專利名稱：一種植物滲透或水分變化原初感應(yīng)的蛋白分子、及其基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，涉及一種植物體內(nèi)的滲透變化或水分感應(yīng)的蛋白分子、及其基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物感知、適應(yīng)逆境涉及一系列復(fù)雜的基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，細(xì)胞受到逆境脅迫之后，通過(guò)感應(yīng)分子的作用能迅速感知外界信號(hào)，依靠復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，一方面激活特定轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，與特定的順時(shí)作用元件結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，另一個(gè)方面， 在翻譯后水平激活特異的修飾蛋白，調(diào)節(jié)靶蛋白和靶基因，最終提高植物的耐逆性。植物在從感知脅迫的信號(hào)到基因表達(dá)產(chǎn)生適應(yīng)性的過(guò)程中，進(jìn)化出一系列復(fù)雜機(jī)制以最大限度減輕脅迫傷害，其中一些基因在快速應(yīng)答的過(guò)程中起了至關(guān)重要的作用，它們成為將物理性的逆境信號(hào)，如干旱、高溫、低溫等逆境，轉(zhuǎn)化為生化信號(hào)的原初載體，脫水或滲透勢(shì)的變化是這類逆境反應(yīng)的共同特征，即引起細(xì)胞模形變的機(jī)械刺激，在轉(zhuǎn)錄水平上，植物中發(fā)現(xiàn)了一類快速應(yīng)答誘導(dǎo)基因，命名為ERD基因(脫水誘導(dǎo)早期應(yīng)答基因) (Taji T，et al.，1999)，主要結(jié)果局限在擬南芥的研究，然而原初的信號(hào)接收分子，卻一直是一個(gè)不解之謎。在擬南芥中已經(jīng)找到16個(gè)ERD成員，這些基因分別屬于葉綠體ATP蛋白依賴酶， 熱激蛋白hsp70-l和hsp80-2、質(zhì)膜蛋白、脯氨酸脫氫酶、糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、衰老誘導(dǎo)基因，硫代谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、II型LEA蛋白、茉莉酸甲酯合成酶和泛素蛋白等。ERDl基因是擬南芥中研究比較深入的一個(gè)脫水誘導(dǎo)早期應(yīng)答基因，編碼一個(gè)類似葉綠素蛋白酶的調(diào)節(jié)亞基(Nakashima K, et, al. 1997，Lam-Son P T, et, al. ,2007) ERD2、ERD8和ERD16受干旱脅迫強(qiáng)烈表達(dá)，分別屬于熱激蛋白hsp70-l、hsp80-2和泛素蛋白(Kiyosue T，et, al.，1994)。ERD4編碼一個(gè)膜蛋白，推測(cè)有9個(gè)跨膜區(qū)，但它的功能目前還不清楚(Froehlich J E，et, al，，2003)。ERD5編碼脯氨酸脫氫酶O^roDH)，催化脯氨酸轉(zhuǎn)化成谷氨酸的第一步反應(yīng)(Nakashima K，et, al.，1998)。ERD6是在擬南芥干旱脅迫 Ih后獲得的，研究表明該基因編碼的蛋白具有12個(gè)跨膜區(qū)，并且有一個(gè)親水中心，屬于糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，受干旱和冷誘導(dǎo)表達(dá)(Kiyosue T，et, al, .1998)。ERDlO和ERD14屬于II型 LEA蛋白家族(Kiyosue T，et，al.，1994)。ERD14在磷酸化的狀態(tài)下具有離子結(jié)合的活性， 主要結(jié)合Ca2+和!^e2+離子，它的作用機(jī)制還在研究中(Muath KA，et，al.，2003)。ERDll和 ERD13編碼的產(chǎn)物屬于硫代谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(Kyiosue T，et, al.，1993)。ERD15可能是一個(gè)新的與ABA信號(hào)脅迫相關(guān)的調(diào)節(jié)器，該基因的功能和作用機(jī)制還需要深入研究(Kariola T，et, al.，2006)。綜上所述，在擬南芥中獲得的16個(gè)ERD基因?qū)儆诓煌幕蚣易澹饔貌煌拇x途徑，它們可能分別通過(guò)感知并傳遞信號(hào)脅迫，產(chǎn)生功能蛋白，參與重要的代謝反應(yīng)，降解毒素等不同的方式增強(qiáng)擬南芥的耐逆性。水分的重要性不言而喻，越來(lái)越嚴(yán)重的干旱等逆境脅迫對(duì)作物產(chǎn)量的影響尤為嚴(yán)重，從感應(yīng)水分的原初反應(yīng)出發(fā)，發(fā)掘關(guān)鍵的分子開(kāi)關(guān)基因，并對(duì)其功能進(jìn)行深入的解析， 從而利用這一分子的特性，不僅可以為抗旱(逆)育種提供具有巨大應(yīng)用價(jià)值的基因資源， 也可以為人類應(yīng)對(duì)水分的流失或皮膚的衰老提供全新的防護(hù)理論。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明人為了解決上述問(wèn)題提出并完成了這一發(fā)明。本發(fā)明的目的是提供一種植物體內(nèi)的滲透或水分變化感應(yīng)的蛋白分子。本發(fā)明的再一目的是提供一種植物體內(nèi)的滲透或水分變化感應(yīng)的基因。本發(fā)明的再一目的是提供上述植物體內(nèi)的滲透或水分變化感應(yīng)蛋白分子的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的植物體內(nèi)的滲透變化或水分感應(yīng)的蛋白分子，其氨基酸序列如SEQ ID No. 1 所示。根據(jù)本發(fā)明的植物體內(nèi)的滲透變化或水分感應(yīng)的基因，編碼上述蛋白分子，優(yōu)選地，其核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。本發(fā)明還提供了上述植物體內(nèi)的滲透或水分變化感應(yīng)的蛋白分子作為鈣離子通道的應(yīng)用。鈣離子作為細(xì)胞的第二信使，其胞內(nèi)濃度的變化或者說(shuō)波動(dòng)，可以啟動(dòng)一系列的生理反應(yīng)過(guò)程，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案，所述鈣離子通道的定義為鈣離子通道是可以介導(dǎo)鈣離子快速跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的分子結(jié)構(gòu)，細(xì)胞內(nèi)鈣離子的波動(dòng)，主要是依賴鈣離子通道的調(diào)控。細(xì)胞的滲透勢(shì)可以幫助維持細(xì)胞的形狀，物質(zhì)的流動(dòng)，滲透勢(shì)的變化，反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)水分和離子濃度的變化，也會(huì)引起細(xì)胞形狀的變化。本發(fā)明發(fā)明闡述了 AtERDRTOS分子，據(jù)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析具有兩個(gè)明顯的功能區(qū)，首先是作為水分變化的感應(yīng)分子，其中一部分(如膜外結(jié)構(gòu)域)能感知滲透勢(shì)引起的細(xì)胞膜的輕微變動(dòng)，并將這種變化傳導(dǎo)到分子的另一部分(通道結(jié)構(gòu)域)，通過(guò)這一分子的通道結(jié)構(gòu)部分，行使鈣通道的功能，將原初感知、傳遞和啟動(dòng)鈣第二信使合為一個(gè)分子，這也是本發(fā)明的一個(gè)最重要的特性，也是30多年來(lái)，很多研究者孜孜以求，而未發(fā)現(xiàn)的原初信號(hào)感應(yīng)、接收分子。本發(fā)明還提供了包含上述植物體內(nèi)的滲透變化或水分感應(yīng)的基因的植物表達(dá)載體。本發(fā)明還提供了上述植物體內(nèi)的滲透變化或水分感應(yīng)的蛋白分子用于感應(yīng)植物體內(nèi)的滲透變化或水信號(hào)變化的應(yīng)用。進(jìn)而，本發(fā)明還提供了上述植物體內(nèi)的滲透變化或水分感應(yīng)的蛋白分子用于植物抗旱的應(yīng)用。本發(fā)明首先選定具有跨膜結(jié)構(gòu)域的ERD4和ERD6類似同源基因家族為研究對(duì)象， 將15個(gè)⑶S克隆到pcDNA3. 1，轉(zhuǎn)化CHO細(xì)胞，獲得了多個(gè)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞株，通過(guò)Fura2熒光檢測(cè)篩選，轉(zhuǎn)化AtERDRT08 (At4g22120)的細(xì)胞株與轉(zhuǎn)化空白質(zhì)粒pcDNA3. 1對(duì)照細(xì)胞株相比，經(jīng)過(guò)高滲溶液處理，可獲得顯著瞬時(shí)上升的鈣信號(hào)(圖1)，同時(shí)獲得了 AtERDRTOS相關(guān)基因的T-DNA突變體庫(kù)，然后利用不同的逆境因子處理，獲得了同一個(gè)基因的兩個(gè)耐高滲脅迫的純和突變體株系，具有強(qiáng)烈抵御高滲的能力，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，這一基因可對(duì)滲透勢(shì)的變化作出快速而精細(xì)的反應(yīng)，介導(dǎo)鈣離子的快速內(nèi)流，類似動(dòng)物中冷、熱的感受通道的變化，具有去敏化的鈣通道特征。滲透勢(shì)的變化是冷、熱、干旱逆境反應(yīng)的共同特征，也是水分變化的本質(zhì)，通過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn)AtERDRTOS的同源基因存在于已知的所有多細(xì)胞生命體，因此， 這一分子有可能是多細(xì)胞生物體感受水分或滲透變化的分子感應(yīng)通道。具體地，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，首先從擬南芥(Arabdopsis t)中克隆了 ERD相關(guān)基因的15個(gè)同源CDS，轉(zhuǎn)化動(dòng)物細(xì)胞CHO篩選到轉(zhuǎn)化AtERDRT08基因(At4g22120)的細(xì)胞株具有明顯的滲透刺激鈣信號(hào)，通過(guò)鑒定獲得T-DNA插入突變體，觀察突變體植株在高滲處理?xiàng)l件下的萌發(fā)和生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)突變體生長(zhǎng)優(yōu)于野生型，由此初步驗(yàn)證了 AtERDRTOS基因?qū)λ肿兓盘?hào)的快速感應(yīng)；進(jìn)一步，利用雙電極電壓鉗技術(shù)(TEVC)和體外異源表達(dá)系統(tǒng)-非洲爪蟾卵母細(xì)胞，表達(dá)分析了 AtERDRT08離子通道活性、發(fā)現(xiàn)AtERDRT08為一個(gè)Ca2+ 通道，而且在高滲處理時(shí)通道活性可以快速改變。雖然ERD基因發(fā)現(xiàn)已經(jīng)10多年的時(shí)間了， 但是大多數(shù)的工作主要集中在轉(zhuǎn)錄水平的研究，即水分逆境誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄水平變化。原初信號(hào)的接收分子功能一直無(wú)從知曉，解析何種分子將機(jī)械刺激的信號(hào)轉(zhuǎn)化為具有生理功能的生化信號(hào)，是RaSmUSSen1978年提出鈣第二信使之后，30多年來(lái)，人們追求的目標(biāo)，至今為止，世界范圍內(nèi)沒(méi)有任何的報(bào)道，本發(fā)明通過(guò)推測(cè)，利用異源細(xì)胞系(CHO)轉(zhuǎn)化基因，經(jīng)過(guò)滲透刺激篩選引起早期(1分鐘之內(nèi))鈣信號(hào)的膜蛋白基因，發(fā)現(xiàn)了具有感應(yīng)和鈣通道活性的分子，這一分子可以將滲透變化的原初機(jī)械刺激信號(hào)轉(zhuǎn)化為生化的鈣第二信使信號(hào)，在高滲刺激時(shí)，通道活性可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣流的快速波動(dòng)，形成具有脫敏特性的鈣波-鈣第二信使，由此啟動(dòng)應(yīng)對(duì)水分變化的下游生理過(guò)程，包括誘導(dǎo)應(yīng)答基因的表達(dá)、行使生理功能等。本發(fā)明為有效利用這一基因資源打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。


圖1、擬南芥AtERDRT08基因的克隆，AtERDRT08基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和pEASY_Tl 重組質(zhì)粒的酶切及PCR鑒定，其中，圖 IA :M 為 Marker III (TransGene) ；lane2 為 AtERDRT08 的 PCR 結(jié)果；圖 IB :M 為 Marker III (TransGene) ；Ianel 為 AtERDRT08 的 BamHI/Xbal 酶切結(jié)果；圖 1C:M 為 Ikb plus marker (TransGene) ；lanel，9，10，12，15 為菌落 PCR 檢測(cè)結(jié)^ ο圖2、擬南芥AtERDRT08轉(zhuǎn)化CHO細(xì)胞，檢測(cè)鈣熒光反應(yīng)。圖3、Aterdrt08T-DNA純合突變體的鑒定，圖 3A 為基因組鑒定結(jié)果，M 為 Marker III(TransGene) ；lanel，2，3，4，5，7，8，9， 10，11，12，13 為 T-DNA insertion 檢測(cè)結(jié)果，WT 為野生型(Col-O)。圖;3B =WT為野生型^ol-O) ；lane2為Aterdrt08的RNA檢測(cè)結(jié)果，表示為純合突變體。圖4、Aterdrt08表現(xiàn)出強(qiáng)烈地抵御高滲的能力圖4A 左圖為1/2MS培養(yǎng)基的結(jié)果；右圖為含300mM甘露醇的1/2MS培養(yǎng)基的結(jié)果，圖中右為Aterdrt08 ；左為野生型Col-O ；圖4B 突變體蓮座葉的失水實(shí)驗(yàn)左為Aterdrt08 ；右為野生型Col_0。圖5、擬南芥AtERDRT08表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定圖 5A 左lanel，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，16 為 pCAMBIA1302 菌落PCR檢測(cè)結(jié)果，M 為 Marker III(TransGene)；右M為MarkerIII(TransGene) ；Ianel 為 pCAMBIA1302 的BamHI/Xbal 酶切結(jié)果。圖 5B :lanel，2，3，5，6，7 為 AtERDRT08 啟動(dòng)子 ρΒΙΙΟΙ. 1 菌落 PCR 檢測(cè)結(jié)果；M 為 Marker III (TransGene)。圖6 :AtERDRT08定位于原生質(zhì)體質(zhì)膜從左至右依次為可見(jiàn)光、紅光、綠光和紅綠融合圖7 :AtERDRT08具有感應(yīng)滲透變化的典型反應(yīng)、Ca2+通道活性和去敏化特征，介導(dǎo) Ca2+的瞬時(shí)內(nèi)流A 基本浴液為IOmM MES-TRIS pH5. 6，1. 8mM氯化鎂，2mM氯化鈣，30mM氯化鈉， 150mM甘露醇；B :10mM MES-TRIS pH5. 6，1. 8mM氯化鎂，30mM氯化鈣，300mM甘露醇，溶液灌流具體方式如圖7所示。圖8為pGEMHE載體圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 擬南芥AtERDRT08基因的克隆提取生長(zhǎng)4周的擬南芥總RNA并以其為模板，以O(shè)ligo dT為引物作逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)完成后取1 μ 1逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，以At4g22120特異引物ERDRT8F和ERDRT8R進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。結(jié)果得到約2. 3kb左右的單一產(chǎn)物(圖1A)。將此擴(kuò)增條帶純化回收后，與peasyTl Vector連接的重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5 α。挑取單克隆質(zhì)粒進(jìn)行酶切檢測(cè)(圖1Β)及菌落PCR鑒定(圖1C)后，選取陽(yáng)性克隆并測(cè)序。ERDRT8F :ATGGCGACACTTCAGGATATTGGERDRT8R TTAGACTAGTTTACCACTAAAGAtERDRT08的cDNA序列及其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如下SEQ ID No. 1 MATLQDIGVS AGINILSAFV FFIIFAVLRL QPFNDRVYFS KffYLKGLRSSPARGGAFAQR60FVNLDFRSYM KFLNWMPEAL KMPEPELIDH AGLDSVVYLR IYffLGLKIFTPIAVLAffAVL120VPVNWTNNTL EMAKQLRNVT SSDIDKLSVS NIPEYSMRFff THIVMAYAFTIffTCYVLMKF180YETIA匪RLQ FVASEARRPD QFTVLVRNVP PDADESVSEL VEHFFLVNHPDHYLTHQVVC240NANKLADLVK KKKKLQNWLD YYQLKYARNN SQRIMVKLGFLGLffGQKVDA IEHYIAEIDK 300ISKEISKERE EVVNDPKAIM PAAFVSFKTR WAAAVCAQTQ QTRNPTQffLTEffAPEPRDVF360WSNLAIPYVS LTVRRLIMHV AFFFLTFFFI VPIAFVQSLA TIEGIVKAAPFLKFIVDDKF420MKSVIQGFLP GIALKLFLAF LPSILMIMSK FEGFTSISSL ERRAAFRYYIFNLVNVFLAS480
VIAGAAFEQLNSFLNQSANQ IPKTIGVAIP MKATFFITYI MVDGWAGVAG
EILMLKPLIM540
FHLKNAFLVKTDKDREEAME)PGSIGFNTGE PRIQLYFLLG LVYAPVTPML
LPFILVFFAL600
AYIVYRHQIINVYNQEYESA AAFWPDVHGR VIAALVISQL LLMGLLGTKH
AALAAPFLIA660
LPVLTIGFHHFCKGRYEPAF IRYPLQEAMM KDTLETAREP NLNLKGYLQN
AYVHPVFIffiD720
EDDYDIDDKLGKFEDEAIIV PTKRQSRRNT PAPSIIS⑶D SPSLPFSGKL
V771
SEQ ID No.2
atggcgacacttcaggatattggtgtatcagctgggataaacattctcagtgcctttgtt60
ttcttcataatctttgcggttttgaggcttcagcctttcaatgatagagtttacttctca120
aaatggtatctcaaggggttaagaagcagccctgctcgtggtggcgcctttgcgcagagg180
tttgtgaacctggacttcaggtcttatatgaagttcttgaattggatgccagaggctctg240
aagatgcctgagcctgagcttattgatcatgctggtttggattcagttgtttatctccgg300
atttactggctggggcttaagatctttactccaatagcagtgcttgcttgggcagttctt360
gtgccagtcaactggactaataacacattggagatggctaagcagttaaggaatgtaact420
tcgagcgacattgacaaactctctgtttcaaatattccagagtattcaatgaggttttgg480
actcatatagtaatggcttatgcctttaccatctggacttgttatgtgctgatgaaagaa540
tatgagacaattgctaacatgaggctccagtttgttgcatcagaagctcgtcgacctgac600
cagttcactgtccttgttaggaatgtacctccggacgcagatgaatctgtaagtgaactg660
gtagagcattttttcctggtcaatcatcctgatcactacctaacacatcaggttgtatgc720
aatgcaaacaagctggccgatttggtgaaaaagaagaaaaagctgcagaattggcttgat780
tactaccagctcaaatacgctaggaataactctcagagaattatggtgaagcttggcttt840
cttgggctatggggacaaaaagtcgatgccattgaacattacattgctgaaattgacaaa900
atatcaaaagagatcagtaaagaaagagaggaagtggtgaatgatcctaaggccattatg960
ccagcagcgtttgtctcctttaaaacacgatgggctgctgCggtttgtgCtcagactcaa1020
cagacccgaaacccaacccaatggctgaccgaatgggctccagaaccgcgtgatgtgttt1080
tggtcaaatcttgctattccatatgtttctctgacagtaaggaggttgatcatgcatgtt1140
gccttcttcttcctaaccttcttcttcattgtccccatcgcgtttgttcaatctcttgct1200
accattgaagggattgtgaaagctgctccgttcttgaagtttattgtagatgataaattc1260
atgaaatcggtgatacaaggtttccttccgggtattgcactgaagcttttcctcgccttt1320
ctgccatccattttgatgatcatgtccaaatttgaaggcttcacatcgatctcatcttta1380
gagagacgagcagcgtttcgatattacatcttcaacttagtgaacgtctttcttgctagc1440
gttatcgctggagctgcgtttgaacagcttaactctttcctcaatcaatccgcaaaccaa1500
cltCCCCclclclclccattggtgtggcgataccgatgaaagcaactttcttcatcacgtatata1560
atggttgatggttgggcaggagttgcaggagagattctaatgctgaaaccattgattatg1620
ttccatctcaaaaacgccttcttggttaagactgataaagacagagaggaagcaatggac1680
ccgggaagcattggttttaacacgggtgagcctcggatacagctctactttcttctcggt1740
cttgtctacgctcctgtgacaccgatgcttcttccttttatcttggtcttcttcgccctt1800
gcttacattgtatatcgccaccaaatcattaacgtatacaatcaagaatacgagagtgct1860
gcagcgttttggccagacgttcatggacgagtcatagcagcattggtaatatcacagttg1920
cttctgatgggtctattgggaacaaagcacgctgcattagctgcaccgtttctcattgct1980
ttgcctgtgcttaccattggtttccaccacttctgcaaaggtcgttatgagccagctttc2040
atcagataccctttacaggaagctatgatgaaagatacattagaaaccgcaagagaacca2100
aacctgaaccttaaaggctacttgcaaaatgcttacgttcatccggttttcaaaggcgat2160
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cccaccaaacgtcagtcgaggagaaatactccggctcctagcataatcagtggggacgat2280
tcgccgtctttgccctttagtggtaaactagtctaa2316實(shí)施例2 擬南芥AtERDRT08基因感應(yīng)高滲刺激，介導(dǎo)鈣離子內(nèi)流?？寺tERDRT08基因，構(gòu)建pcDNA3. 1載體，轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，篩選穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系，F(xiàn)ura2染色，含有IOmM CaC12的高滲和等滲溶液灌流，通過(guò)熒光顯微鏡觀察記錄，經(jīng)過(guò)高滲和等滲處理的細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)高滲處理可以記錄到明顯的鈣離子內(nèi)流，即鈣離子的熒光， 恢復(fù)等滲溶液后，熒光消失，表明AtERDRTOS具有感應(yīng)高滲刺激的功能，同時(shí)，還可以轉(zhuǎn)化為生化信號(hào)，即鈣離子的內(nèi)流波動(dòng)(圖2)，以其他粒子取代灌流液中的鈣離子，未觀察到熒光信號(hào)變化。實(shí)施例3 擬南芥AtERDRT08基因T-DNA插入突變體的獲得以及表型分析購(gòu)買AtERDRTOS基因的T-DNA插入突變體，采用“雙引物法”對(duì)突變體進(jìn)行鑒定 (圖3A)，然后挑選鑒定為純和插入突變的植株提取RNA進(jìn)行鑒定(圖:3B)。結(jié)果顯示已經(jīng)成功獲得該基因的插入突變體。將獲得突變體種子與野生型的種子一起進(jìn)行高滲處理(在1/2MS培養(yǎng)基中加入 300mM的Marmitol)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變體的生長(zhǎng)狀況都優(yōu)于野生型植株(圖4A)，此外還發(fā)現(xiàn)與野生型相比，突變體植株失水更快(圖4B)。證明AtERDRTOS在植物早期脫水反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮作用。實(shí)施例4 擬南芥AtERDRTOS基因的真核表達(dá)載體的構(gòu)建及亞細(xì)胞定位分析1、擬南芥AtERDRT08表達(dá)載體的構(gòu)建將擬南芥AtERDRT08構(gòu)建到pCAMBIA1302載體中(該載體購(gòu)自hvitrogen公司)，將該基因上游2.0Kb的片段作為啟動(dòng)子區(qū)構(gòu)建到ρΒΙΙΟΙ. 1載體中(該載體購(gòu)自 Invitrogen公司)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，提取質(zhì)粒并檢測(cè)(圖5)。2、重組質(zhì)粒的瞬時(shí)表達(dá)將構(gòu)建好的pCAMBIA1302: :AtERDRT08質(zhì)粒，通過(guò)PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體， 進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，在激光共聚焦顯微鏡下觀察AtERDRTOS在細(xì)胞內(nèi)的定位(圖6)。實(shí)施例5 擬南芥AtERDRT08基因的電生理功能分析將擬南芥AtERDRT08基因構(gòu)建到pGEMHE載體(該載體最先由Harvard Medical School的Liman等將非洲爪蟾的一個(gè)β -globin基因的3，-UTR和5，UTR引入pGEM_3Z 載體改造而成,本實(shí)驗(yàn)所用的pGEMHE載體由University of California at Berkeley的 Dr. E Y. Isacoff贈(zèng)與，載體結(jié)構(gòu)圖參見(jiàn)圖8)(載體鑒定如圖5A)，以特異引物M13和M13R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將產(chǎn)物做Capping RNA，通過(guò)顯微注射技術(shù)將其注射到Xenopus oocytes中表達(dá)約2天，再利用TEVC (Two-electrode voltage-clamp)技術(shù)對(duì)AtERDRT08基因做電生理分析。結(jié)果表明該基因具有Ca2+通道活性，而且高滲灌流(300mM Mannitol, IOmM HEPS pH7. 4, IOmM CaCl)時(shí)，介導(dǎo)Ca2+的瞬時(shí)內(nèi)流，具有典型去敏化特征，用同樣的溶液刺激，Ca2+ 的瞬時(shí)內(nèi)流越來(lái)越??；當(dāng)灌流液中Mg2+取代Ca2+，紀(jì)錄不到明顯的陽(yáng)離子內(nèi)流，用其他的單價(jià)陽(yáng)離子(K+、Na+、Li+、NH4+)得到相似的結(jié)論。因此，結(jié)合CHO的鈣離子熒光的測(cè)定結(jié)果 (實(shí)施例2)，AtERDRTOS在異源系統(tǒng)中表達(dá)，可以特異的選擇Ca2+，不選擇其他的單價(jià)陽(yáng)離子K+、Na+、Li+、NH4+和Mg2+、Ba2+等二價(jià)陽(yáng)離子，陰離子的變化也不影響其活性，只介導(dǎo)Ca2+ 的內(nèi)流，離子通道的活性被滲透勢(shì)變化調(diào)節(jié)，高滲透勢(shì)激活者一同到活性，說(shuō)明本發(fā)明的分子為感應(yīng)滲透變化的Ca2+通道。
權(quán)利要求
1.一種植物體內(nèi)的滲透水或分變化原初感應(yīng)的蛋白分子，其特征在于，其氨基酸序列如 SEQ ID No. 1 所示。
2.一種植物體內(nèi)的滲透或水分變化原初感應(yīng)的基因，其特征在于，編碼權(quán)利要求1所述的蛋白分子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID No. 2所示。
4.權(quán)利要求1所述的蛋白分子作為接受機(jī)械刺激信號(hào)的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1所述的蛋白分子作為鈣離子通道的應(yīng)用。
6.包含權(quán)利要求2所述基因的植物表達(dá)載體。
7.權(quán)利要求1所述的蛋白分子用于感應(yīng)植物體內(nèi)的滲透變化或水信號(hào)變化的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1所述的蛋白分子用于植物抗旱和水分脅迫的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，涉及一種植物體內(nèi)的滲透或水分變化原初感應(yīng)的蛋白分子、及其基因和應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的植物體內(nèi)的滲透變化或水分感應(yīng)的蛋白分子，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本發(fā)明，通過(guò)鑒定AtERDRT08T-DNA插入突變體，觀察突變體植株在高滲處理?xiàng)l件下的萌發(fā)和生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)突變體生長(zhǎng)優(yōu)于野生型，由此初步驗(yàn)證了AtERDRT08基因?qū)λ盘?hào)的感應(yīng)；進(jìn)一步，發(fā)現(xiàn)AtERDRT08為一個(gè)Sensor-like Ca2+通道，這一分子可以將滲透變化的原初機(jī)械刺激信號(hào)轉(zhuǎn)化為生化的鈣的第二信使信號(hào)，在高滲刺激時(shí)，通道活性可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣流的快速波動(dòng)，形成具有脫敏特性的鈣波-鈣第二信使，由此啟動(dòng)應(yīng)對(duì)水分變化的下游生理過(guò)程。本發(fā)明為有效利用這一基因資源打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C07K14/415GK102329383SQ20111028557
公開(kāi)日2012年1月25日 申請(qǐng)日期2011年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月23日
發(fā)明者李樂(lè)攻, 田望, 郝艷麗 申請(qǐng)人:首都師范大學(xué)