專利名稱：艾滋病病毒感染的診斷標(biāo)記Talin 1片段及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種艾滋病病毒感染的的診斷標(biāo)記。具體而言，涉及一種以Talin I片段為核心的艾滋病診斷標(biāo)記及其試劑盒。本發(fā)明還提供了相應(yīng)試劑盒的使用方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
艾滋病，即獲得性免疫缺陷綜合癥(又譯:后天性免疫缺陷癥候群)，英語縮寫AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome)的音譯。分為兩型:HIV-1 型和 HIV-2 型，是人體注射感染了“人 類免疫缺陷病毒”(HIV-human immunodeficiency virus)(又稱艾滋病病毒)所導(dǎo)致的傳染病。艾滋病被稱為“史后世紀(jì)的瘟疫”，也被稱為“超級癌癥”和“世紀(jì)殺手”。艾滋病，是種人畜共患疾病，由感染"HIV"病毒引起。HIV是一種能攻擊人體免疫系統(tǒng)的病毒。它把人體免疫系統(tǒng)中最重要的T4淋巴組織作為攻擊目標(biāo)，大量破壞T4淋巴組織,產(chǎn)生高致命性的內(nèi)衰竭。這種病毒在地域內(nèi)終生傳染,破壞人的免疫平衡,使人體成為各種疾病的載體。艾滋病病毒感染者從感染初期算起，要經(jīng)過數(shù)年、甚至長達(dá)10年或更長的潛伏期后才會發(fā)展成艾滋病病人。艾滋病病人因抵抗能力極度下降會出現(xiàn)多種感染，如帶狀皰疹、口腔霉菌感染、肺結(jié)核，特殊病原微生物引起的腸炎、肺炎、腦炎，念珠菌，肺囊蟲等多種病原體引起的嚴(yán)重感染等，后期常常發(fā)生惡性腫瘤，直至因長期消耗，全身衰竭而死亡。艾滋病嚴(yán)重地威脅著人類的生存，已引起世界衛(wèi)生組織及各國政府的高度重視。艾滋病在世界范圍內(nèi)的傳播越來越迅猛，嚴(yán)重威脅著人類的健康和社會的發(fā)展，已成為威脅人們健康的第四大殺手。聯(lián)合國艾滋病規(guī)劃署2006年5月30日宣布自1981年6月首次確認(rèn)艾滋病以來，25年間全球累計有6500萬人感染艾滋病毒，其中250萬人死亡。雖然全世界眾多醫(yī)學(xué)研究人員付出了巨大的努力，但至今尚未研制出根治艾滋病的特效藥物，也沒有可用于預(yù)防的有效疫苗。目前，這種病死率幾乎高達(dá)100%的"超級癌癥"已被我國列入乙類法定傳染病，并被列為國境衛(wèi)生監(jiān)測傳染病之一。故此我們把其稱為"超級絕癥"。艾滋病病毒屬于RNA病毒，由于RNA是單鏈,它不如DNA雙鏈那樣穩(wěn)定,所以艾滋病病毒的突變頻率極高，給研制疫苗帶來巨大的困難。而且艾滋病病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒，所謂逆轉(zhuǎn)錄病毒是它在侵入宿主細(xì)胞后，以自己的單鏈RNA為模板，按照堿基互補(bǔ)配對原則，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，合成cDNA，新合成的cDNA插入宿主的核DNA中，隨宿主DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯達(dá)到擴(kuò)增目的病毒。艾滋病的治療方法有:營養(yǎng)治療、干細(xì)胞骨髓移植、水果治療、抗HIV病毒藥、免疫調(diào)節(jié)藥物、手術(shù)治療、疫苗療法等等。但是，目前尚無預(yù)防艾滋病的有效疫苗。艾滋病檢測原則，是指采用實驗室方法對人體血液、其他體液、組織器官、血液衍生物等進(jìn)行艾滋病病毒、艾滋病病毒抗體及相關(guān)免疫指標(biāo)檢測。
艾滋病的診斷依據(jù)主要以病毒抗體陽性為主，輔以下列任何一項者，可為實驗確診艾滋病病人。(I)近期內(nèi)(3-6個月)體重減輕10%以上，且持續(xù)發(fā)熱達(dá)38°C—個月以上。(2)近期內(nèi)(3-6個月)體重減輕10%以上，持續(xù)腹瀉(每日達(dá)3-5次)一個月以上。(3)卡氏肺囊蟲肺炎(PCR)。(4)卡波濟(jì)肉瘤KS。(5)明顯的霉菌或其他條件致病感染。艾滋病病毒在人體內(nèi)的潛伏期平均為8年至9年，在發(fā)展成艾滋病病人以前，病人外表看上去正常，他們可以沒有任何癥狀地生活和工作很多年。HIV本身并不會引發(fā)任何疾病，而是當(dāng)免疫系統(tǒng)被HIV破壞后，人體由于抵抗能力過低，喪失復(fù)制免疫細(xì)胞的機(jī)會，并感染其它的疾病導(dǎo)致各種疾病復(fù)合感染而死亡。如何較早的確診艾滋病病毒感染者是本領(lǐng)域的重要課題之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的問題提供一種艾滋病病毒載量檢測的診斷標(biāo)記，幫助診斷艾滋病病毒感染者，尤其是針對潛伏期、病毒載量較低的患者。本發(fā)明要解決的另一個問題提供一種艾滋病病毒感染的診斷試劑盒。本發(fā)明基于下面的發(fā)明構(gòu)思:研究表明，talin I蛋白質(zhì)的分子量較低片段在HIV感染者中上調(diào)，且目的片段位于C端`，說明Talin-1的片段化與HIV的感染緊密相關(guān)。通過檢測HIV感染者和健康志愿者的單個核細(xì)胞中蛋白質(zhì)組，發(fā)現(xiàn)HIV感染者體內(nèi)約38Kda大小的Talin-1片段表達(dá)量增加顯著，而且該Talin-1片段的表達(dá)量與病毒載量負(fù)相關(guān)。這種負(fù)相關(guān)性提示，新生成的片段化的Talin-1可以作為一個新型艾滋病感染初期的臨床監(jiān)測指標(biāo)。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步完成本發(fā)明。本發(fā)明提供了一種艾滋病病毒感染的診斷標(biāo)記，所述的診斷標(biāo)記是Talin I片段；所述的Talin I片段如SEQ ID NO I或者SEQ ID NO 2所示。所述的診斷標(biāo)記可以由SEQ ID NO I所示的多肽和SEQ ID NO 2所示的多肽組成。這兩條多肽鏈各自為一個獨立的單位，既可以各自為獨立的多肽鏈，也可以從屬于同一條多肽鏈，即以先后順序連接于同一條多肽鏈上，中間間隔一個或者若干個氨基酸殘基。所述的診斷標(biāo)記也可以是Talin I片段的DNA編碼序列；所述的Talin I片段如SEQ ID NO I 或者 SEQ ID NO 2 所示。所述的診斷標(biāo)記可以由SEQ ID NO I所示多肽的DNA編碼序列和SEQ ID NO 2所示多肽的DNA編碼序列組成。這兩條DNA鏈各自為一個獨立的單位，既可以各自處于獨立的DNA鏈，也可以從屬于同一條DNA鏈，即以先后順序連接于同一條多肽鏈上，兩者中間間隔一個或者若干個核苷酸。本發(fā)明還提供了上述診斷標(biāo)記的應(yīng)用，簡而言之，將樣本與上述任意一種診斷標(biāo)記進(jìn)行對比，檢測樣本中是否含有上述診斷標(biāo)記。較好的，可以進(jìn)一步檢測樣本中含有所述診斷標(biāo)記的數(shù)量。在本發(fā)明的一個實施例中，檢測Talin I片段的方法如下:收集外周血，分離培養(yǎng)外周血單個核細(xì)胞，取蛋白樣品，利用免疫印跡分析方法檢測其中Talin I片段的含量。本發(fā)明提供了一種診斷艾滋病的試劑盒，該試劑盒含有上述任意一種的診斷標(biāo)記。所述的試劑盒還含有分子量標(biāo)記試劑。此外，還可以含有緩沖液，小分子量的蛋白或者核酸標(biāo)記，內(nèi)參試劑或者說明書，等。本發(fā)明的一方面，提供了一種分離的Talin I片段多肽，它包括:具有SEQ ID NO:Ih或者2的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO:1或者2的氨基酸序列的多肽。本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離的Talin I片段多肽的多核苷酸編碼序列，它包括:具有SEQ ID NO:1或者2的氨基酸序列的多核苷酸編碼序列及其簡并序列。該簡并序列是指，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO:1或者2的核苷酸編碼序列同源性低至約70%的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO:1或者2所述的氨基酸序列。實踐中，可以根據(jù)Talin I片段多肽的氨基酸序列人工合成該多肽。也可以將本發(fā)明的Talin I片段多肽的編碼序列與載體連接，用于擴(kuò)增或者表達(dá)Talin I片段多肽。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種產(chǎn)生具有Talin I片段多肽的方法，該方法包括:(a)將編碼Talin I片段多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成Talin I片段多肽表達(dá)載體，所述的Talin I片段多肽與SEQ ID NO:1或者2的氨基酸序列相同； (b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成Talin I片段多肽的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)Talin I片段多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有Talin I片段多肽活性的多肽。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種檢測艾滋病病毒感染的方法，該方法包括:收集待檢測者的血樣或者體液，檢測其中Talin I片段多肽的含量。在一個實施例中，提供了待測樣本是否存在Talin I片段多肽的方法，它包括步驟:將待測樣品與抗Talin I片段多肽的特異性抗體接觸；檢測是否形成了免疫復(fù)合物，形成免疫復(fù)合物就表示該待測樣本含有Talin I片段多肽。實踐中，還可以通過檢測樣本中是否存在Talin I多肽的核酸編碼序列，它包括步驟:用Talin I片段多肽編碼序列的特異性引物，用RT-PCR法擴(kuò)增該樣本的mRNA ;檢測是否有預(yù)計Talin I片段多肽擴(kuò)增產(chǎn)物，存在擴(kuò)增產(chǎn)物就表示該樣本發(fā)生了艾滋病毒感染。在另一實施例中，該方法是通過檢測樣本中是否存在Talin I片段多肽的轉(zhuǎn)錄本，它包括步驟:用Talin I片段多肽核酸編碼序列的特異性探針，與該樣本的cDNA樣品雜交；檢測是否有雜交產(chǎn)物，存在雜交產(chǎn)物就表示該樣本發(fā)生了艾滋病毒感染。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種檢測艾滋病病毒感染的試劑盒，它含有:(I)特異性擴(kuò)增Talin I片段核酸編碼序列的引物對，(2)任選的逆轉(zhuǎn)錄mRNA所需的試劑。另一種檢測艾滋病病毒感染的試劑盒，含有針對Talin I片段多肽的特異性的抗體。另一種檢測艾滋病病毒感染的試劑盒，含有可特異性地與Talin I片段多肽的mRNA雜交的探針。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體。比如，選用市售的載體，然后將編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，可以形成蛋白表達(dá)載體。如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA ;如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰近，而對于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞、和哺乳動物細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞等。另一方面，本發(fā)明還包括對Talin I片段多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于Talin I片段多肽。較佳地，指那些能與Talin I片段多肽結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制Talin I片段多肽的分子，也包括那些并不影響Talin I片段多肽功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的Talin I片段多肽結(jié)合的抗體。本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段,如Fab’或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利N0.4，946，778);或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的Talin I片段多肽或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)Talin I片段多肽或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見 Kohler 等人，Nature 256 ；495,1975 ；Kohler 等人，Rur.T.Tmmunol.6:511,1976 ；Kohler 等人，Rur.T.Tmmunol.6:292,1976 ；Hammerling 等人，In Monoclonal Antibodiesand T Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y., 1981) 本發(fā)明的抗體包括能阻斷 Talin I 片段多肽功能的抗體以及不影響Talin I片段多肽功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用Talin I片段多肽的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與Talin I片段多肽的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而獲得。本發(fā)明首次提供了可以作為艾滋病病毒感染診斷標(biāo)記的Talin-1片段及其試劑盒。使用該診斷標(biāo)記或者試劑盒篩選艾滋病病毒感染患者，方法簡單，操作方便，成本低廉，通俗易懂，能夠較快的提 供診斷結(jié)果，幫助感染患者盡早了解病情，制定治療方案，控制病情。尤其適于檢測艾滋病病毒病毒載量低的樣本。本發(fā)明的診斷標(biāo)記可以與其他診斷方法或者診斷標(biāo)記聯(lián)合使用，以進(jìn)一步提高診斷的準(zhǔn)確率和敏感性。


圖1是HIV患者中Talin-1片段化的電泳局部放大圖。其中，NI，N2，和N3表示健康人血漿的三次重復(fù)實驗，Hl，H2和H3表示未經(jīng)HAART治療的艾滋病患者標(biāo)本。圖中的TLNl基本發(fā)明的Tal in-1。圖2是質(zhì)譜鑒定talin-Ι的38KDa片段信息。圖3是在11個健康志愿者和12個艾滋病患者的PBMC中免疫印跡分析talin I的38KDa片段的表達(dá)。圖4是38KDa附近的Talin-1片段的量與病毒載量負(fù)相關(guān)圖。圖5是MRM定量檢測Talin-1C端肽段。其中1_4為低病毒載量標(biāo)本，5-7為正常標(biāo)本，8-10為高病毒載量標(biāo)本。圖6是HIV假病毒感染TZM-bl細(xì)胞后Talin-1的片段化及對應(yīng)階段的細(xì)胞凋亡檢測。圖7是病毒載量相關(guān)的細(xì)胞凋亡檢測。對3.2中的細(xì)胞模型通常進(jìn)行caspase的免疫印跡實驗，結(jié)果表明:整個假病毒刺激過程中細(xì)胞均未發(fā)生明顯的凋亡。
具體實施例方式實施例12DE-MS在HIV感染者中首次發(fā)現(xiàn)Talin-1片段化采用2DE-MS的技術(shù)路線檢測未經(jīng)HAART治療的HIV感染者和健康志愿者的單個核細(xì)胞中蛋白質(zhì)組，發(fā)現(xiàn)talin l,v`inculin,filamin A等蛋白質(zhì)的分子量較低片段在HIV感染者中上調(diào)(見圖1)，且目的片段位于C端。圖中的TLNl基本發(fā)明的Tal in-1。這一結(jié)果提示:在未經(jīng)過HAART治療的HIV感染者中，Talin-1在其C端發(fā)生了片段化，并且在臨床樣本中得到了很好的驗證。實施例2生物信息學(xué)驗證Talin I及其相互作用蛋白質(zhì)與HIV蛋白質(zhì)的相關(guān)性采用STRING 8.0軟件(http://string, embl.de)以及HIV與宿主細(xì)胞相互作用的數(shù)據(jù)庫(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/RefSeq/HIVInteractions.)分析了 talin I 與HIV蛋白質(zhì)和宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的相互作用，發(fā)現(xiàn)talin I參與了 HIV的pol和vif基因調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)。這與圖1的結(jié)果一致:這個網(wǎng)絡(luò)中的幾個蛋白質(zhì)都在HIV感染者中有表達(dá)上調(diào)的片段(見圖1)。表明=Talin-1的片段化并非是一種獨立的偶然現(xiàn)象，而是位于一個復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)之中。因此其片段化非常有可能是一種宿主面對HIV入侵采取的主動反應(yīng)，從而影響病毒的進(jìn)一步感染。實施例3在臨床標(biāo)本中檢查talin-Ι片段與HIV病毒載量的關(guān)系3.1.Western Blotting檢測Talin-1片段與HIV病毒載量的關(guān)系收集經(jīng)HAART治療6個月后病毒載量低于50或高于70的患者EDTA抗凝全血，分離PBMC，等量蛋白質(zhì)(50 μ g)上樣，用抗talin-1的一抗進(jìn)行免疫印跡實驗。結(jié)果顯不:38KDa附近的Talin-Ι片段的量與病毒載量負(fù)相關(guān)(圖4)。3.2MRM實驗定量talin I的片段A.非冗余肽段篩選
根據(jù)質(zhì)譜鑒定的肽段，初步預(yù)測38KDa片段為talin I的C-端片段。然后分析并最終選擇了 VGAIPANALDDGQWSQGLISAAR(SEQ ID NO I)和 LAQAAQSSVATITR(SEQ ID NO 2)這兩個Talin-1的unique peptide作為對Talin-1進(jìn)行質(zhì)譜定量檢測的依據(jù)。B.多肽的定量分析采用戴安納升液相色譜Ultra3000串聯(lián)布魯克離子阱質(zhì)譜HCT進(jìn)行Talin-1MRM定量檢測。取4個HIV病毒載量< 50艾滋病人、3個健康人和3個HIV病毒載量> 50的艾滋病人PBMC標(biāo)本，提取全細(xì)胞蛋白質(zhì)，測定蛋白含量后，各取50ug進(jìn)行一維SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色。切取38kDa的條帶，脫色脫水凍干后，用DTT和IAA進(jìn)行還原烷基化，每管中加入約20 μ I胰酶(0.02μ g/μ I)。37°C酶解過夜(16 18h)。酶切肽段進(jìn)行萃取后，通過戴安納升級液相色譜Ultimate 3000串聯(lián)高容量離子阱質(zhì)譜(LC-MS/MS)進(jìn)行MRM 定量檢測。肽段樣品先經(jīng)過C18預(yù)柱(300 μ m id x5mm, 5 μ m)脫鹽，流速為20μ L/min，流動相為2% ACN和0.1% FA。然后以300nL/min的流速經(jīng)C-18反向柱(75 μ m內(nèi)徑X 15cm長度,3 μ m)進(jìn)行分離，色譜的梯度為4_48 %，梯度時間為60min。通過C18色譜柱分離的肽段由納流噴針進(jìn)入HCT質(zhì)譜進(jìn)行實時的離子化分析檢測。選取Talin-1C 端肽段 m/z770.8 (序列為 VGAIPANALDDGQffSQGLISAAR)和 m/z 708.9 (序列為LAQAAQSSVATITR)進(jìn)行MRM的定量檢測，相應(yīng)的子離子分別為y4(m/z 404.2)和y5 (m/z561.3)，設(shè)定色譜梯度運(yùn)行到20-28min時質(zhì)譜MRM檢測離子對770.8/404.2，30.5_42min時 MRM 檢測 708.9/561.3。結(jié)果見圖5。結(jié)果表明，HIV病毒載量< 50的4個標(biāo)本均能檢測到兩條Talin-1肽段，3個正常標(biāo)本中只有I個可以檢測到Talin-1肽段，而病毒載量> 50的3個標(biāo)本中也僅有I個標(biāo)本可以同時檢測到兩條talin-Ι肽段。該結(jié)果說明了 Talin-1片段化與病毒載量呈負(fù)相關(guān)。MRM結(jié)合Western Blotting結(jié)果表明，Talin-Ι的片段化與HIV病毒載量呈現(xiàn)強(qiáng)烈的負(fù)相關(guān)性，為本發(fā)明提供了有力的佐證。因為如果Talin-1的片段化只是毫無意義的單純蛋白質(zhì)降解引起或者是促進(jìn)病毒在宿主體內(nèi)的增殖，那么，其片段化應(yīng)該與病毒載量呈正相關(guān)。而恰是這種負(fù)相關(guān)性暗示，新生成的片段化的Talin-1很可能是具備抑制HIV效應(yīng)的功能肽段，可以作為一個新型艾滋病感染初期的臨床監(jiān)測指標(biāo)。實施例4在細(xì)胞模型中驗證Talin-1發(fā)生片段化的時間節(jié)點首先在293T細(xì)胞中包裝獲得功能性HIV假病毒，獲得假病毒后經(jīng)滴度測定，用活性HIV假病毒攻毒TZM-bl細(xì)胞系，分別在共孵育后0.5，1,2,4,8,12，24,48和72小時收集等量細(xì)胞，裂解獲得細(xì)胞總蛋白，隨即進(jìn)行talin I的Western Blotting。實驗結(jié)果顯示38KDa片段的表達(dá)從2h開始增加，2到48小時保持基本不變，72小時后表達(dá)量相對減少(圖 6)。這個結(jié)果提示=Talinl的片段化可能在病毒入侵細(xì)胞階段已經(jīng)發(fā)生。此外，整個感染過程未檢測到凋亡發(fā)生，表明Talin-1片段化并非凋亡誘導(dǎo)切割所致。實施例5 Talin-1片段化并非由細(xì)胞凋亡引起為了了解片段化是由否由于病毒感染導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡所致，對實施例3中用到的臨床樣品，進(jìn)行凋亡程度檢測，根據(jù)caspase中35和17KDa兩條免疫印跡雜交帶的強(qiáng)弱進(jìn)行判斷。WB分析Caspase-3切割與HIV-1載量的關(guān)系，結(jié)果顯示，雖然在病毒載量低于50個拷貝/ml時，仍然能檢測到Caspase-3的切割，但在更高的病毒拷貝含量樣本中，可以檢測到更多的Caspase-3切割，提示高病毒載量樣本中的低Talin-1片段化不是由于凋亡增多引起的蛋白廣泛降解所導(dǎo)致(圖7)。對實施例4中的細(xì)胞模型通常進(jìn)行caspase的免疫印跡實驗，結(jié)果表明:整個假病毒刺激過程中細(xì)胞均未發(fā)生明顯的凋亡( 見圖6)。根據(jù)上述實驗結(jié)果認(rèn)為，Talin-1的片段化與細(xì)胞凋亡之間沒有明顯的相關(guān)性。SEQUENCE LISTING
<110>上海市公共衛(wèi)生臨床中心
〈120〉艾滋病病毒感染的診斷標(biāo)記Talin I片段及其應(yīng)用〈130〉 201191〈160〉 2
<170> PatentIn version 3.1
〈210〉I
〈211〉23
〈212〉PRT〈213〉人工合成
〈400〉 I
Val Gly Ala He Pro Ala Asn Ala Leu Asp Asp Gly Gln Trp Ser Gln151015
Gly Leu He Ser Ala Ala Arg20
〈210〉 2〈211〉 14 〈212〉 PRT〈213〉人工合成
權(quán)利要求
1.一種艾滋病病毒感染的診斷標(biāo)記，其特征在于，所述的診斷標(biāo)記是Talin I片段；所述的Talin I片段如SEQ ID NO I或者SEQ ID NO 2所示。
2.如權(quán)利要求1所述的診斷標(biāo)記，其特征在于，所述的診斷標(biāo)記由SEQID NO I所示的多肽和SEQ ID NO 2所示的多肽組成。
3.一種艾滋病病毒感染的診斷標(biāo)記，其特征在于，所述的診斷標(biāo)記是Talin I片段的DNA編碼序列；所述的Talin I片段如SEQ ID NO I或者SEQ ID NO 2所示。
4.如權(quán)利要求3所述的診斷標(biāo)記，其特征在于，所述的診斷標(biāo)記由SEQID NO I所示氨基酸序列的DNA編碼序列和SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的DNA編碼序列組成。
5.權(quán)利要求1-4中任意一種診斷標(biāo)記的應(yīng)用，其特征在于，將樣本與權(quán)利要求1-4中任意一種診斷標(biāo)記進(jìn)行對比，檢測樣本中是否含有權(quán)利要求1-4中任意一種診斷標(biāo)記。
6.權(quán)利要求1-4中任意一種診斷標(biāo)記的應(yīng)用，其特征在于，檢測樣本中含有所述診斷標(biāo)記的數(shù)量。
7.權(quán)利要求1所述診斷標(biāo)記的應(yīng)用方法，其特征在于，該方法依次包括如下步驟: (1)收集待測外周血樣本； (2)分離、培養(yǎng)外周血單個核細(xì)胞； (3)取蛋白樣品； (4)利用免疫印跡分析方法檢測其中TalinI片段的含量。
8.—種診斷艾滋病病毒感染的試劑盒，其特征在于，該試劑盒含有權(quán)利要求1-4中任意一種的診斷標(biāo)記。
9.如權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還含有分子量標(biāo)記試劑。
10.如權(quán)利要求8所述試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還含有TalinI片段的抗體。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種艾滋病病毒感染的的診斷標(biāo)記。本發(fā)明首次提供了可以作為艾滋病病毒感染診斷標(biāo)記的Talin-1片段及其試劑盒，所述的Talin 1片段如SEQ ID NO 1或者SEQ ID NO 2所示。本發(fā)明還提供了相應(yīng)的試劑盒及其應(yīng)用。使用該診斷標(biāo)記或者試劑盒篩選艾滋病病毒感染患者，方法簡單，操作方便，成本低廉，通俗易懂，能夠較快的提供診斷結(jié)果，幫助感染患者盡早了解病情，制定治療方案，控制病情。尤其適于檢測艾滋病病毒病毒載量低的樣本。本發(fā)明的診斷標(biāo)記可以與其他診斷方法或者診斷標(biāo)記聯(lián)合使用，以進(jìn)一步提高診斷的準(zhǔn)確率和敏感性。
文檔編號C07K7/08GK103172707SQ20111043982
公開日2013年6月26日 申請日期2011年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月23日
發(fā)明者張麗軍, 賈小芳, 馬芳, 姚亞敏, 盧洪洲 申請人:上海市公共衛(wèi)生臨床中心