專(zhuān)利名稱(chēng)：羊胎素蛋白質(zhì)及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種羊胚胎及羊胎盤(pán)生物制品及其制備方法。
背景技術(shù)：
我國(guó)利用動(dòng)物的各種器官、組織及代謝產(chǎn)物進(jìn)行治病、防病和醫(yī)療保健的歷史悠
久，現(xiàn)存完整的藥學(xué)典籍--《神農(nóng)本草論》就有牛黃、犀角、鹿茸、阿膠等多種動(dòng)物藥物
的記載。說(shuō)明了我國(guó)在制藥技術(shù)上早已利用動(dòng)物藥物進(jìn)行加工、提取、精制而成較為純凈的藥劑。胎盤(pán)(Placenta)又名“紫河車(chē)”，為常用中藥，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明胎盤(pán)含有多種免疫球蛋白、活性肽等生物活性物質(zhì)及氨基酸、礦物質(zhì)等成分(統(tǒng)稱(chēng)活細(xì)胞素)，是一種機(jī)體免疫功能的調(diào)節(jié)劑和營(yíng)養(yǎng)、美容保健品?？茖W(xué)家對(duì)多種動(dòng)物胎盤(pán)進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)， 羊胎盤(pán)的細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)與人胎盤(pán)最為相似，可望成為同人類(lèi)胎盤(pán)具有同等養(yǎng)生價(jià)值的替代物。近年來(lái)，在國(guó)內(nèi)外又相繼出現(xiàn)了動(dòng)物胎盤(pán)水解液和胎盤(pán)浸提液二種新型羊胎盤(pán)生物制品，因其獨(dú)特的效能，已引起人們的注目。但我們認(rèn)為上述二種制劑各有弊端，前者在水解過(guò)程中將胎盤(pán)中的天然活性物質(zhì)破壞，失去利用胎盤(pán)的意義；后者雖然有多種天然活性物質(zhì)，但多肽及氨基酸含量甚微，如能使二者融為一體，既保留胎盤(pán)中的天然活性物質(zhì)， 又增加其多肽及氨基酸含量。無(wú)疑這在羊胎及羊胎盤(pán)生物制品開(kāi)發(fā)研究中是一個(gè)新的突破。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種羊胎素蛋白質(zhì)的制備方法。本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提供上述的羊胎素蛋白質(zhì)。為了實(shí)現(xiàn)上述的第一個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案 一種羊胎素氨基酸的制備方法，該方法包括以下的步驟
1)羊胚胎及羊胎盤(pán)原料前處理取羊胚胎及羊胎盤(pán)為原料，清洗，去除雜質(zhì)，0 5°C低溫下粉碎成粗粉；
2)羊胚胎及羊胎盤(pán)超微粉碎、細(xì)胞破壁將羊胚胎及羊胎盤(pán)粗粉低溫-40°C -50°C冷凍1 汕后，-30 -10°C超微粉碎，細(xì)胞破壁，達(dá)到0. 1 10 μ m粒度；
3)羊胚胎及羊胎盤(pán)的提取和酶解細(xì)胞破壁后的羊胚胎及羊胎盤(pán)漿液加3 8倍蒸餾水溫浸提取后過(guò)濾得濾液A和沉淀A，沉淀A采用蛋白酶酶解后抽濾得水解液B，合并濾液 A和水解液B，得羊胚胎及羊胎盤(pán)素的精制羊胎素；
4)采用葡聚糖凝膠層析法，根據(jù)分子量大小對(duì)上述步驟3)中得到的羊胎及羊胎盤(pán)素原液進(jìn)行以下的分級(jí)精制
①分離氨基酸，分子量<700的多肽羊胚胎及羊胎盤(pán)素的精制羊胎素上樣，固定相 Sephadex G_10，依次用水，2%NaCl溶液洗脫，收集不同組分；②分離分子量1000-5000的多肽①中水洗脫液上樣，固定相kphadexG-25，依次用水，0%-2%NaCl溶液梯度洗脫，收集不同組分；
③分離分子量5000-30000的多肽②中水洗脫液上樣，固定相kphadexG-50,依次用水，0%-2%NaCl溶液梯度洗脫，收集不同組分；
④分離分子量30000-150000的蛋白質(zhì)③中水洗脫液上樣，固定相kphadexG-100， 依次用水，0%-2%NaCl溶液梯度洗脫，收集不同組分；
⑤分離分子量150000-600000的蛋白質(zhì)④中水洗脫液上樣，固定相kphadexG-200， 依次用水，0%-2%NaCl溶液梯度洗脫，收集不同組分。作為優(yōu)選，上述的步驟1)中以2 3個(gè)月齡的羊胚胎及羊胎盤(pán)為原料。作為優(yōu)選，上述的步驟3)中蛋白酶采用木瓜蛋白酶與胰蛋白酶中一種或兩種混
口 O作為優(yōu)選，上述的步驟3)中蛋白酶的使用量為沉淀A重量的0. 1% H作為再優(yōu)選，上述的步驟3)中蛋白酶的使用量為沉淀A重量的0. 3% 1%。作為優(yōu)選，上述的步驟3)中蛋白酶采用木瓜蛋白酶與胰蛋白酶兩種混合，酶解反應(yīng)的溫度為40 50°C，pH為7. 0 8. 0，木瓜蛋白酶與胰蛋白酶的酶配比1 :0. 5 2。作為再優(yōu)選，步驟3)中酶解反應(yīng)的溫度為45°C，pH為7. 5，木瓜蛋白酶與胰蛋白酶的酶配比1:1。為了實(shí)現(xiàn)上述的第二個(gè)目的，本發(fā)明還提供了上述的任意一項(xiàng)技術(shù)方案制備得到的羊胎素蛋白質(zhì)。本發(fā)明由于采用了上述的技術(shù)方案，該技術(shù)的生產(chǎn)加工過(guò)程既能充分提取羊胎及羊胎盤(pán)中的有效成分，使羊胎及羊胎盤(pán)的活性物質(zhì)得到最大限度的保留，又便于人體全面吸收，工藝先進(jìn)、合理，質(zhì)量可控。采用上述方法制得羊胎素蛋白質(zhì)，具有以下的作用
1、調(diào)節(jié)女性?xún)?nèi)分泌，全面有效地改善人體皮膚狀況，美容養(yǎng)顏，美白肌膚，增強(qiáng)皮膚彈性、去黑斑，防止皺紋、妊娠紋及延緩衰老；
2、可防止女性不孕癥，流產(chǎn)，早產(chǎn)；
3、益精補(bǔ)髓，增加男子精子生產(chǎn)，改善不孕癥(男女均有效)，增加性功能；
4、調(diào)節(jié)平衡荷爾蒙，增加血液制造，改善貧血、氣虛，增強(qiáng)細(xì)胞活力，加速產(chǎn)后恢復(fù)，幫助產(chǎn)婦泌乳；
5、提高人體免疫機(jī)能，推遲女性更年期，改善更年期綜合癥；
6、促進(jìn)乳房發(fā)育，令產(chǎn)后松弛下垂的乳房恢復(fù)堅(jiān)挺，富有彈性；
7、手術(shù)后的身體恢復(fù)；
8、抗過(guò)敏，抗腫瘤。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
一種羊胎素蛋白質(zhì)的制備方法，該方法包括以下的步驟
1)羊胚胎及羊胎盤(pán)原料前處理以2 - 3個(gè)月齡的羊胚胎及羊胎盤(pán)為原料，清洗、去除雜質(zhì)，0-5 V低溫下粉碎成粗粉。2)羊胚胎及羊胎盤(pán)超微粉碎、細(xì)胞破壁將羊胚胎及羊胎盤(pán)粗粉低溫冷凍(_40°C _45°C)池后低溫(_20°C)超微粉碎(WZJ100藥用超微粉碎機(jī))，細(xì)胞破壁，達(dá)到 0. 1-10 μ m 粒度。3)羊胚胎及羊胎盤(pán)的提取和酶解經(jīng)超微粉碎、細(xì)胞破壁后的羊胚胎及羊胎盤(pán)漿液加6倍蒸餾水溫浸提取后過(guò)濾得濾液A和沉淀A，沉淀A用木瓜蛋白酶與胰蛋白酶酶解后抽濾得水解液B，酶解溫度45°C，酶配比Ig :lg, pH7. 5，酶與底物為20mg :3g ；合并濾液 A和水解液B，得羊胚胎及羊胎盤(pán)素的精制羊胎素。4)采用葡聚糖凝膠(DEAE SepharoseTM Fast Flow, Sephadex G-50)根據(jù)分子量大小對(duì)上述步驟3)中得到的羊胎及羊胎盤(pán)素原液進(jìn)行分級(jí)精制，得到氨基酸、小分子多肽、 和各種分子量蛋白的精制羊胎素。其工藝流程如下
①分離氨基酸，分子量<700的多肽羊胚胎及羊胎盤(pán)素的精制羊胎素上樣，固定相 Sephadex G_10，依次用水，2%NaCl溶液洗脫，收集不同組分。②分離分子量1000-5000的多肽①中水洗脫液上樣，固定相kphadex G-25，依次用水，0%-2%NaCl溶液梯度洗脫，收集不同組分。③分離分子量5000-30000的多肽②中水洗脫液上樣，固定相kphadex G-50,依次用水，0%-2%NaCl溶液梯度洗脫，收集不同組分。④分離分子量30000-150000的蛋白質(zhì)③中水洗脫液上樣，固定相kphadex G-100,依次用水，0%-2%NaCl溶液梯度洗脫，收集不同組分。⑤分離分子量150000-600000的蛋白質(zhì)④中水洗脫液上樣，固定相kphadex G-200,依次用水，0%-2%NaCl溶液梯度洗脫，收集不同組分。采用凝膠滲透色譜-蒸發(fā)光散射(GPC-ELSD)法測(cè)定羊胎及羊胎盤(pán)生物制品的分子量分布，制定其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。步驟如下
①取羊胚胎及羊胎盤(pán)原液、精制粉或者精制羊胎素，加入適量純水加熱或超聲溶解，放冷，定容，過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液；
②液相條件流動(dòng)相為純水，流速lml/min，柱溫30°C；
③固定相凝膠過(guò)濾色譜柱(GPC)色譜柱SiodexOHpak SB-806 HQ, Shodex OHpak SB-805 HQ, Shodex OHpak SB-804 HQ, Shodex OHpak SB-803 HQ 串聯(lián)；
④檢測(cè)器蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)，蒸發(fā)溫度10(TC，霧化溫度80°C，氮?dú)饬魉?1.5L/min。實(shí)施例2
一種羊胎素蛋白質(zhì)的制備方法，該方法除步驟3)中酶解采用木瓜蛋白酶外，其他技術(shù)方案如實(shí)施例1所述。
權(quán)利要求
1.羊胎素蛋白質(zhì)的制備方法，其特征在于該方法包括以下的步驟1)羊胚胎及羊胎盤(pán)原料前處理取羊胚胎及羊胎盤(pán)為原料，清洗，去除雜質(zhì)，0 5°C低溫下粉碎成粗粉；2)羊胚胎及羊胎盤(pán)超微粉碎、細(xì)胞破壁將羊胚胎及羊胎盤(pán)粗粉低溫-40°C -50°C冷凍1 汕后，-30 -10°C超微粉碎，細(xì)胞破壁，達(dá)到0. 1 10 μ m粒度；3)羊胚胎及羊胎盤(pán)的提取和酶解細(xì)胞破壁后的羊胚胎及羊胎盤(pán)漿液加3 10倍蒸餾水溫浸提取后過(guò)濾得濾液A和沉淀A，沉淀A采用蛋白酶酶解后抽濾得水解液B，合并濾液A和水解液B，得羊胚胎及羊胎盤(pán)素的精制羊胎素；4)采用葡聚糖凝膠層析法，根據(jù)分子量大小對(duì)上述步驟3)中得到的羊胎及羊胎盤(pán)素原液進(jìn)行以下的分級(jí)精制①分離氨基酸，分子量<700的多肽羊胚胎及羊胎盤(pán)素的精制羊胎素上樣，固定相 Sephadex G_10，依次用水，2%NaCl溶液洗脫，收集不同組分；②分離分子量1000-5000的多肽①中水洗脫液上樣，固定相kphadexG-25，依次用水，0%-2%NaCl溶液梯度洗脫，收集不同組分；③分離分子量5000-30000的多肽②中水洗脫液上樣，固定相kphadexG-50,依次用水，0%-2%NaCl溶液梯度洗脫，收集不同組分；④分離分子量30000-150000的蛋白質(zhì)③中水洗脫液上樣，固定相kphadexG-100， 依次用水，0%-2%NaCl溶液梯度洗脫，收集不同組分；⑤分離分子量150000-600000的蛋白質(zhì)④中水洗脫液上樣，固定相kphadexG-200， 依次用水，0%-2%NaCl溶液梯度洗脫，收集不同組分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的羊胎素蛋白質(zhì)的制備方法，其特征在于步驟1)中以2 3 個(gè)月齡的羊胚胎及羊胎盤(pán)為原料。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的羊胎素蛋白質(zhì)的制備方法，其特征在于步驟3)中蛋白酶采用木瓜蛋白酶與胰蛋白酶中一種或兩種混合。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的羊胎素蛋白質(zhì)的制備方法，其特征在于步驟3)中蛋白酶的使用量為沉淀A重量的0. 1% H
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的羊胎素蛋白質(zhì)的制備方法，其特征在于步驟3)中蛋白酶的使用量為沉淀A重量的0. 3% 1%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4或5所述的羊胎素蛋白質(zhì)的制備方法，其特征在于步驟3)中蛋白酶采用木瓜蛋白酶與胰蛋白酶兩種混合，酶解反應(yīng)的溫度為40 50°C，pH為 7. 0 8. 0，木瓜蛋白酶與胰蛋白酶的酶配比1 :0. 5 2。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的羊胎素蛋白質(zhì)的制備方法，其特征在于步驟3)中酶解反應(yīng)的溫度為45°〇，？!1為7.5，木瓜蛋白酶與胰蛋白酶的酶配比1 :1。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4或5所述的方法制備得到的羊胎素蛋白質(zhì)。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法制備得到的羊胎素蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種羊胚胎及羊胎盤(pán)生物制品及其制備方法。一種羊胎素蛋白質(zhì)的制備方法，該方法包括以下的步驟:1)羊胚胎及羊胎盤(pán)原料前處理；2)羊胚胎及羊胎盤(pán)超微粉碎、細(xì)胞破壁；3)羊胚胎及羊胎盤(pán)的提取和酶解；4)采用葡聚糖凝膠層析法，根據(jù)分子量大小對(duì)上述步驟3)中得到的羊胎及羊胎盤(pán)素原液進(jìn)行以下的分級(jí)精制制得羊胎素蛋白質(zhì)。采用上述方法制得羊胎素蛋白質(zhì)，使羊胎及羊胎盤(pán)的活性物質(zhì)得到最大限度的保留，又便于人體全面吸收，工藝先進(jìn)、合理，質(zhì)量可控。
文檔編號(hào)C07K1/16GK102329841SQ20111019392
公開(kāi)日2012年1月25日 申請(qǐng)日期2011年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月12日
發(fā)明者姜艷, 姜雪琪 申請(qǐng)人:湖州康海斯生物科技有限公司