專利名稱：一種去除西瓜葉片Rubisco酶干擾，分離剩余低豐度蛋白質(zhì)的電泳方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域,涉及一種去除植物葉片Rubisco酶干擾,富集和分離剩余低豐度蛋白質(zhì)的電泳方法，更特別的是涉及一種去除西瓜葉片Rubisco酶干擾，富集和分離剩余低豐度蛋白質(zhì)的電泳方法。
背景技術(shù)：
西瓜是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，也是世界性重要的水果型蔬菜，研究其抗逆性機(jī)理和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)功能因子對(duì)于西瓜的栽培和生產(chǎn)尤其重要。西瓜葉片蛋白質(zhì)組學(xué)研究能夠?yàn)槲鞴系目鼓嫘栽耘嗪蜖I(yíng)養(yǎng)品質(zhì)分析提供重要的功能信息。蛋白質(zhì)雙向電泳是蛋白質(zhì)組學(xué)研究分離蛋白質(zhì)最常用的技術(shù)手段。然而，西瓜葉片中大約有50%的可溶性蛋白質(zhì)為核酮糖 I，5_ 二憐酸羧化 / 加氧酶(Ribulose-1, 5-bisphosphate carbox-ylase/oxygenase, Rubisco)，導(dǎo)致西瓜葉片中其他低豐度蛋白質(zhì)提取不完全或者遮擋和限制了低豐度蛋白質(zhì)進(jìn)入二維凝膠和低豐度蛋白質(zhì)在凝膠上的顯現(xiàn)，使得西瓜葉片蛋白質(zhì)組學(xué)研究的質(zhì)譜鑒定結(jié)果大多為Rubisco的大小亞基，妨礙了其他低豐度蛋白質(zhì)的分離和鑒定，尤其是一些調(diào)控因子和信號(hào)因子很難或不能被雙向電泳分離到，成為困擾西瓜葉片蛋白質(zhì)組研究的難題。目前，去除葉片Rubisco酶干擾的方法主要有以下四種1)Rubisco免疫耗竭柱 (Immunodepletion columns) (Cellar et al. , 2008)和抗體親和的方法(Hashimoto and Komatsu, 2007)。這兩種方式雖然能夠有效地去除植物葉片中的Rubisco酶，但均基于免疫學(xué)原理，要求抗體特異性非常強(qiáng)，成本較高，一般實(shí)驗(yàn)室無法進(jìn)行。2)肌醇六磷酸沉淀法 利用肌醇六磷酸與不同濃度的Ca2+結(jié)合作為沉淀介質(zhì)，在高溫孵育的條件下去除葉片中的 Rubisco0該方法操作繁瑣復(fù)雜，且其去除操作需在高溫下進(jìn)行(37°C或42°C)，可能導(dǎo)致其他蛋白質(zhì)，尤其是一些調(diào)控因子和信號(hào)因子的降解和損失(Krishnan and Natarajan, 2009 ;李紅兵和康振生，2011)。3)高濃度的二硫蘇糖醇(DTT)沉淀法(Cho et al. ,2008), 其原理和有效性還有待進(jìn)一步考察和驗(yàn)證。4)聚乙二醇沉淀法聚乙二醇(PEG)是一種常用的用來沉淀蛋白質(zhì)的水溶性非離子聚合物，不同濃度的PEG沉淀出來的蛋白質(zhì)不同，在鹽濃度和PH值一定的介質(zhì)中，與蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量有關(guān)。采用PEG去除植物葉片中Rubisco簡(jiǎn)便有效，成本低。自Kim et al. (2001)采用不同濃度的PEG對(duì)水稻葉片全蛋白進(jìn)行分餾以除去水稻葉片中Rubisco酶后，15%或16% 的PEG很快就被一些研究者廣泛運(yùn)用在水稻葉片低豐度蛋白質(zhì)組學(xué)研究中(Lee et al.， 2007 ；Lee et al.，2010)。然而，由于采用PEG沉淀蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的分子量和等電點(diǎn)有關(guān)，不同植物葉片的Rubisco酶分子量和等電點(diǎn)存在一定的差異(柴常星等，1985)，因此， 采用15%或者16% PEG去除水稻葉片Rubisco酶的方法并不適用于西瓜葉片上。另外,單子葉植物水稻葉片中含有大量的纖維素和木質(zhì)素，各個(gè)組分和含量與西瓜葉片蛋白質(zhì)組成均不相同，其所用的酚抽法或丙酮沉淀法抽提剩余蛋白質(zhì)的方法也不是抽提西瓜葉片蛋白質(zhì)的最佳方案。因此，本發(fā)明試圖找到一個(gè)去除西瓜葉片Rubisco酶的最佳的PEG濃度,能夠簡(jiǎn)便快速的富集剩余的低豐度蛋白質(zhì)，并創(chuàng)建了一種適合分離西瓜葉片低豐度蛋白質(zhì)雙向電泳的方法，對(duì)于西瓜的抗逆性研究和品質(zhì)育種有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種去除西瓜葉片Rubisco的方法。本發(fā)明的另一目的是提供一種去除西瓜葉片Rubisco干擾，分離剩余蛋白質(zhì)的雙向電泳方法。本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種去除西瓜葉片Rubisco的方法利用18% (g/100ml,下同)的PEG-4000去除西瓜葉片中的Rubisco。該方法具體為采集西瓜成熟葉片，置于研磨中，加入液氮研磨至粒徑為O. Olmm
0.05mm粉末，迅速轉(zhuǎn)至離心管中，在離心管中按體積比I : 3加入預(yù)冷勻漿緩沖液后混勻， 將離心管水平置于冰上孵育10分鐘，4°C下于1500g，離心3分鐘，棄沉淀，保留上清，4°C下于l，5000g，離心20分鐘，棄沉淀，保留上清；在上清液中加入18%的PEG-4000，水平置于冰上孵育20分鐘，4°C下于l，5000g，離心25分鐘，棄沉淀，保留上清。一種去除西瓜葉片Rubisco干擾，分離剩余蛋白質(zhì)的方法，先利用18 %的 PEG-4000沉淀西瓜葉片中的Rubisco，再通過雙向電泳分離西瓜葉片剩余蛋白質(zhì)。 該方法優(yōu)選包括如下步驟A)采集西瓜成熟葉片，置于研磨中，加入液氮研磨至粒徑為O. Olmm O. 05mm 粉末，迅速轉(zhuǎn)至離心管中，在離心管中按體積比I : 3加入預(yù)冷勻漿緩沖液后混勻，將離心管水平置于冰上孵育10分鐘，4°C下于1500g，離心3分鐘，棄沉淀，保留上清，4°C下于
1,5000g,離心20分鐘,棄沉淀,保留上清；B)在上清液中加入18 %的PEG-4000，水平置于冰上孵育20分鐘，4°C下于 l，5000g,離心25分鐘,棄沉淀,保留上清；C)在提取的上清中加入10% (v/v)三氯乙酸-丙酮溶液，于-20°C放置過夜，所述的入10% (v/v)三氯乙酸-丙酮溶液中含有O. 07%的β-巰基乙醇；D)取出離心管，4°C下于2，5000g，離心25分鐘，棄上清，保留沉淀，加入含O. 07% 的巰基乙醇的丙酮清洗沉淀，于_20°C放置I小時(shí)。重復(fù)上述洗滌離心操作4次至離心管中蛋白質(zhì)沉淀發(fā)白，無雜色，棄上清，保留沉淀；E)將留有沉淀的離心管置于通風(fēng)櫥中，室溫下干燥20-30分鐘，得蛋白粉末；F)在含有蛋白粉末的離心管中加入裂解液，室溫下放置40-60分鐘；G)4°C下于3，000(^，離心30分鐘，棄沉淀，保留上清，置于-801保存?zhèn)溆茫籋)對(duì)步驟G所得上清先進(jìn)行等電聚焦電泳，再進(jìn)行垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳；步驟A中所述的勻漿緩沖液為PH 8. 3,0. 5M的Tris-HCl，含2% (v/v)的NP-40， 20mMMgCl2,2% (v/v)的 β-巰基乙醇和 I % (v/v)的 PMSF ;步驟F中所述的裂解液含8M尿素，IM硫脲，2%的CHAPS，65mM DTT, O. 08 % IPG buffer(PH4-7)。
所述等電聚焦電泳中，蛋白質(zhì)上樣量為800ug/18cm膠條，所述聚丙烯酰胺凝膠電泳中采用的染色方法為常規(guī)考馬斯亮藍(lán)R-250方法。有益效果本發(fā)明通過采用不同濃度的PEG-4000去除西瓜葉片Rubisco，發(fā)現(xiàn)18% PEG是去除西瓜葉片Rubisco的最佳濃度,一方面,能夠最大限度地去除西瓜葉片Rubsico ;另一方面，剩余的蛋白質(zhì)得到了明顯的富集，尤其是低分子量(分子量約為23. 4kDa)的蛋白質(zhì)在 I-DE和2-DE圖譜上均達(dá)到了顯現(xiàn)和分離的效果。采用18% PEG去除西瓜葉片的Rubisco 后，剩余蛋白質(zhì)的2-DE圖譜上，Rubsico的大小亞基大部分消失,剩余的蛋白點(diǎn)大部分表達(dá)量均上調(diào)，分離到的蛋白質(zhì)增加了 48.4%，在分子量小于25. OkDa的區(qū)域出現(xiàn)大量新的蛋白點(diǎn)(63±15個(gè))，經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)證明，重復(fù)性好，圖譜清晰，結(jié)果可靠。該方法能夠大量，快速，有效的去除西瓜葉片中的高豐度的Rub i sCo,使得葉片中其他較低豐度的蛋白質(zhì)得到富集，達(dá)到雙向電泳可提取和分離的目的。采用本發(fā)明中所述的PEG沉淀Rubisco,分離剩余蛋白質(zhì)的方法不干擾后續(xù)的質(zhì)譜鑒定分析，有利于西瓜葉片除Rubisco以外的較低豐度蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，適用于西瓜葉片較低豐度蛋白質(zhì)的雙向電泳。


圖I 為在步驟 I. C 中加入不同濃度 PEG-4000 (O %，10 %，12 %，14%，16 %和 18 % ) 后，西瓜葉片蛋白質(zhì)的SDS-PAGE圖譜圖2為西瓜葉片全蛋白(圖2A)和18% PEG去除西瓜葉片Rubisco后所得上清 (圖2B)按上述步驟提取所得蛋白質(zhì)的雙向電泳圖譜。
具體實(shí)施例方式下面以西瓜(Citrullus Ianatus Mansfeld)葉片為例，闡明本發(fā)明的去除雙子葉植物葉片Rubsico,分離剩余蛋白質(zhì)的雙向電泳方法實(shí)施例I沉淀西瓜葉片Rubisco的最佳PEG濃度篩選A.取西瓜(Citrullus Ianatus Mansfeld)幼苗成熟葉片2g,置于液氮中快速研磨至精細(xì)粉末(粒徑約為O. Olmm),用小藥匙迅速將粉末轉(zhuǎn)至IOml離心管中，加入7ml預(yù)冷勻漿緩沖液，然后在渦旋儀上振動(dòng)混勻，水平置于冰上孵育10分鐘。B.4°C下于1500g，離心3分鐘，棄沉淀，保留上清；再于4°C下于l，5000g，離心20
分鐘，棄沉淀，保留上清。C.在上清液中加入不同濃度PEG-4000，水平置于冰上孵育20分鐘，4°C下于 I, 5000g,離心25分鐘,棄沉淀,保留上清。D.將步驟C中所得上清用Brandford法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量至2ug/ul,加入等體積變性液，然后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，篩選出去除Rubisco的最佳PEG濃度為18%。其中，上述變性液組成為pH6. 8 的 Tris-HCl O. Immol · Λ 20 % 甘油(v/v)， 20% SDS(v/v)5% β -巰基乙醇(ν/ν)，0· 01%溴酚藍(lán)。SDS-PAGE濃縮膠濃度5%，分離膠濃度12. 5%，在Bio-Rad公司Mini-PROTAEN System上進(jìn)行，上樣量12ug，電泳設(shè)置參數(shù)恒壓先80V/20min，后140V/40min。電泳結(jié)束后采用常規(guī)考馬斯亮藍(lán)染色法染色(染色液含 R-2500. I % (w/v),甲醇40% (ν/ν),冰醋酸10% (ν/ν),定容后過濾)2h,后用脫色液(甲醇冰醋酸和去離子水體積比為I : I : 8)中脫色，反復(fù)脫色至蛋白條帶在背景上清晰。 脫色至背景色透明后，用LabScan圖像掃描軟件掃描得SDS-PAGE電泳圖。由圖I可知，在步驟I. C中所得上清加入不同濃度PEG-4000后對(duì)西瓜葉片全蛋白R(shí)ubisco去除效果不同 隨著PEG濃度增加，Rubisco大小亞基(LSR和SSR)含量逐漸下降，其余蛋白質(zhì)條帶也逐漸增強(qiáng)，當(dāng)PEG濃度為16% (g/100ml，下同)和18% (g/100ml，下同)時(shí)，大量低豐度蛋白質(zhì)得到富集，條帶明顯增強(qiáng)，在分子量25. OkDa和分子量18. 4kDa之間(分子量約23. 2kDa) 甚至出現(xiàn)了新的蛋白條帶。然而，16% PEG對(duì)Rubisco的去除效果不理想,LSR和SSR仍然明顯存在；采用18% PEG時(shí)，不僅能有效地去除西瓜葉片Rubisco，LSR和SSR條帶均明顯減弱，且剩余蛋白質(zhì)得到明顯地富集，條帶增強(qiáng)；采用20% PEG會(huì)將大量非靶標(biāo)目的蛋白質(zhì)也會(huì)被去掉(由于加入20% PEG后，剩余蛋白質(zhì)含量已經(jīng)非常低，無法進(jìn)行SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)， 故數(shù)據(jù)沒有顯示)。因此，我們確定18% PEG-4000為去除西瓜葉片Rubisco，富集剩余蛋白質(zhì)的最佳濃度。實(shí)施例2I)沉淀西瓜葉片Rubisco后,剩余蛋白質(zhì)樣品的制備A.重復(fù)實(shí)施例I步驟A-B，得全蛋白上清，向上清中加入60%的PEG-4000，使得 PEG-4000在溶液中的終濃度達(dá)到18%，在渦旋儀上振動(dòng)混勻，水平置于冰上孵育20分鐘， 4°C下于1，5000g，離心25分鐘，棄沉淀，保留上清。B.向上清中加入8倍體積的10%的三氯乙酸-丙酮溶液(w/v，含0.07%的β-巰基乙醇)，于_20°C放置過夜。4°C下于2，5000g，離心25分鐘，棄上清，保留沉淀。C.向沉淀中加入8ml丙酮(含0. 07%的β -巰基乙醇)清洗沉淀，于_20°C放置 I小時(shí)，與B步驟相同條件下離心，棄上清，保留沉淀。D.重復(fù)步驟C 3-4次至離心管中蛋白質(zhì)沉淀發(fā)白，無雜色，棄上清，保留沉淀。E.將留有沉淀的離心管置于通風(fēng)櫥中，室溫下干燥20-30分鐘，得蛋白粉末。F.在含有蛋白粉末的離心管中加入400-500ul裂解液，室溫下裂解40_60分鐘。G. 4°C下于3，0000g，離心30分鐘，棄沉淀，保留上清，置于_80°C保存?zhèn)溆谩?)蛋白質(zhì)定量用Brandford法定量蛋白。3)雙向凝膠電泳水化及第一向等電聚焦電泳參照GE Healthcare公司儀器說明進(jìn)行。蛋白定量后， 取上樣水化液 8M 尿素，IM 硫脲，2% 的 CHAPS,0. 08% IPG buffer (PH4-7), 0. Olmg 溴酚藍(lán)， 用前加入65mM 二硫蘇糖醇稀釋成350ul溶液(含800ug蛋白質(zhì))，用Iml移液槍小心吸盡離心管中所有溶液，避免產(chǎn)生氣泡，再小心地打入Immobiline DryStrip泡漲盤(美國(guó)GE Healthcare)中，避免產(chǎn)生氣泡。將預(yù)先解凍的pH4_7的18cm的IPG膠條(購自美國(guó)GE Healthcare)膠面朝下放在泡漲盤中的溶液上，除去膠面與溶液之間的氣泡，使膠面與溶液充分接觸潤(rùn)濕，再用5ml礦物油覆蓋膠條，室溫下(25°C )放置12小時(shí)。用鑷子夾住IPG膠條的負(fù)極端，從Immobiline DryStrip泡漲盤中取出泡漲好的IPG膠條(泡漲好的膠條厚度約為1mm)，用Iml超純水沖洗IPG膠條的膠面，用濾紙小心吸掉IPG膠條上的超純水，再將IPG膠條轉(zhuǎn)至等電聚焦儀(Ettan IPGphor III，美國(guó)GE Healthcare)的Manifold膠條槽(美國(guó)GE Healthcare)上(膠面朝上，正極與IPGphor儀器陽極平臺(tái)接觸，負(fù)極與IPGphor儀器陰極接觸)，在IPG膠條的正負(fù)兩端各放置一張預(yù)先用125ul超純水潤(rùn)濕過的電極紙片，分別加上電極。接著進(jìn)行第一向等電聚焦電泳，具體參數(shù)設(shè)置如下一步升壓，100V/lh，200V/lh， 500V/lh，1000V/lh，逐步升壓 10000V/5h，然后 10000V 至累積電壓 75000Vhr，最后在 500V 恒壓下維持5h。以上操作可選擇的方式是蛋白定量后，取上樣水化液SM尿素，IM硫脲，2%的 CHAPS, O. 08% IPG buffer (PH4-7)，O. Olmg 溴酚藍(lán)，用前加入 65mM二硫蘇糖醇稀釋成 350ul 溶液(含800ug蛋白質(zhì))，用Iml移液槍小心吸盡離心管中所有溶液，避免產(chǎn)生氣泡，再小心地打入18cm的標(biāo)準(zhǔn)膠條槽中，避免產(chǎn)生氣泡。將預(yù)先解凍的pH4-7的18cm的IPG膠條(購自美國(guó)GE Healthcare)膠面朝下放入標(biāo)準(zhǔn)膠條槽中，除去膠面與溶液之間的氣泡，使膠面與溶液充分接觸潤(rùn)濕，再用2. 5ml礦物油覆蓋膠條，進(jìn)行等電聚焦。等電聚焦參數(shù)設(shè)置為 50V 水化 12h ;一步升壓，100V/lh, 200V/lh, 500V/lh, 1000V/lh ;逐步升壓 10000V/5h,然后 10000V至累積電壓75000Vhr，最后在500V恒壓下維持5h。等電聚焦結(jié)束后，膠條依次在平衡液I (6M Urean, 30 %甘油，2 % SDS, 50m molTris-Hcl, PH 8. 8,1 % DTT)和平衡液 II，(6M Urean，30 % 甘油，2 % SDS，50m mo I Tris-HCl, PH 8. 8,2. 5% IAA)中各平衡 15 分鐘。第二向SDS-PAGE在美國(guó)GE Healthcare公司，Ettan DALTsix垂直電泳儀上進(jìn)行，封膠瓊脂糖濃度為0. 5%，分離膠濃度為12. 5%，在15°C恒溫下，設(shè)置參數(shù)IW/膠條電泳
I.5h，再改成15W/膠條2. 5 3h。4)蛋白染色及凝膠圖像分析采用常規(guī)考馬斯亮藍(lán)R-250染色方法染色(染色液含R-2500. 1% (w/v),甲醇 40% (ν/ν)，冰醋酸10% (ν/ν)，定容后過濾)過夜，然后在脫色液(甲醇冰醋酸和去離子水體積比為I : I : 8)中脫色，反復(fù)更換脫色液直至蛋白點(diǎn)在背景上變成清晰。脫色至背景色透明后用LabScan圖像掃描軟件掃描，采用Imagemaster 2D Platinum6. O軟件分析處理圖像。本發(fā)明采用上述TCA-丙酮沉淀法來抽提西瓜葉片剩余低豐度蛋白質(zhì)，簡(jiǎn)化了蛋白質(zhì)抽提步驟，篩選出一種適合去除西瓜葉片Rubisco酶干擾的最佳PEG濃度。在同樣的上樣量(800ug)下，西瓜葉片全蛋白(圖2A，未加入PEG)的雙向電泳圖譜上共分離到523± 12 個(gè)蛋白點(diǎn)，采用18% PEG沉淀西瓜葉片的Rubisco后,對(duì)上清(即剩余的蛋白質(zhì))進(jìn)行雙向電泳，共分離到776±24個(gè)蛋白點(diǎn)，Rubisco的大小亞基大多消失，大部分蛋白點(diǎn)表達(dá)量上調(diào)，大量豐度較低的蛋白點(diǎn)在雙向電泳圖譜上達(dá)到可分離的強(qiáng)度，且表達(dá)量較高，尤其是分子量較低的蛋白(分子量低于25. OkDa的蛋白，共63±15個(gè))(圖2B和表I)。表I采用Imagemaster 6. O對(duì)圖2所得雙向電泳圖譜分離到的總蛋白點(diǎn)和差異蛋白點(diǎn)的統(tǒng)計(jì)分析
項(xiàng)目全蛋白(個(gè))沉淀Rubsico后的剩余蛋白(個(gè))總蛋白523±12776±24表達(dá)量上調(diào)的蛋白466±11表達(dá)量下調(diào)或消失的蛋白47±5新出現(xiàn)的蛋白253±18分子量低于25. OkDa的新蛋白63±1權(quán)利要求
1.一種簡(jiǎn)便、有效、快速去除西瓜葉片Rubisco的方法,其特征在于利用18% (w/v)的 PEG-4000去除西瓜葉片中的Rubisco。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于該方法具體為采集西瓜成熟葉片，置于研磨中，加入液氮研磨至粒徑為O. Olmm O. 05mm粉末，迅速轉(zhuǎn)至離心管中，在離心管中按體積比I : 3加入預(yù)冷勻漿緩沖液后混勻，將離心管水平置于冰上孵育10分鐘，4°C下于 1500g,離心3分鐘,棄沉淀,保留上清，4°C下于1，5000g,離心20分鐘,棄沉淀,保留上清； 在上清液中加入18%的PEG-4000，水平置于冰上孵育20分鐘，4°C下于1，5000g,離心25分鐘，棄沉淀，保留上清。
3.—種去除西瓜葉片Rubisco干擾,分離剩余蛋白質(zhì)的方法,其特征在于先利用18% (w/v)的PEG-4000去除西瓜葉片中的Rubisco,再通過TCA-丙酮沉淀法來抽提剩余蛋白質(zhì)，最后再利用雙向電泳分離西瓜葉片剩余蛋白質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于該方法包括如下步驟A)采集西瓜成熟葉片，置于研磨中，加入液氮研磨至粒徑為O.Olmm O. 05mm粉末，迅速轉(zhuǎn)至離心管中，在離心管中按體積比I : 3加入預(yù)冷勻漿緩沖液后混勻，將離心管水平置于冰上孵育10分鐘，4°C下于1500g，離心3分鐘，棄沉淀，保留上清，4°C下于1，5000g，離心 20分鐘,棄沉淀,保留上清；B)在上清液中加入18%的PEG-4000，水平置于冰上孵育20分鐘，4°C下于1，5000g，離心25分鐘,棄沉淀,保留上清；C)在提取的上清中加入8倍體積的10%(w/v)三氯乙酸-丙酮溶液，于_20°C放置過夜，所述的10% (w/v)三氯乙酸-丙酮溶液中含有O. 07%的β-巰基乙醇；D)取出離心管，4°C下于2，5000g，離心25分鐘，棄上清，保留沉淀，加入含8mlO. 07% 的巰基乙醇的丙酮溶液清洗沉淀，于_20°C放置I小時(shí)，于4°C下2，5000g，離心25分鐘，棄上清，保留沉淀；重復(fù)上述洗滌離心操作4次至離心管中蛋白質(zhì)沉淀發(fā)白，無雜色，棄上清，保留沉淀；E)將留有沉淀的離心管置于通風(fēng)櫥中，室溫下干燥20-30分鐘，得蛋白粉末；F)在含有蛋白粉末的離心管中加入裂解液，室溫下放置40-60分鐘；G)4°C下于3，OOOOg，離心30分鐘，棄沉淀，保留上清，置于_80°C保存?zhèn)溆?；H)對(duì)步驟G所得上清先進(jìn)行等電聚焦電泳，再進(jìn)行垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，步驟A中所述的勻漿緩沖液為0.5M的Tris-HCl (pH8.3)，含 2% (v/v)的 NP-40，20mM MgC12,2% (v/v)的 β-巰基乙醇和 1% (ν/ν)的 PMSF。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，步驟F中所述的裂解液含SM尿素，IM硫脲，2%的 CHAPS, 65mM DTT，0.08% 的 IPG buffer (pH4_7)。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述等電聚焦電泳中，蛋白質(zhì)上樣量為 800ug/18cm膠條，所述聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠濃度為12. 5 %，采用的染色方法為常規(guī)考馬斯亮藍(lán)R-250方法。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種去除植物葉片Rubisco，富集和分離剩余蛋白質(zhì)的電泳方法。該方法先利用18％的PEG-4000去除西瓜葉片中的Rubisco，再通過TCA-丙酮沉淀法抽提剩余蛋白質(zhì)，進(jìn)行雙向電泳分離西瓜葉片剩余蛋白質(zhì)。與全蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜相比，采用18％PEG沉淀西瓜葉片Rubsico后，Rubsico的大小亞基大部分消失，剩余的蛋白點(diǎn)大部分表達(dá)量均上調(diào)，分離到的蛋白質(zhì)增加了48.4％，在分子量小于25.0kDa的區(qū)域出現(xiàn)大量新的蛋白點(diǎn)(63±15個(gè))，經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)證明，重復(fù)性好，圖譜清晰，結(jié)果可靠。
文檔編號(hào)C07K1/28GK102584972SQ201210058590
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月7日
發(fā)明者嚴(yán)蓓, 何立中, 孫錦, 李斌, 郭世榮, 陽燕娟 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)