結(jié)合血清白蛋白的蛋白的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及能夠結(jié)合血清白蛋白的氨基酸序列；涉及包含該氨基酸序列的蛋白和多肽，或基本上由該氨基酸序列組成的蛋白和多肽；涉及編碼該氨基酸序列、蛋白或多肽的核酸；涉及包含該氨基酸序列、蛋白和多肽的組合物，特別是藥物組合物；并且涉及該氨基酸序列、蛋白和多肽的應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】結(jié)合血清白蛋白的蛋白
[0001]本發(fā)明涉及能夠結(jié)合血清白蛋白的氣基酸序列；涉及包含該氣基酸序列的蛋白和多肽，或基本上由該氨基酸序列組成的蛋白和多肽；涉及編碼該氨基酸序列、蛋白或多肽的核酸；涉及包含該氨基酸序列、蛋白和多肽的組合物，特別是藥物組合物；并且涉及該氨基酸序列、蛋白和多肽的應(yīng)用。
[0002]本發(fā)明的其他方面，實(shí)施方案，優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用將通過(guò)本文進(jìn)一步描述變得清晰。
[0003]如果任何術(shù)語(yǔ)在本文沒(méi)有具體定義，這些術(shù)語(yǔ)具有在W02009/068627或W006/122787中給出的關(guān)于它們的定義。如果在本文中所用的任何術(shù)語(yǔ)在本文或在W02009/068627/W006/122787中沒(méi)有具體定義，那么它們具有在本領(lǐng)域的一般含義，對(duì)于此例如參考標(biāo)準(zhǔn)書籍。
[0004]能夠結(jié)合人血清白蛋白的氨基酸序列及其在多肽構(gòu)建體中增加治療相關(guān)蛋白和多肽的半衰期的應(yīng)用是本領(lǐng)域中已知的。
[0005]例如， 申請(qǐng)人:的W004/041865描述了針對(duì)血清白蛋白(和具體地針對(duì)人血清白蛋白)的納米抗體，所述納米抗體可以連接于其他蛋白(如針對(duì)需要的靶標(biāo)的一個(gè)或多個(gè)其他納米抗體)從而增加所述蛋白的半衰期。
[0006]國(guó)際申請(qǐng)W006/122787描述了許多針對(duì)(人)血清白蛋白的納米抗體。這些納米抗體包括稱為Alb-1 (在W006/122787中的SEQ ID NO: 52)的納米抗體及其人源化變體，如Alb-8(在 W006/122787 中的 SEQ ID NO:62)。[納米抗體:? 和納米抗體 是Ablynx N.V.的商標(biāo)]。此外，這些可以用于延長(zhǎng)治療用蛋白和多肽和其他治療用實(shí)體或結(jié)構(gòu)部分的半衰期。
[0007]到第一次提交本申請(qǐng)之日時(shí)，針`對(duì)(人)血清白蛋白的納米抗體用于延長(zhǎng)治療用結(jié)構(gòu)部分如納米抗體的半衰期的應(yīng)用已經(jīng)通過(guò)臨床試驗(yàn)的方式得到證實(shí)。例如，已經(jīng)在I期臨床試驗(yàn)中證實(shí)了 ALX-0141的安全性，耐受性，免疫原性和藥物代謝動(dòng)力學(xué)(PK)，所述ALX-0141是一種包括兩個(gè)針對(duì)RANK-L的納米抗體和一個(gè)針對(duì)人血清白蛋白的納米抗體的蛋白構(gòu)建體(在倫敦的歐洲風(fēng)濕病學(xué)年度代表大會(huì)(Annual European Congressof Rheumatology (EULAR)上由 Ablynx Ν.V.在 2011 年 5 月 27 日提交的數(shù)據(jù)))。此外，許多Ablynx N.V.的公開的專利申請(qǐng)?zhí)峁┝司哂性黾拥陌胨テ诘臉?gòu)建體的實(shí)例,所述構(gòu)建體包括一個(gè)或多個(gè)針對(duì)治療革巴標(biāo)的納米抗體和一個(gè)或多個(gè)針對(duì)血清白蛋白的納米抗體(如 Alb-8)。例如，參考 W004/041862, W02006/122786, W02008/020079, W02008/142164, W02009/068627 和 W02009/147248。
[0008]盡管已經(jīng)確定使用針對(duì)(人)血清白蛋白的納米抗體(如在W004/041865和W006/122787中所述的那些和具體地在W006/122787中所述的Alb-1的人源化變體)對(duì)于延長(zhǎng)納米抗體和其他治療用結(jié)構(gòu)部分和實(shí)體的半衰期提供了良好的和可廣泛使用的方法，但是這并不意味著技術(shù)人員不會(huì)得益于針對(duì)人血清白蛋白的進(jìn)一步改善的納米抗體的獲得，技術(shù)人員為此目的對(duì)所述納米抗體進(jìn)行處理。
[0009]本發(fā)明提供針對(duì)人血清白蛋白的這樣的改善的納米抗體(稱為“Alb-23” ;見SEQID NO:1)，以及該納米抗體的許多變體(在本文也稱為“Alb-23樣序列”或“Alb_23變體”，關(guān)于一些非限制性實(shí)例參見SEQ ID N0’s3-ll)，以及包含其的化合物，多肽和其他(蛋白)構(gòu)建體(如本文進(jìn)一步所述)。
[0010]改善的SEQ ID N0:1的納米抗體及其變體可以提供的超過(guò)在W004/041865和W006/122787中所述的納米抗體的優(yōu)勢(shì)通過(guò)本文進(jìn)一步描述變得清晰。例如，但不限于，這些優(yōu)勢(shì)可以包括
[0011]-提高的穩(wěn)定性(如通過(guò)測(cè)量Tm所確定的提高的熱穩(wěn)定性)；和/或
[0012]-和/或提高的貯存穩(wěn)定性，如例如在實(shí)施例5所述的SEC實(shí)驗(yàn)中所測(cè)量的)；和/或[0013]-在一些配制條件下降低的形成二聚體的傾向(例如，在一些水性制劑緩沖液中高濃度下-也見例如實(shí)施例5)。
[0014]此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)改善的SEQ ID NO:1的納米抗體及其變體特別適合用于延長(zhǎng)免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的半衰期，所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域包含超過(guò)一個(gè)二硫鍵，如屬于“VHH-1類”的VHH’ s和納米抗體(其如本文進(jìn)一步所述可以包括兩個(gè)或甚至三個(gè)二硫鍵)。例如，但不限于，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與包含根據(jù)W006/122787的結(jié)合血清白蛋白的納米抗體如“Alb-8”(在W006/122787中的SEQ ID NO:62)而不是SEQ ID NO:1的氨基酸序列的相應(yīng)多肽相比，包括一個(gè)或多個(gè)VHH-1類的治療用VHH’s/納米抗體和納米抗體Alb-23 (或Alb-23變體)的多肽在某些宿主或宿主細(xì)胞中可以具有更好的表達(dá)水平(和/或通常當(dāng)其表達(dá)、純化和/或制備/生產(chǎn)時(shí)其他的優(yōu)勢(shì)性質(zhì))。此外，這將通過(guò)本文進(jìn)一步的描述和實(shí)驗(yàn)部分變得清晰。
[0015]本發(fā)明的這些和其他優(yōu)勢(shì)，以及各個(gè)方面，實(shí)施方案，用途和應(yīng)用，將通過(guò)本文進(jìn)一步描述變得清晰。
[0016]已知免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域如納米抗體，VHH’s，(單)結(jié)構(gòu)域抗體，dAbs，IgNAR結(jié)構(gòu)域和微體(如例如在W000/29004中所述)可以在許多宿主細(xì)胞和宿主生物中表達(dá)，所述宿主細(xì)胞和宿主生物如細(xì)菌細(xì)胞如大腸桿菌(E.coli)，酵母菌株如畢赤酵母(Pichia)和釀酒酵母(Saccharomyces)，和各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞或細(xì)胞系。例如，參考EP0656946和EP0698097,以及各種Ablynx N.V.的公開的專利申請(qǐng)，如例如W004/041862, W02006/122786，W02008/020079, W02008/142164, W02009/068627 或 W02009/147248。
[0017]類似地，已知當(dāng)一個(gè)或多個(gè)針對(duì)治療靶標(biāo)的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域與針對(duì)(人)血清白蛋白的納米抗體(如在W004/041865和W006/122787中描述的那些)連接從而提供具有增加的半衰期(即，與單獨(dú)的治療用結(jié)構(gòu)域比較)的構(gòu)建體時(shí)，得到的多肽和構(gòu)建體也可以在許多宿主細(xì)胞和宿主生物如細(xì)菌細(xì)胞如大腸桿菌(E.coli)，酵母菌株如畢赤酵母和釀酒酵母，和各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞或細(xì)胞系中表達(dá)。再次參考W004/041865，W006/122787，W02010/056550和本文提及的來(lái)自Ablynx N.V.的各種公開的專利申請(qǐng)。
[0018]通常也已知所有的VHH’s和納米抗體包含在位置22的半胱氨酸殘基和在位置92的半胱氨酸殘基之間的至少一個(gè)二硫鍵(根據(jù)Kabat的編號(hào)方式,見Ablynx N.V.的專利申請(qǐng))。
[0019]盡管大多數(shù)VHH’s僅包含這樣的單個(gè)二硫鍵，但是還已知一些VHH’s包含共兩個(gè)(或在例外的情形中，三個(gè))二硫鍵。例如，被稱為“VHH-1型”或“VHH-1類”的一類VHH’ s和納米抗體通常在位置50的半胱氨酸殘基(⑶R2的第一個(gè)氨基酸殘基)和⑶R3中存在的半胱氨酸殘基之間具有第二個(gè)二硫鍵(所述VHH’s和納米抗體也通常在位置44-47具有序列基序EREG)。此外，來(lái)自駱駝的一些VHH’ s有時(shí)在⑶Rl中存在的半胱氨酸殘基和⑶R3存在的半胱氨酸殘基之間具有二硫鍵。
[0020]所述VHH-1型納米抗體的一些非限制性實(shí)例(在本文僅作舉例；可以在來(lái)自Ablynx N.V.的一些其他專利申請(qǐng)中發(fā)現(xiàn)針對(duì)其它靶標(biāo)的其他VHH-1型序列)是來(lái)自 W02009/068627 的序列 P23ILPMP37D5(SEQ ID NO:2490)和 P12ILPMP80F10(SEQ IDN0:1954)，來(lái)自TO2008/020079的序列PMP30A2(SEQ ID N0:419) ,PMP31C5 (SEQ ID N0:413)和 PMP30G11(SEQ ID NO: 416);和來(lái)自 TO2009/147248 的序列 RSVPMP5A2 (SEQ ID NO:262),RSVPMP5B2(SEQ ID NO:263)和 RSVPMP5C3(SEQ ID NO:264)。
[0021]都轉(zhuǎn)讓于Ablynx N.V.的未預(yù)先公開的美國(guó)申請(qǐng)61/388，172 (2010年9月30日提交并且標(biāo)題為“涉及c-Met的生物材料”和US61/451，869(2011年3月11日提交并且標(biāo)題為“涉及c-Met的生物材料”)描述了針對(duì)治療靶標(biāo)c-Met的VHH’s和納米抗體；并且這些VHH’ s和納米抗體中的一些(如US61/451, 869中的4E09, SEQ ID NO: 26，和這里的SEQID NO: 12，以及在US61/451，869中描述的4E09的一些變體)也屬于VHH-1類。
[0022]US61/388, 172和US61/451，869也描述了所述VHH-1類納米抗體可以與針對(duì)人血清白蛋白的納米抗體連接從而增加其半衰期(在US61/388，172和US61/451，869中所用的針對(duì)人血清白蛋白的納米抗體被稱為“Alb-11”并且在US61/451，869中在SEQ ID NO:5中給出。Alb-1I具有和Alb-8相同的氨基酸序列，其是在W006/122787中的SEQ ID NO:62)。包含Alb-1l和4E09的所述多肽的實(shí)例在US61/451, 869中的SEQ ID NO:9中給出。
[0023]盡管VHH-1型的VHH’s/納米抗體(或更一般地，包含兩個(gè)或三個(gè)二硫鍵的VHH’s/納米抗體)，以及包含其的多肽和其他蛋白構(gòu)建體(包括還包含至少一個(gè)針對(duì)血清白蛋白的納米抗體從而提供增加的半衰期的這樣的多肽)，可以在任何適合的宿主或宿主生物中表達(dá)，但是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)關(guān)于所 述VHH，納米抗體，多肽或構(gòu)建體獲得的表達(dá)水平可以明顯低于關(guān)于包含不屬于VHH-1類的VHH’ s或納米抗體(或更一般地，包含僅具有一個(gè)二硫鍵的VHH’ s/納米抗體)的類似/相當(dāng)?shù)腣HH’ S，納米抗體，多肽或構(gòu)建體獲得的表達(dá)水平。例如，但不限于，盡管關(guān)于包含Alb-8和一個(gè)或多個(gè)非VHH-1型的治療用納米抗體的多肽，在畢赤酵母(Pichia)中常規(guī)獲得了超過(guò)0.8g/l以上(如lg/Ι以上)的表達(dá)水平(再次參見Ablynx N.V.的一些公開的專利申請(qǐng))，但是發(fā)現(xiàn)對(duì)于包含抗_c_Met VHH-1型的納米抗體4E09(在US61/451，869中的SEQ ID NO: 26和本文的SEQ ID NO: 12)或其人源化的變體和Alb-8的多肽，難以獲得超過(guò)0.5g/l的表達(dá)水平(見下面的實(shí)驗(yàn)部分)。令人驚奇的是，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)當(dāng)在所述多肽中使用SEQ ID NO:1的納米抗體(即，替代Alb-8)時(shí)，可以獲得顯著更高的表達(dá)水平(見下面的實(shí)驗(yàn)部分)。
[0024]如所提及，在第一方面中，本發(fā)明涉及針對(duì)(人)血清白蛋白的氨基酸序列，其基本由下述氨基酸序列組成，或是下述氨基酸序列:
[0025]EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISG
[0026]SGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQ
[0027]GTLVTVSS[SEQ ID NO:1]
[0028]該氨基酸序列在本文中也稱為“Alb-23”或“本發(fā)明的氨基酸序列”。Alb-23是氨基酸序列“Alb-Ι”(來(lái)自 W006/122787 的 SEQ ID NO: 52，在W006/122787 中也稱為“PMP6A6”)的人源化形式。
[0029]為方便起見，圖1提供了 Alb-23與Alb-1和W006/122787的表1II中公開的Alb-1的人源化形式(在W006/122787中稱為“Alb_3”_ “Alb-10”，也見TO06/122787中的SEQID NO，s:57-64)的比對(duì)。Alb-1的氨基酸序列為:
[0030]AVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKEPEWVSSIS[0031 ] GSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLKPEDTAVYYCTIGGSLSRS
[0032]SQGTQVTVSS[SEQ ID NO:2]
[0033]在上述序列中，已經(jīng)以粗體和下劃線表示了 Albl和Alb-23之間的主要差異。這些是(關(guān)于根據(jù)Kabat的編號(hào)方式，見例如W02008/020079的表A-5至A-8 ;并且關(guān)于根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)單字母氨基酸符號(hào)給氨基酸殘基命名的每個(gè)字母，例如參見W02008/020079的表A-2):位置 5:V-L;位置 16:N-G;位置 44 和 45:EP-GP;位置 74-76:AKT-SKN;位置 83:K_R。
[0034]因此，在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及作為序列Alb-1(SEQ ID NO:2)的變體的氨基酸序列，所述變體包括:
[0035]⑴在位置44和45上的氨基酸基序GP ；
[0036](ii)在位置74-76上的氨基酸基序SKN ；
[0037](iii)氨基酸序 列為 SFGMS(SEQ ID NO:29)的 CDRl ；
[0038](iv)氨基酸序列為 SISGSGSDTLYADSVKG(SEQ ID NO:30)的 CDR2 ；
[0039](V)氨基酸序列為 GGSLSR(SEQ ID N0:31)的 CDR3 ；
[0040]并且其優(yōu)選地還包括
[0041](vi)在位置 16 的 G ;
[0042]并且其中優(yōu)選地(但不限于):
[0043](vii)位置83是R (但是可以任選地也是K ；
[0044]并且相對(duì)于在SEQ ID NO: 2中給出的序列，還包括(即除了在位置16，44和45，74-76和83上的前述氨基酸差異之外，其中在位置16和83的氨基酸差異是任選的但是優(yōu)選的)1-7個(gè)如1-5個(gè)其他的“氨基酸差異”(如在W02008/020079中所定義的)，其可以例如是一個(gè)或多個(gè)人源化取代(如在W02008/020079中所定義；也見例如表A-5至A-8)和/或其他取代(其中所述人源化或其他取代的非限制性實(shí)例是:位置1:A至E，位置14:P至A，或位置108:Q至L)。
[0045]類似地，本發(fā)明涉及作為序列Alb-23 (SEQ ID NO:1)的變體的氨基酸序列，所述變體包括:
[0046](ii)在位置44和45上的氨基酸基序GP ；
[0047](ii)在位置74-76上的氨基酸基序SKN ；
[0048](iii)氨基酸序列為 SFGMS(SEQ ID NO:29)的 CDRl ；
[0049](iv)氨基酸序列為 SISGSGSDTLYADSVKG(SEQ ID NO:30)的 CDR2 ；
[0050](V)氨基酸序列為 GGSLSR(SEQ ID N0:31)的 CDR3 ；
[0051]并且其優(yōu)選地還包括
[0052](vi)在位置 16 的 G ;
[0053]并且其中優(yōu)選地(但不限于):
[0054](vii)位置83是R (但是可以任選地也是K)；[0055]并且相對(duì)于在SEQ ID NO:1中給出的序列，還包括1_7個(gè)如1_5個(gè)其他的“氨基酸差異”(如在W02008/020079中所定義的)，其可以例如是一個(gè)或多個(gè)人源化取代(如在W02008/020079中所定義；也見例如表A-5至A-8)和/或其他取代(其中所述人源化或其他取代的非限制性實(shí)例是:位置1:A至E，位置14:P至A，或位置108:Q至L)。
[0056]如技術(shù)人員所清楚的，并且盡管Alb-23 (的應(yīng)用)在本發(fā)明的背景中通常是優(yōu)選的，但是在前述段落中描述的變體與Alb-23共享一些相同的氨基酸取代(即與Alb-1比較)，這是Alb-23的特征(也與在W006/122787中所述的Alb-1的人源化變體比較)，并且因此預(yù)期提供至少一些或甚至全部在本文中關(guān)于Alb-23所述的優(yōu)勢(shì)。為此原因，這些變體在本文中也稱為“Alb-23-樣序列”或“Alb-23變體”。
[0057]在一個(gè)具體，但非限制性的方面中，Alb-23變體是這樣的從而使得當(dāng)其在實(shí)施例5中所述的貯存穩(wěn)定性測(cè)定法中使用時(shí)(即作為還包含IGE045和9GS接頭的構(gòu)建體的部分)，在25°C貯存I個(gè)月后關(guān)于包含Alb-23變體的構(gòu)建體在SE-HPLC上的前鋒(在實(shí)施例5中給出的其他條件下)少于10%，優(yōu)選地少于5% ;和/或在40°C貯存I個(gè)月后，關(guān)于包含Alb-23變體的構(gòu)建體在SE-HPLC上的前鋒(在實(shí)施例5中給出的其他條件下)少于20%，優(yōu)選地少于15%。例如，參考在表8中的比較結(jié)果。
[0058]一些Alb-23樣序列的一些非限制性實(shí)例在SEQ ID NO’ s:3_11中給出。當(dāng)在多肽或蛋白構(gòu)建體的C-端末端提供結(jié)合白蛋白的納米抗體時(shí)，可以具體地使用SEQ IDN0’s6-ll的變體(或在C-端具有1-3個(gè)氨基酸殘基的其他Alb-23變體，所述氨基酸殘基可以分別獨(dú)立地選自天然存在的氨基酸殘基并且可以例如獨(dú)立地選自A，G，V，L和I)。在圖2中提供Alb-23與SEQ ID NO，s:6_ll的序列的比對(duì)。
[0059]Alb-23A:
[0060]AVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISG[0061 ] SGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQ
[0062]GTLVTVSS[SEQ ID NO:3]
[0063]Alb-23B:
[0064]AVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISG
[0065]SGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQ
[0066]GTQVTVSS [SEQ ID NO:4]
[0067]Alb-23C:
[0068]EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISG
[0069]SGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQ
[0070]GTQRVTVSS[SEQ ID NO:5]
[0071]Alb-23D:
[0072]EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISG
[0073]SGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQ
[0074]GTLVTVSSA[SEQ ID NO:6]
[0075]Alb-23E:
[0076]EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISG
[0077]SGSDTLYADSVGRFTISRDNSKNTL YLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQ[0078]GTLVTVSSAA[SEQ ID NO:7]
[0079]Alb-23F:
[0080]EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISG[0081 ] SGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQ
[0082]GTLVTVSSAAA[SEQ ID NO:8]
[0083]Alb-23G:
[0084]EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISG
[0085]SGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQ
[0086]GTLVTVSSG[SEQ ID NO:9]
[0087]Alb-23H:
[0088]EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISG
[0089]SGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQ
[0090]GTLVTVSSGG[SEQ ID NO:10]
[0091]Alb-231:
[0092]EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISG
[0093]SGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQ
[0094]GTLVTVSSGGG[SEQ ID NO:11]
[0095]因此，在一個(gè)具體但非限制性的方面中，本發(fā)明提供這樣的蛋白或多肽，其基本由氨基酸序列Alb-23 (或本文所述的Alb-23變體之一的氨基酸序列)組成。
[0096]如本文進(jìn)一步所述，氨基酸序列Alb-23和本文所述的其他Alb-23變體可以在作為結(jié)構(gòu)部分，結(jié)合單元或融合配偶體使用以增加治療用結(jié)構(gòu)部分的半衰期上具有優(yōu)勢(shì)，所述治療用結(jié)構(gòu)部分如多肽，蛋白，化合物(包括，但不限于小分子)或其他治療用實(shí)體。
[0097]因此，在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供多肽、蛋白、構(gòu)建體、化合物或其他化學(xué)實(shí)體，其包括氨基酸序列Alb-23 (或本文所述的Alb-23變體之一的氨基酸序列)和一個(gè)或多個(gè)其它氨基酸序列、(結(jié)合)結(jié)構(gòu)域、結(jié)合單元或其他結(jié)構(gòu)部分或化學(xué)實(shí)體或基本由氨基酸序列Alb-23 (或本文所述的Alb-23變體之一的氨基酸序列)和一個(gè)或多個(gè)其它氨基酸序列、(結(jié)合)結(jié)構(gòu)域、結(jié)合單元或其他結(jié)構(gòu)部分或化學(xué)實(shí)體組成。
[0098]具體地，本發(fā)明提供這樣的多肽、蛋白、構(gòu)建體、化合物或其他化學(xué)實(shí)體，其包括彼此直接或通過(guò)一個(gè)或多個(gè)適合的接頭或間隔臂適當(dāng)?shù)剡B接的氨基酸序列Alb-23 (或本文所述的Alb-23變體之一)和一個(gè)或多個(gè)(如一個(gè)或兩個(gè))治療用結(jié)構(gòu)部分(其可以是相同的或不同的，并且可以例如針對(duì)相同的靶標(biāo)或不同的靶標(biāo)，并且當(dāng)它們針對(duì)相同的靶標(biāo)時(shí)，可以針對(duì)所述靶標(biāo)的相同 的或不同的表位，部分，結(jié)構(gòu)域或亞基)。所述多肽、蛋白或構(gòu)建體可以例如但不限于是融合蛋白，如本文所述。
[0099]本發(fā)明還涉及所述多肽，蛋白，構(gòu)建體或化合物的治療應(yīng)用和包含所述多肽，蛋白，構(gòu)建體或化合物的藥物組合物。
[0100]在一個(gè)方面中，至少一個(gè)治療用結(jié)構(gòu)部分包括治療用蛋白，多肽，化合物，因子或其他實(shí)體或基本由治療用蛋白，多肽，化合物，因子或其他實(shí)體組成。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，治療用結(jié)構(gòu)部分針對(duì)需要的抗原或靶標(biāo)，能夠結(jié)合需要的抗原(并且具體地能夠特異性結(jié)合需要的抗原)，和/或能夠與需要的靶標(biāo)相互作用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)治療用結(jié)構(gòu)部分包括治療用蛋白或多肽或基本由治療用蛋白或多肽組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)治療用結(jié)構(gòu)部分包括結(jié)合結(jié)構(gòu)域或結(jié)合單元，如免疫球蛋白或免疫球蛋白序列(包括但不限于免疫球蛋白片段)，如抗體或抗體片段(包括但不限于ScFv片段)，或基本由其組成，或基本由另一種適合的蛋白支架組成，所述蛋白支架如蛋白A結(jié)構(gòu)域(如Affibodies?),淀粉酶抑肽(tendamistat),纖連蛋白，脂籠蛋白，CTLA-4, T-細(xì)胞受體,設(shè)計(jì)的錨蛋白重復(fù)序列，avimers和PDZ結(jié)構(gòu)域(Binz等，Nat.Biotech2005,卷23:1257),和基于DNA或RNA的結(jié)合結(jié)構(gòu)部分，包括但不限于DNA或RNA適體(Ulrich等，Comb ChemHigh Throughput Screen20069(8):619-32)。[0101]在另一個(gè)方面中，至少一個(gè)治療用結(jié)構(gòu)部分包括抗體可變結(jié)構(gòu)域，如重鏈可變結(jié)構(gòu)域或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域或基本由抗體可變結(jié)構(gòu)域，如重鏈可變結(jié)構(gòu)域或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域組成。
[0102]在一個(gè)優(yōu)選的方面中，至少一個(gè)治療用結(jié)構(gòu)部分包括或基本由下述組成:至少一個(gè)免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，如結(jié)構(gòu)域抗體，單結(jié)構(gòu)域抗體，“dAb”或納米抗體(如VHH，人源化VHH或駱駝源化VH)或IgNAR結(jié)構(gòu)域。
[0103]在一個(gè)具體實(shí)施方案中，至少一個(gè)治療用結(jié)構(gòu)部分包括或基本由下述組成:至少一個(gè)單價(jià)納米抗體或二價(jià)，多價(jià)，雙特異性或多特異性納米抗體構(gòu)建體。
[0104]包含Alb-23 (或Alb-23)變體和一個(gè)或多個(gè)治療用結(jié)構(gòu)部分的多肽，(融合)蛋白，構(gòu)建體或化合物可以通常如上述引用的現(xiàn)有技術(shù)(如W004/041865和W006/122787)所述進(jìn)行(制備和使用)，但是用Alb-23或Alb-23變體取代在所述現(xiàn)有技術(shù)中所述的增加半衰期的結(jié)構(gòu)部分。
[0105]包含Alb-23 (或Alb-23)變體和一個(gè)或多個(gè)治療用結(jié)構(gòu)部分的多肽，(融合)蛋白，構(gòu)建體或化合物通常地和優(yōu)選地具有與所述一個(gè)治療用結(jié)構(gòu)部分或多個(gè)治療用結(jié)構(gòu)部分本身相比增加的半衰期。
[0106]一般地，本文所述的構(gòu)建體或融合蛋白優(yōu)選地具有是相應(yīng)治療用結(jié)構(gòu)部分本身的半衰期的至少1.5倍，優(yōu)選地至少2倍，如至少5倍，例如至少10倍或超過(guò)20倍的半衰期(如在人或適合的動(dòng)物，如小鼠或食蟹猴中所測(cè)量的)。
[0107]此外，優(yōu)選地，任何這樣的融合蛋白或構(gòu)建體在人中具有與相應(yīng)治療用結(jié)構(gòu)部分本身的半衰期相比增加超過(guò)I小時(shí)，優(yōu)選地超過(guò)2小時(shí)，更優(yōu)選地超過(guò)6小時(shí)的半衰期，如增加超過(guò)12小時(shí)的半衰期。
[0108]此外,優(yōu)選地,任何融合蛋白或構(gòu)建體在人中具有超過(guò)I小時(shí)，優(yōu)選地超過(guò)2小時(shí)，更優(yōu)選地超過(guò)6小時(shí)，如超過(guò)12小時(shí)的半衰期，例如具有約I天，2天，I周，2周或3周的半衰期，優(yōu)選地不超過(guò)2個(gè)月的半衰期，盡管后者可以是較不重要的。
[0109]通常，半衰期可以定義為多肽在體內(nèi)的血清濃度減少50%(例如由于通過(guò)天然機(jī)制導(dǎo)致配體的降解和/或配體的清除或螯合)所需要的時(shí)間。具體地，半衰期可以在W02009/068627 中定義。
[0110]藥物代謝動(dòng)力學(xué)分析和半衰期確定的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的。詳情可見于 Kenneth, A 等:Chemical Stability of Pharmaceuticals:A Handbookfor Pharmacists (藥物的化學(xué)穩(wěn)定性:藥劑師手冊(cè))和Peters等，Pharmacokineteanalysis:A Practical Approach(藥物代謝動(dòng)力學(xué)分析:實(shí)踐方法)(1996)。還參考"Pharmacokinetics (藥物代謝動(dòng)力學(xué))〃，M Gibaldi&D Perron, Marcel Dekker 出版，第二修訂版(1982)。
[0111]如所提及，在一個(gè)方面中，可以將氨基酸序列Alb-23 (或本文所述的Alb-23變體中任一個(gè)的氨基酸序列)用于增加(一個(gè)或多個(gè))免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，如結(jié)構(gòu)域抗體，單結(jié)構(gòu)域抗體，“dAb’ s，，，VHH’ s或納米抗體(如VHH’ s’人源化VHH’ s或駱駝源化的VH’ s如駱駝源化的人VH’ s)的半衰期。
[0112]具體地，如本文所提及，氨基酸序列Alb-23 (或本文所述的Alb-23變體中任一個(gè)的氨基酸序列)的使用可以有利于增加包含兩個(gè)以上(如兩個(gè)或三個(gè))二硫鍵的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，如VHH’ s/VHH-Ι類的納米抗體的半衰期。
[0113]因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及這樣的多肽，構(gòu)建體或融合蛋白，其包含彼此直接或任選地通過(guò)一個(gè)或多個(gè)適合的接頭或間隔臂適當(dāng)連接的氨基酸序列Alb-23 (或本文所述的Alb-23變體之一)和一個(gè)或多個(gè)(如一個(gè)或兩個(gè))免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域序列。如本文所提及，在所述多肽，構(gòu)建體或融合蛋白中存在的每個(gè)這樣的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域可以獨(dú)立地是結(jié)構(gòu)域抗體，單結(jié)構(gòu)域抗體，“dAb’ ”或納米抗體(如VHH，人源化VHH或駱駝源化的VH，如駱駝源化的人VH);并且根據(jù)一個(gè)具體但非限制的方面，至少一個(gè)(并且至多所有的)這些免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域包含兩個(gè)或三個(gè)二硫鍵。
[0114]優(yōu)選地，每個(gè)這樣的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域是納米抗體；并且根據(jù)一個(gè)具體的但非限制性的方面，至少一個(gè)(并且至多所有的)這些免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域是VHH-1類的納米抗體。
[0115]例如，但不限于， 所述構(gòu)建體，融合蛋白或多肽可以包括:
[0116]-一個(gè)拷貝的Alb-23(或一個(gè)拷貝的本文所述的Alb-23變體之一)和一個(gè)這樣的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域序列；
[0117]-一個(gè)拷貝的Alb-23(或一個(gè)拷貝的本文所述的Alb-23變體之一)和兩個(gè)這樣的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域序列(其可以是相同或不同的)；
[0118]或甚至(盡管通常不需要并且較不優(yōu)選，這是因?yàn)榈玫降牡鞍赘?
[0119]-兩個(gè)拷貝的Alb-23(或兩個(gè)拷貝的本文所述的Alb-23變體，其可以是相同或不同的)和一個(gè)這樣的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域序列；
[0120]-兩個(gè)拷貝的Alb-23(或兩個(gè)拷貝的本文所述的Alb-23變體，其可以是相同或不同的)和兩個(gè)這樣的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域序列(其可以是相同或不同的)；
[0121]-一個(gè)拷貝的Alb-23和三個(gè)這樣的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域序列(其可以是相同或不同的)。
[0122]本發(fā)明的構(gòu)建體，融合蛋白或多肽的一些非限制性實(shí)例可以如下示意性地表示，其中“ [Alb-23] ”表示Alb-23 (或本文所述的Alb-23變體之一)，“[治療用結(jié)構(gòu)部分I] ”和“[治療用結(jié)構(gòu)部分2]”表示治療用結(jié)構(gòu)部分(其如提及可以彼此獨(dú)立地是免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域)，“表示適合的接頭(其是任選的)并且N-端在左手側(cè)，C-端在右手側(cè)。
[0123][Alb-23]-[治療用結(jié)構(gòu)部分I]
[0124][治療用結(jié)構(gòu)部分I]-[Alb-23]
[0125][Alb-23]-[治療用結(jié)構(gòu)部分1]_[治療用結(jié)構(gòu)部分I]
[0126][治療用結(jié)構(gòu)部分1]_[治療用結(jié)構(gòu)部分I]-[Alb-23][0127][治療用結(jié)構(gòu)部分I]-[Alb-23]_[治療用結(jié)構(gòu)部分I]
[0128][Alb-23]-[治療用結(jié)構(gòu)部分1]_[治療用結(jié)構(gòu)部分2]
[0129][治療用結(jié)構(gòu)部分1]_[治療用結(jié)構(gòu)部分2]-[Alb-23]
[0130][治療用結(jié)構(gòu)部分I]-[Alb-23]_[治療用結(jié)構(gòu)部分2]
[0131]當(dāng)在本發(fā)明的構(gòu)建體或多肽中存在兩個(gè)以上不同的治療用結(jié)構(gòu)部分(如兩個(gè)以上不同的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域)時(shí)，它們可以是相同或不同的，并且當(dāng)它們是不同時(shí)，它們可以針對(duì)相同的靶標(biāo)(例如，針對(duì)所述靶標(biāo)相同或不同的部分，結(jié)構(gòu)域，亞基或表位)或針對(duì)不同的靶標(biāo)。
[0132]因此，在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及包含Alb-23 (或本文所述的Alb-23變體之一)和至少一個(gè)其他納米抗體(如一個(gè)或兩個(gè)其他納米抗體，其可以是相同或不同的)的多特異性(和具體地雙特異性)納米抗體構(gòu)建體，其中所述至少一個(gè)其他納米抗體優(yōu)選地針對(duì)需要的靶標(biāo)(其優(yōu)選地是治療靶標(biāo))和/或是另一種用于或適合用于治療，預(yù)防和/或診斷目的的納米抗體。此外,Alb-23和其他納米抗體可以直接或任選地通過(guò)一個(gè)或多個(gè)適合的接頭或間隔臂適當(dāng)?shù)乇舜诉B接，并且根據(jù)一個(gè)具體但非限制性的方面，其他納米抗體的至少一個(gè)(并且多至所有)可以是VHH-1類的。
[0133]對(duì)于包含一個(gè)或多個(gè)納米抗體的多價(jià)和多特異性多肽和它們的制備的一般描述，也參考 Conrath 等，J.Biol.Chem.(生物化學(xué)雜志)，卷 276，10.7346-7350，2001;Muyldermans, Reviews in Molecular Biotechnology (分子生物技術(shù)綜述)74 (2001)，277-302;以及例如 W096/34103, TO99/23221, TO04/041862, TO2006/122786, TO2008/020079,W02008/142164 或 W 02009/068627。
[0134]本發(fā)明的一些具體多特異性和/或多價(jià)多肽的一些其他實(shí)例可以見于本文提及的Ablynx N.V.的申請(qǐng)。具體地，關(guān)于包含針對(duì)血清蛋白的用于增加半衰期的至少一個(gè)納米抗體的多價(jià)和多特異性構(gòu)建體，編碼其的核酸，包含其的組合物，前述的制備和前述的應(yīng)用的一般描述，參考上述提及的國(guó)際申請(qǐng)W004/041865和W006/122787 (本文所述的Alb-23和Alb-23變體通常可以類似于本文所述的延長(zhǎng)半衰期的納米抗體如Alb_8的方式使用)，以及參考在 W004/041862, W02006/122786, W02008/020079, W02008/142164 或W02009/068627中給出的所述構(gòu)建體的一般描述和具體實(shí)例。
[0135]在一個(gè)非-限制性實(shí)施方案中，在所述多肽或蛋白構(gòu)建體中存在的一個(gè)或多個(gè)其他納米抗體可以針對(duì)c-Met,并且可以具體地是針對(duì)c-Met的I型納米抗體?？梢栽谒龆嚯幕虻鞍讟?gòu)建體中存在的針對(duì)c-Met的納米抗體的一些非限制性實(shí)例可以例如見于本文提及的未預(yù)先公開的美國(guó)申請(qǐng)US61/388，172和US61/451，869。
[0136]可以在所述多價(jià)和/或多特異性多肽中存在的針對(duì)C-Met的一個(gè)特別優(yōu)選的I型納米抗體(僅次于Alb-23或Alb-23變體)是4E09 (在US61/451, 869中的SEQ ID NO: 26和本文的SEQ ID NO: 12)或其變體。4E09的這樣的變體可以通常在US61/451，869中所述(并且通常與4E09具有至少80%，如至少85%，例如至少90%以上如95%以上的序列同一性)并且優(yōu)選是這樣的從而使得(i)其與4E09競(jìng)爭(zhēng)與c-Met的結(jié)合(在適合的結(jié)合測(cè)定法中，如在實(shí)施例7中所述的alphascreen測(cè)定法中，但是使用4E09替代如在實(shí)施例7中所用的HGF);和/或(ii)其結(jié)合與4E09相同的在c-Met上的表位；和/或(iii)交叉阻斷(如在W02009/068627中定義)4E09與c-Met的結(jié)合。4E09的這樣的變體可以例如是4E09的人源化和/或序列-優(yōu)化的變體(如在US61/451，869中進(jìn)一步所述)?？梢栽谒龅鞍谆蚨嚯闹写嬖诘?E09的一些優(yōu)選，但是非限制性實(shí)例如下，其也在US61/451，869:04E09 (L49S);04E09(C50S/C100bG);04E09(C22A/C92S);A00790067=4E09(Q108L);A00790068=4E09(A74S，K83R, Q108L);A00790069=4E09(A74S, K83R, G88A, Q108L)和 A00790105=4E09(E1D, A74S,K83R, G88A, Q108L)中進(jìn)行描述，其中尤其優(yōu)選后者。4E09和這些變體的氨基酸序列在SEQID NO’ s:12-19 中給出。
[0137]因此，在一個(gè)具體但非限制性的方面中，本發(fā)明涉及這樣的多肽或蛋白構(gòu)建體，其包括與一種或兩種針對(duì)c-Met的納米抗體適當(dāng)?shù)剡B接(直接或通過(guò)一個(gè)或多個(gè)適合的接頭)的Alb-23 (優(yōu)選的)或Alb-23變體(如本文所述)或基本由其組成。如所提及，根據(jù)一個(gè)具體的，但非限制性的方面，所述針對(duì)c-Met的一種或兩種納米抗體包含兩個(gè)二硫鍵(即，是“I類”)。 [0138]具體地，本發(fā)明涉及這樣的多肽或蛋白構(gòu)建體，其包括與一種或兩種(優(yōu)選地僅一種)針對(duì)c-Met的納米抗體適當(dāng)?shù)剡B接(直接或通過(guò)一個(gè)或多個(gè)適合的接頭)的Alb-23(優(yōu)選的)或Alb-23變體(如本文所述)或基本由其組成，所述針對(duì)c-Met的納米抗體是4E09 (SEQ ID NO 12)或4E09的變體(如本文所述并且在US61/451，869中描述)，并且優(yōu)選地是4E09的人源化或序列優(yōu)化的變體并且更優(yōu)選地是A00790105(SEQ ID NO: 19)。
[0139]所述蛋白和多肽的一些具體但非限制性的實(shí)例是構(gòu)建體
[0140]Alb23-9GS-4E09, 4E09-9GS_Alb23，Alb23-9GS-A00790105,
[0141]A00790105-9GS-Alb23, Alb23-35GS_4E09, 4E09-35GS_Alb23，Alb23-35GS_A00790105，A00790105-35GS-Alb23 和
[0142]A00790105-35GS-A00790105-35GS-Alb23。這些的序列分別在 SEQ ID NO’s:20-28中給出。在這些之中，構(gòu)建體A00790105-9GS-Alb23(SEQ ID NO: 23)是特別優(yōu)選的，并且因此本發(fā)明的一個(gè)方面還涉及這樣的多肽，其與SEQ ID NO: 23的多肽具有至少80%，如至少85%，例如至少90%，如至少95%以上的序列同一性。
[0143]本發(fā)明還涉及這樣的核苷酸序列或核酸，其編碼本文所述的氨基酸序列，融合蛋白和構(gòu)建體。本發(fā)明還包括這樣的遺傳構(gòu)建體，其包含前述核苷酸序列或核酸以及用于本身已知的遺傳構(gòu)建體的一個(gè)或多個(gè)元件。遺傳構(gòu)建體可以是質(zhì)粒或載體的形式。此外，所述構(gòu)建體可以通常如在Ablynx N.V的公開的專利申請(qǐng)中描述,所述專利申請(qǐng)如例如W004/041862, W02006/122786, W02008/020079, W02008/142164 或 W02009/068627。
[0144]本發(fā)明還涉及這樣的宿主或宿主細(xì)胞，其包含所述核苷酸序列或核酸，和/或表達(dá)(或能夠表達(dá))本文所述的氨基酸序列，融合蛋白和構(gòu)建體。此外，所述宿主細(xì)胞可以通常如在Ablynx N.V的公開的專利申請(qǐng)中所述，所述專利申請(qǐng)如例如W004/041862，W02006/122786，W02008/020079, W02008/142164 或 W02009/068627。
[0145]本發(fā)明還涉及用于制備本文所述的氨基酸序列，融合蛋白或構(gòu)建體的方法，所述方法包括在使得宿主細(xì)胞產(chǎn)生或表達(dá)本文所述的氨基酸序列，融合蛋白或構(gòu)建體的條件下培養(yǎng)或維持本文所述的宿主細(xì)胞，并且任選地還包括分離這樣產(chǎn)生的氨基酸序列，融合蛋白或構(gòu)建體。此外，所述方法可以如通常在Ablynx N.V公開的專利申請(qǐng)中所述進(jìn)行，所述專利申請(qǐng)如例如 W004/041862, W02006/122786, W02008/020079, W02008/142164 或W02009/068627o[0146]本發(fā)明還涉及藥物組合物，其包含至少一種本文所述的氨基酸序列，融合蛋白或構(gòu)建體，和任選地至少一種藥用載體，稀釋劑或賦形劑。所述制劑，載體，賦形劑和稀釋劑可以通常如在Ablynx N.V.的公開的專利申請(qǐng)中所述，所述專利申請(qǐng)如例如W004/041862，WO2006/122786，W02008/020079, W02008/142164 或 W02009/068627。
[0147]然而，由于本文所述的氨基酸序列，融合蛋白或構(gòu)建體具有增加的半衰期，所以它們優(yōu)選地施用于循環(huán)。因此，它們可以以允許氨基酸序列，融合蛋白或構(gòu)建體進(jìn)入循環(huán)的任何適合方式進(jìn)行施用，如靜脈內(nèi)，通過(guò)注射或輸注，或以允許氨基酸序列，融合蛋白或構(gòu)建體進(jìn)入循環(huán)的任何其他適合的方式進(jìn)行施用(包括口服施用，皮下施用，肌內(nèi)施用，通過(guò)皮膚施用，鼻內(nèi)施用，通過(guò)肺施用等)。適合的施用方法和路徑是技術(shù)人員清楚的，并且也例如來(lái)自Ablynx N.V.的公開的專利申請(qǐng)的教導(dǎo)，所述專利申請(qǐng)如例如W004/041862，W02006/122786，W02008/020079, W02008/142164 或 W02009/068627。
[0148]因此，在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及用于預(yù)防和/或治療至少一種可以通過(guò)使用本文所述的融合蛋白或構(gòu)建體進(jìn)行預(yù)防或治療的疾病或病癥，所述方法包括向需要其的受試者施用藥用活性量的本發(fā)明的融合蛋白或構(gòu)建體，和/或包含其的藥物組合物。可以通過(guò)使用本文所述的融合蛋白或構(gòu)建體預(yù)防或治療的疾病和病癥通常與可以通過(guò)使用本發(fā)明的融合蛋白或構(gòu)建體中存在的治療用結(jié)構(gòu)部分預(yù)防或治療的疾病和病癥相同。
[0149]在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“預(yù)防和/或治療”不僅包括預(yù)防和/或治療疾病，通常還包括預(yù)防疾病的發(fā)作，減緩或逆轉(zhuǎn)疾病進(jìn)程，預(yù)防或減緩一個(gè)或多個(gè)與疾病相關(guān)癥狀的發(fā)作，減輕和/或緩解一個(gè)或多個(gè)與疾病相關(guān)的癥狀，減輕疾病和/或其任意相關(guān)癥狀的嚴(yán)重性和/或持續(xù)時(shí)間，和/或預(yù)防疾病和/或其任意相關(guān)癥狀嚴(yán)重性的進(jìn)一步增加，預(yù)防、降低或逆轉(zhuǎn)由疾病導(dǎo)致的任何生理學(xué)損傷，和通常任何有益于被治療的患者的藥理學(xué)作用。
[0150]待治療的受試者可以是任何溫血?jiǎng)游?，但是特別是哺乳動(dòng)物，和更特別地是人。如技術(shù)人員應(yīng)該清楚的，待治療 的受試者應(yīng)該具體地是患有本文中提及的疾病和病癥或處于本文中提及的疾病和病癥危險(xiǎn)中的人。
[0151]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于免疫治療，和特別是用于被動(dòng)免疫治療的方法，所述方法包括向患有本文中提及疾病和病癥或處于本文中提及疾病和病癥危險(xiǎn)中的受試者施用藥物活性量的本發(fā)明的融合蛋白或構(gòu)建體，和/或藥物活性量的包括所述本發(fā)明的融合蛋白或構(gòu)建體的藥物組合物。
[0152]按照適于預(yù)防和/或治療待預(yù)防或治療的疾病或病癥的治療方案，施用融合蛋白或構(gòu)建體和/或包含其的組合物。臨床醫(yī)生通常應(yīng)該能夠根據(jù)各種因素確定合適的治療方案，所述因素諸如待預(yù)防或治療的疾病或病癥，待治療疾病的嚴(yán)重性和/或其癥狀的嚴(yán)重性，待使用的具體的本發(fā)明的多肽，使用的具體給藥途徑和藥物制劑或組合物，患者的年齡、性別、體重、飲食、總體狀態(tài)，和臨床醫(yī)生熟知的類似因素。
[0153]通常，所述治療方案包括以一個(gè)或多個(gè)藥物有效量或劑量，施用一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的融合蛋白或構(gòu)建體，或一個(gè)或多個(gè)包含其的組合物。臨床醫(yī)生也可以根據(jù)以上列出的因素確定具體的待施用量或劑量。
[0154]通常，為了預(yù)防和/或治療本文提及的疾病和病癥，并根據(jù)待治療的具體疾病或病癥，使用的具體融合蛋白或構(gòu)建體的功效和/或半衰期，使用的具體給藥途徑和具體藥物制劑或組合物，通常應(yīng)該以這樣的量，在一天中連續(xù)地(例如通過(guò)輸注)作為單次日劑量或作為多個(gè)分劑量施用本發(fā)明的納米抗體和多肽，所述量是I克-0.01微克/kg體重/天，優(yōu)選地0.1克-0.1微克/kg體重/天，諸如約1，10，100或1000微克/kg體重/天。臨床醫(yī)生通常也能夠根據(jù)本文中提到的因素確定合適的日劑量。還應(yīng)該清楚的是，在具體情形中，例如，基于以上列出的因素和他的專業(yè)判斷，臨床醫(yī)生可以選擇偏離這些量。通常，可以由對(duì)基本通過(guò)相同途徑施用的針對(duì)相同靶標(biāo)的類似常規(guī)抗體或抗體片段通常施用的量獲得一些關(guān)于待施用量的指導(dǎo)，然而考慮親和性/親合力、功效、生物分布、半衰期和技術(shù)人員熟知的類似因素中的差別。
[0155]通常，在以上方法中，使用本發(fā)明的單一多肽。然而，組合使用兩種或更多種本發(fā)明的多肽也屬于本發(fā)明的范圍。
[0156]本發(fā)明的多肽還可以與一個(gè)或多個(gè)其他藥物活性化合物或成分組合使用，即作為組合的治療方案使用，其可以引起或可以不引起協(xié)同功效。而且，臨床醫(yī)生能夠基于以上列出的因素和他的專業(yè)判斷，選擇這些其他化合物或成分，以及合適的組合治療方案。
[0157]特別地，本發(fā)明的多肽可以與其他藥物活性化合物或成分組合使用，所述藥物活性化合物或成分用于或能夠用于預(yù)防和/或治療能夠用本發(fā)明的融合蛋白或構(gòu)建體預(yù)防或治療的疾病和病癥，且作為其結(jié)果，可以獲得或可以不獲得協(xié)同功效。
[0158]臨床醫(yī)生應(yīng)該清楚地，可以以關(guān)于所涉及的疾病或病癥本身已知的任何方式，確定和/或跟蹤按照本發(fā)明使用的治療方案的效力。臨床醫(yī)生還能夠，在適當(dāng)時(shí)和或在個(gè)案基礎(chǔ)上，改變或改進(jìn)具體的治療方案，從而獲得理想的治療效果，以避免、限制或減少不希望的副作用，和/或在 一方面獲得理想治療效果和另一方面避免、限制或減少不希望有的副作用之間獲得適當(dāng)?shù)钠胶狻?br> [0159]通常，應(yīng)該遵從治療方案，直到獲得理想的治療效果和/或盡量長(zhǎng)地維持理想治療效果。而且，這可以由臨床醫(yī)生確定。
[0160]待治療的受試者可以是任何溫血?jiǎng)游?，特別是哺乳動(dòng)物，和更特別是人。如技術(shù)人員應(yīng)該清楚的，待治療的受試者應(yīng)該特別是患有本文中提及的疾病和病癥或處于本文中提及的疾病和病癥危險(xiǎn)中的人。
[0161]本發(fā)明的其他方面，實(shí)施方案，優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用將通過(guò)本文進(jìn)一步的描述變得清晰。
[0162]現(xiàn)在將通過(guò)非限制性實(shí)驗(yàn)部分和附圖進(jìn)一步舉例說(shuō)明，其中:
[0163]-圖1是Alb-23(SEQ ID NO:1)與在W006/122787中描述的Alb-1及其各種人源化變體的比對(duì)；
[0164]-圖2是Alb-23(SEQ ID NO:1)與本文描述的Alb_23變體中的一些的比對(duì)；
[0165]-圖3顯示在本申請(qǐng)說(shuō)明書中提及的各種序列；
[0166]-圖4顯示使用SDS-PAGE分析由具有低(L=I)和高(H=超過(guò)I)拷貝數(shù)(CN)的表達(dá)盒的畢赤酵母克隆產(chǎn)生的A007900009的表達(dá)模式。
[0167]-圖5顯示使用SDS-PAGE分析由具有低(L=I)和高(H=超過(guò)I)拷貝數(shù)(CN)的表達(dá)盒的畢赤酵母克隆產(chǎn)生的A007900171的表達(dá)模式。
[0168]-圖6顯示使用SDS-PAGE分析由具有低(L=I)和高(H=超過(guò)I)拷貝數(shù)(CN)的表達(dá)盒的畢赤酵母克隆產(chǎn)生的A007900057和A007900058的表達(dá)模式。
[0169]-圖7顯示使用SDS-PAGE分析由具有低(L=I)和高(H=超過(guò)I)拷貝數(shù)(CN)的表達(dá)盒的畢赤酵母克隆產(chǎn)生的A007901219變體的表達(dá)模式。
[0170]-圖8顯示表達(dá)A00700171和A00701219的巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)的發(fā)酵樣品誘導(dǎo)結(jié)束時(shí)的SDS-Page分析(非還原條件)。將5 μ L無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基加載到凝膠上(泳道1-4)。泳道5-7包括以不同的量加載的對(duì)照納米抗體。左邊的泳道包括分子量標(biāo)記物。
[0171]實(shí)驗(yàn)部分:
[0172]實(shí)施例1:4Ε09纟目合Albll或Alb23的表汰樽式
[0173]表1提供了基于抗-c_Met4E09VHHl納米抗體結(jié)構(gòu)單元(SEQ ID NO: 12)組合Albll和Alb23的形式的綜述。將不同的納米抗體克隆到pPiczalpha表達(dá)載體中，并轉(zhuǎn)化到巴斯德畢赤酵母X-33菌株中(來(lái)自Invitrogen/RCT的商購(gòu)表達(dá)系統(tǒng))。在包含博萊霉素(zeocin)的平板上選擇克隆并且進(jìn)行qPCR以根據(jù)它們的拷貝數(shù)對(duì)克隆進(jìn)行分等級(jí)。在搖瓶實(shí)驗(yàn)中比較低拷貝和高拷貝數(shù)克隆之間的表達(dá)水平。關(guān)于包含Albll的形式觀察到在表達(dá)水平和拷貝數(shù)之間的逆相關(guān)(圖4和5)。與此相反，關(guān)于包含Alb23納米抗體的納米抗體形式觀察到在表達(dá)水平和拷貝數(shù)之間的正相關(guān)(圖6和7)。
[0174]表1:VHH14E09納米抗體結(jié)構(gòu)單元或序列優(yōu)化的形式通過(guò)9GS或35GS接頭與Albll或Alb23納米抗體結(jié)構(gòu)單元融合的5種形式的綜述。
[0175]
【權(quán)利要求】
1.多肽、蛋白、構(gòu)建體、化合物或其他化學(xué)實(shí)體，其包括直接或任選地通過(guò)一個(gè)或多個(gè)適合的接頭或間隔臂彼此適當(dāng)連接的氨基酸序列Alb-23 (SEQ ID NO:1)或Alb_23的變體和一個(gè)或多個(gè)(如一個(gè)或兩個(gè))其他氨基酸序列、結(jié)合結(jié)構(gòu)域、結(jié)合單元或其他結(jié)構(gòu)部分或化學(xué)實(shí)體，或基本由直接或任選地通過(guò)一個(gè)或多個(gè)適合的接頭或間隔臂彼此適當(dāng)連接的氨基酸序列Alb-23 (SEQ ID NO:1)或Alb_23的變體和一個(gè)或多個(gè)(如一個(gè)或兩個(gè))其他氨基酸序列、結(jié)合結(jié)構(gòu)域、結(jié)合單元或其他結(jié)構(gòu)部分或化學(xué)實(shí)體組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽、蛋白、構(gòu)建體、化合物或其他化學(xué)實(shí)體，其中所述Alb-23的變體包括: (i)在位置44和45上的氨基酸基序GP； (ii)在位置74-76上的氨基酸基序SKN； (iii)氨基酸序列為SFGMS(SEQ ID NO:29)的 CDRl ； (iv)氨基酸序列為SISGSGSDTLYADSVKG(SEQ ID NO:30)的 CDR2 ； (ν)氨基酸序列為 GGSLSR(SEQ ID NO:31)的 CDR3 ； 并且其優(yōu)選地還包括 (vi)在位置16上的G ;和/或(vii)在位置83上的R (優(yōu)選地在位置16上是G并且在位置83上是R)； 并且相對(duì)于在SEQ ID NO:1中給出的序列，還包括1-7個(gè)如1_5個(gè)其他的氨基酸差異。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽、蛋白、構(gòu)建體、化合物或其他化學(xué)實(shí)體，其包括直接或任選地通過(guò)一個(gè)或多個(gè)適合的接頭或間隔臂彼此適當(dāng)連接的氨基酸序列Alb-23 (SEQ IDNO:1)和一個(gè)或多個(gè)(如一個(gè)或兩個(gè))其他氨基酸序列、(結(jié)合)結(jié)構(gòu)域、結(jié)合單元或其他結(jié)構(gòu)部分或化學(xué)實(shí)體，或基本由直接或任選地通過(guò)一個(gè)或多個(gè)適合的接頭或間隔臂彼此適當(dāng)連接的氨基酸序列Alb-23 (SEQ ID NO:1)和一個(gè)或多個(gè)(如一個(gè)或兩個(gè))其他氨基酸序列、(結(jié)合)結(jié)構(gòu)域、結(jié)合單元或其他結(jié)構(gòu)部分或化學(xué)實(shí)體組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的多肽、蛋白、構(gòu)建體、化合物或其他化學(xué)實(shí)體，其中所述一個(gè)或多個(gè)(如一個(gè)或兩個(gè))其他氨基酸序列、(結(jié)合)結(jié)構(gòu)域、結(jié)合單元或其他結(jié)構(gòu)部分或化學(xué)實(shí)體是一個(gè)或多個(gè)(如一個(gè)或兩個(gè))治療用氨基酸序列、(結(jié)合)結(jié)構(gòu)域、結(jié)合單元、結(jié)構(gòu)部分或?qū)嶓w。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的多肽、蛋白或構(gòu)建體，其中所述一個(gè)或多個(gè)其他氨基酸序列、(結(jié)合)結(jié)構(gòu)域、結(jié)合單元或其他結(jié)構(gòu)部分或化學(xué)實(shí)體是一個(gè)或多個(gè)(如一個(gè)或兩個(gè))免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的多肽、蛋白或構(gòu)建體，其中所述一個(gè)或多個(gè)其他氨基酸序列、(結(jié)合)結(jié)構(gòu)域、結(jié)合單元或其他結(jié)構(gòu)部分或化學(xué)實(shí)體是一個(gè)或多個(gè)(如一個(gè)或兩個(gè))納米抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的多肽、蛋白或構(gòu)建體，其中至少一個(gè)(和至多全部)的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或納米抗體包含至少兩個(gè)二硫鍵。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的多肽、蛋白或構(gòu)建體，其中至少一個(gè)(和至多全部)的納米抗體是I類VHH納米抗體。
9.根據(jù)權(quán)利要求5-8中任一項(xiàng)所述的多肽、蛋白或構(gòu)建體，其中至少一個(gè)(和至多全部)的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或納米抗體是針對(duì)c-met。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的多肽、蛋白或構(gòu)建體，其中至少一個(gè)(和至多全部)針對(duì)c-met的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或納米抗體包含兩個(gè)二硫鍵。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的多肽、蛋白或構(gòu)建體，其中針對(duì)c-met的所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或納米抗體是4E09 (SEQ ID NO 12)或4E09的變體。
12.根據(jù)權(quán)利要求9-11中任一項(xiàng)所述的多肽、蛋白或構(gòu)建體，其中針對(duì)c-met的所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或納米抗體是A00790105 (SEQ ID NO: 19)。
13.根據(jù)權(quán)利要求11任一項(xiàng)所述的多肽、蛋白或構(gòu)建體，其為A00790105-9GS-Alb23 (SEQ ID NO:23)或與 SEQ ID NO: 23 具有至少 80%、如至少 85%、例如至少90%、如至少95%或更高序列同一性的多肽。
【文檔編號(hào)】C07K16/28GK103619878SQ201280030647
【公開日】2014年3月5日 申請(qǐng)日期:2012年6月14日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月23日
【發(fā)明者】布魯諾·東布雷克特, 彼得·肖特, 賽德里克·約瑟夫·內(nèi)奧特里·韋爾責(zé)肯 申請(qǐng)人:埃博靈克斯股份有限公司