專利名稱：甘蔗蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SoERD6基因及其編碼蛋白序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種甘蔗蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SoERD6基因及其編碼蛋白序列。
背景技術(shù)：
鹿糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(sucrosetransporters 或 sucrose carrier, SUT 或 SUC)主要功能是負(fù)責(zé)植物光合產(chǎn)物蔗糖的跨膜運(yùn)輸，在韌皮部介導(dǎo)的源一庫(kù)蔗糖運(yùn)輸和庫(kù)器官的蔗糖供給中起著關(guān)鍵作用。植物SUT屬于MFS(major facilitator superfamily)超家族下的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的一個(gè)中等規(guī)模的亞家族。在干旱脅迫下，能誘導(dǎo)植物一些基因的表達(dá)，以減輕由脅迫造成對(duì)植物的傷害。依據(jù)基因做出響應(yīng)的時(shí)間，可以分為ERD(earlyresponsive to dehydration)基因和 RD (responsive to dehydration)基因。ERD 基因是一些對(duì)干旱、低溫等脅迫信號(hào)快速應(yīng)答的基因，其中ERD6編碼的蛋白具有12個(gè)跨膜區(qū)，且 有一個(gè)親水中心，屬于蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。在植物的整個(gè)生命過程中，糖類物質(zhì)作為營(yíng)養(yǎng)成分以及信號(hào)物質(zhì)發(fā)揮著重要的作用。SUT與蔗糖的運(yùn)輸和碳分配密切相關(guān)，其活性大小直接影響植物的生長(zhǎng)與發(fā)育，甚至影響農(nóng)作物的產(chǎn)量。而蔗糖從源到庫(kù)的運(yùn)輸過程中，至少需要5種蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白作用第I種SUT可能是易化蛋白，負(fù)責(zé)將蔗糖從葉肉細(xì)胞釋放到細(xì)胞壁中。第2種SUT的功能是將蔗糖裝載進(jìn)韌皮部。第3種SUT在蔗糖運(yùn)輸途徑中負(fù)責(zé)將滲透出韌皮部的蔗糖重新吸收進(jìn)韌皮部，如莖中的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。第4種是存在于庫(kù)組織中的SUT，韌皮部卸出的蔗糖可以通過這種蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的跨膜運(yùn)輸或通過胞間連絲進(jìn)行。Walker等推測(cè)參與韌皮部卸出的蔗糖外流運(yùn)輸?shù)鞍拙哂幸谆鞍谆蛸|(zhì)子反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能。第5種是在庫(kù)細(xì)胞的液泡中含有用于吸收蔗糖的H+/蔗糖反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和用于釋放蔗糖的單向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。自從1992年Riesmeier等從菠菜中克隆到第I個(gè)植物SUT基因以來，相繼從20多種植物中得到52個(gè)SUT基因。如水稻中已克隆到5個(gè)、擬南芥中9個(gè)、玉米中6個(gè)、大麥中2個(gè)SUT等。Sauer等根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化分析法將9個(gè)擬南芥蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員分為SUTl、SUT2和SUT4三個(gè)亞族。AtSUCl基因主要在花粉、表皮毛及根中表達(dá)，為花粉管的伸長(zhǎng)和根尖細(xì)胞的快速分裂提供蔗糖。AtSUC2基因在成熟葉片的收集韌皮部和運(yùn)輸韌皮部中均有表達(dá)，在收集韌皮部中主要負(fù)責(zé)韌皮部的蔗糖裝載，而在運(yùn)輸韌皮部中的作用還尚不清楚。AtSUC4在源葉小葉脈的伴胞中表達(dá)，主要功能是負(fù)責(zé)蔗糖的韌皮部裝載。Endler研究發(fā)現(xiàn)，AtSUC4在葉肉細(xì)胞的液泡膜上也有表達(dá)，參與擬南芥葉肉細(xì)胞中蔗糖的液泡貯藏。AtSUC4蛋白屬于低親和高轉(zhuǎn)運(yùn)能力載體，與高親和低轉(zhuǎn)運(yùn)能力的SUTl亞族載體相比，SUT4亞族載體的Km值大約是SUTl亞族的10倍甚至更高，因此Weise推測(cè)，SUT4在韌皮部裝載過程中可能起著更為重要的作用。甘蔗是重要的糖料和能源植物，蔗糖運(yùn)輸及其在蔗莖中的積累過程十分復(fù)雜，而蔗糖在源葉中合成到庫(kù)組織儲(chǔ)存的過程需要蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的參與，因此對(duì)甘蔗SUT功能進(jìn)行研究，對(duì)揭示SUT在甘蔗蔗糖的運(yùn)輸和在蔗莖中蔗糖積累的機(jī)理將會(huì)起到重要作用。目前，已經(jīng)從甘蔗中克隆到蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ShSUTI、ShSUTIA和ShSUT4，并對(duì)其功能進(jìn)行初步研究。ShSUTl主要在成熟葉片和莖節(jié)間表達(dá)，定位于葉片和莖的維管束外圍細(xì)胞中，可能具有將蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)到質(zhì)外體和將遺漏在質(zhì)外體的蔗糖重新轉(zhuǎn)入共質(zhì)體的功能。ShSUT4在葉片中的表達(dá)最強(qiáng)，在根部的表達(dá)最弱。研究發(fā)現(xiàn)ShSUT4的表達(dá)量與甘蔗糖分的積累量呈正相關(guān)。然而還沒有甘蔗蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在甘蔗抗逆脅迫中應(yīng)用的研究報(bào)道。本發(fā)明從受干旱脅迫處理的甘蔗心葉中克隆到一個(gè)SoERD6，屬于蔗糖轉(zhuǎn)錄蛋白基因，該基因可能與甘蔗的抗逆性有關(guān)，具體功能還需要進(jìn)一步的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為進(jìn)一步研究甘蔗蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SoERD6基因在甘蔗蔗糖運(yùn)輸和在蔗莖中積累功能及應(yīng)用SoERD6基因改良甘蔗品種，提供一種甘蔗蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SoERD6基因及其編碼蛋白序列。本發(fā)明所采取的技術(shù)方案如下
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甘蔗蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SoERD6基因及其編碼蛋白序列，是在對(duì)所有植物蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ERD6基因全長(zhǎng)序列進(jìn)行進(jìn)化分析的基礎(chǔ)上，比對(duì)玉米、高粱和短柄草等親緣關(guān)系較近的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ERD6基因cDNA序列，并設(shè)計(jì)擴(kuò)增SoERD6基因核心片段的引物。從干旱脅迫5天的甘蔗幼嫩心片提取總RNA，并經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄，用常規(guī)PCR法擴(kuò)增SoERD6基因核心片段；然后在核心片段序列5'端設(shè)計(jì)兩個(gè)特異引物，在核心片段序列3'端設(shè)計(jì)兩個(gè)特異引物和一個(gè)錨定引物，通過RACE PCR技術(shù)分別擴(kuò)增到SoERD6基因核心區(qū)的5'端和3'端序列，三個(gè)序列經(jīng)過拼接，獲得甘蔗SoERD6基因全長(zhǎng)cDNA序列，全長(zhǎng)2163bp，經(jīng)Vector NTI11.0軟件分析，該基因的ORF為1521bp，編碼506個(gè)氨基酸，起始密碼子(ATG)位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)后169bp處，終止密碼子(TAG)后還有一段474bp的非編碼序列，并帶有真核生物典型的poIyA尾巴。本發(fā)明所獲得的甘蔗蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SoERD6基因核心區(qū)序列，是用以下核苷酸序列為引物擴(kuò)增獲得SUT6F1 (5; -atgagctttcgggaccaggagag-3');SUT6R1 (5; -tcagcggaatgagaatgcgat-31 )；本發(fā)明所獲得的甘蔗蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SoERD6基因5'端序列，是用以下核苷酸序列為引物，與5' -Full RACE Kit(TAKARA)提供的引物結(jié)合，鳥巢式擴(kuò)增獲得SUT6SYR1 (51 -gtgaaaccgaactggatgggacc-31 )；SUT6SYR2 (51 -tacaatgagcgtgcagagcgtgg-31 )；本發(fā)明所獲得的甘蔗蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SoERD6基因基因3'端的序列，是用以下核苷酸序列為引物，與3,端錨定引物相結(jié)合，鳥巢式擴(kuò)增獲得SUT6XYR1 (5' -tggaggaacctttgctatctatg-3')；SUT6XYR2 (5' -tgctgtgtctaccatggccctca-3')。以上所述的甘蔗蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SoERD6，其特征在于它具有序列表中SEQID NO. I的DNA序列，且它的編碼區(qū)從第169位核苷酸到1689位核苷酸。以下是本發(fā)明所獲得的甘蔗SoERD6基因的全長(zhǎng)cDNA序列GAAAGTGCGTGGATTGCCTTCTCTCGGCTAATCATTCAATCAGATCCAATTTCGTGCGCTGATCGTACTCGCCTTCTTCTCCTCCGCCAGCGCTCGAGATTGACGGACGCTCCTCGCAGGAATTCTTCGTCCGTTGCGGTGCGGCCGAGAAGAAACTAAGGCTCAGGC AGCTTTCGGGACCAGGAGAGTGGCGGGGAGGATGCGGGCAGGACGTCCTCCTCGTCCGACCTGCGGAAGCCGCTCCTGAACACCGGGAGCTGGTACCGCATGCCGCCGGCGGGCGGCATGATGGGCTCGCGGCAGTCCAGCCTCATGGAGCGCCTAGGCTCCTCTGCCTTCTCCCTCCGCGACGTCGCCATCTCGGCCACGCTCTGCACGCTCATTGTAGCTCTAGGTCCCATCCAGTTCGGTTTCACCTGCGGGTACTCCTCCCCCACGCAGGACGCCATCATTGCTGACCTCGGCCTCTCCCTCTCCGAGTTCTCGCTCTTCGGATCGTTATCAAACGTAGGGGCAATGGTAGGCGCCATCTCCAGTGGGCAACTTGCAGAGTATATCGGTCGCAAGGGGTCTCTCATGATCGCTGCAATTCCAAACATAATTGGGTGGCTCGCGATATCATTCGCAAAAGATTCCTCTTTCTTGTTTATGGGTCGGCTGCTAGAAGGATTTGGAGTCGGTGTAATATCTTATACAGTACCGGTTTATATTGCAGAAATCGCTCCTCAAGATCAGAGGGGAGCTCTTGGTTCTGTCAATCAGCTCTCCGTCACAATTGGTATATTGCTTGCCTACCTGTTTGGCATGTTTGTTCCCTGGAGAATTCTTGCTGTTCTAGGCGTTTTACCTTGTTCAATACTGATTCCTGGACTGTTCTTTGTCCCTGAATCCCCAAGGTGGCTGGCAAAAATGGGGAAGATGGAGGATTTTGAATATTCACTGCAAGTTCTGCGAGGATTTCAGACGGACATCACAGCAGAAGTAAATGAAATAAAGAGATCAGTAGCATCATCAAGGAGGAGGACAACCATAAGGTTTGCTGATATCAAGCAGAAGAGATACAGTGTTCCCCTTGCGATAGGAATCGGTCTCCTTGTCCTGCAGCAGCTAAGTGGTGTCAATGGCATTCTATTTTATGCTGGGAGCATCTTCAAAGCTGCTGGTATTACAAACAGTAATCTAGCAACCTTTGGTTTGGGGGTTGT TCAGGTGATTGCTACTGGAGTGACAACCTGGTTGACTGACAAAGCTGGTCGAAGGCTTCTTCTCATTATTTCTACCACAGGAATGGTCATTACTCTTGTTATTGTTTCTGTGTCATTTTTTGTGAAGGACAACATAACTGCTGGTTCTCACTTATACTCTACAATGAGTATGCTTTCACTGGCTGGACTTGTGGCATTTGTGATTGCATTTTCTCTTGGCTTGGGAGCAATTCCCTGGGTCATTATGTCTGAGATTCTTCCTGTTAACATCAAGAGCCTTGCTGGAAGTGTTGCGACCCTTGCGAACTGGCTGACAGCATGGGCCATTACAATGACTGCAAGCCTAATGTTGAACTGGAGCAATGGAGGAACCTTTGCTATCTATGCTGCTGTGTCTACCATGGCCCTCATTTTCGTGTGCTTGTGGGTACCGGAGACCAAAGGAAGGACACTAGAGGAAATCGCATTCTCATTCCGC[TGA|CACGTCATGATCTTAGGTATGAGAAGCCACCATGTGCTAGTCATGCCTCAGGGCCATTCAGTTCATGGATTCAGCAGCATCTTGCAGCCATTCTTTCTTGGATGTACCATCTTCAGTGTTCATATGAATGTACATTGTACAATATGAGGCCGTAGCAGAAGGCAAGTGTGTTTATATATATTTGTATATGGTACGATGGATAGTAGCAGAACGCACTCAACCCTTGCATGGGTTGCGGAGAGCAATTCATTTGTTGTATTCATCAGCTATGGTATGTCTGGTTAAATACCGGGCACACGTTAGAATTTTGAAAACAATAAATTTTGAGCAAATTTGTACCCGTGGTATTTACAGTGCTGCCAGCTCTATGCGTTTGCATGCATGCGGTTGGAGTCACTGATCTTGTAATTGGTCATGAACTAGACATGGAGTCTAAATATTTAGGCATGATTTTGGTTTATAAAAAAAAAAAAA甘蔗SoERD6基因編碼的蛋白，是具有序列表中SEQID NO. 2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將SEQID NO. 2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)以上氨基酸殘基的取代和/或缺失成添加且具有與SEQID NO. 2的氨基酸殘基序列相同活性的衍生蛋白質(zhì)。以下是本發(fā)明所獲得的甘蔗SoERD6基因所編碼蛋白的氨基酸序列MSFRDQESGGEDAGRTSSSSDLRKPLLNTGSWYRMPPAGGMMGSRQSSLMERLGSSAFSLRDVAISATLCTLIVALGPIQFGFTCGYSSPTQDAIIADLGLSLSEFSLFGSLSNVGAMVGAISSGQLAEYIGRKGSLMIAAIPNIIGWLAISFAKDSSFLFMGRLLEGFGVGVISYTVPVYIAEIAPQDQRGALGSVNQLSVTIGILLAYLFGMFVPffRILAVLGVLPCSILIPGLFFVPESPRWLAKMGKMEDFEYSLQVLRGFQTDITAEVNEIKRSVASSRRRTTIRFDIKQKRYSVPLAIGIGLLVLQQLSGVNGILFYAGSIFKAAGITNSNLATFGLGVVQVIATGVTTWLTDKAGRRLLLIISTTGMVITLVIVSVSFFVKDNITAGSHLYSTMSMLSLAGLVAFVIAFSLGLGAIPWVIMSEILPVNIKSLAGSVATLANWLTAWAITMTASLMLNWSNGGTFAIYAAVSTMALIFVCLffVPETKGRTLEEIAFSFR。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及其積極效果本發(fā)明的甘蔗SoERD6序列，不僅為研究甘蔗SoERD6的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)機(jī)制，進(jìn)一步探討甘蔗體內(nèi)蔗糖的運(yùn)輸和在蔗莖中的積累機(jī)理奠定基礎(chǔ)，而且通過氨基酸序列可以獲得具有生物活性的純化蛋白，進(jìn)一步用于研究蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的生物學(xué)功能及利用該基因進(jìn)行甘蔗高糖品種改良。


圖I :甘蔗SoERD6基因的全長(zhǎng)cDNA序列；圖2 :甘蔗SoERD6基因所編碼蛋白的氨基酸序列。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例 I、植物SoERD6基因進(jìn)化分析用與甘蔗同源性最近的玉米ZmERD6 (基因登錄號(hào)為FJ750248),在NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih. gov)進(jìn)行同源性比對(duì)分析，獲得所有植物ERD6序列。對(duì)所獲得的所有序列進(jìn)行分析，除去重復(fù)的序列。共得到植物ERD6序列33條，其中全長(zhǎng)序列10條。用ClustalX對(duì)所有全長(zhǎng)ERD6的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，并將比對(duì)結(jié)果保存為PHYLIP格式；然后用PHYLIP軟件包的Seqboot、Protdistjeighbor和Consense程序進(jìn)行進(jìn)化分析，將植物所有全長(zhǎng)ERD6基因分為相應(yīng)的家族。2、設(shè)計(jì)擴(kuò)增SoERD6基因核心片段的引物設(shè)計(jì)擴(kuò)增SoERD6基因核心片段的引物，在Vector NTI11.0上比對(duì)單子葉植物ERD6基因的cDNA序列進(jìn)行。在保守區(qū)設(shè)計(jì)一對(duì)用于擴(kuò)增SoERD6部分片段的引物。SUT6F1 (5; -atgagctttcgggaccaggagag-3');SUT6R1 (5; -tcagcggaatgagaatgcgat-31 )。3、甘蔗總RNA的提取(I)取經(jīng)干旱脅迫處理的新鮮甘蔗心葉在液氮中迅速研磨成粉末狀。稱取IOOmg研磨后的產(chǎn)物，放入用液氮預(yù)冷過的I. 5ml離心管中,加入Iml Trizol-A+提取液(天根生化科技有限公司)。(2)將樣品充分混勻，室溫下放置5min，使得核酸蛋白復(fù)合物完全分離。(3) 40C, 14，OOOg,離心 IOmin0(4)吸取上清液于另一個(gè)I. 5ml離心管中，加入氯仿體積為上清液體積的1/5，充分振蕩混勻15sec,室溫放置2_3min。(5) 4°C，14, OOOg,離心 15min。(6)重復(fù)步驟4，5 一次。(7)吸取上層水相溶液于另一個(gè)I. 5ml離心管中，加入等體積預(yù)冷的異丙醇，混勻lOmin，冰上放置25min(8)4°C，14，000g，離心IOmin后，在管側(cè)和管底形成白色膠狀沉淀。(9)去上清液，留沉淀。加入lml75%乙醇洗滌沉淀2遍(每次4°C，2，300g,離心3min)。(10)倒出液體，室溫放置3_5min ；加入30-50 μ I DEPC處理水，充分溶解后于-70°C保存。(11)取I μ I RNA樣品用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，另取I μ IRNA樣品測(cè)濃度。4、RT-PCR (反轉(zhuǎn)錄 PCR):(I)準(zhǔn)備一個(gè)O. 2ml的離心管，加入以下成分甘蔗總RNA:O. 1-5μ g ；oligo(dT)18 引物(O. 5μ g/μ I) : 1μ I ；加入DEPC-treated water 到總體積12 μ I。(2)輕微混勻，簡(jiǎn)短離心之后，65° C溫育5min，放置冰上冷卻。
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(3)按要求加入以下成分5 X Reaction Buffer 4 μ I ；RiboLock RNase Inhibitor (20U/ μ I) I μ I ；IOmM dNTP Mix 2 μ I ;ReverAid M-MuLV Reverse Tranxcriptase I μ I ；總體積為20 μ I。(4)輕微混勻，簡(jiǎn)短離心。(5)42。C 溫育 60min。(6)70° C溫育5min終止反應(yīng)，-20° C保存?zhèn)溆谩?、SoERD6基因核心片段克隆以I μ I RT-PCR產(chǎn)物為模板，用SUT6F1和SUT6R1引物進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后克隆到T載體并測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度1521bp。6、SoERD6基因5 ' -RACE克隆根據(jù)上一步測(cè)序獲得的核心區(qū)序列，設(shè)計(jì)了5' -RACE的基因特異引物SUT6SYR1 (51 -gtgaaaccgaactggatgggacc-31 )；SUT6SYR2 (51 -tacaatgagcgtgcagagcgtgg-31 )。5' -Full RACE Kit(TAKARA)試劑盒提供的引物Outer Primer: (5' -catggctacatgctgacagccta-3')；Inner Primer (5' -cgcggatccacagcctactgatgatcagtcgatg-3' ) 提取甘蔗幼嫩葉總RNA，按照5 ' -Full RACE Kit (TAKARA)操作手冊(cè)進(jìn)行5' -RACE。巣式PCR :以外引物SUT6SYR1和Outer Primer的PCR產(chǎn)物為模板，再以內(nèi)引物SUT6SYR2和Inner Primer進(jìn)行第二輪PCR，產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后克隆到T載體并測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，5' -RACE產(chǎn)物長(zhǎng)度390bp。7、S0ERD6基因3 ' -RACE克隆根據(jù)上一步測(cè)序獲得的核心區(qū)序列，設(shè)計(jì)了3' -RACE的兩個(gè)基因特異引物。SUT6XYR1 (5' -tggaggaacctttgctatctatg-3')；SUT6XYR2 (5' -tgctgtgtctaccatggccctca-3')。3'錨定引物錨定引物(5'-ggccacgcgtcgactagtac-3')；逆轉(zhuǎn)錄弓丨物 GZS : (5' -ggccacgcgtcgactagtactttttttttttttttttt-31 )。提取甘蔗幼嫩葉總RNA，按照上述RT-PCR方法，以引物GZS核苷酸序列為反轉(zhuǎn)錄引物，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA ;用SUT6XYR1和錨定引物進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物稀釋50倍后，作為SUT6SYR2和錨定引物的模板，用SUT6XYR2和錨定引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增。產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后克隆到T載體并測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，產(chǎn)物長(zhǎng)度568bp。8、甘蔗SoERD6基因全長(zhǎng)序列分析將所獲得的三個(gè)序列進(jìn)行拼接，獲得了 SoERD6基因全長(zhǎng)cDNA序列，總長(zhǎng)2163bp。經(jīng)Vector NTI11. O軟件分析，該序列的ORF為1521bp，編碼506個(gè)氨基酸。起始密碼子(ATG)位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)后169bp處，終止密碼子(TAA)后還有一段474bp的非編碼序列，并帶有真核生物典型的polyA尾巴。甘蔗蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SoERD6基因序列表，詳見序列表。序列表〈110〉廣西大學(xué)
<120>甘蔗蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ERD6基因及其編碼蛋白序列<160>2〈210〉I<211>2163<212>DNA〈213〉甘鹿(Saccharum off icinarum)〈220〉<221>CDS<222>(168). . . (1689)〈220〉〈221>5， UTP<222>(1). . . (168)〈220〉〈221>3， UTP<222>(1690). . . (2163)〈400〉IGAAAGTGC GTGGATTGCC TTCTCTCGGC TAATCATTCA ATCAGATCCA 48ATTTCGTGCG CTGATCGTAC TCGCCTTCTT CTCCTCCGCC AGCGCTCGAG ATTGACGGAC 108GCTCCTCGCA GGAATTCTTC GTCCGTTGCG GTGCGGCCGA GAAGAAACTA AGGCTCAGGC 168ATG AGC TTT CGG GAC CAG GAG AGT GGC GGG GAG GAT GCG GGC AGG 213Met Ser Phe Arg Asp Gln Glu Ser Gly Gly Glu Asp Ala Gly Arg51015ACG TCC TCC TCG TCC GAC CTG CGG AAG CCG CTC CTG AAC ACC GGG 258Thr Ser Ser Ser Ser Asp Leu Arg Lys Pro Leu Leu Asn Thr Gly202530AGC TGG TAC CGC ATG CCG CCG GCG GGC GGC ATG ATG GGC TCG CGG 303Ser Trp Tyr Arg Met Pro Pro Ala Gly Gly Met Met Gly Ser Arg354045CAG TCC AGC CTC ATG GAG CGC CTA GGC TCC TCT GCC TTC TCC CTC 348
Gln Ser Ser Leu Met Glu Arg LeuGly Ser Ser Ala Phe Ser Leu505560CGC GAC GTC GCC ATC TCG GCC ACG CTC TGC ACG CTC ATT GTA GCT 393Arg Asp Val Ala He Ser Ala ThrLeu Cys Thr LeuHe Val Ala657075CTA GGT CCC ATC CAG TTC GGT TTC ACC TGC GGG TAC TCC TCC CCC 438Leu Gly Pro He Gln Phe Gly PheThr Cys Gly TyrSer Ser Pro808590·
ACG CAG GAC GCC ATC ATT GCT GAC CTC GGC CTC TCC CTC TCC GAG 483Thr Gln Asp Ala He He Ala AspLeu Gly Leu SerLeu Ser Glu95100105TTC TCG CTC TTC GGA TCG TTA TCA AAC GTA GGG GCA ATG GTA GGC 528Phe Ser Leu Phe Gly Ser Leu SerAsn Val Gly Ala Met Val Gly110115120GCC ATC TCC AGT GGG CAA CTT GCA GAG TAT ATC GGTCGC AAG GGG 573Ala He Ser Ser Gly Gln Leu Ala Glu Tyr He GlyArg Lys Gly125130135TCT CTC ATG ATC GCT GCA ATT CCA AAC ATA ATT GGG TGG CTC GCG 618Ser Leu Met He Ala Ala He ProAsn He He GlyTrp Leu Ala140145150ATA TCA TTC GCA AAA GAT TCC TCTTTC TTG TTT ATG GGT CGG CTG 663He Ser Phe Ala Lys Asp Ser SerPhe Leu Phe MetGly Arg Leu155160165CTA GAA GGA TTT GGA GTC GGT GTA ATA TCT TAT ACA GTA CCG CTT 708Leu Glu Gly Phe Gly Val Gly ValHe Ser Tyr ThrVal Pro Val170175180TAT ATT GCA GAA ATC GCT CCT CAA GAT CAG AGG GGA GCT CTT GGT 753Tyr He Ala Glu He Ala Pro GlnAsp Gln Arg GlyAla Leu Gly185190195TCT GTC AAT CAG CTC TCC GTC ACA ATT GGT ATA TTG CTT GCC TAC 798Ser Val Asn GLn Leu Ser Val ThrHe Gly He LeuLeu Ala Tyr200205210CTG TTT GGC ATG TTT GTT CCC TGG AGA ATT CTT GCTGTT CTA GGC 843Leu Phe Gly Met Phe Val Pro TrpArg He Leu Ala Val Leu Gly215220225GTT TTA CCT TGT TCA ATA CTG ATTCCT GGA CTG TTC TTT GTC CCT 888Val Leu Pro Cys Ser He Leu HePro Gly Leu PhePhe Val Pro230235240GAA TCC CCA AGG TGG CTG GCA AAA ATG GGG AAG ATG GAG GAT TTT 933
Glu Ser Pro Arg Trp Leu Ala LysMet Gly Lys MetGlu Asp Phe245250255GAA TAT TCA CTG CAA GTT CTG CGA GGA TTT CAG ACGGAC ATC ACA 978Glu Tyr Ser Leu Gln Val Leu Arg Gly Phe Gln ThrAsp He Thr260265270GCA GAA GTA AAT GAA ATA AAG AGA TCA GTA GCA TCATCA AGG AGG 1023Ala Glu Val Asn Glu He Lys Arg Ser Val Ala SerSer Arg Arg275280285AGG ACA ACC ATA AGG TTT GCT GATATC AAG CAG AAGAGA TAC AGT 1068·Arg Thr Thr He Arg Phe Ala AspHe Lys Gln LysArg Tyr Ser290295300GTT CCC CTT GCG ATA GGA ATC GGTCTC CTT GTC CTGCAG CAG CTA 1113Val Pro Leu Ala He Gly He GlyLeu Leu Val LeuGln Gln Leu305310315AGT GGT GTC AAT GGC ATT CTA TTTTAT GCT GGG AGCATC TTC AAA 1158Ser Gly Val Asn Gly He Leu PheTyr Ala Gly SerHe Phe Lys320325330GCT GCT GGT ATT ACA AAC AGT AATCTA GCA ACC TTTGGT TTG GGG 1203Ala Ala Gly He Thr Asn Ser AsnLeu Ala Thr PheGly Leu Gly335340345GTT GTT CAG GTG ATT GCT ACT GGA GTG ACA ACC TGGTTG ACT GAC 1248Val Val Gln Val He Ala Thr GlyVal Thr Thr TrpLeu Thr Asp350355360AAA GCT GGT CGA AGG CTT CTT CTC ATT ATT TCT ACCACA GGA ATG 1293Lys Ala Gly Arg Arg Leu Leu LeuHe He Ser ThrThr Gly Met365370375GTC ATT ACT CTT GTT ATT GTT TCTGTG TCA TTT TTTGTG AAG GAC 1338Val He Thr Leu Val He Val SerVal Ser Phe PheVal Lys Asp380385390AAC ATA ACT GCT GGT TCT CAC TTA TAC TCT ACA ATGAGT ATG CTT 1383Asn He Thr Ala Gly Ser His LeuTyr Ser Thr MetSer Met Leu395400405TCA CTG GCT GGA CTT GTG GCA TTTGTG ATT GCA TTTTCT CTT GGC 1428Ser Leu Ala Gly Leu Val Ala PheVal He Ala PheSer Leu Gly410415420TTG GGA GCA ATT CCC TGG GTC ATTATG TCT GAG ATTCTT CCT GTT 1473Leu Gly Ala He Pro Trp Val HeMet Ser Glu HeLeu Pro Val425430435AAC ATC AAG AGC CTT GCT GGA AGTGTT GCG ACC CTTGCG AAC TGG 1518
Asn lie Lys Ser Leu Ala Gly Ser Val Ala Thr Leu Ala Asn Trp440445450CTG ACA GCA TGG GCC ATT ACA ATG ACT GCA AGC CTA ATG TTG AAC 1563Leu Thr Ala Trp Ala lie Thr Met Thr Ala Ser Leu Met Leu Asn455460465TGG AGC AAT GGA GGA ACC TTT GCT ATC TAT GCT GCT GTG TCT ACC 1608Trp Ser Asn Gly Gly Thr Phe Ala lie Tyr Ala Ala Val Ser Thr470475480 ATG GCC CTC ATT TTC GTG TGC TTG TGG GTA CCG GAG ACC AAA GGA 1653Met Ala Leu lie Phe Val Cys Leu Trp Val Pro Glu Thr Lys Gly485490495AGG ACA CTA GAG GAA ATC GCA TTC TCA TTC CGC1686Arg Thr Leu Glu Glu lie Ala Phe Ser Phe Arg500505 506TGACACGTCA TGATCTTAGG TATGAGAAGC CACCATGTGC TAGTCATGCC TCAGGGCCAT 1746TCAGTTCATG GATTCAGCAG CATCTTGCAG CCATTCTTTC TTGGATGTAC CATCTTCAGT 1806GTTCATATGA ATGTACATTG TACAATATGA GGCCGTAGCA GAAGGCAAGT GTGTTTATAT 1866ATATTTGTAT ATGGTACGAT GGATAGTAGC AGAACGCACT CAACCCTTGC ATGGGTTGCG 1926GAGAGCAATT CATTTGTTGT ATTCATCAGC TATGGTATGT CTGGTTAAAT ACCGGGCACA 1986CGTTAGAATT TTGAAAACAA TAAATTTTGA GCAAATTTGT ACCCGTGGTA TTTACAGTGC 2046TGCCAGCTCT ATGCGTTTGC ATGCATGCGG TTGGAGTCAC TGATCTTGTA ATTGGTCATG 2106AACTAGACAT GGAGTCTAAA TATTTAGGCA TGATTTTGGT TTATAAAAAA AAAMAA 2163<210>2<211>506<212>PRT〈213〉甘鹿(Saccharum off icinarum)Met Ser Phe Arg Asp Gln Glu Ser Gly Gly Glu Asp Ala Gly Arg51015Thr Ser Ser Ser Ser Asp Leu Arg Lys Pro Leu Leu Asn Thr Gly202530Ser Trp Tyr Arg Met Pro Pro Ala Gly Gly Met Met Gly Ser Arg354045Gln Ser Ser Leu Met Glu Arg Leu Gly Ser Ser Ala Phe Ser Leu505560Arg Asp Val Ala lie Ser Ala Thr Leu Cys Thr Leu lie Val Ala657075Leu Gly Pro lie Gln Phe Gly Phe Thr Cys Gly Tyr Ser Ser Pro808590Thr Gln Asp Ala lie lie Ala Asp Leu Gly Leu Ser Leu Ser Glu
95 100105Phe Ser Leu Phe GlySer Leu Ser Asn Val GlyAla Met Val Gly110 115120Ala He Ser Ser GlyGln Leu Ala Glu Tyr HeGly Arg Lys Gly125 130135Ser Leu Met He AlaAla He Pro Asn He HeGly Trp Leu Ala140 145150He Ser Phe Ala LysAsp Ser Ser Phe Leu PheMet Gly Arg Leu 155 160165Leu Glu Gly Phe GlyVal Gly Val He Ser TyrThr Val Pro Val170 175180Tyr He Ala Glu HeAla Pro Gln Asp Gln ArgGly Ala Leu Gly185 190195Ser Val Asn GLn LeuSer Val Thr He Gly HeLeu Leu Ala Tyr200 205210Leu Phe Gly Met PheVal Pro Trp Arg He LeuAla Val Leu Gly215 220225Val Leu Pro Cys SerHe Leu He Pro Gly LeuPhe Phe Val Pro230 235240Glu Ser Pro Arg TrpLeu Ala Lys Met Gly LysMet Glu Asp Phe245 250255Glu Tyr Ser Leu GlnVal Leu Arg Gly Phe GlnThr Asp He Thr260 265270Ala Glu Val Asn GluHe Lys Arg Ser Val AlaSer Ser Arg Arg275 280285Arg Thr Thr He ArgPhe Ala Asp He Lys GlnLys Arg Tyr Ser290 295300Val Pro Leu Ala HeGly He Gly Leu Leu ValLeu Gln Gln Leu305 310315Ser Gly Val Asn GlyHe Leu Phe Tyr Ala GlySer He Phe Lys320 325330Ala Ala Gly He ThrAsn Ser Asn Leu Ala ThrPhe Gly Leu Gly335 340345Val Val Gln Val HeAla Thr Gly Val Thr ThrTrp Leu Thr Asp350 355360Lys Ala Gly Arg ArgLeu Leu Leu He He SerThr Thr Gly Met365 370375Val He Thr Leu ValHe Val Ser Val Ser PhePhe Val Lys Asp380 385390
Asn lie Thr Ala Gly SerHis Leu Tyr Ser Thr MetSer Met Leu395 400405Ser Leu Ala Gly Leu ValAla Phe Val lie Ala PheSer Leu Gly410 415420Leu Gly Ala lie Pro TrpVal lie Met Ser Glu lieLeu Pro Val425 430435Asn lie Lys Ser Leu AlaGly Ser Val Ala Thr LeuAla Asn Trp440 445450 Leu Thr Ala Trp Ala lieThr Met Thr Ala Ser LeuMet Leu Asn455 460465Trp Ser Asn Gly Gly ThrPhe Ala lie Tyr Ala AlaVal Ser Thr470 475480Met Ala Leu lie Phe ValCys Leu Trp Val Pro GluThr Lys Gly485 490495Arg Thr Leu Glu Glu lieAla Phe Ser Phe Arg500505 50權(quán)利要求
1.甘蔗蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白S0ERD6基因及其編碼蛋白序列，其特征在于 a、甘蔗蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SoERD6基因，它具有以下序列表中的DNA序列，且它的編碼區(qū)從第169位核苷酸到1689位核苷酸； 甘蔗蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SoERD6基因的全長(zhǎng)cDNA序列GAAAGTGCGTGGATTGCCTTCTCTCGGCTAATCATTCAATCAGATCCAATTTCGTGCGCTGATCGTACTCGCCTTCTTCTCCTCCGCCAGCGCTCGAGATTGACGGACGCTCCTCGCAGGAATTCTTCGTCCGTTGCGGTGCGGCCGAGAAGAAACTAAGGCTCAGGC |Sg| AGCTTTCGGGACCAGGAGAGTGGCGGGGAGGATGCGGGCAGGACGTCCTCCTCGTCCGACCTGCGGAAGCCGCTCCTGAACACCGGGAGCTGGTACCGCATGCCGCCGGCGGGCGGCATGATGGGCTCGCGGCAGTCCAGCCTCATGGAGCGCCTAGGCTCCTCTGCCTTCTCCCTCCGCGACGTCGCCATCTCGGCCACGCTCTGCACGCTCATTGTAGCTCTAGGTCCCATCCAGTTCGGTTTCACCTGCGGGTACTCCTCCCCCACGCAGGACGCCATCATTGCTGACCTCGGCCTCTCCCTCTCCGAGTTCTCGCTCTTCGGATCGTTATCAAACGTAGGGGCAATGGTAGGCGCCATCTCCAGTGGGCAACTTGCAGAGTATATCGGTCGCAAGGGGTCTCTCATGATCGCTGCAATTCCAAACATAATTGGGTGGCTCGCGATATCATTCGCAAAAGATTCCTCTTTCTTGTTTATGGGTCGGCTGCTAGAAGGATTTGGAGTCGGTGTAATATCTTATACAGTACCGGTTTATATTGCAGAAATCGCTCCTCAAGATCAGAGGGGAGCTCTTGGTTCTGTCAATCAGCTCTCCGTCACAATTGGTATATTGCTTGCCTACCTGTTTGGCATGTTTGTTCCCTGGAGAATTCTTGCTGTTCTAGGCGTTTTACCTTGTTCAATACTGATTCCTGGACTGTTCTTTGTCCCTGAATCCCCAAGGTGGCTGGCAAAAATGGGGAAGATGGAGGATTTTGAATATTCACTGCAAGTTCTGCGAGGATTTCAGACGGACATCACAGCAGAAGTAAATGAAATAAAGAGATCAGTAGCATCATCAAGGAGGAGGACAACCATAAGGTTTGCTGATATCAAGCAGAAGAGATACAGTGTTCCCCTTGCGATAGGAATCGGTCTCCTTGTCCTGCAGCAGCTAAGTGGTGTCAATGGCATTCTATTTTATGCTGGGAGCATCTTCAAAGCTGCTGGTATTACAAACAGTAATCTAGCAACCTTTGGTTTGGGGGTTGTTCAGGTGATTGCTACTGGAGTGACAACCTGGTTGACTGACAAAGCTGGTCGAAGGCTTCTTCTCATTATTTCTACCACAGGAATGGTCATTACTCTTGTTATTGTTTCTGTGTCATTTTTTGTGAAGGACAACATAACTGCTGGTTCTCACTTATACTCTACAATGAGTATGCTTTCACTGGCTGGACTTGTGGCATTTGTGATTGCATTTTCTCTTGGCTTGGGAGCAATTCCCTGGGTCATTATGTCTGAGATTCTTCCTGTTAACATCAAGAGCCTTGCTGGAAGTGTTGCGACCCTTGCGAACTGGCTGACAGCATGGGCCATTACAATGACTGCAAGCCTAATGTTGAACTGGAGCAATGGAGGAACCTTTGCTATCTATGCTGCTGTGTCTACCATGGCCCTCATTTTCGTGTGCTTGTGGGTACCGGAGACCAAAGGAAGGACACTAGAGgaaatcgcattctcattccgc[tga]cacgtcatgatcttaggtatgagaagccaccatgtgctagtcatgcctcaggGCCATTCAGTTCATGGATTCAGCAGCATCTTGCAGCCATTCTTTCTTGGATGTACCATCTTCAGTGTTCATATGAATGTACATTGTACAATATGAGGCCGTAGCAGAAGGCAAGTGTGTTTATATATATTTGTATATGGTACGATGGATAGTAGCAGAACGCACTCAACCCTTGCATGGGTTGCGGAGAGCAATTCATTTGTTGTATTCATCAGCTATGGTATGTCTGGTTAAATACCGGGCACACGTTAGAATTTTGAAAACAATAAATTTTGAGCAAATTTGTACCCGTGGTATTTACAGTGCTGCCAGCTCTATGCGTTTGCATGCATGCGGTTGGAGTCACTGATCTTGTAATTGGTCATGAACTAGACATGGAGTCTAAATATTTAGGCATGATTTTGGTTTATAAAAAAAAAAAAA b、甘蔗蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SoERD6基因編碼的蛋白，是具有以下序列表中氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)； 甘蔗蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SoERD6基因所編碼蛋白的氨基酸序列MSFRDQESGGEDAGRTSSSSDLRKPLLNTGSWYRMPPAGGMMGSRQSSLMERLGSSAFSLRDVAISATLCTLIVALGPIQFGFTCGYSSPTQDAIIADLGLSLSEFSLFGSLSNVGAMVGAISSGQLAEYIGRKGSLMIAAIPNIIGWLAlSFAKDSSFLFMGRLLEGFGVGVISYTVPVYIAEIAPQDQRGALGSVNQLSVTIGILLAYLFGMFVPffRILAVLGVLPCSILIPGLFFVPESPRffLAKMGKMEDFEYSLQVLRGFQTDITAEVNEIKRSVAS SRRRTTIRFADIKQKRYSVPLAIGIGLLVLQQLSGVNGILFYAGSIFKAAGITNSNLATFGLGVVQVIATGVTTWLTDKAGRRLLLIISTTGMVITLVIVSVSFFVKDNITAGSHLYSTMSMLSLAGLVAFVIAFSLGLGAIPWVIMSEILPVNIKSLAGSVATLANWLTAWAITMTASLMLNWSNGGTFAIYAAVSTMALIFVCLWVPETKGRTLEEIAFSFRo
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的甘蔗蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SoERD6基因及其編碼蛋白序列，其特征在于所述的甘蔗蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SoERD6基因的全長(zhǎng)cDNA序列，是用以下核苷酸序列為引物擴(kuò)增獲得a、用于擴(kuò)增甘蔗蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SoERD6基因核心區(qū)引物對(duì)SUT6F1 (5r -atgagctttcgggaccaggagag-3!)；SUT6R1 (5r -tcagcggaatgagaatgcgat-3!)； b、用于擴(kuò)增甘蔗蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SoERD6基因5'端的引物SUT6SYR1 (5! -gtgaaaccgaactggatgggacc-3!)；SUT6SYR2 (5r -tacaatgagcgtgcagagcgtgg-3!)； C、擴(kuò)增甘蔗甘蔗蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SoERD6基因3'端的引物 SUT6XYR1:(5, -tggaggaacctttgctatctatg-3!)；SUT6XYR2 (5' -tgctgtgtctaccatggccctca-3!)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種甘蔗蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ERD6基因及其編碼蛋白序列，在對(duì)所有植物蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ERD6基因全長(zhǎng)序列進(jìn)行比對(duì)分析的基礎(chǔ)上，在植物蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ERD6基因序列的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，從甘蔗幼嫩葉片提取總RNA，并經(jīng)反轉(zhuǎn)錄，用常規(guī)PCR法擴(kuò)增，結(jié)合RACE PCR技術(shù)克隆到甘蔗蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SoERD6基因的全長(zhǎng)cDNA序列。不僅為研究甘蔗蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ERD6基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)機(jī)制，進(jìn)一步探討蔗糖在甘蔗體內(nèi)的運(yùn)輸和在蔗莖中積累機(jī)理奠定基礎(chǔ)，而且通過氨基酸序列可以獲得具有生物活性的純化蛋白，進(jìn)一步用于研究蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的生物學(xué)功能及利用該基因進(jìn)行甘蔗高糖品種改良。
文檔編號(hào)C07K14/415GK102925461SQ201210473830
公開日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2012年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月21日
發(fā)明者楊麗濤, ?？∑? 李楊瑞, 黃靜麗 申請(qǐng)人:廣西大學(xué)