專利名稱：一種對(duì)櫻della蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)野生植物基因資源保護(hù)利用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及對(duì)櫻DELLA蛋白 PpGAI及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
赤霉素(Gibberellins，GAs)作為一類較大的四環(huán)雙萜類植物激素，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著極其重要的作用，并作用于植物整個(gè)生命周期，例如種子萌發(fā)，莖的伸長(zhǎng)，葉片延展，花與果實(shí)的發(fā)育(Fleet C Μ, SUN T P. A DELLAcate balance :the role of gibberellin in plant morphogenesis. Current Opinion Plant Biology,2005,8 77 85)。目前，GAs的合成與代謝途徑已研究得較為清楚，而且代謝關(guān)鍵酶和相應(yīng)的基因也相繼得以克隆，因而現(xiàn)在研究重點(diǎn)集中于對(duì)赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的分子機(jī)制的探討(Harberd N P，Belfield E，Yasumura Y. The angiosperm gibberellin-GID I-DELLA growth regulatory mechanism :how an“inhibitor of an inhibitor"enables flexible response to fluctuating environments. Plant Cell，2009，21 :1328 1339)。在已發(fā)現(xiàn)的植物GA信號(hào)傳遞組分中，有一類蛋白的N端極其保守，具有共同的DELLA結(jié)構(gòu)域，稱之為DELLA家族蛋白，其作為一個(gè)關(guān)鍵調(diào)控因子，在GA信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中起負(fù)調(diào)節(jié)作用(Peng J，Carol P，Richards D，et al. Arabidopsis GAI gene defines a signaling pathway that negatively regulates gibberellin responses. Genes & Development，1997，11 3194 3205)。在沒(méi)有GA的情況下，DELLA蛋白阻遏植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程；當(dāng)有GA信號(hào)時(shí)，DELLA蛋白通過(guò)泛素化途徑降解，從而解除其阻遏作用。如果GA的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑受阻，將使植物產(chǎn)生矮化等異常的生理現(xiàn)象(Sun T P. Gibberellin-GIDl-DELLA =A Pivotal Regulatory Module for Plant Growth and Development. Plant Physiology,2010,154 567 570)。20世紀(jì)90年代，有研究發(fā)現(xiàn)“綠色革命”中導(dǎo)致小麥產(chǎn)生矮化性狀的基因 rhtl即為DELLA蛋白的編碼基因。該基因突變后導(dǎo)致小麥無(wú)法正常響應(yīng)赤霉素信號(hào)，因而形成一個(gè)新的矮化品種。由于其早結(jié)實(shí)、抗倒伏、耐風(fēng)沙，從而極大地促進(jìn)了世界糧食作物的增產(chǎn)(Peng J，Richards D Ε, Hartley N M，et al. ‘Green revolution' genes encode mutant gibberellin response modulators· Nature，1999，400 :256 261)。目前，已從擬南芥、水稻、葡萄等物種中克隆得到DELLA蛋白基因，其功能也得以進(jìn)一步研究。lister等將蘋果DELLA蛋白基因MdRGLh轉(zhuǎn)入擬南芥中進(jìn)行過(guò)表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出葉片緊縮、莖桿變短、花期延長(zhǎng)、對(duì)外源GA3敏感度降低等現(xiàn)象，類似于擬南芥gai矮化突變體的表型特征(Foster Τ,Kirk C,Jones W Τ,et al. Characterization of the DELLA subfamily in apple (Malus Xdomestica Borkh.). Tree Genet Genomes，2007，3 :187 197)。在釀酒葡萄11突變體中，DELLA區(qū)域突變成了 DELHA，使葡萄蔓藤上本應(yīng)生長(zhǎng)蔓須的部位形成花序， ^^IWMit (Paul K B, Mark R Τ. Association of dwarfism and floral induction with a grape 'green revolution’ mutation. Nature, 2002,416 :847 850)。以上石if究結(jié)果暗示了 DELLA蛋白在不同物種之間的功能較為保守，通過(guò)干擾GA的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程可達(dá)
3到使植株矮化的目的。甜櫻桃(Primus avium L.)果實(shí)色澤艷麗，晶瑩美觀，味美多汁，營(yíng)養(yǎng)豐富，深受消費(fèi)者喜愛(ài)，被譽(yù)為果中珍品，是經(jīng)濟(jì)效益最好的栽培果樹(shù)之一；而甜櫻桃的矮密栽培更具有提早結(jié)果、方便采摘、提高土地和光能利用效率等優(yōu)點(diǎn)，成為櫻桃產(chǎn)業(yè)高效發(fā)展的一種良好的栽培模式。傳統(tǒng)的密植方式多采用矮化砧木來(lái)控制樹(shù)體大小和高度，然而目前國(guó)內(nèi)成功選育出的甜櫻桃矮化砧木品種屈指可數(shù)，且應(yīng)用范圍小，生產(chǎn)上大多利用從國(guó)外引進(jìn)的砧木資源，如Gisela系列、Colt。但由于地理環(huán)境的差異，這些砧木在我國(guó)的實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用上尚存在一定的局限性，例如Gisela系列砧木對(duì)土壤肥力要求高，且嫁接接穗品種后普通存在砧木“小腳”現(xiàn)象，而Colt砧木的耐鹽堿性較差，易感根癌病。中國(guó)櫻桃‘對(duì)櫻’(ft~UnUS pseudocerasus L.)是分布于北京地區(qū)的一個(gè)半野生小喬木，其抗逆性及抗病蟲(chóng)害能力強(qiáng)， 與甜櫻桃品種的嫁接親和力好，但將其作為甜櫻桃的砧木品種，嫁接樹(shù)生長(zhǎng)健壯，樹(shù)冠較高大，矮化效果不明顯。鑒于此，如果通過(guò)基因工程的手段，將赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)負(fù)向調(diào)節(jié)因子 DELLA蛋白基因?qū)胫袊?guó)櫻桃砧木品種‘對(duì)櫻’，培育出性狀優(yōu)良并適于櫻桃矮化密植的砧木新品種，將為甜櫻桃矮化育種開(kāi)辟新途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種對(duì)櫻DELLA蛋白及其編碼基因。本發(fā)明的目的還在于提供包含對(duì)櫻DELLA蛋白編碼基因的載體及其工程菌。本發(fā)明的目的還在于提供對(duì)櫻DELLA蛋白編碼基因的獲得方法。本發(fā)明的目的還在于提供對(duì)櫻DELLA蛋白編碼基因及其表達(dá)的DELLA蛋白在果樹(shù)矮化密植方面的用途。一種DELLA蛋白的編碼基因，所述編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO=I所示。所述DELLA蛋白的編碼基因來(lái)源于對(duì)櫻(Prunus pseudocerasus L.)。包含權(quán)利要求1所述DELLA蛋白的編碼基因的表達(dá)載體。包含權(quán)利要求3所述表達(dá)載體的工程菌。一種DELLA蛋白，所述DELLA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。所述 DELLA 蛋白來(lái)源于對(duì)櫻(Prunus pseudocerasus L.)。一種DELLA蛋白的編碼基因的獲得方法，按照如下步驟進(jìn)行(1) CTAB法提取對(duì)櫻葉片總RNA，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA ；(2)根據(jù)權(quán)利要求1所述的DELLA蛋白的編碼基因設(shè)計(jì)引物PpGAI-L和PpGAI-R， 以步驟(1)得到的cDNA為模板，利用RT-PCR方法擴(kuò)增全長(zhǎng)PpGAI基因；所述PpGAI-L的核苷酸序列如SEQ ID NO 13所示；PpGAI-R的核苷酸序列如SEQ ID NO 14所示。上述DELLA蛋白的編碼基因，發(fā)明人將其命名為PpGAI，蛋白命名為PpGAI。上述任一 DELLA蛋白的編碼基因或DELLA蛋白在果樹(shù)矮化密植方面的用途。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明第一次從櫻桃中克隆得到赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因子DELLA蛋白及其編碼基因PpGAIJf PpGAI轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21證明其具有生物活性，能夠編碼預(yù)期分子量大小的蛋白，將PpGAI基因轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，證明該基因編碼的DELLA蛋白可導(dǎo)致擬南芥出現(xiàn)明顯的矮化性狀。從而為果樹(shù)轉(zhuǎn)基因工程提供了一個(gè)優(yōu)良的矮化基因，并為櫻桃矮化密植開(kāi)辟一條新的途徑。


圖1為從對(duì)櫻葉片中提取的總RNA電泳圖。圖2為通過(guò)簡(jiǎn)并引物L(fēng)T、RT擴(kuò)增櫻桃DELLA蛋白基因的中間片斷的電泳檢測(cè)圖；圖中，M為DNA Marker II，1為PpGAI基因中間片斷的PCR產(chǎn)物。圖3為PpGAI基因的3 ‘末端PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)圖；圖中，M 為 IOObp plus DNA Ladder, 1 為 PpGAI 基因的 3'末端 PCR 產(chǎn)物。圖4為PpGAI基因的5 ‘末端PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)圖；圖中，M 為 DNA Marker II，1 為 PpGAI 的 5 ‘末端 PCR 產(chǎn)物。圖5為PpGAI基因全長(zhǎng)電泳檢測(cè)圖；圖中，M為500bp DNA Ladder, 1為PpGAI的開(kāi)放閱讀框全長(zhǎng)。圖6為利用MEGA軟件進(jìn)行的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析。圖7為BamH I和sal I雙酶切重組質(zhì)粒鑒定PpGAI基因陽(yáng)性克隆電泳圖；圖中，M為DNAMarker III，1、2均為重組質(zhì)粒的酶切結(jié)果。圖8為PpGAI蛋白的考馬斯亮藍(lán)染色圖；圖中，M為蛋白Ladder (10_250kD)，1為未經(jīng)誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化子表達(dá)的總蛋白，2 6為分別誘導(dǎo)2、4、6、8、IOh轉(zhuǎn)化子表達(dá)的總蛋白，7為未經(jīng)誘導(dǎo)的pGEX-4T-l空載體表達(dá)的總蛋白，8 12為分別誘導(dǎo)2、4、6、8、10h pGEX_4T_l空載體表達(dá)的總蛋白。圖9為Nco I和Bgl II雙酶切重組質(zhì)粒鑒定PpGAI基因陽(yáng)性克隆電泳圖；圖中，M為DNA Marker III，1、2均為重組質(zhì)粒的酶切結(jié)果。圖10為PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)PpGAI基因陽(yáng)性擬南芥植株；圖中，M為Marker V，1 9為轉(zhuǎn)基因擬南芥苗，10為野生型擬南芥對(duì)照。圖11為野生型和轉(zhuǎn)PpGAI基因擬南芥植株表型比較；圖左側(cè)為野生型擬南芥植株，圖右為PpGAI基因擬南芥植株。圖12為野生型和轉(zhuǎn)PpGAI基因擬南芥植株葉片比較；圖上一行為野生型擬南芥植株葉片，圖下一行為轉(zhuǎn)PpGAI基因擬南芥植株葉片。
具體實(shí)施例方式下面以附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。以下實(shí)施例試驗(yàn)所用材料為中國(guó)櫻桃‘對(duì)櫻，(Primus pseudocerasus L.)，采自北京市海淀區(qū)植物組織培養(yǎng)技術(shù)實(shí)驗(yàn)室。2009年6月下旬采取嫩葉后，置于冰盒中立即帶回實(shí)驗(yàn)室，液氮速凍后，存于-80°C冰箱備用。原核表達(dá)載體PGEX-4T-1、植物表達(dá)載體pCAMBIA1301、大腸桿菌Dffia感受態(tài)細(xì)胞、根癌農(nóng)桿菌EHA105菌株、大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京天根生化公司。Taq DNA聚合酶、dNTP Mixture^RNase Inhibitor^RNase-Free DNase I、限制性內(nèi)切酶BamH I、sal I,Nco I 和 Bgl II、T4 DNA連接酶，購(gòu)自 TAKARA 公司。Clotech Smarter RACE cDNA Amplication Kit 購(gòu)自 Clotech 公司，M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自 Promega 公司；DNA Marker購(gòu)自中科瑞泰北京生物技術(shù)有限公司，蛋白Ladder 10-250KD購(gòu)自中科瑞泰NEB 公司；氨芐青霉素、硫酸卡鈉酶素、利福平購(gòu)自北京新經(jīng)科生物技術(shù)有限公司，潮霉素購(gòu)自Sigma公司；離心柱型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自北京匯天東方科技有限公司，離心柱型質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自北京博大泰恒生物技術(shù)有限公司，SDS-PAGE試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司。實(shí)施例1、對(duì)櫻DELLA蛋白PpGAI及其編碼基因的獲得一、PpGAI基因中間片斷的獲得以中國(guó)櫻桃‘對(duì)櫻’ (Prunus pseudocerasus L.)為試驗(yàn)材料(采自北京市海淀區(qū)植物組織培養(yǎng)技術(shù)實(shí)驗(yàn)室)，CTAB法提取其葉片總RNA。用30 μ 1超濾水(RNA free)溶解所提取的RNA沉淀。取1 2 μ 1溶解的RNA，加入1 μ 1 6 X電泳上樣緩沖液后混勻，1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA。在凝膠成像系統(tǒng)下觀察，電泳結(jié)果如圖1所示，從圖中可以清晰地看到^S rRNA和18S rRNA兩條帶，且^S rRNA和18S rRNA含量之比大約為1 1-2 1， 無(wú)拖尾及彌散現(xiàn)象。紫外分光度測(cè)量0D26Q/0D28Q = 1. 95,OD260/OD230 = 2. 00，濃度為1131ng/ μ 1，說(shuō)明RNA純度較好，完整性好且濃度較高，達(dá)到后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。以上述提取得到的總RNA為模板，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。再以此cDNA為模板，通過(guò)簡(jiǎn)并引物L(fēng)T、RT擴(kuò)增櫻桃DELLA蛋白基因的中間片斷。引物序列如下
權(quán)利要求
1.一種DELLA蛋白的編碼基因，其特征在于，所述編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種DELLA蛋白的編碼基因，其特征在于，所述DELLA蛋白的編碼基因來(lái)源于對(duì)櫻(Prunus pseudocerasus L.)。
3.包含權(quán)利要求1所述DELLA蛋白的編碼基因的表達(dá)載體。
4.包含權(quán)利要求3所述表達(dá)載體的工程菌。
5.一種DELLA蛋白，其特征在于，所述DELLA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種DELLA蛋白，其特征在于，所述DELLA蛋白來(lái)源于對(duì)櫻 (Prunus pseudocerasus L.) 0
7.—種如權(quán)利要求1所述DELLA蛋白的編碼基因的獲得方法，其特征在于，按照如下步驟進(jìn)行(1)CTAB法提取對(duì)櫻葉片總RNA，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA；(2)根據(jù)權(quán)利要求1所述的DELLA蛋白的編碼基因設(shè)計(jì)引物PpGAI-L和PpGAI-R，以步驟(1)得到的cDNA為模板，利用RT-PCR方法擴(kuò)增全長(zhǎng)PpGAI基因；所述PpGAI-L的核苷酸序列如SEQ ID NO 13所示；PpGAI-R的核苷酸序列如SEQ ID NO 14所示。
8.權(quán)利要求1、2、5、6所述任一DELLA蛋白的編碼基因或DELLA蛋白在果樹(shù)矮化密植方面的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了屬于農(nóng)業(yè)野生植物基因資源保護(hù)利用技術(shù)領(lǐng)域的一種對(duì)櫻DELLA蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明第一次從櫻桃中克隆得到赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因子DELLA蛋白及其編碼基因，將其命名為PpGAI，將PpGAI轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21證明其具有生物活性，能夠編碼預(yù)期分子量大小的蛋白，將PpGAI基因轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，證明該基因編碼的DELLA蛋白可導(dǎo)致擬南芥出現(xiàn)明顯的矮化性狀。本發(fā)明為果樹(shù)轉(zhuǎn)基因工程提供了一個(gè)優(yōu)良的矮化基因，并為櫻桃矮化密植開(kāi)辟一條新的途徑。
文檔編號(hào)C07K14/415GK102277360SQ20111022436
公開(kāi)日2011年12月14日 申請(qǐng)日期2011年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月5日
發(fā)明者李天紅, 沈欣杰, 趙凱, 鐘翡 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)