專利名稱：一種利用牛毛制備抗氧化肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用牛毛制備抗氧化肽的方法，屬于生物材料的制備領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
自由基是指含有未配對 電子的原子、原子團(tuán)、離子或分子，具有高度的氧化活性，易與蛋白質(zhì)、脂類、脫氧核糖核酸(DNA)等生物大分子反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體的分子、細(xì)胞及組織器官的各種損傷，加速機(jī)體衰老并誘發(fā)各種慢性疾病。同時，自由基可引發(fā)食品的鏈?zhǔn)窖趸?，?yán)重影響食品的品質(zhì)及安全?？茖W(xué)研究表明，通過抗氧化物質(zhì)清除自由基，是延緩衰老、預(yù)防疾病、抑制食品氧化的有效手段。目前，廣泛使用的抗氧化劑主要是丁基羥基茴香醚(BHA)和2，6- 二叔丁基對甲苯酚(BHT)等化學(xué)合成的物質(zhì)。鑒于這些合成抗氧化劑對人體健康的潛在危害，在食品及醫(yī)藥領(lǐng)域的使用受到越來越多的限制。因此，尋找高效、安全的天然抗氧化劑已成為相關(guān)科研人員的研究熱點?？寡趸氖且活惥哂袃?yōu)良乳化特性，能有效清除自由基，抑制脂質(zhì)過氧化發(fā)生的肽類物質(zhì)。抗氧化活性主要依靠組成中的疏水性氨基酸、抗氧化性氨基酸和功能性官能團(tuán)，它們起到螯合金屬離子、清除自由基、促進(jìn)過氧化物分解等抗氧化作用。天然存在的抗氧化肽主要為肌肽和谷胱甘肽，這些肽類在自然界含量甚微，提取困難；人工合成抗氧化肽主要靠化學(xué)合成、酶法合成和重組DNA技術(shù)制備，這些途徑技術(shù)要求高，成本昂貴，實用價值低。利用蛋白質(zhì)水解制備抗氧化肽的方式目前較多被采用，該法條件溫和，過程可控，操作簡單，易于工業(yè)化生產(chǎn)。中國專利CN 100999752 B 一種源自膠原蛋白的抗氧化肽混合物及其制備方法和用途；中國專利CN 101748182 B 一種抗氧化肽的制備方法；中國專利CN101690604 B 一種米蛋白抗氧化肽的制備方法，公開了利用蛋白質(zhì)酶解制備抗氧化肽的技術(shù)。上述方法雖工藝簡單，但所用原料成本較高，高溫滅酶過程可能破壞抗氧化肽的結(jié)構(gòu)和功能，影響產(chǎn)品的質(zhì)量，而關(guān)土采用牛毛非酶水解制備抗氧化肽的研究國內(nèi)外的專利文獻(xiàn)和非專利文獻(xiàn)均未見有報道。牛毛是畜牧加工業(yè)的主要副產(chǎn)品，我國年生產(chǎn)量約70余萬噸。目前制革工業(yè)中廣泛采用的保毛脫毛技術(shù)，即會產(chǎn)生大量的廢棄牛毛。因牛毛纖維短、顏色深，大部分作為廢物丟棄而難以回收利用。但牛毛是一種優(yōu)良的可再生蛋白質(zhì)資源，其組成中富含胱氨酸、谷氨酸等活性氨基酸及二硫鍵、巰基等功能性官能團(tuán)。來自牛毛的抗氧化肽，安全性高、無毒副作用，通過利用牛毛開發(fā)具有清除自由基、延緩衰老作用的抗氧化肽不僅能豐富人們對毛蛋白加工利用基礎(chǔ)理論及其科學(xué)問題的認(rèn)識，有廣闊的利用前景，也能帶來顯著的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種利用牛毛制備抗氧化肽的方法，其特點是以畜牧加工業(yè)的副產(chǎn)品牛毛為原料，成本低廉，工藝簡單、條件溫和，在避免對環(huán)境污染的同時，加強(qiáng)了對牛毛中蛋白質(zhì)資源的綜合利用，實現(xiàn)固體廢物的高值轉(zhuǎn)化。所得抗氧化肽安全性高，無毒副作用，清除自由基能力強(qiáng)，具有很好的抗氧化功能。本發(fā)明的目的由以下技術(shù)措施實現(xiàn)，其中所述原料份數(shù)除特殊說明外，均為重量份數(shù)。利用牛毛制備抗氧化肽的方法如下步驟(I)將50份牛毛用水洗凈，浙水/除雜，在溫度35 65° C干燥4 8h,用濃度r5wt%的堿性溶液500 1000份浸泡O. 5 2h，經(jīng)水洗至中性，用濃度O. 05 0. 5M的無機(jī)酸溶液50(Γ1000份浸泡2 8h，再經(jīng)水洗至中性，浙去水分，晾干備用；(2)將上述處理后的牛毛，放入濃度O. 5 3wt %的堿性溶液500 1000份中，在攪拌狀態(tài)下，于溫度4(T80° C水解反應(yīng)l(T48h，得到牛毛蛋白水解液；(3)將上述牛毛蛋白水解液,在5000 10000rpm條件下離心10 30min,取上清液，用截留分子量< IOOOODa的透析袋在純水中透析12 48h，得到牛毛多肽溶液；(4)將牛毛多肽溶液在溫度35 45° C、真空度O. 05、. IMPa條件下低溫濃縮，濃縮液再在溫度_65'45° C、3 10Pa條件下冷凍干燥12 48h，得到牛毛抗氧化肽。所述無機(jī)酸為鹽酸、硫酸、硝酸和磷酸中的任一種。所述堿性溶液中的堿為MgO、CaO> NaOH> KOH> Na2CO3和NaHCO3中的至少一種。所述利用牛毛制備抗氧化肽的方法制備得到的抗氧化肽。所述抗氧化肽在保健品、化妝品、食品、醫(yī)藥產(chǎn)品中作為抗氧化成分應(yīng)用。性能測試采用總抗氧化能力檢測試劑(ABTS法)測定本發(fā)明產(chǎn)品的自由基清除能力；采用普魯士藍(lán)法測定本發(fā)明產(chǎn)品的還原能力；按照文獻(xiàn)方法測定本發(fā)明產(chǎn)品在花生油體系中的抗氧化能力。所用測定方法均為常規(guī)檢測手段，具體操作如下①ABTS法測定抗氧化肽的自由基清除能力(Zeng et al. Antibrowning andantimicrobial activities of the water-soluble extract from pine needles ofCedrus deodara. Journal of Food Science, 2011, 76, C318-C323.)將等量的7mM ABTS溶液與2. 45mM過硫酸鉀混合并置于暗處12 16小時以制備ABTS基液。用純水稀釋ABTS基液至其在波長734nm處吸光度為0. 700 ±0. 005，得ABTS工作液。取0. ImL不同濃度樣品液，與3. 9mL ABTS工作液混合，6min后測量其在734nm處的吸光度，純水做空白對照。自由基清除率按下式計算清除率(％)=(I-A樣品/A空白)X 100%②普魯士藍(lán)法測定抗氧化肽的還原能力(Zeng et al. Chemical composition,antimicrobial and antioxidant activities of essential oil from Gnaphliumaffine. Food and Chemical Toxicology, 2011, 49, 1322-1328.)取2. 5mL不同濃度的樣品溶液，同2. 5mL磷酸緩沖液(0. 2M，pH6. 6)和2. 5mL鐵氰化鉀溶液(I %，w/v)混勻，50° C保溫20min,迅速冷卻，再加入2. 5mL三氯乙酸(10%,w/v),混合后3000r/min離心IOmin,取上清液2. 5mL,加入2. 5mL純水和0. 5mL FeCl3溶液(0. 1% , w/v),混勻,測定其在700nm處的吸光度。吸光度越大,表示還原力越強(qiáng)。③測定抗氧化肽在花生油體系中的抗氧化能力(張紅梅等.花生衣紅抗氧化活性的研究·食品與生物技術(shù)學(xué)報，2005，24，83-87.)在花生油中添加不同量的樣品，置70° C恒溫烘箱中孵育，間隔24小時測定花生油的過氧化值(POV)。POV的測定方法取2mL油樣并加入20mL冰醋酸與氯仿的混合液(I 1，v/v)，及ImL飽和KI溶液，暗處放置3min后加入30mL純水，以淀粉溶液(l%,w/v)做指示劑，用O. OlM的Na2 S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，同時做空白試驗，POV值按下式計算
式中V1為試樣耗用Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(mL)，V2為空白耗用Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(mL)，Cs為Na2S2O3S準(zhǔn)溶液的濃度(mol/L)，m為試樣的質(zhì)量(g);0. 269為Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液ImL相當(dāng)于碘的克數(shù)。 本發(fā)明及其產(chǎn)品具有以下優(yōu)點(I)原料牛毛為畜牧加工業(yè)副產(chǎn)品，來源廣泛，成本低廉，不僅對牛毛資源的開發(fā)具有重要意義，而且實現(xiàn)了廢物的循環(huán)利用，促進(jìn)了農(nóng)副產(chǎn)品的高值轉(zhuǎn)化，減少了對環(huán)境的污染，變廢為寶。( 2 )制備工藝簡單，易于操作，產(chǎn)品不含有害成分，適合大規(guī)模生產(chǎn)。(3)抗氧化效果好，清除自由基能力強(qiáng)，安全性高，無毒副作用，分子量低，活性穩(wěn)定，易被人體吸收利用。廣泛用于保健品、化妝品、食品、醫(yī)藥領(lǐng)域，具有顯著的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。


圖I為實施例I中所制備牛毛抗氧化肽的ABTS自由基清除能力。圖2為實施例2中所制備牛毛抗氧化肽的還原能力。圖3為實施例3中所制備牛毛抗氧化肽在花生油體系中的抗氧化能力。
具體實施例方式下面通過實施例對本發(fā)明進(jìn)行具體的描述，有必要在此指出的是本實施例只用于對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，不能理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員可以根據(jù)上述本發(fā)明的內(nèi)容作出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。實施例I :(I)將50份牛毛用水洗凈,浙水/除雜,在溫度35° C干燥8h,用濃度lwt%的NaOH溶液500份浸泡O. 5h，經(jīng)水洗至中性，用濃度O. 05M的鹽酸溶液1000份浸泡8h，再經(jīng)水洗至中性，浙去水分，晾干備用；(2)將上述處理后的牛毛，放入濃度O. 5wt%的NaOH溶液500份中，在攪拌狀態(tài)下，于溫度40° C水解反應(yīng)48h，得到牛毛蛋白水解液；(3)將上述牛毛蛋白水解液在5000rpm條件下離心30min,取上清液,用截留分子量< IOOOODa的透析袋在純水中透析48h，得到牛毛多肽溶液；(4)將牛毛多肽溶液在溫度35° C、真空度O. 05MPa條件下低溫濃縮，濃縮液再在溫度-65° C、3Pa條件下冷凍干燥12h，得到牛毛抗氧化肽。所制備牛毛抗氧化肽的ABTS自由基清除能力的結(jié)果詳見圖I所示。實施例2:(I)將50份牛毛用水洗凈，浙水/除雜，在溫度50° C干燥6h，用濃度2. 5wt%的NaCO3溶液700份浸泡Ih，經(jīng)水洗至中性，用濃度O. 3M的硫酸溶液700份浸泡5h，再經(jīng)水洗至中性，浙去水分，晾干備用；(2)將上述處理后的牛毛，放入濃度I. 5wt%的KOH溶液700份中，在攪拌狀態(tài)下，于溫度60° C水解反應(yīng)24h，得到牛毛蛋白水解液；(3)將上述牛毛蛋白水解液在8000rpm條件下離心20min,取上清液,用截留分子量彡IOOOODa的透析袋在純水中透析36h，得到牛毛多肽溶液；(4)將牛毛多肽溶液在溫度40° C、真空度 O. OSMPa條件下低溫真空濃縮，濃縮液再在溫度-55° C、5Pa條件下冷凍干燥24h，得到牛毛抗氧化肽。
所制備牛毛抗氧化肽的還原能力如圖2所示。實施例3 (I)將50份牛毛用水洗凈,浙水/除雜,在溫度65° C干燥4h,用濃度5wt%的NaHCO3溶液1000份浸泡2h，經(jīng)水洗至中性，用濃度O. 5M的硝酸溶液500份浸泡2h，再經(jīng)水洗至中性，浙去水分，晾干備用；(2)將上述處理后的牛毛，放入濃度3wt%的Na2CO3溶液1000份中，在攪拌狀態(tài)下，于溫度80° C水解反應(yīng)10h，得到牛毛蛋白水解液；(3)將上述牛毛蛋白水解液在IOOOOrpm條件下離心lOmin，取上清液，用截留分子量彡IOOOODa的透析袋在純水中透析12h，得到牛毛多肽溶液；(4)將牛毛多肽溶液在溫度45° C、真空度O. IMPa條件下低溫真空濃縮，濃縮液再在溫度-45° C、IOPa條件下冷凍干燥48h，得到牛毛抗氧化肽。所制備牛毛抗氧化肽在花生油體系中的抗氧化能力如圖3所示。
權(quán)利要求
1.一種利用牛毛制備抗氧化肽的方法，其特征在于該方法包括以下步驟，按重量份計為 (1)將50份牛毛用水洗凈，浙水/除雜，在溫度35 65°C干燥4 8h，用濃度I 5wt%的堿性溶液50(Tl000份浸泡0. 5^2h,經(jīng)水洗至中性，用濃度0. 05、. 5M的無機(jī)酸溶液500^1000份浸泡2 8h，再經(jīng)水洗至中性，浙去水分，晾干備用； (2)將上述處理后的牛毛，放入濃度0.5^3wt%的堿性溶液500 1000份中，在攪拌狀態(tài)下，于溫度40 80° C水解反應(yīng)l(T48h，得到牛毛蛋白水解液； (3)將上述牛毛蛋白水解液，在500(Tl0000rpm條件下離心l(T30min，取上清液，用截留分子量< IOOOODa的透析袋在純水中透析12 48h，得到牛毛多肽溶液； (4)將上述牛毛多肽溶液在溫度35 45°C、真空度0.05、. IMPa條件下低溫濃縮，濃縮液在溫度_65'45° C、3 10Pa條件下冷凍干燥12 48h，得到牛毛抗氧化肽。
2.如權(quán)利要求I所述利用牛毛制備抗氧化肽的方法，其特征在于無機(jī)酸為鹽酸、硫酸、硝酸和磷酸中的任一種。
3.如權(quán)利要求I所述利用牛毛制備抗氧化肽的方法，其特征在于堿性溶液中的堿為MgO, CaO, NaOH, KOH、Na2CO3 和 NaHCO3 中的至少一種。
4.如權(quán)利要求I所述利用牛毛制備抗氧化肽的方法制備得到的抗氧化肽。
5.如權(quán)利要求4所述抗氧化肽在保健品、化妝品、食品、醫(yī)藥產(chǎn)品中作為抗氧化成分應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用牛毛制備抗氧化肽的方法。其特點是將50份牛毛用水洗凈，瀝水/除雜，在溫度35~65°C干燥4~8h，用濃度1~5wt%的堿性溶液500~1000份浸泡0.5~2h，經(jīng)水洗至中性，用濃度0.05~0.5M的無機(jī)酸溶液500~1000份浸泡2~8h，再經(jīng)水洗至中性，瀝去水分，晾干，放入濃度0.5~3wt%的堿性溶液500~1000份中，在攪拌下，于溫度40~80°C水解反應(yīng)10~48h，得到牛毛蛋白水解液，在5000~10000rpm條件下離心10~30min，取上清液，用截留分子量≤10000Da 的透析袋在純水中透析12~48h，得到牛毛多肽溶液，在溫度35~45°C、真空度0.05~0.1MPa條件下低溫濃縮，濃縮液在溫度-65~-45°C、3~10Pa條件下冷凍干燥12~48h，得到牛毛抗氧化肽。
文檔編號C07K1/12GK102964422SQ20121047926
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月23日
發(fā)明者曾維才, 石碧, 廖學(xué)品, 曹明蓉 申請人:四川大學(xué)