)一步描述的，含有本發(fā)明包括的KEX2區(qū)域的培養(yǎng)的里氏木霉細(xì)胞的上清液的蛋白質(zhì)印跡。泳道I表示如上述的分子量標(biāo)記。泳道2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 和 13 相應(yīng)地表示 VAV￡KR(SEQ ID NO:9), VAVffKR(SEQ ID NO:25)、VAVGKR(SEQ ID NO:26)、VAVRKR(SEQ ID NO:27)、VAVTKR(SEQ ID NO:28)、VAVVKR(SEQID NO:29)、VAVAKR(SEQ ID NO:30)、VAVLKR(SEQ ID NO:31)、VAVDKR(SEQ ID NO:32)、VAVNKR(SEQ ID NO:33), VAVYKR(SEQ ID NO:34), VAVHKR(SEQ ID NO:35)KEX2 區(qū)域。
[0024]圖6顯示如實(shí)施例5、6和7中進(jìn)一步描述的，含有KEX2區(qū)域序列的培養(yǎng)的里氏木霉細(xì)胞的上清液的蛋白質(zhì)印跡。泳道I和10表示分子量標(biāo)記,如上文所述。泳道2、3、4、5、
6、7、8、9、11、12、13、14、15 和 16 相應(yīng)地表示 MVEKR(SEQ ID NO:38), GAVEKR (SEQ ID NO:37),MAVEKR(SEQ ID NO:36),LAVEKR(SEQ ID NO:39),WAVEKR(SEQ ID NO:40),KAVEKR(SEQID NO:41), PAVEKR(SEQ ID NO:42)、MVEKR (SEQ ID NO:51), VAVEKR(SEQ ID NO:9)、HAYEKR (SEQ ID NO: 52)、QAVEKR (SEQ ID NQ:47) ,SAVEKR (SEQ ID NO:46)、NVISKR (SEQ IDNO:22)和 SDVTKR(SEQ ID NO:24)KEX2 區(qū)域。
[0025]圖7顯示如實(shí)施例5中進(jìn)一步描述的，含有KEX2區(qū)域序列的培養(yǎng)的里氏木霉細(xì)胞的上清液的蛋白質(zhì)印跡。泳道I表示分子量標(biāo)記，如上文所述。泳道2、3、4、5、6、7、8、9、10和 11 相應(yīng)地表示VAV￡KR(SEQ ID NO:9) ,VGVEKR(SEQ ID NO:56) ,VTVEKR(SEQ ID NO:65)、VEVEKR (SEQ ID NO: 55), VPVEKR (SEQ ID NO:62), VwVEKR (SEQ ID NO:67), VKVEKR (SEQ IDNO:58)、VEVEKR(SEQ ID NO:63), VVVEKR(SEQ ID NO:66)和 VIVEKR(SEQ ID NO:57)KEX2區(qū)域。
[0026]圖8顯示如實(shí)施例5中進(jìn)一步描述的，含有KEX2區(qū)域序列的培養(yǎng)的里氏木霉細(xì)胞的上清液的蛋白質(zhì)印跡。泳道ι-ll相應(yīng)地表000Q00000000000000000000Q0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000074)、VANEKR (SEQID NO:76)、VALEKR(SEQ ID NO:75)、VASEKR(SEQ ID NO:79)、VAREKR(SEQ ID NO:78)和VAPEKR(SEQ ID NO:83)KEX2 區(qū)域。
[0027]圖9顯示如實(shí)施例8中進(jìn)一步描述的，含有VAVEKR(SEQ ID N0:9)KEX2區(qū)域的培養(yǎng)的黑曲霉的上清液的SDS-PAGE凝膠。泳道I表示分子量標(biāo)記，Markerl2麗標(biāo)準(zhǔn)(Invitrogen)。泳道2、3和4表示3種轉(zhuǎn)化體并分別對(duì)應(yīng)于轉(zhuǎn)化體A10、All和A12。
[0028]定義
[0029]除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義相同的含義。Singleton，et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY ANDMOLECULAR BIOLOGY,2D ED.，John Wiley and Sons, New York(1994)和 Hale & Markham,THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, N.Y.(1991)為普通技術(shù)人員提供了本文使用的許多術(shù)語(yǔ)的一般意義。盡管如此，為了清楚和便于參考，某些術(shù)語(yǔ)在下文中被定義。
[0030]術(shù)語(yǔ)“重組”當(dāng)用于指代細(xì)胞、核酸、蛋白或載體時(shí)，表示該細(xì)胞、核酸、蛋白或載體已經(jīng)通過(guò)異源核酸或蛋白的引入或天然核酸或蛋白的改變而被修飾；或者該細(xì)胞衍生自被如此修飾的細(xì)胞。因此，例如，重組細(xì)胞表達(dá)在天然(非重組)形式的細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)的核酸或多肽，或表達(dá)否則被不正常表達(dá)、表達(dá)不足、過(guò)量表達(dá)或根本不表達(dá)的天然基因。
[0031]“基因”指的是涉及產(chǎn)生多肽的DNA片段，并包括編碼區(qū)之前和之后的區(qū)域，例如，啟動(dòng)子和終止子，以及各個(gè)編碼片段(外顯子)之間的間插序列(內(nèi)含子)。
[0032]術(shù)語(yǔ)“核酸”包括單鏈或雙鏈的DNA、RNA，及其化學(xué)修飾物。術(shù)語(yǔ)“核酸”和“多核苷酸”在本文中可以交換使用。由于遺傳密碼具有簡(jiǎn)并性，所以多于一個(gè)密碼子可被用于編碼特定的氨基酸，并且本發(fā)明包含編碼特定的氨基酸序列的多核苷酸。
[0033]術(shù)語(yǔ)“DNA構(gòu)建體”表示被可操控地連接到合適的控制序列的DNA序列，所述控制序列能夠?qū)崿F(xiàn)蛋白質(zhì)在合適宿主中的表達(dá)。這樣的控制序列可包括啟動(dòng)子以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄；任選的操縱子序列以控制轉(zhuǎn)錄；編碼mRNA上合適的核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列；增強(qiáng)子以及控制轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列。
[0034]術(shù)語(yǔ)“融合DNA構(gòu)建體”或“融合核酸”指的是從5'到3'包含多個(gè)多核苷酸序列(例如，編碼信號(hào)序列的DNA分子、編碼載體蛋白的DNA分子、編碼KEX2位點(diǎn)的DNA分子和編碼目標(biāo)蛋白的DNA分子)的核酸，所述多個(gè)多核苷酸序列被可操控地連接在一起并且編碼融合多肽。
[0035]“載體”指的是設(shè)計(jì)用來(lái)將核酸引入一種或多種細(xì)胞類型的多核苷酸序列。載體包括克隆載體、表達(dá)載體、穿梭載體、質(zhì)粒、曬菌體顆粒、表達(dá)框(cassettes)等。
[0036]“表達(dá)載體”指的是具有并入和表達(dá)異體細(xì)胞中的異源DNA片段的能力的載體。多種原核和真核表達(dá)載體可以購(gòu)買(mǎi)得到。
[0037]“啟動(dòng)子”是結(jié)合RNA聚合酶以啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄中涉及的調(diào)控序列。
[0038]術(shù)語(yǔ)“信號(hào)序列”指的是在蛋白氨基端的氨基酸序列，其將蛋白指引到分泌系統(tǒng)，用于從細(xì)胞分泌。信號(hào)序列在蛋白質(zhì)分泌之前從該蛋白質(zhì)上被剪切掉。在某些情況下，信號(hào)序列可被稱為“信號(hào)肽”或“前導(dǎo)肽”。信號(hào)序列的定義是功能性定義。成熟形式的細(xì)胞外蛋白缺少信號(hào)序列，其在分泌過(guò)程中被剪切掉。
[0039]“在轉(zhuǎn)錄控制下”是本領(lǐng)域內(nèi)公知的術(shù)語(yǔ)，其表示:通常為DNA序列的多核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄依賴于其被可操控地連接到有助于轉(zhuǎn)錄的起始或促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的元件。
[0040]“在翻譯控制下”是本領(lǐng)域內(nèi)公知的術(shù)語(yǔ)，其表示:在mRNA已經(jīng)形成后發(fā)生的調(diào)控過(guò)程。
[0041]術(shù)語(yǔ)“可操控地連接”指的是并列(juxtaposition),其中元件以允許它們功能上相關(guān)的方式排列。例如，如果啟`動(dòng)子控制編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則啟動(dòng)子被可操控地連接到該編碼序列。
[0042]術(shù)語(yǔ)“選擇標(biāo)記”指的是能夠在宿主中表達(dá)的蛋白質(zhì)，其使得易于選擇含有引入的核酸或載體的那些宿主?？蛇x擇標(biāo)記的實(shí)例包括，但不限于抗微生物劑(如，潮霉素、爭(zhēng)光霉素或氯霉素)和/或賦予代謝優(yōu)勢(shì)例如對(duì)宿主細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)優(yōu)勢(shì)的基因。
[0043]術(shù)語(yǔ)“蛋白”和“多肽”在本文中可以交換使用。用于氨基酸殘基的傳統(tǒng)單字母或三字母密碼在本文中被使用。
[0044]術(shù)語(yǔ)“載體蛋白”指的是來(lái)自天然分泌的真菌多肽的多肽序列或其功能部分。
[0045]與免疫球蛋白(Igs)互換使用的術(shù)語(yǔ)“抗體蛋白”指的是含有一種或多種與抗原特異性結(jié)合的多肽的蛋白質(zhì)。該術(shù)語(yǔ)包括任何同種型的抗體；保留與抗原的特異性結(jié)合的抗體的片段，包括但不限于Fab、Fv、scFv、Fd、Fab’、Fv、F(ab’ )2抗體；保留與抗原的特異性結(jié)合的抗體片段；單克隆抗體；嵌合抗體；人源化抗體；單鏈抗體、雙功能(即，雙特異性)雜合抗體以及含有抗體的抗原結(jié)合部分和非抗體蛋白的融合蛋白。
[0046]單體形式的抗體包含兩種不同類型的四個(gè)多肽鏈，所述兩種類型一個(gè)是重鏈，一個(gè)是輕鏈。不同類型的重鏈和輕鏈被識(shí)別。輕鏈在結(jié)構(gòu)上被分成兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，可變區(qū)(VL)和恒定區(qū)(CL)。重鏈也被分成不同的結(jié)構(gòu)域。例如，Y重鏈從氨基端開(kāi)始包括:可變區(qū)(VH)、恒定區(qū)(CHl)、鉸鏈區(qū)、第二恒定區(qū)(CH2)和第三恒定區(qū)(CH3)。
[0047]術(shù)語(yǔ)“等價(jià)融合多肽”指的是這樣的融合多肽:除KEX2位點(diǎn)前序列之外，其與參考融合多肽相比具有相同的氨基酸序列。如果除了 KEX2位點(diǎn)前序列中的差異之外，具有第一KEX2位點(diǎn)前序列的第一融合多肽與具有不同KEX2位點(diǎn)前序列的第二融合多肽具有相同的氨基酸序列，則所述第一融合多肽等價(jià)于所述第二融合多肽。
[0048]術(shù)語(yǔ)“衍生于”包括術(shù)語(yǔ)“起源于”、“獲得自”或“可獲得自”、和“分離自”。
[0049]“宿主株”或“宿主細(xì)胞”表示含有多核苷酸的表達(dá)載體或DNA構(gòu)建體的合適宿主，所述多核苷酸編碼多肽，尤其是本發(fā)明包含的重組融合多肽。在特定的實(shí)施方式中，宿主株可為絲狀真菌細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”包含細(xì)胞和原生質(zhì)體二者。
[0050]術(shù)語(yǔ)“絲狀真菌”指的是真菌亞門(mén)(subdivision Eumycotina)的所有絲狀形式(參見(jiàn)，Alexopoulos, C.J.(1962)，INTRODUCTORY MYCOLOGY, Wiley, New York)。這些真菌的特征是帶有細(xì)胞壁的營(yíng)養(yǎng)菌絲體，細(xì)胞壁包含幾丁質(zhì)、葡聚糖和其它復(fù)合多糖。本發(fā)明的絲狀真菌在形態(tài)上、生理上和遺傳上與酵母不同。絲狀真菌的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)是通過(guò)菌絲伸展，并且碳分解代謝是專性需氧的。
[0051]術(shù)語(yǔ)“培養(yǎng)”指的是在適當(dāng)?shù)臈l件下，在液態(tài)或固態(tài)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)一群微生物細(xì)胞。
[0052]關(guān)于多核苷酸或多肽的術(shù)語(yǔ)“異源”指的是在宿主細(xì)胞中不天然發(fā)生的多核苷酸或多肽。在一些實(shí)施方式中，蛋白是商業(yè)上重要的工業(yè)蛋白，并且在一些實(shí)施方式中，異源蛋白是治療蛋白。該術(shù)語(yǔ)意欲包含由天然發(fā)生的基因、突變基因和/或合成基因編碼的蛋白。
[0053]關(guān)于多核苷酸 或蛋白質(zhì)的術(shù)語(yǔ)“同源”指的是在宿主細(xì)胞中天然發(fā)生的多核苷酸或蛋白質(zhì)。
[0054]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“回收的”、“分離的(isolated) ”和“分離的(s印arated) ”，指的是從至少一種與其天然相關(guān)的組分中移去的蛋白質(zhì)、細(xì)胞、核酸或氨基酸。
[0055]如本文所用，用于指代細(xì)胞的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化的”、“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的”和“轉(zhuǎn)基因的”表示細(xì)胞具有并入其基因組的非天然(如，異源的)核酸序列或額外拷貝的天然(如，同源的)核酸序列，或具有貫穿多代保持的附加型質(zhì)粒。
[0056]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”指的是這樣的過(guò)程:通過(guò)該過(guò)程，多肽基于基因的核酸序列被產(chǎn)生。該過(guò)程包括轉(zhuǎn)錄和翻譯二者。
[0057]術(shù)語(yǔ)“糖基化”蛋白質(zhì)表示具有加入到蛋白質(zhì)上特定氨基酸殘基的寡糖分子的蛋白質(zhì)。
[0058]術(shù)語(yǔ)“非糖基化”蛋白質(zhì)是不具有連接于蛋白質(zhì)的寡糖分子的蛋白質(zhì)。
[0059]術(shù)語(yǔ)“引入”在插入核酸序列到細(xì)胞中的上下文中，表示“轉(zhuǎn)染”或“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)”，并包括指代核酸序列摻入真核或原核細(xì)胞，其中核酸序列可被摻入細(xì)胞的基因組(例如，染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體DNA)中、被轉(zhuǎn)化為自主復(fù)制子或被暫時(shí)表達(dá)(如，轉(zhuǎn)染的mRNA)。
[0060]術(shù)語(yǔ)“KEX2”指的是根據(jù)IUBMB酶命名法，具有被定義為EC3.4.21.61的活性的鈣依賴性內(nèi)肽酶。KEX2在蛋白分泌過(guò)程中切割緊鄰一對(duì)堿性氨基酸C-端的肽鍵(KEX2切割位點(diǎn))。
[0061]術(shù)語(yǔ)“KEX2區(qū)域”指的是連續(xù)的8到4個(gè)氨基酸殘基區(qū)域，其位于融合多肽中載體蛋白C-端和目標(biāo)蛋白N-端之間。KEX2區(qū)域包含KEX2位點(diǎn)和KEX2位點(diǎn)前序列(pre-sequence)。
[0062]術(shù)語(yǔ)“KEX2位點(diǎn)”指的是蛋白中兩個(gè)氨基酸的KEX2剪切基序。KEX2位點(diǎn)包含任意順序(如，KK、RR、KR或RK)的兩個(gè)連續(xù)堿性氨基酸(如，賴氨酸、組氨酸和/或精氨酸)。
[0063]術(shù)語(yǔ)“KEX2位點(diǎn)前序列”指的是緊接KEX2位點(diǎn)之前(即，緊鄰其N-端)的2到6個(gè)連續(xù)氨基酸[(X)n，其中η為2到6]。例如，如果ΚΕΧ2區(qū)域被定義為VAVEKR，則“KR”基序是該區(qū)域的ΚΕΧ2位點(diǎn)；η為4并且“VAVE”基序?qū)?yīng)于該區(qū)域的ΚΕΧ2位點(diǎn)前序列。
[0064]術(shù)語(yǔ)“變體”指的是與參考蛋白相比，含有一個(gè)或多個(gè)不同氨基酸的蛋白的區(qū)域。
[0065]術(shù)語(yǔ)“分泌蛋白”指的是在蛋白分泌過(guò)程中，從細(xì)胞中釋放的多肽的區(qū)域。在一些實(shí)施方式中，分泌蛋白是從本發(fā)明的重組融合多肽中釋放或切割的蛋白。
[0066]術(shù)語(yǔ)“分泌”指的是蛋白在宿主細(xì)胞中選擇性地跨膜移動(dòng)到細(xì)胞外空間和周圍介質(zhì)中。
[0067]術(shù)語(yǔ)“確定”、“測(cè)量”、“評(píng)估(evaluating)”、“評(píng)價(jià)(assessing) ” 和“測(cè)試(assaying) ”在本文可互換使用，以指代任何形式的測(cè)量，并包括確定元件存在與否。這些術(shù)語(yǔ)包括定量和/或定性測(cè)量。評(píng)價(jià)可以是相對(duì)的或絕對(duì)的。
[0068]“評(píng)估......的存在”包括確定某物存在的量，以及確定其是否存在。
[0069]其它術(shù)語(yǔ)的定義可貫穿整個(gè)說(shuō)明書(shū)出現(xiàn)。
[0070]詳述
[0071]在更詳細(xì)地描述示例性的實(shí)施方式之前，應(yīng)該理解本發(fā)明不限于所述的特定實(shí)施方式，因?yàn)樗鼈儺?dāng)然可能變化。也應(yīng)該理解，本文使用的術(shù)語(yǔ)只是出于描述特定實(shí)施方式的目的，而非意欲限制，因?yàn)楸景l(fā)明的范圍僅由所附權(quán)利要求書(shū)所限制。
[0072]在提供數(shù)值范圍的情`況下，應(yīng)該理解:在該范圍上限和下限之間的每一個(gè)中間
值-到下限的十分位(tenth of unit),除非另有明確說(shuō)明-也被具體公開(kāi)。在一個(gè)陳
述范圍中的任何陳述值或中間值和該陳述范圍中的任何其它陳述值或中間值之間的每一較小范圍包含在本發(fā)明中。這些較小范圍的上限和下限可獨(dú)立地包括在該范圍內(nèi)或被排除在該范圍外，并且下列每一范圍也包含在本發(fā)明中:一個(gè)限值包含在該較小范圍內(nèi)，兩個(gè)限值都不包含在該較小范圍內(nèi)，或兩個(gè)限值都包含在該較小范圍內(nèi)，并接受陳述范圍內(nèi)的任何具體排除的限值。在陳述范圍內(nèi)包含一個(gè)或兩個(gè)限值的情況下，排除那些被包含限值之一或兩者的范圍也包含在本發(fā)明中。
[0073]盡管與本文所述的方法和材料相似或等價(jià)的任何方法和材料可以被用于本發(fā)明的實(shí)施或測(cè)試中，現(xiàn)在描述示例性的和優(yōu)選的方法和材料。本文提到的所有出版物在此并入作為參考，以公開(kāi)并描述與引用出版物相關(guān)的方法和/或材料。
[0074]必須注意，如用在本文及所附權(quán)利要求書(shū)中，單數(shù)形式“一 (a) ”、“一 (an) ”和“該(the)”包括復(fù)數(shù)指代物，除非上下文另有明確說(shuō)明。因此，例如，對(duì)“一個(gè)基因(a gene)的指代”包括多數(shù)的這些候選物，并且對(duì)“該細(xì)胞(the cell)”的指代包括指代一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其等價(jià)物等等。
[0075]本文討論的出版物僅針對(duì)在本申請(qǐng)?zhí)峤蝗罩暗钠涔_(kāi)內(nèi)容而提供。本文中的任何內(nèi)容都不被解釋為承認(rèn):本發(fā)明由于在先發(fā)明而不具有先于這些出版物的資格。而且，所提供出版物的日期可能不同于實(shí)際
【公開(kāi)日】，其可能需要進(jìn)行單獨(dú)確認(rèn)。
[0076]融合多肽
[0077]如上文所指出，標(biāo)題融合多肽包括:a)信號(hào)序列；b)載體蛋白；c)KEX2區(qū)域，其包含:i)KEX2位點(diǎn)和ii)緊鄰KEX2位點(diǎn)N-端的KEX2位點(diǎn)前序列；和d)目標(biāo)蛋白。[0078]圖1示出本發(fā)明的標(biāo)題融合多肽。標(biāo)題多肽的各個(gè)部分(即，“信號(hào)序列”、載體蛋白、“KEX2區(qū)域”和“目標(biāo)蛋白”)僅僅是為了清楚和方便而被這樣標(biāo)記。應(yīng)該知道，標(biāo)題融合多肽也可被稱作“前蛋白(pro-protein) ”或“前體蛋白”，因?yàn)槠渫ǔ：性诜置谶^(guò)程中被剪切掉的N-端區(qū)域和被分泌的C-端區(qū)域。
[0079]信號(hào)序列和載體蛋白
[0080]標(biāo)題融合多肽的信號(hào)序列可以是促進(jìn)蛋白從絲狀真菌細(xì)胞分泌的任何信號(hào)序列。在特定的實(shí)施方式中，標(biāo)題融合多肽可包括已知從欲在其中產(chǎn)生該融合蛋白的絲狀細(xì)胞高度分泌的蛋白的信號(hào)序列。采用的信號(hào)序列對(duì)于欲在其中產(chǎn)生融合蛋白的細(xì)胞而言可以是內(nèi)源的或非內(nèi)源的。在特定的實(shí)施方式中，信號(hào)序列可包括在其N-端包含信號(hào)序列的“載體”，其中所述載體是內(nèi)源于細(xì)胞并且被細(xì)胞有效分泌的蛋白的至少N-端部分。
[0081]合適的信號(hào)序列和載體在本領(lǐng)域是已知的(參見(jiàn)，例如Ward et al, Bio/Technology19908:435-440 ；和 Paloheimo et al, Applied and EnvironmentalMicrobiology200369:7073-7082)。合適的信號(hào)序列和載體蛋白的實(shí)例包括纖維二糖水解酶I，纖維二糖水解酶II，內(nèi)切葡聚糖酶1、II和III，α -淀粉酶，天冬氨酰蛋白酶，葡糖淀粉酶，肌醇六磷酸酶，甘露聚糖酶(mannanase)，α和β葡萄糖苷酶，牛凝乳酶，人干擾素和人組織纖溶酶原激活物的那些，以及合成的共有真核信號(hào)序列，如Gwynne et al.，(1987)Bio/Technology5:713-719 中所述的那些。
[0082]在一些實(shí)施方式中，如果木霉屬(如里氏木霉(T.reesei))被用作宿主細(xì)胞，那么里氏木霉甘露聚糖酶I (Man5A或MANI)、里氏木霉纖維二糖水解酶II (Cel6A或CBHII)、內(nèi)切葡聚糖酶I (Ce17b或EGI)、內(nèi)切葡聚糖酶II (Cel5a或EGII)、內(nèi)切葡聚糖酶III (Cell2A或EGIII)、木聚糖酶I或II (XynIIa或XynIIb)、或里氏木霉纖維二糖水解酶I (Cel7a或CBHI)的信號(hào)序列或載體可被用于融合多肽中。
[0083]在其它實(shí)施方式中，如果曲霉屬(如黑曲霉)被用作宿主細(xì)胞，那么黑曲霉葡糖淀粉酶(GlaA)或α淀粉酶的信號(hào)序列或載體可被用于融合多肽中。黑曲霉和泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶具有相同的氨基酸序列。兩種形式的酶通常被認(rèn)為在培養(yǎng)上清液中。GAI是全長(zhǎng)形式(氨基酸殘基1-616)而GAII是包含氨基酸殘基1_512的天然蛋白水解片段。GAI已知折疊成由伸展的接頭區(qū)連接的兩個(gè)單獨(dú)結(jié)構(gòu)域。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域是471個(gè)殘基的催化結(jié)構(gòu)域(氨基酸1-471)和108個(gè)殘基的淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域(氨基酸509-616)，兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間的接頭區(qū)為36個(gè)殘基(氨基酸472-508)。GAII缺少淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域。參考 Libby et al., (1994)Protein Engineering?:1109_1114。在一些實(shí)施方式中，用作載體蛋白并包含信號(hào)序列的葡糖淀粉酶與曲霉屬或木霉屬葡糖淀粉酶的催化結(jié)構(gòu)域具有95%、96%、97%、98%和99%以上的序列同一性。術(shù)語(yǔ)“催化結(jié)構(gòu)域”指的是具有蛋白的催化活性的蛋白氨基酸序列的結(jié)構(gòu)部分或區(qū)域。
[0084]在某些實(shí)施方式中，信號(hào)序列和載體蛋白從相同的基因獲得。在一些實(shí)施方式中，信號(hào)序列和載體蛋白從不同的基因獲得。
[0085]載體蛋白可包括分泌多肽的全部或部分成熟序列。在一些實(shí)施方式中，使用全長(zhǎng)的分泌多肽。然而，分泌多肽的功能部分可被使用。如本文所用，分泌多肽的“部分”或其語(yǔ)法等價(jià)物表示截短 的分泌多肽，其保留折疊成正常構(gòu)型的能力，雖然所述構(gòu)型是截短的。
[0086]在一些實(shí)例中，分泌多肽的截短表示功能蛋白保留生物學(xué)功能。在一些實(shí)施方式中，使用分泌多肽的催化結(jié)構(gòu)域，盡管其它功能域可被使用，例如底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一種實(shí)施方式中，當(dāng)葡糖淀粉酶被用作載體蛋白(即，來(lái)自黑曲霉的葡糖淀粉酶)時(shí)，優(yōu)選的功能部分保留該酶的催化結(jié)構(gòu)域并包含氨基酸1-471 (參見(jiàn)，W003089614,如實(shí)施例10)。在另一實(shí)施方式中，當(dāng)CBH I被用作載體蛋白(即，來(lái)自里氏木霉的CBH I)時(shí)，優(yōu)選的功能部分保留該酶的催化結(jié)構(gòu)域。參考W005093073中圖2的SEQ ID NO:1，其中編碼里氏木霉CBHl信號(hào)序列、里氏木霉CBHl催化結(jié)構(gòu)域(也被稱作催化核心或核心結(jié)構(gòu)域)和里氏木霉CBHl接頭的序列被公開(kāi)。在一些實(shí)施方式中，CBHl載體蛋白——包含信號(hào)序列——與W005093073 中圖 2 的 SEQ ID NO:1 具有 95%、96%、97%、98%和 99% 以上的序列同一性。
[0087]一般地，如果載體蛋白是截短的蛋白，它是C-端截短的(即包含完整的N-端)?？蛇x地，載體蛋白可以是N-端截短的，或任選地在兩端都截短，留下功能部分。通常，含有載體蛋白的分泌蛋白部分包含50 %以上、70 %以上、80 %以上和90 %以上的分泌蛋白和優(yōu)選地含有分泌蛋白的N-端部分。在一些實(shí)施方式中，載體蛋白將包括除催化結(jié)構(gòu)域以外的接頭區(qū)。在本文實(shí)例的融合構(gòu)建體中，CBHI蛋白的部分接頭區(qū)被用在載體蛋白中。
[0088]如本文所用，含有發(fā)揮分泌序列功能的信號(hào)序列的第一氨基酸序列由第一 DNA分子編碼。含有載體蛋白的第二氨基酸序列由第二 DNA序列編碼。然而，如上文所述，信號(hào)序列和載體蛋白可以從相同的基因獲得。
[0089]KEX2 區(qū)域 [0090]KEX2區(qū)域包含KEX2位點(diǎn)(B1B2)和緊鄰所述KEX2位點(diǎn)N-端的KEX-2位點(diǎn)前序列((X)n = 2_6)。在一些實(shí)施方式中，KEX2區(qū)域提供在體內(nèi)、在氨基端將目標(biāo)蛋白從融合多肽剪切(分離)的方式。本發(fā)明包含的融合多肽的KEX2區(qū)域不是載體蛋白和目標(biāo)蛋白之間天然發(fā)生的區(qū)域。
[0091]KEX2切割位點(diǎn)一發(fā)生在KEX2區(qū)域的C-端，可被天然絲狀真菌蛋白酶(例如，天然曲霉屬KEXB樣蛋白酶或天然木霉屬KEX2蛋白酶)切割。目標(biāo)蛋白從依據(jù)本發(fā)明的融合多肽緊鄰KEX2位點(diǎn)下游被切割。
[0092]KEX2位點(diǎn)包含氨基酸序列I1B2”，其中B1和B2獨(dú)立為堿性氨基酸。優(yōu)選地，KEX2位點(diǎn)包括KK、KR、RK或RR中的任一，并且更優(yōu)選地為KR。
[0093]KEX2位點(diǎn)前序列包含氨基酸序列(X) n = 2_6，其中X是任意氨基酸且η為2到6，優(yōu)選為4。本文定義的ΚΕΧ2區(qū)域在載體蛋白中、在載體蛋白的C-端未被天然發(fā)現(xiàn)，所述載體蛋白構(gòu)成依據(jù)本發(fā)明的融合多肽。在一些實(shí)施方式中，ΚΕΧ2位點(diǎn)前序列是不同于載體蛋白C-端天然發(fā)生的連續(xù)(X)η = 2_6氨基酸殘基的氨基酸序列。然而，連續(xù)的(幻? = 2_6氨基酸殘基可在載體蛋白的其它部分發(fā)現(xiàn)，并且可連接有ΚΕΧ2位點(diǎn)(B1B2)，但是ΚΕΧ2區(qū)域不會(huì)連接到目標(biāo)蛋白的N-端。
[0094]在一些實(shí)施方式中，當(dāng)ΚΕΧ2位點(diǎn)前序列被定義為X4X3X2X1B1B2時(shí)，
[0095]a) X1、X2 和 X3 不是 G ;
[0096]b)如果X2和X3是G, X4是A,或X3是S,那么X1不是S ；
[0097]c)如果X3是A且X2是S，那么X4不是T ;或
[0098](1)X1 不是 D。
[0099]在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，KEX2區(qū)域是X4X3X2X1B1B2，其中B1B2是KR并且
[0100]BUpXdPX3 不是 G ;[0101]a)如果\和&是6，父4是六，或&是5，那么父1不是3;
[0102]b)如果X3是A且X2是S，那么X4不是T ;或
[0103]cMUi 不是 D。
[0104]在其它實(shí)施方式中，KEX2位點(diǎn)前序列被定義為X4X3X2X1，其中
[0105]a)X4 是 V、S、N、L 或K ;
[0106]a)X3 是 A、V、D、W、E 或P ;
[0107]b)X2 是丫、1、L 或 F ;且
[0108]CU1 是E、S、T 或 Y。
[0109]而在其它實(shí)施方式中，KEX2位點(diǎn)前序列被定義為X4X3X2X1，其中
[0110]&)父4是￥^或1^;
[0111]a)X3 是 A、V、D、W、E 或P ;
[0112]b)X2 是丫、1、L 或 F ;且
[0113]c)X1是E 或 Y。
[0114]而在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，X4X3X2X1KR KEX2區(qū)域可選自:X4是V ;X3是A ;X2是V J1是E或Y及其組合。
[0115]在一些實(shí)施方式中，KEX2位點(diǎn)前序列選自:VAVE(SEQ ID NO:84)、NVIS(SEQ IDNO:85)、SDVT (SEQ ID NO:86)、VAVY (SEQ ID NO:87)、LAVE (SEQ ID NO:88)、KAVE (SEQ IDNO:89)、VAIE (SEQ ID NO:90)、VALE (SEQ ID NO:91)、VAFE (SEQ ID NO:92)、VWVE (SEQ IDNO:93)、VEVE(SEQ ID NO:94)和 VPVE(SEQ ID NO:95)。
[0116]在一些實(shí)施方式中，KEX2位點(diǎn)前序列不是KSRS (SEQ ID NO:109)、SRIS (SEQ IDNO:111),GGGS(SEQ ID NO:110)、TSTY (SEQ ID NO:96)、ASIS(SEQ ID NO:97)、ATAS(SEQ IDNO:98)、TASQ (SEQ ID NO:99)、TASL (SEQ ID NO: 100)、SVIS (SEQ ID NO: 101)、NVIS (SEQID NO:85)、GGG、TSRD(SEQ ID NO: 102)、SPMD(SEQ ID NO:106)、DLGE(SEQ ID NO:107)或TPTA (SEQ ID NO:108)。
[0117]盡管優(yōu)選的KEX2區(qū)域被定義為X4X3X2X1B1B2,如上文所示，但KEX2位點(diǎn)前序列可以包含6個(gè)氨基酸殘基，在一些實(shí)施方式中，KEX2區(qū)域可包括一個(gè)或兩個(gè)更多的氨基酸殘基。在其它的實(shí)施方式中，KEX2位點(diǎn)前序列可包括僅2或3個(gè)氨基酸殘基(X3X2X1B1B2或X2X1B1B2^在本實(shí)施方式中，
[0118]a)X1、X2 和 X3 不是 G(如 GGGB1B2 或 GGB1B2)；
[0119]a)如果X2和X3是G，或X3是S，那么X1不是S (如SX2S或SGS)；
[0120]和
[0121]WX1 不是 D。
[0122]在一些實(shí)施方式中，與目標(biāo)蛋白從缺少KEX2位點(diǎn)前序列的等價(jià)融合多肽的剪切和/或分泌相比，KEX2位點(diǎn)前序列提供目標(biāo)蛋白從宿主細(xì)胞的增強(qiáng)剪切和/或分泌。
[0123]在一些實(shí)施方式中，KEX2位點(diǎn)前序列是優(yōu)化KEX2位點(diǎn)前序列。優(yōu)化KEX2前序列是本發(fā)明包含的KEX2前序列，但是與其它變體KEX2位點(diǎn)前序列相比，其提供從宿主細(xì)胞的更高或更有效的剪切或分泌。
[0124]在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明包含的融合多肽將包括優(yōu)化KEX2前序列作為KEX2前序列。優(yōu)化KEX2前序列可與任何信號(hào)序列、來(lái)自分泌蛋白的任何載體區(qū)域、任何KEX2位點(diǎn)或任何目標(biāo)蛋白一起使用。含有優(yōu)化KEX2位點(diǎn)前序列的標(biāo)題KEX2區(qū)域可以是非天然發(fā)生的。在某些實(shí)施方式中，含有優(yōu)化KEX2位點(diǎn)前序列的標(biāo)題KEX2區(qū)域未被發(fā)現(xiàn)于絲狀真菌細(xì)胞分泌的任何蛋白中。
[0125]目標(biāo)蛋白
[0126]目標(biāo)蛋白(或載體蛋白)可為可以從絲狀真菌細(xì)胞分泌的蛋白的任何部分，所述蛋白包括所謂的工業(yè)酶、治療蛋白、激素、結(jié)構(gòu)蛋白、血漿蛋白、食物添加劑和食品等。目標(biāo)蛋白可為異源或同源蛋白，并且可包括雜合多肽，所述雜合多肽包含部分或完整多肽的組合，每一所述多肽對(duì)于真菌表達(dá)宿主可為同源的或異源的。目標(biāo)分泌蛋白可從細(xì)菌(如桿菌屬各種(Bacillus species)和假單胞菌屬各種(Pseudomonas species))、真菌(如曲霉屬、木霉屬、腐殖霉屬(Humicola)或毛霉屬(Mucor)各種)、病毒(如，甲型或乙型肝炎、或腺病毒)、哺乳動(dòng)物(如，人或小鼠)和植物來(lái)源衍生。目標(biāo)蛋白包括蛋白的天然發(fā)生的等位基因變異，以及工程化的變異。
[0127]在一種實(shí)施方式中，目標(biāo)蛋白可以是酶，例如糖酶，如淀粉水解α-淀粉酶、堿性α-淀粉酶、淀粉酶、纖維素酶，葡聚糖酶、α-葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、半纖維素酶、戍聚糖酶(pentosanase)、木聚糖酶、轉(zhuǎn)化酶、乳糖酶、柚苷酶、果膠酶或支鏈淀粉酶；蛋白酶，如酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、無(wú)花果蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、肽酶、粗制凝乳酶、凝乳酶(rennin)、凝乳酶(chymosin)、枯草桿菌蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶或胰蛋白酶；顆粒淀粉水解酶，如葡糖淀粉酶或ct -淀粉酶；脂酶或酯酶，如甘油三酯酶、磷脂酶、胃前酯酶(pregastric esterase)、磷酸酶、肌醇六磷酸酶、酰胺酶、亞氨基酰基轉(zhuǎn)移酶(iminoacylase)、谷氨酰胺酶、溶菌酶或青霉素酰基轉(zhuǎn)移酶；異構(gòu)酶，如葡萄糖異構(gòu)酶；酚氧化酶，如漆酶；氧化還原酶，如氨基酸氧化酶、過(guò)氧化氫酶、氯過(guò)氧化物酶(chloroperoxidase)、葡萄糖氧化酶、輕留類脫氫酶(hydroxysteroid dehydrogenase)或過(guò)氧化物酶；裂解酶,如乙酰乳酸脫羧酶、天冬氨酸β_脫羧酶、延胡索酸酶(fumarese)或組氨酸酶(histadase);轉(zhuǎn)移酶,如環(huán)式糊精糖基轉(zhuǎn)移酶(cyclodextrin glyc`osyltranferase)或?；D(zhuǎn)移酶；或例如連接酶。在特定的實(shí)施方式中，蛋白可為氨基肽酶、羧基肽酶、幾丁質(zhì)酶、葡糖淀粉酶、α -淀粉酶、角質(zhì)酶(cutinase)、肌醇六磷酸酶、脫氧核糖核酸酶、α -半乳糖苷酶、β -半乳糖苷酶、β -葡萄糖苷酶、漆酶、甘露糖苷酶、葡聚糖變構(gòu)酶(mutanase)、果膠分解酶(pectinolytic enzyme) >多酚氧化酶、核糖核酸酶或轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。
[0128]在其它實(shí)施方式中，目標(biāo)蛋白可為治療蛋白(即，具有治療性生物活性的蛋白)。合適的治療蛋白的實(shí)例包括:促紅細(xì)胞生成素，細(xì)胞因子，如干擾素-α、干擾素、干擾素-Y、干擾素-O，和粒細(xì)胞-CSF，GM-CSF，凝血因子，如因子VII1、因子IX，和人蛋白C，抗凝血酶III，凝血酶，可溶性IgE受體α-鏈，免疫球蛋白，如免疫球蛋白G (IgG)、IgG片段、IgG融合體、IgM或IgA ;白細(xì)胞介素,尿激酶,類胰凝乳蛋白酶(chymase)和尿素胰蛋白酶抑制劑(urea trypsin inhibitor), IGF-結(jié)合蛋白，表皮生長(zhǎng)因子,生長(zhǎng)激素釋放因子，膜聯(lián)蛋白V融合蛋白，制管張素(angiostatin)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-2，髓系祖細(xì)胞抑制因子-1，護(hù)骨蛋白，ct-1-抗胰蛋白酶，甲胎蛋白(α-feto proteins),脫氧核糖核酸酶II (DNase II),人纖維蛋白溶酶原的三環(huán)(kringle) 3,葡糖腦苷脂酶，TNF結(jié)合蛋白I,促卵泡激素，細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4-1g，跨膜激活劑和鈣調(diào)控劑和親環(huán)蛋白配體，可溶TNF受體Fe融合物，胰高血糖素樣蛋白I和IL-2受體激動(dòng)劑。
[0129]在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，目標(biāo)蛋白是來(lái)自任何種類G、A、M、E或D的免疫球蛋白(參見(jiàn)USP4，816，567及其中引用討論免疫球蛋白結(jié)構(gòu)的參考文獻(xiàn))。在其它優(yōu)選的實(shí)施方式中，諸如單克隆抗體的抗體蛋白包括重鏈或輕鏈及其片段。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，人源化抗體是特別有興趣的目標(biāo)蛋白(如，曲妥珠單抗(赫塞汀(herceptin)))。優(yōu)選的單克隆抗體片段的一些具體實(shí)例是截短形式的重鏈以除去恒定區(qū)的一部分，如Fab片段，其中重鏈(Fd)缺少鉸鏈區(qū)和CH2及CH3結(jié)構(gòu)域；Fab'片段，其中重鏈包括鉸鏈區(qū)但缺少CH2和CH3結(jié)構(gòu)域；及F(ab' )2片段，其包含被鉸鏈區(qū)連接的Fab部分。(Venna et al.，(1998)J.1mmunological Methods216:165-181 和 Pennell and Eldin(1998)Res.Tmmunol.149:599-603)。也感興趣的是單鏈抗體(ScFv)和單結(jié)構(gòu)域抗體(如駱駝科動(dòng)物抗體)。
[0130]在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，依據(jù)本發(fā)明的融合多肽包括可操控連接的信號(hào)序列；載體蛋白；KEX2區(qū)域和目標(biāo)蛋白，如下文所示:
[0131]融合DNA構(gòu)律體和載體
[0132]在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了編碼如上文公開(kāi)的融合多肽的融合DNA構(gòu)建體，其從所述構(gòu)建體5'端起以可操控連接方式包括:啟動(dòng)子；編碼信號(hào)序列的第一 DNA分子；編碼載體蛋白的第二 DNA分子；編碼KEX2區(qū)域的第三DNA分子，所述KEX2區(qū)域包含KEX2位點(diǎn)和緊鄰該KEX2位點(diǎn)5'端的KEX2位點(diǎn)前序列；及編碼目標(biāo)蛋白的第四DNA分子。由于遺傳密碼已知，考慮到對(duì)標(biāo)題融合多肽的描述，這些核酸的設(shè)計(jì)與生產(chǎn)在技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)。在某些實(shí)施方式中，核酸可被密碼子優(yōu)化，用于融合多肽在特定宿主細(xì)胞中的表達(dá)。由于多種絲狀真菌的密碼子使用表是可得的，編碼標(biāo)題融合多肽的密碼子優(yōu)化的核酸的設(shè)計(jì)與生產(chǎn)將在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)。
[0133]啟動(dòng)子
[0134]用于指導(dǎo)標(biāo)題核酸`在絲狀真菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動(dòng)子的實(shí)例是從米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性ct -淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定α -淀粉酶(Korman et al (1990) Curr.Genetl7:203-212 ；Gines et al.，(1989)Gene79:107-117)、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)(Nunberg et al.，(1984)Mol.Cell Biol.4:2306-2315 ；Boel E.et al.，(1984)EMBO J.3:1581-1585)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖(triose phosphate)異構(gòu)酶、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酸胺酶(Hyner et al.，
(1983)Mol.Cell.Biol.3:1430-1439)、鍵抱霉(Fusarium venenatum)淀粉轉(zhuǎn)葡萄糖苷酶、尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶樣蛋白酶(W096/00787)、里氏木霉纖維二糖水解酶I (Shoemaker et al.(1984)EPA EP00137280)、里氏木霉纖維二糖水解酶I1、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶1、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I1、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II1、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶IV、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶1、里氏木霉木聚糖酶I1、里氏木霉木糖苷酶基因中獲得的啟動(dòng)子，以及NA2_tpi啟動(dòng)子(來(lái)自黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶基因的啟動(dòng)子的雜合體)；及其突變體、截短和雜合的啟動(dòng)子。也參考 Yelton et al., (1984)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA81:1470-1474 ；Mullaney etal., (1985)Mol.Gen.Genet.199:37-45 ;Lockington et al., (1986)Gene33:137-149 ;Macknight et al.，(1986)Cell46:143-147 ；Hynes et al.，(1983)Mol.Cell Biol.3:1430-1439ο 高等真核啟動(dòng)子，如 SV40 早期啟動(dòng)子(Barclay et al (1983)Molecular andCellular Biology3:2117-2130)也可以是有用的。啟動(dòng)子可為組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。一些優(yōu)選的啟動(dòng)子包括里氏木霉纖維二糖水解酶I或II，里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶1、II或III，和里氏木霉木聚糖酶II。
[0135]載述
[0136]標(biāo)題多核苷酸可存在于載體中，例如，噬菌體、質(zhì)粒、病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。在某些實(shí)施方式中，載體可為用于在絲狀真菌細(xì)胞中表達(dá)標(biāo)題融合多肽的表達(dá)載體。
[0137]用于重組蛋白表達(dá)的載體是本領(lǐng)域公知的(Ausubel,et al, Short Protocols inMolecular Biology,3rd ed.,Wiley & Sons, 1995 ；Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Second Edition, (1989)Cold Spring Harbor, N.Y.)。
[0138]依據(jù)本發(fā)明的融合DNA構(gòu)建體可以使用例如在EPO
【發(fā)明者】王華明, M·華德 申請(qǐng)人:金克克國(guó)際有限公司